ES2238750T3

ES2238750T3 - Dispositivo y aparato para la deteccion simultanea de varios analitos.

Info

Publication number: ES2238750T3
Application number: ES98303019T
Authority: ES
Inventors: Stephen Peter Fitzgerald; John Victor Lamont; Robert Ivan Mcconnell; El Ouard Benchikh
Original assignee: Randox Laboratories Ltd
Current assignee: Randox Laboratories Ltd
Priority date: 1997-04-21
Filing date: 1998-04-20
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2018-04-20
Also published as: CA2235183A1; HU220777B1; HUP9800920A1; DE69829089T3; UA54400C2; CZ116998A3; AU713388B2; AU6198898A; HU9800920D0; JP4209494B2; NO981766D0; ID20179A; HRP980215A2; JPH10319011A; GB2324866B; YU49328B; SK283340B6; EG22471A; PL325914A1; DE69829089T2

Abstract

DISPOSITIVO DE ESTADO SOLIDO PARA REALIZAR ENSAYOS MULTIANALITICOS, QUE COMPRENDE UN SUSTRATO Y VARIAS ZONAS DE REACCION DISCRETAS, SOPORTANDO CADA UNA UN LIGANDO UNIDO COVALENTEMENTE AL SUSTRATO, SIENDO LA SUPERFICIE DEL SUSTRATO ENTRE LAS ZONAS DE REACCION INERTE ANTE EL ANALITICO. ESTE DISPOSITIVO PUEDE OBTERNERSE MEDIANTE UN PROCESO DE ACTIVACION DE LA SUPERFICIE DEL SUSTRATO Y APLICANDO UNA MATRIZ DE LIGANDOS EN AREAS DISCRETAS SOBRE LA SUPERFICIE.

Description

Dispositivo y aparato para la detección simultanea de varios analitos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un dispositivo y aparato para detección simultánea de analitos múltiples.

Antecedentes de la invención

Tradicionalmente, los analitos distintos estructuralmente han sido analizados por medio de métodos específicos, por ejemplo, inmunoensayo de enzimas, cromatografía de líquidos de alto rendimiento, cromatografía de gases, métodos enzimáticos y métodos colorimétricos. Estos métodos son, predominantemente, métodos de un ensayo para un analito.

La automatización de los métodos analíticos se ha enfocado generalmente hacia analizadores de acceso a partidas y al azar, donde se llevan a cabo análisis múltiples sobre muestras de ensayo individuales empleando métodos de ensayo individuales secuenciales. Esto requiere el uso de múltiples paquetes de equipos de ensayo individuales. Además, hay análisis que requieren el empleo de varios tipos de equipos, por ejemplo analizadores de química clínica, HPLC, GCMS, instrumentos de inmunoensayo automátizado o instrumentos de absorción atómica.

Un sistema para analito múltiple debería comprender medios para proporcionar un análisis simultáneo de varios analitos en una muestra de ensayo. Este análisis proporcionaría resultados que identificarían analitos individuales y permitirían la determinación cuantitativa de cada analito individual en esa muestra de ensayo. Se reclama frecuentemente un método de análisis de analito múltiple, pero los criterios que se acaban de dar no han sido satisfechos por lo general ninguno de los dos.

En un sistema de analito múltiple, un substrato típico contiene una pluralidad de lugares de reacción de ensayo individuales poseyendo cada uno un diferente ligando de unión. La muestra de ensayo se pone en contacto con cada una de las zonas de reacción y después se instrumentalizan una serie de técnicas de detección para identificar el presente analito. Es importante que el método de detección utilizado permita la determinación cuantitativa de cada analito individual.

Para producir ordenaciones de áreas espacialmente distintas de ligandos biológicamente activos sobre un substrato, el método más común ha sido a través de técnicas fotolitográficas. El substrato se cubre con un reticulador foto-lábil. En teoría, este reticulador deberá hacerse reactivo solo para un ligando de unión después de la irradiación con luz de longitud de onda adecuada. La resolución espacial se alcanza por colocación de un enmascarador físico (normalmente hecho de cromo) sobre el substrato. El modelo de orificios en el enmascarador determina el modelo de regiones de unión sobre el substrato.

