KR101195254B1

KR101195254B1 - 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드

Info

Publication number: KR101195254B1
Application number: KR1020110080706A
Authority: KR
Inventors: 김남수; 조용진; 김종태
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2011-08-12
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2012-10-29
Also published as: KR20110104462A

Abstract

본 발명에 의하여, C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계, 분석하고자 하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 스트렙트아비딘과 혼합하여 형광나노입자로 표지시키는 단계, 상기 항체를 혼합경쟁적으로 면역반응시키는 단계, 형광카메라로 분석하는 단계에 있어서, 상기 C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정화하기 위하여, 3-아미노프로필트리메톡시실란으로 개질된 슬라이드를 제조하는 단계, 3-아미노프로필트리메톡시실란으로 개질된 슬라이드를 수화하는 단계, 글루타르 알데히드 용액을 사용하여 상기 개질된 슬라이드를 활성화시키는 단계, 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)에 C-반응성 단백을 0.01-0.5㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화용 항원용액을 제조하는 단계, 스포팅 가이드 상에 상기 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 상기 제조한 항원용액을 1-100㎕ 적하점에 스포팅하는 단계, 및 상기 단계에 의하여 준비된 슬라이드를 1-6시간 반응시켜 항원을 고정화하는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 이에 의하여 제조되는 면역형광 슬라이드가 개시된다.

Description

항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드{PREPARATION METHOD OF ANTIGEN-IMMOBILIZED IMMUNO- FLUORESCENCE SLIDE AND THE IMMUNO-FLUOROSCENCE SLIDE MADE BY THE METHOD}

본 발명은 C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계, 분석하고자 하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 스트립트아비딘과 혼합하여 형광나노입자로 표지시키는 단계, 상기 항체를 혼합경쟁적으로 면역반응시키는 단계, 형광카메라로 분석하는 단계로 이루어지는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드에 관한 것이다.

바이오칩(Biochip)은, 다양한 종류의 프로브를 단위 면적의 고체상 지지체의 표면에 고정화한 것으로, 이러한 바이오칩을 이용하면 소량의 시료로 질병의 진단, 고효율 스크리닝(High Throughput Screening; HTS), 효소활성측정 등의 실험을 대규모로 손쉽게 실시할 수 있다.

프로브를 슬라이드나 슬라이드에 고정시키는 방법의 대부분은 코팅물질로 표면을 전처리한 유리 슬라이드 상에 프로브를 고정시킴으로써 제작된다. 이를 위해 다양한 표면화학물질이 제안되었으며, 대표적으로 자기조립 단분자층(Self-assembled monolayer)등의 기술이 적용된다(대한민국 특허공개 제 2003-0038932호).

이에 대해, 고정화되는 프로브의 양을 증대시키고 프로브의 활성을 유지하기 위한 시도로서 3 차원 고정화 방법이 개발되었다(Gill 및 Ballesteros, Trends in Biotechnology 18:282, 2000). 예컨대, 패커드 바이오사이언스(Packard Bioscience)의 히드로겔^®(Hydrogel) 코팅 슬라이드, 바이오셉트사의 폴리에틸렌글리콜계 히드로겔, 및 LG화학의 솔겔 등을 이용한 3 차원의 고정화 방법을 예로 들 수 있다.

면역센서용 슬라이드로서는 유리, 실리콘, 히드로겔, 금속, 세라믹, 다공성 멤브레인으로 구성된 그룹에서 선택된다.

현재, 대응되는 항원 또는 항체의 특이적 반응성에 기초하여, 항체 또는 항원이 기재 상에 고정화된 항체 또는 항원 프로브-플레이트가, 검출하기 위해 널리 사용되고 있다. 이러한 사용을 위한 세 종류의 대표적 키트는, 래피트(rapid) 테스트 키트, 루틴(routine) 테스트 키트 및 바이오칩 키트이다.

이들은 고정화된 항체 프로브 또는 항원 프로브에 대응하는 타겟 항원 또는 타겟 항체를 검출하기 위해 사용된다.

일부 경우에는 여러 반응기들이 한 프로브-플레이트로 조합되는데, 상기 반응기들 각각은 항원 또는 항체를 검출하는 테스트 스트립을 각각 포함한다

한편, 최근 건강기능식품법이 발효되면서 국내에서도 천연물을 기반으로 식품소재 및 가공식품을 제조하고 이를 건강기능식품으로 인정받을 수 있는 문호가 개방되었다. 그러나 이를 위해서는 건강기능식품의 기능성, 예를 들면 심혈관계 질환예방, 노화억제, 암 예방, 비만방지, 면역조절, 위·장관 질환예방 등의 건강기능식품의 기능성을 과학적으로 입증하는 자료를 제시해야 하므로 식품기능성 평가의 중요성은 점점 증대되고 있고 그 결과로서 기능성평가 분야의 사업화 가능성도 매우 높은 실정이다.

식품의 기능성평가는 위의 6대 기능성 유형을 중심으로 생체외(in vitro) 기능성 평가, 쥐(rat)와 같은 실험동물을 이용한 생체내(in vivo) 기능성 평가 및 임상실험을 망라하고 있는데, 식품산업의 측면에서 볼 때 식품소재 및 기능성식품의 기능성평가를 효율적이고 신속하게 행하기 위한 실험동물을 이용한 생체내 기능성 검색기술 개발의 필요성이 증대되고 있다.

기능성 식품으로서 인정되기 위해서는 심혈관계 기능성과 같은 목적하는 기능성이 과학적으로 입증되어야 하는데, 식품에 대한 기능성의 평가의 중요성은 아무리 강조해도 지나침이 없다(Kim 등, 직접결합 수정진동자 면역센서에 의한 C-reactive protein 검출, 한국생물공학회지, Vol. 22, p. 443, 2007). 임상실험에 앞서서 전 단계로서 행해지는 실험동물을 이용한 생체내 기능성 평가는 종래로부터 체중, 혈압, 및 기관 형태와 같은 신체적 요소의 변화를 측정하는 것이었다. 그러나, 이러한 방법은 불균일한 결과를 초래할 뿐만 아니라 평가 프로토콜의 다양성, 숙련된 전문가 및 값 비싼 분석기구 등이 필요하다는 단점이 있다. 생체내 식품 기능성에 대한 균일한 평가방법은 래트와 같은 실험동물 체내에서 특정 질환이나 대사증상과 관련된 특정 바이오마커 단백질의 상승 및 하강을 측정하는 것이다. 이 경우는 기능성 식품으로 인정받고자 하는 식품을 포함하는 것을 실험동물에 투여하게 된다.