Para cada ligando biológico que se va a inmovilizar, el protocolo general es: irradiación de primeros lugares, incubación del substrato irradiado con un primer ligando que se va a inmovilizar, lavado para separar el ligando poco unido, bloqueo de los lugares sin reaccionar activados por la etapa de irradiación, e irradiación de las regiones donde el segundo ligando biológico ha de ser inmovilizado, con las siguientes etapas repetidas como para el primer ligando. La resolución espacial está dictada por el control del lugar de irradiación, ya sea por control del lugar de irradiación por medio de una fuente de luz UV coherente de un láser o por un cierto número de enmascaradores físicos y una fuente de luz incoherente. Esto supone de la tarea de inmovilizar la pluralidad de ligandos biológicos un proceso que consume tiempo. Otra desventaja del método fotolitográfico es la necesidad de enmascaradores físicos o una fuente de luz de láser, caros. Además, hay un alto grado de uniones no específicas.

Por ejemplo, el empleo de arilazidas, fluoro-arilazidas y benzofenonas ha sido asociado con un alto grado de uniones no-específicas. Una alta unión no específica da por resultado un alto fondo en el ensayo, lo que reduce significativamente el intervalo dinámico de cada ensayo de analitos múltiples. Las uniones no específicas son debidas en gran medida a adsorción pasiva de moléculas a la superficie del reticulador foto-lábil no activado a través de interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals, etc.

La Patente WO-A-9516204 describe un método fotolitográfico para reducir los problemas asociados a uniones no específicas. En este método, la molécula de unión a la superficie era avidina y la molécula foto-lábil era fotobiotina o un derivado de la misma. Aunque se reivindica unión no-específica reducida, esta técnica necesita todavía las secuencias que consumen tiempo que se han señalado antes. La inmovilización de una pluralidad de 20 ligandos biológicos separados requeriría un total de 80 etapas, teniendo en cuenta el requerimiento básico de etapas de irradiación, unión, bloqueo y lavado para cada ligando separado que va a ser inmovilizado.

La resolución espacial se ha logrado por adsorción pasiva. Por ejemplo, la Patente US-A-5432099 describe uniones en las que el ligando se une a la superficie del substrato a través de combinación de interacciones iónicas, interacciones hidrófobas, y fuerzas de Van der Waals. Los procesos de adsorción pasivos dependen de cambios en el pH, temperatura, concentración iónica y del tipo de substrato utilizado, haciendo el proceso de unión más difícil de controlar. La mayor desventaja con este método es la susceptibilidad de una proporción de ligando débilmente inmovilizado que se va a des-adsorber en la etapa de lavado o etapas de incubación del ensayo biológico, dando lugar a una precisión pobre intra- e inter-ensayos.

Un reticulador utilizado en muchas publicaciones ha sido el glutaraldehido. Este reticulador presenta muchas desventajas, incluyendo la tendencia de las proteínas a la reticulación lo que probablemente altere la función de la proteína. Otra desventaja es que el procedimiento de copulación deberá incluir una etapa de reducción que consume tiempo y es potencialmente muy peligrosa, por ejemplo si se emplea cianoborohidruro de sodio como agente reductor. Se han utilizado reticuladores heterofuncionales pero en muchos casos éstos suponen la necesidad de grupos sulfhidrilo libres en la proteína que se va a unir. Esto requiere modificación de la proteína antes de la inmovilización.

En un ensayo de analito múltiple, es deseable proporcionar tanto resultados cualitativos como cuantitativos. Se ha dispuesto de ensayos de analito múltiple para antibióticos, por ejemplo. Estos se basan en gran medida en ensayos de inhibicion microbiana, donde un antibiótico presente en la muestra inhibe el crecimiento bacteriano y forma una zona vacía que es proporcional a la concentración del antibiótico presente en la muestra. Este método, sin embargo, no puede proporcionar ninguna indicación en cuanto a la identidad del antibiótico o una determinación exacta de su concentración. Los métodos de inhibición microbiana son también muy lentos, llevando el proceso completo varios días.

Los métodos de análisis químico de selección, tal como cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía de gas/líquido- espectrometría de masas [GCMS/LCMS] se esfuerzan en acomodar los extremos diversidad estructural/polaridad de cada grupo de antibióticos, por ejemplo penicilinas, sulfonamidas, aminoglicósidos, tetraciclinas, etc. Además, los métodos cromatográficos requieren una extensa preparación de las muestras con el fin de que las relaciones señal-a-ruido sean tales que se puedan lograr los límites de detección requeridos.

Entre los dispositivos de analitos múltiples disponibles se incluyen los Triage (véase Clinical Chemistry 38(9):
1678-1684 (1992) y Advisor (véase Clinical Chemistry 39(9):1899-1903 (1893)). Estos dispositivos son solamente adecuados para análisis cualitativo.

El dispositivo Triage es para detección simultánea de un panel de siete drogas en orina humana. Cada dispositivo solo puede analizar una muestra de orina. Al final del procedimiento, el analista examina visualmente cada una de las zonas de ensayo específicas para la droga en cuanto a la presencia de una barra roja. Todas las etapas del protocolo de ensayo deben ser realizadas manualmente por el analista. Tampoco hay disponible copia de vaciado sobre papel del resultado de ensayo.

El dispositivo Advisor es similar en su aplicación al dispositivo Triage. El dispositivo Advisor pone en pantalla cinco clases diferentes de drogas. El dispositivo funciona por utilización de los principios del ensayo de aglutinación, con canales individuales para cada droga. Todas las etapas del protocolo de ensayo son llevadas a cabo por el analista. Las muestras negativas tienen partículas aglutinadas, mientras que las muestras con droga positivas proporciona un modelo sin agregados de partículas.

La mayor parte de los biosensores/dispositivos microfabricados para aplicación biológica han empleado silicio como substrato. Otros utilizan substratos de vidrio o de cuarzo. El silicio tiene una estructura cristalográfica muy controlada con planos de cristal bien definidos. La uniformidad del substrato de silicio lo hace ideal para el desarrollo de un dispositivo de ensayo de analito múltiple.

Sin embargo, los substratos oscuros tales como silicio dan los llamados efectos de cuerpo negro. En el caso de detección por fluorescencia, en que se excita un fluoróforo utilizando luz de una longitud de onda particular, un substrato oscuro puede absorber la energía luminosa de la excitación incidente, reduciendose así la emisión de luz desde el fluoróforo.

La Patente EP-A-0127438 describe la producción de un dispositivo de estado sólido por foto-activación utilizando un enmascarador, y uniendo un ligando a las partes así activadas de la superficie del substrato. La Patente WO-A-9516204 describe también la preparación de un dispositivo con dibujo en la superficie, por irradiación selectiva de una fracción de unión fotosensible.

Compendio de la invención

Según la presente invención, se proporciona método para la producción de un dispositivo de estado sólido para realizar ensayos de analito múltiple, que comprende un substrato y una multiplicidad de lugares de reacción discretos llevando cada uno un ligando unido covalentemente al substrato, donde la superficie del substrato entre los lugares de reacción es inerte con respecto al analito, el método comprende la activación y la transformación en hidrófoba de la citada superficie; y la aplicación a la superficie hidrófoba activada de una ordenamiento de ligandos, para formar lugares de reacción discretos, donde los ligandos se aplican en agua. Si se desea, las áreas activas entre los lugares de reacción se pueden bloquear.

Un nuevo dispositivo obtenible por este método es un dispositivo de analito múltiple de estado sólido que presenta poca o ninguna unión no-específica.

Los ligandos se pueden unir al substrato a través de un reticulador. En particular, se prefiere que la superficie activada reaccione sucesivamente con un organosilano, un reticulador bifuncional y el ligando. Los reticuladores bifuncionales se han utilizado para proporcionar químicas de copulación muy eficaces entre organosilanos inmovilizados covalentemente sobre substratos microfabricados de silicio o cerámicos. Los ligandos biológicos se pueden inmovilizar así en ordenamientos de analitos múltiples.

Esta invención elimina la necesidad de equipos de reactivos de ensayo individuales múltiples así como la de varios tipos de instrumentos, facilitando con ello la detección simultánea de análisis múltiple sobre una sola muestra. La invención proporciona un analizador integrado único capaz de proporcionar detección simultánea de una amplia gama de substancias químicas. Además, los reactivos de ensayo pueden suministrarse en formato combinado para un panel de analitos particular.

Como parte de esta invención, se inmoviliza una pluralidad de ligandos biológicos en un modelo de puntos o líneas espacialmente definido por micro-dispensación de fluido del ligando sobre un substrato activado químicamente. El ligando biológico se une covalentemente al substrato. La eficacia de copulación del ligando biológico puede ser tal que la reacción química quede completada en unos minutos. El procedimiento de inmovilización puede asegurar que el ligando biológico retenga su actividad biológica tanto en el corto plazo como a largo plazo.