대한민국 등록특허 10-921237호에서는 식품소재 및 기능성식품의 심혈관계 기능성을 신속하게 검색할 수 있는 생체내 기능성 평가를 위한 새로운 방법의 하나로서, 관상동맥질환, 고혈압 등에 대한 주요 바이오마커(biomarker)의 하나로 알려지고 있으며 포유동물의 간에서 인터류킨-6(interleukin- 6) 및 인터류킨-1베타(interleukin-1β)에 의한 유도자극으로 합성되는 분자질량 118 킬로달톤(killodalton, kDa) 정도의 펜타머 단백질인 C-반응성 단백(C-reactive protein)(Biosensors and Bioelectronics, Vol. 19, p. 1193, 2004; Clinical Chemistry, Vol. 47, p. 403, 2001; New England Journal of Medicine, Vol. 340, p. 448, 1999; Biochemical Journal, Vol. 327, p. 425, 1997)을 수정진동자 면역센서(quartz crystal microbalance immunosensor)를 이용하여 고감도로 검출하는 측정방법에 대하여 기술하였다.

상기의 방법은 C-반응성 단백을 측정하기 위한 기존방법의 하나인 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)(American Journal of Cardiology, Vol. 1, p. 155, 2005; American Journal of Veterinary Research, Vol. 1, p. 62, 2005; Journal of Clinical Laboratory Analysis, Vol. 18, p. 280, 2004)에 비하여 착색물질에 의한 측정저해를 받지 않으면서도 간편하게 사용할 수 있는 장점이 있고 측정감도도 기존의 다른 센서측정법에 비하여 우수하거나 비슷한 수준으로 나타났다(Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22, p. 973, 2007; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1987, 2006; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1631, 2006; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1141, 2006; Analytical Biochemistry, Vol. 328, p. 210, 2004).

최근에 이르러 바이오센서를 이용한 센서계측에 금속 콜로이드(metallic colloid), 탄소나노튜브(carbon nanotube), 형광 실리카 나노입자(fluorescent silica nanoparticle), 반도체 양자점(semiconductor quantum dot)과 같은 나노소재를 이용하는 빈도가 증가하고 있으며 그 적용을 통하여 센서신호의 감응성, 안정성, 선택성 등을 증진한 연구결과가 다수 보고되고 있다(Analytical Chemistry, Vol. 79, p. 630-707, 2007; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1900, 2006; Langmuir, Vol. 22, p. 4357, 2006; Nano Letters, Vol. 5, p. 113, 2005; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 20, p. 2454, 2005; Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 100, p. 4984, 2003; Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 274, p. 817, 2000).

바이오센서에 의하여 실험동물의 혈액 중에 존재하는 바이오마커로서의 C-반응성 단백을 측정하여 식품의 생체내 심혈관계 기능성을 평가하고자 할 때, 센서 감도의 증대는 여전히 중요하며 또한 간편하게 측정할 필요성이 끊임없이 제기되어 왔다.

본 발명은 바이오칩의 제작 및 측정에 바이오칩 어레이어나 마이크로-어레이 스캐너와 같이 복잡한 장치의 사용 없이 사용자가 마이크로 디스펜싱 피펫을 사용하여 슬라이드 상에 일정부피의 항원을 고정화하여 분석하고자 하는 단백질과 항체 및 형광나노입자의 접합체간의 면역반응 혹은 고정화된 항원과 형광성 나노프루브 및 특정 표적분자의 혼합물의 면역반응을 면역형광 슬라이드 상의 항원 코팅부위에서 행한 후 면역반응에 의하여 특이적으로 슬라이드 표면에 결합된 나노프루브를 형광현미경에 의하여 간편하게 형광강도나 형광입자 수를 측정하고 그 결과로서 생체지표와 같은 특정 표적분자의 농도를 알 수 있게 하는 센서의 감도가 높은 1회용 면역센서용 슬라이드를 제공하고자 한다.

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 분석하고자 하는 단백질(항원)을 슬라이드에 고정시키고, 상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 형광성 물질로 표지시키고, 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질을 상기 형광 표지된 항체와 혼합시키고, 상기 혼합된 혼합물을 상기 슬라이드에 고정된 항원부위와 반응시키고, 반응되지 않은 항체와 항원을 증류수를 사용하여 세척시키고, 상기 슬라이드를 인큐베이터에 위치시켜 건조한 후, 형광현미경을 사용하여 형광강도 또는 형광입자 수를 측정하는 단계로 이루어진다.

시료를 분석하기 위하여 본 발명에서는 간접경합방법(indirect-competitive assay format)을 사용하는 것을 보여주고 있지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 직접경합방법(direct-competitive assay format)이나 샌드위치방법(sandwich assay format)에 의하여 행할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에서 사용되는 면역센서용 슬라이드는 유리, 실리콘, 히드로겔, 금속, 세라믹, 다공성 멤브레인으로 구성된 그룹에서 선택되어지며 20~40X70~80mm의 가로, 세로 규격을 가진다.

본 발명에서는 분석하고자 하는 시료로서 C-반응성 단백(이하 "CRP"라 칭한다)을 사용하였으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 방법을 기타의 식품기능성 바이오마커인 엘디엘(LDL), 피브리노겐(fibrinogen), 안기오텐신 II(angiotensin II), 카디악 트로포닌(cardiac troponin) 등의 실혈관계 바이오마커와 노화억제, 암 예방, 비만 방지, 면역조절, 위ㆍ장관 질환예방 등과 관련된 바이오마커 단백질을 사용할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다.

C-반응성 단백 항체는 쥐(rat), 마우스(mouse), 토끼, 원숭이, 사람 등 포유동물 유래의 C-반응성 단백을 사용하여 제조한 항체 중에서 선택된 어느 하나인 것을 사용할 수 있다.

검체에서 채취되는 시료는 C-반응성 단백이 반응완충용액에 용해된 표준용액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 체액, 간 등의 조직추출물 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.

항원이 고정화된 슬라이드 표면의 항원과 반응하지 않은 부위를 블로킹(blocking) 하기 위하여 사용되는 용액으로는 1-5%의 BSA(Bovine serum albumin), RSA(Rat serum albumin), HSA(Human serum albumin), MSA(Mouse serum almumin), GSA(goat serum albumin) 용액 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 각 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명의 슬라이드에 항원인 C-반응성 단백의 고정화는 하기의 두 가지 방법중 하나를 선택하여 실시할 수 있다.