La invención proporciona también un sistema de analizador integrado para la detección simultánea de una amplia gama de analitos en un formato de analito múltiple. El sistema analizador se diseña según la conveniencia del usuario final, con la capacidad de obtener identificación y determinación cuantitativa de los analitos múltiples de cada muestra de ensayo. El sistema de analizador preferido es una combinación de una plataforma de traducción X-Y, una unidad de manejo de la muestra, medios de control del flujo/manejo de líquido, una cámara oscura de temperatura controlada, una cámara de CCD, y programas de procesado de imagen. La plataforma puede ir asociada a un motor de accionamiento gradual para conseguir una precisión en la colocación de, por ejemplo, 10 \mum, por disposición del(de los)

\hbox{dispositivo(s)}

de cada etapa del procedimiento analítico. Descripción de los dibujos

En los dibujos adjuntos:

La Figura 1 muestra la formación de una superficie de substrato no uniforme;

La Figura 2 muestra la activación química de grupos sobre la superficie de un substrato;

Las Figuras 3, 5 y 6 muestran la inmovilización covalente de un ligando en la superficie de un substrato;

La Figura 4 muestra el uso de partículas de látex en la superficie de un substrato;

Las Figuras 7-11 ilustran dispositivos para la incorporación de pastillas que incorporan la invención;

Las Figuras 12-14 son vistas esquemáticas de un sistema adecuado para análisis de un dispositivo de la invención; y

La Figura 15 muestra curvas de calibrado para analitos ensayados por medio de la invención.

Descripción de la invención

El substrato que se emplea en un dispositivo de esta invención puede ser, por ejemplo, de silicio, de cuarzo, vidrio o cerámica. Los substratos cerámicos (óxido de aluminio) proporcionan una excelente alternativa a los substratos de silicio, ya que se pueden emplear con éxito técnicas de detección tanto fluorescentes como quimioluminiscentes. Estos hallazgos son inesperados, ya que la cristalografía de los materiales cerámicos no los haría candidatos inmediatos para seleccionarlos como substratos.

Se puede fabricar un substrato cerámico para proporcionar una gama de tamaños de grano (1 a 30 \mum). El tamaño de partícula preferido del substrato cerámico utilizado en esta invención es de menos de 20 \mum, preferiblemente menos de 10 \mum. El tamaño de partícula reducido imparte una uniformidad de superficie mucho mejor lo que a su vez potencia el comportamiento en los ensayos biológicos. Otras características importantes de los substratos cerámicos incluyen tolerancia de la topografía de la superficie, porosidad, estanqueidad al vacío y absorción cero de agua.

El material cerámico preferido consiste en 94% de alúmina (Al_{2}O_{3}) con un tamaño de partícula en el intervalo de 4-8 \mum El material es estanco al vacío, y tiene una topografía de superficie de 0,6 a 0,8 \mum cuando se tritura. La uniformidad de la superficie puede mejorarse por un proceso de pulimentado para conseguir superficies con una variación de 0,4-0,5 \mum. Se consigue una mayor mejora por bruñido y pulimentado, para obtener una superficie con una variabilidad de 0,05-0,1 \mum.

Se ha encontrado que el comportamiento de ciertos substratos cerámicos depende de las características del tamaño de grano. Se ha encontrado un comportamiento de ensayo superior para materiales cerámicos que tienen un tamaño de grano de hasta 8 \mum, por ejemplo, 4-8 \mum. Los resultados para materiales de mayor tamaño de grano no han resultado satisfactorios. Se evaluaron substratos cerámicos con tamaños de grano de aproximadamente 1 \mum y no dieron mejores resultados que los alcanzados para los substratos de 4-8 \mum. Esto es ventajoso, ya que el coste de material es considerablemente más alto (aproximadamente 5 veces) para los cerámicos de partícula muy pequeña.

Los substratos de silicio adecuados se producen con una película de óxido de un espesor exacto, por ejemplo con una tolerancia de \pm2 nm para una película de óxido de 100 nm. La película de óxido puede ser de un espesor de 50-500 nm, preferiblemente de menos de 200 nm, más preferiblemente del orden de 100 nm.

El substrato puede formar parte del dispositivo micromecanizado, microfabricado, de estado sólido, desarrollado para una amplia gama de ensayos de panel para aplicaciones diagnósticas veterinarias y clínicas. Cada dispositivo de ensayo de estado sólido tiene un ordenamiento de regiones de reacción. Cada región de reacción es específica para un analito individual. La región de reacción puede tener la forma de un punto, canal, hoyo, concavidad, pocillo o cámara. Las regiones de reacción se obtienen por inmovilización de moléculas biológicas sobre el substrato.