첫째, 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-Aminopropyltrimethoxysilane, 이하 "APTMS"라 칭한다)을 이용하여 항원을 고정화하는 방법이다. 이 방법을 이용하기 위하여 먼저, APTMS로 개질된 슬라이드를 제조한다. 상기 개질을 위하여 피란하 용액(Piranha solution, H₂SO₄:H₂O₂ = 2:1~4:1, 부피비율)에 슬라이드를 5~15분 침지한 후 꺼내 증류수로 헹군 다음 증류수내에서 3~10분간 초음파처리 하고 85~95℃의 열수로 30~90분간 수화시켜 세척한 후 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 20~120분간 실온건조한다. 표면세척을 행한 준비된 슬라이드를 아세톤에 5~15% 농도로 용해된 APTMS 용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어 실온에서 30~90분간 반응시킨다. 아세톤, 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8), 증류수로 슬라이드 앞, 뒤를 3~4회씩 순차적으로 헹구고 증류수가 담긴 비커에서 1~60분간 침지시킨다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에서 20~120분간 실온건조한 후 30~150℃ 대류오븐에서 3~7시간 열처리한 후 방냉하고 사용할 때까지 데시게이터에 건조한 상태로 보관한다.

APTMS로 개질된 슬라이드를 증류수에 10~20분간 침지하여 수화시킨다. 침지된 슬라이드를 꺼내서 글루타르알데히드 1~4% 용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어서 30~90분간 반응시켜 슬라이드 표면에 단백질이 결합할 수 있도록 활성화시킨다. 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 활성화된 슬라이드 앞, 뒤를 3~4회 세척한다. 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1~60분간 침지시킨다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 20~120분간 실온건조한다.

상기에서 사용되는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)는 46~49㎖의 증류수에 30-70% 농도의 글루타르 알데히드 1~4㎖를 가하여 30~70㎖로 정용하여 제조한다.

분석하고자 하는 단백질, 예컨대, C-반응성 단백을 고정화하기 위하여 먼저 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)에 C-반응성 단백을 0.01~0.5㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화용 항원용액을 제조한다. 격자로 된 스포팅 가이드(Spotting guide)상에 글루타르알데히드 활성화 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 미리 제조한 항원용액 1~100㎕를 스포팅 가이드상의 적하점에 해당하는 슬라이드 부위에 스포팅한 후 뚜껑을 덮고 1~6시간 반응시켜 항원의 고정화를 행한 후 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 세척하고 증류수가 담긴 비커에서 1분간 침지시킨다. 항원의 고정화를 행한 글루타르알데이드 활성화 슬라이드 표면의 항원과 반응하지 않은 부위를 블로킹하기 위하여 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)에 용해된 1~5% BSA 용액이 담긴 작은 플라스틱 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 뚜껑을 덮어 1~5시간 반응시키며, 반응이 끝난 후 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 BSA 블로킹된 슬라이드 앞, 뒤를 3~4회 세척한 후 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1-60분간 침지시킨다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 20-120분간 실온건조한다.

둘째, MPTMS-GMBS(3-Mercaptopropyltrimethoxysilane-N-gamma- maleimidobutyryloxy succinimide ester)방법으로 고정화하는 방법을 사용한다. 먼저 표면세척을 위하여 슬라이드를 진한염산(18-36%)과 메탄올(50-100%)의 혼합용액(HCl:MtOH = 1:1~1:2, 부피비율)에 15~45분 침지시킨 후 증류수로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 헹군다. 85~95℃의 증류수로 슬라이드를 세척한 후 킴와이프스 위에 놓고 실온에서 20~120분간 건조한다.

이렇게 준비된 슬라이드를 실란화시키기 위하여 1-3%의 톨루엔, 디메틸 포름아미드, 및 아세톤으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유기용매 용액에 용해된 MPTMS 용액 50~500㎖를 준비한다. 상기 용액이 담긴 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 실온에서 1~3시간 반응시킨다. 상기의 MPTMS 용액의 조제에 사용된 동일한 유기용매로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 세척한 후 킴와이프스 위에 놓고 20~120분간 실온건조한다.

슬라이드 표면을 활성화시키기 위하여 1~3mM GMBS용액을 다음과 같이 제조한다. GMBS시료 14~42㎎을 100㎕의 DMF(N,N-Dimethylformamide; 시그마알드리치사, 미국)에 녹인 후 에탄올 49.9㎖를 가한다. 상기 실란화 단계를 거친 슬라이드를 GMBS용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어 실온에서 30~90분간 반응시킨다. 증류수와 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 세척한다. 그 후 슬라이드를 킴와이프스에 놓고 20~120분간 실온건조한다.

CRP 항원의 고정화는 다음과 같이 실시한다. 먼저 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)에 C-반응성 단백을 0.01~0.5㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화 항원용액을 제조한다. 상기의 스포팅 가이드 위로 GMBS 활성화 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 미리 제조한 항원용액 1~100㎕를 스포팅 가이드상의 적하점에 해당하는 슬라이드 부위에 스포팅한 후 뚜껑을 덮고 1~6시간 반응시켜 항원의 고정화를 행한 후 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 헹구고 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1~60분간 침지시킨다. 분석의 정확도를 높이기 위하여 1~5% BSA용액이 담긴 작은 플라스틱 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 뚜껑을 덮어 1~5시간 반응시킨다. 상기와 같은 인산버퍼용액을 사용하여 슬라이드 앞, 뒷면을 3~4회 세척한다. 증류수가 담긴 비커에 1~60분간 침지시킨 후, 킴와이프스 위에 슬라이드를 위치시키고 20~120분간 실온건조한다.

상기 두 가지 방법을 개략적으로 나타낸 것을 도 1로서 나타내었다

본 발명의 면역센서용 슬라이드를 이용하여 특정 단백질을 분석함에 있어서는 슬라이드에 고정되는 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 표지시킨다. 상기 항체를 표지시키는 것은 민감성과 재현성이 높은 형광염색방법을 사용하며, 이를 위하여 본 발명에서는 형광 실리카 나노입자(Fluorescent silica nanoparticle, 이하 "FSNP"라 칭한다)를 사용한다.

형광 실리카 나노입자(FSNP)를 제조하는 방법에 대하여 개략적으로 기술한다. 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 표지하는데 사용되는 FSNP는 유기형광색소를 실리카 구조내로 포함시키는 포괄법(Dye entrapment), 활성화 유기형광색소를 아미노실란(Amino silane) 화합물과 공유결합 시킨 후 이를 실리카 구조내로 포합시키는 코어-쉘법(Core shell method), 유기형광색소를 실리카 구조내로 포합시켜 형성된 입자를 유기실란 (Organosilane) 화합물과 반응시켜 관능기를 도입하여 기능화하는 역 코어-쉘법(Inverted core shell method) 등에 의하여 제조된 것을 사용할 수 있다. 이 때 유기형광색소로는 디클로로트리스(1,10-페난트롤린) 루테니움(II)일수화물(Dichlorotris(1,10-phenanthroline)ruthenium(II)·hydrate), 플루오레신(Fluorescein), 로다민 B(Rhodamine B), 5(6)-카르복시테트라메틸로다민(5(6)-Carboxytetramethylrhodamine) 등을 사용할 수 있고, 활성화 유기형광색소로는 플루오레신 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate), 5(6)-카르복시테트라메틸로다민 N-숙신이미딜 에스테르(5(6)-Carboxytetramethylrhodamine N-succinimidyl ester), 테트라메틸로다민 5-이소티오시아네이트(Tetramethylrhodamine 5-isothiocyanate), 비스(2,2'-비피리딘)-4'-메틸-4-카르복시비피리딘-루테니움 N-숙신이미딜 에스테르 헥사 플루오로포스페이트 (Bis(2,2'-bipyridine)-4'-methyl-4-carboxybipyridine-ruthenium N-succinimidyl ester-bis(hexafluorophosphate)), 비스(2,2'-비피리딘)- 4,4'-디카르복시비피리딘-루테니움 디(N-숙신이미딜 에스테르)비스(헥사플루오로포스페이트)(Bis(2,2'-bipyridine)-4,4'-dicarboxybipyridine ruthenium di(N-Succinimidyl ester)bis(hexafluorophosphate)) 등을 사용할 수 있으며, 아미노실란 화합물로는 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-Aminopropyl)triethoxysilane) 등을 사용할 수 있으며, 유기실란 화합물로는 카르복실레이트(Carboxylate), 아민(Amine), 아민/포스포네이트(Amine/phosphonate), 폴리(에틸렌글리콜)(Poly(ethylene glycol)), 옥타데실(Octadecyl), 카르복실레이트/옥타데실(Carboxylate/ octadecyl) 관능기를 지닌 화합물을 사용할 수 있다.

FSNP를 사용하여 항체를 표지시키는 방법을 설명한다. 우선, FSNP를 비오틴(Biotin)과 특이적으로 결합하는 스트렙트아비딘(Streptavidin, 이하 "SA"라 칭한다)으로 개질하는 것이 필요한데, 이는 이하에서 설명하는 SA가 부착된 FSNP를 비오티닐화된 항체와 결합시키기 위함이다. FSNP를 SA로 개질하기 위하여 3-머캅토프로필트리메톡시 실란 ((3-Mercaptopropyl)trimethoxy silane, 이하 "MPTMS"라 칭한다)과 반응시켜 티올-개질된 FSNP를 먼저 제조한다. 10~70㎖ 용량의 캡 튜브에 상기의 FSNP 1~5㎎과 에탄올, 메탄올, 프로판올 등의 알코올 5~15㎖를 가하여 잘 흔들어 준 후 FSNP를 알코올에 완전히 용해시키기 위하여 10~30분간 초음파처리 한다. 이 후 캡 튜브에 MPTMS 30-70~200㎕를 첨가하고 실온에서 30-200rpm의 저속으로 교반하면서 2~6시간 반응시킨다. 반응혼합물을 3~10℃에서 20~40분간 7000-17000rpm으로 원심분리하여 얻은 침전물을 반응에 사용된 동일한 알코올을 사용하여 1~5회 세척하고 각각의 세척 후 동일한 조건에서 원심분리하여 침전물을 얻는다. 튜브의 캡을 분리하고 알루미늄호일을 살짝 덮어 실온건조한다. 침전물을 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8) 2~6㎖에 재용해하여 티올-개질된 FSNP 용액을 제조한다.

티올-개질된 FSNP에 말레이미드 활성화된(Maleimide-activated) SA를 부가하여 SA가 부착된 FSNP를 제조한다. 보다 구체적으로, 10-70㎖ 용량의 캡 튜브에 SA-말레이미드 0.1~0.5㎎과 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8) 3~7㎖를 가하여 용해시켜 SA-말레이미드 용액을 제조한다. 여기에 상기에서 제조한 티올-개질된 FSNP용액 0.5~2.0㎖를 가하여 30~200rpm의 저속으로 계속 저어주면서 실온에서 1~3시간 반응시킨다. 3~10℃에서 20~40분간 7000-17000rpm으로 원심분리하여 침전물을 취한다. 상기 단계에서 취한 침전물을 30~70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)로 1~5회 세척하고 각각의 세척 후 동일한 조건에서 원심분리 하여 침전물을 얻는다. 상기 단계에서 세척된 침전물을 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8) 1~5㎖에 재현탁시킨다. 이를 캡 튜브에 담아 알루미늄호일을 감싼 후 냉장보관하여 이하에서 설명하는 비오티닐화된 항체와 반응시킨다.

C-반응성 단백 항체의 비오티닐화는 다음 두 가지 방법 중의 어느 하나를 이용하여 실시 할 수 있다.

첫 번째 방법으로서, C-반응성 단백 항체에 탄산완충용액(Carbonate- bicarbonate buffer)을 가하여 C-반응성 단백 항체를 포함하는 탄산완충용액을 얻는 단계, 유기용매인 디메틸 포름아미드(Dimethyl formamide)에 용해한 비오틴화 시약인 비오틴아미도헥사노익산 N-히드록시석신이미드 에스테르(Biotinamidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester, NHS-LC-비오틴) 용액을 상기 단계의 탄산완충용액과 반응시키는 단계, 상기 단계에서 얻은 용액을 염화나트륨 용액에서 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어지는 방법을 들 수 있다.

보다 구체적으로, C-반응성 단백 항체에 탄산완충용액을 가하여 C-반응성 단백 항체의 농도가 1.0~3.0㎎/㎖인 탄산완충용액을 얻는 단계, 디메틸 포름아미드에 1~5㎎/㎖ 농도로 용해한 NHS-LC-비오틴 용액 30~100㎕를 상기 단계의 탄산완충용액 25~75㎕와 1 내지 5시간 얼음물 하에서 반응시키는 단계, 상기 단계에서 얻은 용액 75~175㎕를 0.1~0.3M염화나트륨 용액에서 하룻밤 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어진다.

두 번째 방법으로서, C-반응성 단백 항체에 인산완충식염수를 가하여 C-반응성 단백 항체를 포함하는 인산완충식염수를 얻는 단계, 재증류수에 용해한 수용성 비오틴화 시약인 설포숙신이미딜-6-(비오티아미도)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate, 설포-NHS-LC-비오틴) 용액을 상기 단계의 인산완충식염수와 반응시키는 단계, 상기 단계에서 얻은 용액을 인산완충식염수에서 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어지는 방법을 들 수 있다.