Típicamente, un dispositivo de la invención es de un área de hasta 1 cm^{2}. El área de cada lugar de reacción será normalmente inferior a 1 mm^{2}.

El substrato sólido se produce preferiblemente para proporcionar una intrincada red de portillos, cámaras, canales, pocillos, concavidades, etc. Puede ser ventajoso también crear pilares dentro del canal o pocillo. Estas irregularidades pueden ayudar a conseguir interacciones máximas de áreas supericiales entre ligandos unidos biológicamente y reactivos de ensayo, reduciendo en gran medida los tiempos de incubación para inmunoensayos competitivos e inmunoensayos sandwich similares.

Como alternativa o adición a, por ejemplo, concavidades o canales sobre el substrato de silicio o cerámico, se puede también microfabricar la superficie para incorporar de nanolitros a microlitros mezclando cámaras/reservorios/canales. Por ejemplo, la superficie de silicio se oxida primero para formar una capa de óxido. Se deposita entonces una capa de laca fotosensible desde la que se crea el dibujo deseado. Después de la formación del dibujo sobre la capa de óxido, se retira la laca fotosensible. Se graba químicamente entonces el silicio, por ejemplo, utilizando HF, y se retira la película de óxido. Por último la película de óxido se deja crecer uniformemente sobre la pastilla de silicio completa.

En la Figura 1 se muestra un procedimiento ilustrativo. En la etapa (i) se oxida una pastilla de silicio para proporcionar una capa de óxido 2; en la etapa (ii), se deposita una capa de laca fotosensible 3; en la etapa (iii), la aplicación de luz proporciona el dibujo del modelo a la capa de óxido; en la etapa (iv), se retira la laca fotosensible; en la etapa (v), la pastilla 1 se graba químicamente; en la etapa (vi), se retira la película de óxido; y en la etapa (vii), se vuelve a formar una película continua de óxido 2a.

Los ligandos biológicos se inmovilizan por unión covalente. Las interacciones de adsorción pasiva son susceptibles a cambios del pH, temperatura y concentración iónica, y algunas veces dan lugar a liberación de ligandos débilmente unidos durante las etapas de incubación y lavado, contribuyendo así a una mala reproducibilidad del ensayo. Es deseable, naturalmente, que el ligando biológico retenga la máxima actividad, después de proceder a su inmoviliza-
ción.

Antes de cualquier activación química, la superficie de los substratos deberán limpiarse cuidadosamente. La primera etapa comprende preferiblemente la limpieza de la superficie por sonicación en un detergente alcalino, seguido de lavado exhaustivo con agua doblemente desionizada. Los substratos se tratan entonces con una solución de ácido crómico. La solución de ácido crómico limpia la superficie y abre los grupos epóxido de la superficie, como se muestra en la Figura 2. Los grupos epóxido se pueden abrir también por otros medios, por ejemplo sonicación durante 1 hora.

Los grupos hidroxilo de la superficie quedan entonces dispuestos para derivación. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 3, una secuencia de reacciones comprende la utilización de un organosilano, después un reticulador (hetero)bifuncional Z-R-Y, para formar un intermediario altamente reactivo, y finalmente un ligando funcionalizado, para proporcionar una inmovilización covalente.

Más detalladamente, en los organosilanos de la fórmula (RO)_{3}Si-(CH_{2})_{n}-X, cada R es un alquilo u otro grupo hidrocarbilo tal como CH_{3} ó CH_{2}CH_{3}; n es un entero, por ejemplo, 1 a 18; y X es un grupo funcional tal como epoxiciclohexilo, NH_{2}, CHO, OH, SH, p-clorobencilo, m-clorobencilo, Br, Cl, -NH-CH_{2}-CH_{2}-NH_{2}, 2,3-epoxipropoxi, -N=C=O, -N=C=S ó p-clorosulfonilfenilo. Estos organosilanos se pueden elegir de manera que proporcionen un grupo terminal reactivo, capaz de formar un enlace covalente con una molécula biológica, o una fracción menos reactiva tal como NH_{2} donde se necesita más activación con un reticulador bifuncional para proporcionar el grupo final apropiado. Los organosilanos que poseen grupos funcionales electrófilos terminales no requieren activación con un reticulador bifuncional, ya que los ligandos biológicos se pueden inmovilizar covalentemente a través de grupos nucleófilos sobre el ligando biológico.

En el caso de organosilanos que poseen grupos nucleófilos, se puede utilizar cualquiera entre una pluralidad de reticuladores bifuncionales para proporcionar un grupo químico muy reactivo a través del cual se pueda unir covalentemente una molécula biológica o ligando. Esta invención incluye el empleo de reticuladores bifuncionales que pueden utilizarse en la producción en masa de substratos activados químicamente y son suficientemente estables para permitir un almacenamiento a largo plazo antes de la unión covalente de la molécula biológica o ligando de unión. Los reticuladores preferidos son inertes en las condiciones atmosféricas normales al mismo tiempo que son suficientemente reactivos para formar enlaces covalentes con grupos funcionales del ligando biológico que se va a inmovilizar en un período de tiempo muy corto (típicamente < 10 minutos).

El reticulador bifuncional puede ser, por ejemplo, fosgeno, tiofosgeno, carbonato de N,N-disuccinimidilo, xililendiamina, 1,6-diaminohexano, 1,12-diaminododecano, 1,6-diisocianatohexano, 1,12-diisocianatodecano, 1,4-fenilenditioisocianato, cloruro cianúrico, aldehido tereftálico, cloruro de p-nitro-benzoilo, ácido sulfanílico, p-toluensulfonato de 2-fluorometilpiridinio, ácido 3-aminofenilborónico, ácido p-bromofenilborónico, pirocarbonato de dietilo, cloroformiato de etilo, p-bromoanilina, p-bromofenil hidrazida, p-bromobenzaldehido, el 1,2-etilen glicol de p-bromobenzaldehido, N,N'-carbonildiimidazol, cloruro de tereftaloilo, epiclorhidrina, 1,4-diyodobenceno, 1,4-dibromobenceno o un derivado de N-hidroxisuccinamida, por ejemplo de ácido p-aminobenzoico, ácido p-bromobenzoico, ácido p-bromofenilacético, ácido p-bromoetilbenzoico, ácido p-bromometilbenzoico, ácido p-formilbenzoico, ácido p-hidroximetilbenzoico, 1,2-etilen glicol de p-formilbenzoico, ácido p-bromofenilpropiónico ó ácido p-hidroxifenilpropiónico. Se puede utilizar un reticulador foto-lábil para reacción con un organosilano que tiene grupo final nucleófilo o electrófilo. El reticulador es, por ejemplo, la N-hidroxisuccinimida de ácido p-azidobenzoico ó p-aminobenzofenona.

La utilización de reticuladores bifuncionales, como alternativa o adición, es ventajoso también para inmovilizar covalentemente una capa de partículas de látex. El diámetro de partículas de látex es preferiblemente inferior a 500 nm, y más preferiblemente menor que 150 nm. Las partículas de látex pueden tener una serie de grupos funcionales, por ejemplo -CH_{2}Cl, -CHO, p-clorofenilo, p-cloroestirilo, -N=NH, -NH-NH_{2} o -NH_{2}. Las partículas de látex se pueden incubar a una concentración de aproximadamente 0,5 a 1% peso/volumen con substratos modificados con el organosilano apropiado, con o sin la presencia de reticulador bifuncional como se ha descrito antes.

La Figura 4 muestra dos esquemas de reacción para la inmovilización del látex. Uno u otro puede llevarse a cabo por activación del látex con un segundo reticulador, y la inmovilización de una molécula biológica, o inmovilización covalente directa, de, por ejemplo, un anticuerpo.

Una alternativa a la utilización de partículas de látex de poliestireno es la inmovilización covalente de ligandos biológicos a los derivados de polietilen glicol ya anclados sobre un substrato silanatado. Por ejemplo, se hacen reaccionar derivados de PEG con dos grupos electrófilos tales como epoxi o carbonilimidazol con un silano que tiene un grupo terminal -NH_{2}, tal como APTES, sobre el substrato elegido. Una secuencia de reacción adecuada es la mostrada en la Figura 5.