보다 구체적으로, C-반응성 단백 항체에 인산완충식염수를 가하여 C-반응성 단백 항체의 농도가 0.5~3.0㎎/㎖인 인산완충식염수를 얻는 단계, 재증류수에 2~20mM 농도로 용해한 설포-NHS-LC-비오틴 용액 5~20㎕를 상기 단계의 인산완충식염수 30~800㎕와 얼음물 하에서 1 내지 5시간 반응시키는 단계, 상기 단계에서 얻은 용액 55~820㎕를 0.05~0.25M인산완충식염수에 대하여 하룻밤 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어진다.

다음 단계로서 나노물질이 부착된 항체를 제조한다. 상기에서 제조한 SA 개질된 FSNP와 비오틴화된 항체를 가하여 혼합하면 비오틴이 SA와 특이적으로 결합하기 때문에 형광물질로 표지된 항체가 제조된다.

보다 구체적으로, 상기에서 제조한 SA-개질된 FSNP 용액을 10~30분간 초음파처리 한 후 이 중 200~600㎕를 상기에서 제조한 0.05~0.25㎎/㎖ 농도의 비오틴화된 항체용액 1~3㎖에 가하여 30분 간격으로 30~200rpm의 저속으로 2~7분씩 저어주면서 실온에서 1~3시간 반응시킨다. 3~10℃에서 20~40분간 7000-17000rpm으로 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물을 취한다. 상기 단계에서 취한 침전물을 30~70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)로 1~5회 세척하고 각각의 세척 후 상기와 동일한 조건에서 원심분리 하여 침전물을 얻는다. 상기 단계에서 세척된 침전물을 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8) 0.4~1.2㎖에 재현탁시킨다.

본 발명의 CRP와 특이적으로 결합하는 항체를 형광성 물질로 표지하는 개략적인 방법을 도 2로서 나타내었다.

본 발명의 면역센서용 슬라이드를 이용하여 특정 단백질을 분석함에 있어서 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질을 상기와 같이 표지된 항체와 혼합시킨다.

보다 구체적으로, 에펜도르프 튜브에 있는 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)을 사용하여 단계별로 희석하여 제조한 각각의 농도별 C-반응성 단백 시료용액에 비오틴과 SA의 특이적 결합에 의하여 상기와 같이 제조한, 나노물질로서 FSNP가 부착된 C-반응성 단백 항체용액을 동량 가하여 혼합시킨 후 실온에서 5~300분간 정치시킨다.

다음 단계로 상기와 같이 혼합된 혼합물을 슬라이드에 고정된 항원부위와 반응시킨다.

보다 구체적으로, 상기의 글루타르알데히드 공정이나 MPTMS-GMBS 공정에 의하여 항원인 C-반응성 단백을 고정화하고 BSA(bovine serum albumin) 블로킹 공정에 의하여 비선택적인 단백질 흡착을 최소화한 바이오트랜스듀서(bio-transducer)로서의 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 격자로 된 스포팅 가이드 위에 올려놓고 슬라이드상의 항원이 고정화되어 있는 부위에 상기와 같이 혼합하여 실온에서 5~300분간 정치시킨 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질과 상기와 같이 표지된 항체의 혼합물 1~100㎕를 정확히 스포팅 한 후 뚜껑을 덮고 실온에서 0.5~16시간 반응시켜 FSNP로 표지된 항체 및 슬라이드상에 고정된 항원과 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질간의 간접경합반응을 행한다. 반응이 끝난 후 반응되지 않은 항체와 항원을 증류수를 사용하여 슬라이드 앞, 뒤를 3~4회 세척한 후 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1~60분간 침지시켜 제거한다.

본 발명 슬라이드에 고정화된 항원과 형광표지된 항체가 간접경합방식에 의하여 결합하는 방식을 설명하는 모양을 도 3에 나타내었으며, 검체에서 채취한 C-반응성 단백 대신 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)을 상기와 같이 표지된 항체와 혼합한 후 슬라이드상의 항원이 고정화되어 있는 부위에 적하하여 경시적인 항원·항체반응을 행하였을 때 슬라이드에 결합된 형광입자수의 변화를 도 4에 나타내었다.

상기 슬라이드를 인큐베이터에 넣고 20~120분간 건조한다.

형광현미경을 사용하여 형광강도 및 형광입자 수를 측정한다. 검체 중의 CRP 농도가 높으면 형광표지된 항체와 반응을 많이 하기 때문에 슬라이드에 고정화된 항원과 형광표지된 항체가 결합하는 수가 적어 형광강도와 형광입자 수가 줄기 때문에 형광이 낮게 나타난다. 이와 같이 슬라이드에 고정된 항원과 검체 중의 항원은 형광표지된 항체와 경쟁적인 상호작용을 통하여 형광도가 다르게 나타나기 때문에 CRP를 단시간내에 간단히 측정할 수 있게 된다.

본 발명에 의하여 관상동맥질환, 고혈압 및 염증에 대한 주요한 바이오마커의 하나로 알려지고 있는 C-반응성 단백을 슬라이드에 코팅하고 형광성 나노프로브와 결합되어 있는 항체를 반응시킴으로서 나노몰 수준으로 측정할 수 있어 특정한 생체내 식품기능성의 지표인 해당 바이오마커를 고감도로 간편하게 측정할 수 있는 면역센서용 슬라이드가 제공된다.

본 발명은 C-반응성 단백 이외에 향후 엘디엘(low density lipoprotein, LDL), 피브리노겐(fibrinogen), 안기오텐신 II(angiotensin II) 등 실험동물의 혈액 등에 다양한 농도범위로 존재하는 바이오마커에 대한 초고감도 고속 동시측정에 필요한 식품기능성 평가와 관련된 기반기술을 확립할 수 있다.

도 1은 C-반응성 단백을 항원에 고정시키는 두 가지 방법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 CRP와 특이적으로 결합하는 항체를 형광성 물질로 표지하는 방법을 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명의 슬라이드에 고정화된 항원과 형광표지된 항체가 간접경합방식에 의하여 결합하는 방식을 설명하는 도이다.
도 4는 검체에서 채취한 C-반응성 단백 대신 30-70mM 인산버퍼용액(pH 6.5-7.8)을 본 발명에 의한 표지된 항체와 혼합한 후 슬라이드상의 항원이 고정화되어 있는 부위에 적하하여 경시적인 항원·항체반응을 행하였을 때 슬라이드에 결합된 형광입자수의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5의 a, b, c는 피란하용액 처리전 슬라이드의 표면에 존재하는 불순물 등 오염물질의 저해반점이 피란하처리를 통하여 제거됨을 나타내는 도로서, APTMS에 의한 실란화을 거친 후에도 형광영상상의 저해반점이 관찰되지 않음을 나타내는 도이다. 도 5의 d는 글루타르알데히드 2.5% 용액으로 처리한 기판을 처리하여 형광영상 사진을 찍어 저해반점이 발견되지 않음을 나타낸 도이다. 도 5의 e는 항원 고정화 후 BSA 블로킹 슬라이드 표면에서 저해반점은 발견되지 않음을 나타낸 도이다. 도 5의 f는 본 발명의 방법에 의하여 간접경합반응을 행한 슬라이드 표면에 결합한 형광 실리카 나노입자 표지항체의 형광반점을 나타낸 도이다.
도 6은 형광분석을 위한 장치를 나타낸 그림이다.
도 7은 항원고정화 면역형광 슬라이드 및 FSNP 표지항체 기반 C-반응성 단백의 검량선을 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 설명한다. 그러나 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되지 아니한다.