Puede ser ventajoso también inmovilizar covalentemente el ligando biológico directamente a la capa de silano, evitando así la necesidad de activación del silano con materiales poliméricos o reticuladores bifuncionales. Los organosilanos deberán ser receptivos al ataque nucleófilo por un grupo químico (por ejemplo, NH_{2}, SH, OH ó NH-NH_{2}) sobre el ligando biológico. Los organosilanos que son adecuados para unión biológica directa del ligando pueden poseer grupos funcionales haluro, epoxi, isocianato, aldehido o tosilato. Esta reacción se muestra en la Figura 6, donde E es un grupo electrófilo sobre el organosilano. Entre los ejemplos de E están Br, Cl, -O-CH_{2}-CH=CH_{2}, -NCO, -CHO y p-clorosulfonilfenilo.

Los organosilanos que poseen grupos electrófilos, por ejemplo, glicidoxi, tienen la ventaja también de ser menos susceptibles a la polimerización durante el procedimiento de silanación debido a la ausencia de grupos nucleófilos disponibles para atacar la función metoxi o etoxi del organosilano. Por lo tanto, la superficie de substrato no deberá contener organosilano polimerizado.

La química de las superficies proporciona un medio de conseguir resolución espacial en virtud de la cinética rápida de la formación de enlaces covalentes entre el grupo funcional químico de la superficie y un grupo químico adecuado presente en una posición estéricamente favorable sobre la molécula biológica que se va a inmovilizar. La molécula biológica se dispone preferiblemente en la superficie del substrato con un microdispensador de fluido en la forma de gotita individual o serie de gotitas que forman una línea. El volumen dispensado es del orden de 1 a 100 nanolitros, preferiblemente menos de 50 nanolitros, por ejemplo, más cerca de 10 nl. La rapidez de la formación de los enlaces covalentes es tal que la inmovilización covalente se alcanza en minutos, antes de que la gotita o línea de gotitas dispensada se evapore en la superficie. La precisión de la colocación a la que la gotita o línea de líquido se suministra tiene una tolerancia de \pm20 \mum.

Los ligandos se aplican en agua, y la superficie es hidrófoba, para evitar cualquier difusión lateral de la gotita o línea de gotitas dispensadas. Esta propiedad contribuye a excelentes calidad y reproducibilidad de la mancha y permite un mayor número de manchas de moléculas biológicas inmovilizadas por área superficial unidad.

La presente invención resuelve el problema asociado con la fotolitografía convencional al permitir la formación de manchas de ligandos biológicos espacialmente separadas, que no requieren luz UV o enmascaradores físicos. Tal como se ha indicado antes, la resolución espacial se puede alcanzar por técnicas de microdispensación. Un factor importante es la rápida cinética de la reacción de copulación covalente, para asegurar una elevada eficacia de copulación del ligando biológico en una región espacialmente distinta, eliminación de la digresión lateral del ligando biológico inmovilizado.

Las fracciones químicas sin reaccionar en el substrato pueden ser bloqueadas entonces, por ejemplo, utilizando las moléculas bloqueantes conocidas por los especialistas en esta técnica. Estas moléculas adecuadas incluyen proteínas tales como caseína, albúmina de suero bovino, lactalbúmina, etc. o bloqueantes de bajo peso molecular tales como glicina, glutamina, etc.

Se pueden utilizar también reticuladores foto-lábiles. Por ejemplo, el organosilano sobre la superficie del substrato se hace reaccionar en la oscuridad con un reticulador fotolábil (por ejemplo, benzofenona, arilazidas, etc.). La superficie se salpica con los ligandos biológicos como se desee, y se alcanza la unión covalente después de un corto período de irradiación con luz UV o un período más largo con luz visible. Las restantes regiones de la superficie del substrato son bloqueadas, utilizando bloqueantes similares a las moléculas descritas antes, en presencia de luz UV o
visible.

Las moléculas biológicas inmovilizadas en el substrato se pueden estabilizar, por ejemplo, por incubación en una solución de azúcar (por ejemplo trehalosa) durante un corto período de tiempo (1 hora), seguido de secado a 37ºC durante 16 horas. Los substratos estabilizados se pueden encerrar entonces en bolsas de hoja con un desecante y almacenarse. Las moléculas biológicas inmovilizadas son estables durante más de 6 o 12 meses, por ejemplo, hasta más de 2 años cuando se almacenan entre +2 y +8ºC.