본 실험에서 사용되는 재료는 다음과 같다:

마우스 골수종 세포주(NSO)에서 발현된 재조합 히스티딘 태그된 래트 CRP(순수한 상태)는 R&D Systems, Inc.(미니아폴리스, MN, 미합중국)에서 입수하여 본 실험 전 과정에서 사용하였다. 이의 호모펜타메릭(homopentameric)구조는 세 개의 비공유 및 두 개의 공유결합된 서브유니트로 이루어져 있다. 마우스 골수종과 정제된, NSO-유래로부터 얻어진 재조합 래트 CRP로 면역된 마우스로부터 얻은 B셀을 융합한 것으로부터 나온 하이브리도마로부터 생성된 단일클론 항-래트 CRP항체도 상기 R&D Systems Inc.로부터 입수하였다. 글라스 슬라이드는 Coring Inc.(Kennebunk, ME, 미합중국)에서 입수하였다. 수용성 비오틸화 시약(설포숙신이미딜-6-(비오티아미도)헥사노에이트(설포-NHS-LC-비오틴)은 Pierce Biotechnology, Inc.(Rockford, IL, 미합중국)으로부터 구입하였다. 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS), 글루타르알데히드 및 소 혈청 알부민(BSA)은 Sigma- Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO, 미합중국)에서 입수하였다. 모든 다른 화합물들은 다양한 공급자로부터 보증된 것들이며 실험의 전 과정에서 이중 증류수를 사용하였다.

실시예 1: APTMS - GA 처리 슬라이드 상에의 항원 고정화

항원을 슬라이드에 고정하는 것은 다음과 같은 과정을 거쳐서 준비하였다. 즉, 표면클리닝을 위하여 슬라이드를 피란하 용액(H₂SO₄:H₂O₂ = 3:1, 부피비율)에 10분간 침지한 후, 증류수로 헹군 다음 증류수내에서 5분간 초음파처리 하고 90℃의 열수로 1시간 수화시켜 세척한 후 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 30분간 실온건조하였다.

항원의 고정화에 필요한 반응기인 아미노기(-NH₂)를 슬라이드 표면에 도입하기 위한 실란화를 행하기 위하여 표면세척을 행한 준비된 슬라이드를 아세톤에 10% 농도로 용해된 APTMS 용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어 실온에서 1시간 반응시켰다. 아세톤, 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4), 증류수로 슬라이드 앞, 뒤를 3회씩 순차적으로 세척하고 증류수가 담긴 비커에서 1분간 침지시켰다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에서 30분간 실온건조한 후 120℃ 대류오븐에서 5시간 열처리한 후 방냉하고 형광영상 사진을 찍었다(도 5의 a, b, c). 도 5의 a, b, c에서 볼 수 있는 것처럼 피란하처리 전 슬라이드의 표면에 존재하는 불순물 등 오염물질의 저해반점이 피란하처리를 통하여 제거됨을 알 수 있었고 APTMS에 의한 실란화를 거친 후에도 형광영상상의 저해반점이 관찰되지 않음을 알 수 있었다.

APTMS로 개질된 슬라이드를 활성화시키기 위하여 증류수에 15분간 침지하여 수화시켰다. 침지된 슬라이드를 꺼내서 글루타르알데히드 2.5% 용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어서 1시간 반응시켜 슬라이드 표면에 단백질이 결합할 수 있도록 활성화시켰다. 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 활성화된 슬라이드 앞, 뒤를 3회 세척한 후 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1분간 침지시켰다. 이를 꺼내어 킴와이프스 위에 슬라이드를 놓고 30분간 실온건조하였으며, 형광영상 사진을 찍어 확인한 결과 GA활성화 슬라이드 표면에서도 저해반점은 발견되지 않았다(도5의 d).

항원(CRP, C-반응성 단백)을 슬라이드상에 고정시키기 위하여 먼저 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)에 C-반응성 단백을 0.1㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화용 항원용액을 제조하였다. 격자로 된 스포팅 가이드(Spotting guide)상에 글루타르알데히드 활성화 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 미리 제조한 항원용액 20㎕를 스포팅 가이드상의 적하점에 해당하는 슬라이드 부위에 스포팅(적하, spotting)한 후 뚜껑을 덮고 1시간 반응시켜 항원의 고정화를 행한 후 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3회 세척하고 증류수가 담긴 비커에서 1분간 침지시켰다. 항원의 고정화를 행한 글루타르 알데히드 활성화 슬라이드 표면의 항원과 반응하지 않은 부위를 블로킹(blocking)하기 위하여 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)에 용해된 1% BSA(bovine serum albumin) 용액이 담긴 작은 플라스틱 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 뚜껑을 덮어 1시간 반응시켰다. 이 슬라이드를 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 앞, 뒤를 3회 세척하고, 증류수가 담긴 비커에 1분간 침지시키고, 킴와이프스 위에 위치시킨 후 30분간 실온건조하였으며, 형광영상 사진을 찍어 확인한 결과 항원 고정화 후 BSA 블로킹 슬라이드 표면에서도 저해반점은 발견되지 않았다(도5의 e).

실시예 2: MTS - GMBS 처리 슬라이드 상에의 항원 고정화

항원을 슬라이드에 고정하는 것은 다음과 같은 과정을 거쳐서 준비하였다. 즉, 표면클리닝을 위하여 슬라이드를 진한염산(35%)과 메탄올(70%)이 1:1의 부피비율로 혼합된 용액에 30분간 침지한 후, 증류수로 슬라이드를 3회 세척하였다. 진한황산에 30분 침지한 후 증류수로 슬라이드 앞, 뒷면을 3회 세척하고, 끓는 증류수로 슬라이드를 세척한 후 킴와이프스 위에 놓고 실온에서 30분간 건조하였다.

항원의 고정화에 필요한 반응기인 티올기(-SH)를 슬라이드 표면에 도입하기 위한 실란화를 행하기 위하여 톨루엔 98㎖에 MPTMS ((3-Mercaptopropyl)trimethoxy silane) 2㎖을 첨가하여 2% MPTMS 용액을 제조하였다. 상기의 용액이 담긴 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 이 후 톨루엔으로 슬라이드를 3회 세척한 후, 킴와이프스에 슬라이드를 위치시키고 30분간 실온에서 건조하였다.

MPTMS로 개질된 슬라이드를 활성화시키기 위하여 28㎎의 GMBS를 100㎕의 DMF(N,N-Dimethylformamide, chromosllvr^®Plus, St. Louis, MO, 미합중국, HPLC≥99.9%)에 용해한 후 여기에 에탄올 49.9㎖를 가하여 2mM GMBS용액을 제조하였다. 실란화된 슬라이드를 2mM GMBS용액이 담긴 페트리디쉬에 넣어 실온에서 1시간 반응시켰다. 증류수와 50mM 인산완충용액(pH 7.4)로 슬라이드의 앞, 뒤를 3회 세척하고 킴와이프스에서 30분간 실온건조하였다.

항원(CRP, C-반응성 단백)을 슬라이드상에 고정시키기 위하여 먼저 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)에 C-반응성 단백을 0.1㎎/㎖ 농도로 용해하여 고정화용 항원용액을 제조하였다. 상기의 스포팅 가이드 위에 GMBS 활성화 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 올려놓고 미리 제조한 항원용액 20㎕를 스포팅 가이드상의 적하점에 해당하는 슬라이드 부위에 적하한 후 뚜껑을 덮고 1시간 반응시켜 항원의 고정화를 행하였다. 이 슬라이드를 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 슬라이드 앞, 뒷면을 3회 세척하고 증류수가 담긴 비커에서 1분간 침지시켰다. 항원의 고정화를 행한 GMBS 활성화 슬라이드 표면의 항원과 반응하지 않은 부위를 블로킹하기 위하여 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)에 용해된 1% BSA 용액이 담긴 작은 플라스틱 페트리디쉬에 슬라이드를 넣고 뚜껑을 덮어 1시간 반응시켰다. 이 슬라이드를 50mM 인산완충용액(pH 7.4)으로 앞, 뒤를 3회 세척하고, 증류수가 담긴 비커에 1분간 침지시키고, 킴와이프스 위에 위치시킨 후 30분간 실온건조시켰다.

MTS-GMBS 처리 슬라이드 상에의 항원 고정화과정의 각 단계인 표면클리닝, 실란화, 활성화, 항원 고정화 및 BSA 블로킹을 행한 슬라이드에 대하여 형광영상 사진을 찍어 확인한 결과 진한염산과 메탄올 혼합용액(1:1, 부피비율) 처리전 슬라이드의 경우를 제외하고는 슬라이드 표면에서 센서계측을 저해하는 저해반점은 발견되지 않았다.

실시예 3: SA 로 개질된 FSNP 의 제조

25㎖ 용량의 캡 튜브에 상기의 FSNP 2㎎과 에탄올 10㎖를 가하여 잘 흔들어 준 후 FSNP를 에탄올에 완전히 용해시키기 위하여 15분간 초음파처리 하였다. 이 후 캡 튜브에 MPTMS 100㎕를 첨가하고 실온에서 100rpm으로 저속교반하면서 4시간 반응시켰다. 반응혼합물을 4℃에서 30분간 13000rpm으로 원심분리하여 얻은 침전물을 에탄올로 3회 세척하고 각각의 세척 후 동일한 조건에서 원심분리하여 침전물을 얻었다. 튜브의 캡을 분리하고 알루미늄호일을 살짝 덮어 실온건조시켰다. 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4) 4㎖에 재용해하여 티올-개질된 FSNP 용액을 제조하였다.

25㎖ 용량의 캡 튜브에 SA-말레이미드 0.25㎎과 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4) 5㎖를 가하여 용해시켜 SA-말레이미드 용액을 제조하였다. 여기에 상기의 티올-개질된 FSNP용액 1㎖를 가하여 100rpm의 저속으로 계속 저어주면서 실온에서 2시간 반응시켰다. 4℃에서 20분간 10000rpm으로 원심분리하여 침전물을 취하였다. 상기 단계에서 취한 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)으로 3회 세척하고, 각각의 세척 후 상기와 동일한 조건에서 원심분리하여 침전물을 얻었다. 상기 단계에서 세척된 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH7.4) 2㎖에 재현탁시켰다. 이를 캡 튜브에 담아 알루미늄호일을 감싼 후 냉장보관하여 이하에서 설명하는 비오티닐화된 항체와 반응시켰다.

실시예 4: 항체의 비오티닐화

냉장보관하는 수용성 비오틴화 시약인 설포석신이미딜-6-(비오티아미도)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate, 설포-NHS- LC-비오틴) 1㎎ 바이알(vial)을 실험 당일 냉장고에서 꺼내 실온조건으로 옮겨주고 단일클론 항-래트 CRP항체 30-700㎍ 바이알에 0.1M 인산완충식염수(pH 7.2) 30-700㎕를 가하여 용해시켰다. 상기의 설포-NHS-LC-비오틴 1㎎ 바이알에 증류수 180㎕를 가하여 10mM 설포-NHS-LC-비오틴 용액을 제조한 후 이 중 6.67㎕를 상기의 항체용액에 가하여 비오틴과 항체의 분자비율을 20:1로 조정하였다. 반응혼합물이 담긴 바이알을 가볍게 흔들어 섞어준 후 에펜도르프 튜브 랙에 담아 얼음물에 넣어 2시간 반응시켰다. Slide-A-lyzer kit(Pierce Biotechnology, Inc)에 반응혼합물을 넣은 후 0.1M 인산완충식염수(pH 7.2)에 대하여 하룻밤 투석하여 미반응시약을 제거하고, 투석막내의 내용물을 회수한 후 동일한 인산완충식염수를 사용하여 총 부피를 1㎖로 조절하여 비오티닐화 항체를 제조하였다.

실시예 5: 나노물질이 부착된 항체의 제조

SA-개질된 FSNP 용액을 15분간 초음파처리 한 후 이 중 400㎕를 0.1㎎/㎖ 농도의 비오틴화된 항체용액 2㎖에 가하여 30분 간격으로 100rpm의 저속으로 5분씩 저어주면서 실온에서 2시간 반응시켰다. 4℃에서 20분간 10000rpm으로 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물을 취하였다. 상기 단계에서 취한 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH7.4)으로 3회 세척하고 각각의 세척 후 상기와 동일한 조건에서 원심분리 하여 침전물을 얻었다. 상기 단계에서 세척된 침전물을 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4) 0.8㎖에 재현탁시켰다.

실시예 6: 검체용액과 표지항체의 혼합

에펜도르프 튜브에 있는 50mM 인산버퍼용액(pH 7.4)을 사용하여 단계별로 희석하여 제조한 각각의 농도별 C-반응성 단백 시료용액에 비오틴과 SA의 특이적 결합에 의하여 상기와 같이 제조한, 나노물질로서 FSNP가 부착된 C-반응성 단백 항체용액을 동량 가하여 혼합시킨 후 실온에서 1시간 정치시켰다.

실시예 7: 간접경합반응

상기의 실시예 1과 실시예 2에 의하여 항원인 C-반응성 단백을 고정화하고 BSA 블로킹 공정에 의하여 비선택적인 단백질 흡착을 최소화한 바이오트랜스듀서로서의 슬라이드를 포함하는 페트리디쉬를 격자로 된 스포팅 가이드위에 올려놓고 슬라이드상의 항원이 고정화되어 있는 부위에 상기와 같이 혼합하여 실온에서 1시간 정치시킨, 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질과 상기와 같이 표지된 항체의 혼합물 20㎕를 정확히 적하한 후 뚜껑을 덮고 실온에서 2시간 반응시켜 FSNP로 표지된 항체 및 슬라이드상에 고정된 항원과 검체에서 채취한 분석하고자 하는 단백질간의 간접경합반응을 행하였다. 반응이 끝난 후 반응되지 않은 항체와 항원을 증류수를 사용하여 슬라이드 앞, 뒤를 3회 세척한 후 증류수가 담긴 비커에 슬라이드를 1분간 침지시켜 제거하였다.

실시예 8: 형광영상 분석

간접경합반응을 행한 실시예 7의 슬라이드를 인큐베이터에 넣고 건조하였다. 건조한 슬라이드를 형광현미경을 사용하여 형광영상 분석을 행하고 형광강도 및 형광입자 수를 측정하였다. 도 6은 형광분석을 위한 장치를 나타내고, 형광영상 사진을 찍어 확인한 결과 간접경합반응을 행한 슬라이드 표면에 결합한 FSNP 표지항체의 형광반점을 확인할 수 있었다(도 5의 f). 도 7은 FSNP 표지항체를 이용한 C-반응성 단백의 농도 의존적 형광영상으로부터 상대형광도를 측정하여 작성한 검량선을 나타내는데, 검체 중의 CRP 농도가 증가하면 표지항체와의 반응정도가 높아지므로 슬라이드에 고정화된 항원과 표지항체와의 결합정도는 줄어들어 형광이 낮게 나타났으며, 매우 낮은 C-반응성 단백의 농도범위에서 직선성을 보여주어 본 면역형광 슬라이드에 의한 CRP 계측 시의 검출한계가 0.1~1.0 ng/㎖에 이를 정도로 감도가 매우 높음을 알 수 있었다.

실시예 9: 면역형광 슬라이드 제조

실시예 1내지 8의 방법을 적용하여 30X70mm의 가로, 세로 규격을 지닌 투명한 현미경용 슬라이드를 사용하여 1회용의 3-아미노프로필트리메톡시실란 또는 3-머캅토프로필트리메톡시실란-N-감마 말레이미도부티릴옥시 숙신이미드 에스테르로 슬라이드 표면이 개질되고, 0.01-0.5㎎/㎖의 농도인 C-반응성 단백을 1-100㎕ 포함하는 면역형광 슬라이드를 제조하였다.

Claims

C-반응성 단백질을 슬라이드에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계, 상기 C-반응성 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 형광나노입자로 표지시키는 단계, 검체에서 채취한 상기 C-반응성 단백질을 상기 형광 표지된 항체와 혼합시키고, 상기 혼합된 혼합물을 상기 슬라이드에 고정된 항원부위와 반응시키고, 형광현미경을 사용하여 형광강도 또는 형광입자 수를 측정하여 분석하는 단계에 있어서,
항체를 형광 나노입자로 표지시키기 위하여,
3-머캅토프로필트리메톡시 실란을 형광 실리카 나노입자와 반응시켜 티올-개질된 형광 실리카 나노입자를 제조하는 단계;.
상기 티올-개질된 형광 실리카 나노입자에 말레이미드 활성화된 스트렙트아비딘을 부가하여 스트렙트아비딘이 부착된 형광 실리카 나노입자를 제조하는 단계;
C-반응성 단백 항체를 비오티닐화하는 단계; 및
상기 스트렙트아비딘 개질된 형광 실리카 나노입자와 비오틴화된 항체를 가해서 혼합하여 형광물질로 표지된 항체를 제조하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법.
제 1항에 있어서,상기 C-반응성 단백 항체를 비오티닐화하는 것은
C-반응성 단백 항체에 탄산완충용액을 가하여 C-반응성 단백 항체를 포함하는 탄산완충용액을 얻는 단계;
디메틸 포름아미드(Dimethyl formamide)에 용해한 비오틴화 시약인 비오틴아미도헥사노익산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (Biotinamidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester, NHS-LC-비오틴) 용액을 탄산완충용액을 얻는 단계에서 얻어진 탄산완충용액과 반응시키는 단계, 및 디메틸 포름아미드(Dimethyl formamide)에 용해한 비오틴화 시약인 비오틴아미도헥사노익산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (Biotinamidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester, NHS-LC-비오틴)과 탄산완충용액을 얻는 단계에서 얻은 탄산완충용액과 반응시킨 용액을 염화나트륨 용액에서 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법.
제 1항에 있어서,상기 C-반응성 단백 항체를 비오티닐화하는 것은
C-반응성 단백 항체에 인산완충식염수를 가하여 C-반응성 단백 항체를 포함하는 인산완충식염수를 얻는 단계;
재증류수에 용해한 수용성 비오틴화 시약인 설포숙신이미딜-6-(비오티아미도)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate, 설포-NHS-LC-비오틴) 용액을 인산완충식염수를 얻는 단계에서 얻어진 인산완충식염수와 반응시키는 단계; 및 재증류수에 용해한 수용성 비오틴화 시약인 설포숙신이미딜-6-(비오티아미도)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate, 설포-NHS-LC-비오틴) 용액을 인산완충식염수를 얻는 단계에서 얻어진 인산완충식염수와 반응시켜서 얻은 용액을 인산완충식염수에서 투석하여 미반응 비오틴화 시약을 제거하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법.
제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조되고, 3-아미노프로필트리메톡시실란 또는 3-머캅토프로필트리메톡시실란-N-감마 말레이미도부티릴옥시 숙신이미드 에스테르로 슬라이드 표면이 개질되고, 0.01-0.5㎎/㎖의 농도인 C-반응성 단백을 1-100㎕ 포함하는 면역형광 슬라이드.
제 4항에 의한 면역형광 슬라이드를 사용하여 검체중의 C-반응성 단백질을 측정하는 방법.