Los dispositivos se pueden colocar en una serie de diferentes soportes que incorporan características de control de la eficacia del mezclado de los reactivos de ensayo. El flujo de los reactivos de ensayo líquidos se puede alcanzar por atracción capilar, fuerza centrífuga, fuerza de vacío o flujo electroosmótico. El empleo de flujo electroosmótico puede evitar la necesidad de válvulas para no tener que utilizarse piezas mecánicas móviles

Se pueden formar canales cerrados por unión de una placa de vidrio a la superficie microfabricada. Las moléculas biológicas se inmovilizan covalentemente sobre la superficie antes de la unión a la placa de vidrio. Muchos procedimientos de unión, por ejemplo unión anódica, suponen temperaturas elevadas que pueden destruir una molécula biológica. Por tanto, las técnicas de unión no habrán de ser desnaturalizantes para las moléculas biológicas inmovilizadas. Un método adecuado es el de unión indirecta, por ejemplo aquel en que la pastilla se une a una placa de vidrio con un aglutinante adecuado, por ejemplo cola epoxídica.

Los dispositivos se pueden colocar entonces en un soporte adecuado. Varios de tales soportes se ilustran en las Figuras 7 y 8. Por vía de ejemplo, las dimensiones del dispositivo mostrado en la Figura 8 son de 48,62 mm x 48,62 mm, incluyendo pocillos que tienen un diámetro interno de 10 mm y un diámetro externo de 12,82 mm. El espaciado de centro a centro de los pocillos es de 15,33 mm.

Los dispositivos pueden incorporar características para potenciar el mezclado de los reactivos de ensayo, muestras, etc. Esto queda ilustrado en la Figura 9, donde el dispositivo incluye un lugar de adición de reactivo 11, canales de reactivo 12, y lugares de reacción de ensayo 13.

En la Figura 10, el dispositivo incluye reservorios de reactivo 21, una válvula distribuidora de suministro 22, lugares de ensayo en canales de suministro de reactivo 23, y un reservorio de residuos 24. La Figura 11 muestra una estructura de canal 4 con partes similares.

La invención proporciona un sistema completamente integrado para detección cuantitativa simultánea de analitos de una amplia gama de pesos moleculares, diversidad estructural y polaridad. Se dispone de paneles de analitos apropiados para diagnóstico clínico/veterinario o análisis de selección de drogas.

Los ligandos de unión se eligen los que correspondan dependiendo de los analitos. Esto entra dentro de la pericia y conocimiento de los dedicados a esta técnica. Entre los analitos adecuados se incluyen:

antibióticos, por ejemplo tetraciclinas, sulfonamidas, ionóforos, aminoglicósidos, penicilinas o fluoroquinolonas;

hormonas, por ejemplo, hormona luteinizante (LH), prolactina (PL), hormona estimulante de folículos (FSH) u hormona estimulante de tiroides (TSH);

marcadores de lesión cardiaca, por ejemplo, mioglobina, anhidrasa carbónica, troponina I, glicogeno fosforilasa BB, CK-MB, proteína de unión a ácido graso o troponina T,

marcadores de enfermedad infecciosa;

marcadores de alergia;

drogas;

enzimas;

virus;

nucleótidos; y

péptidos.

Por ejemplo, hay un panel para la detección de antibióticos de sulfonamida. Esta invención proporciona un método para la identificación cuantitativa simultánea de, por ejemplo, hasta 20 sulfonamidas individuales. Otros ejemplos incluyen paneles de enfermedades cardiacas, de fertilidad y de enfermedades infecciosas.

La invención hace posible detectar simultáneamente hasta, por ejemplo, 20 analitos que pueden no tener similitud estructural. Entre las matrices de muestras que pueden ser ensayadas se incluyen suero, plasman orina, bilis, heces, tejido, agua y comida. El volumen de muestra requerido es muy bajo, típicamente <1,5 \mum/analito). Los reactivos de ensayo, por ejemplo anticuerpos marcados con enzima, haptenos marcados con enzima, anticuerpos marcados fluorescentemente o haptenos marcados fluorescentemente, pueden estar contenidos todos en un solo reservorio de reactivos, lo que reduce espectacularmente los requerimientos de manejo de líquido.

En los ensayos en sandwich, por ejemplo, de hormona luteinizante, hormona estimulante de folículos, prolactina, hormona estimulante de tiroides, etc., la muestra se añade junto con un agente tampón de ensayo y se incuba durante un corto período que es, típicamente, inferior a 30 minutos, y preferiblemente menos de 10 minutos. Después de una etapa de lavado, se añade la mezcla de anticuerpos de detección marcados y se incuba durante otro período de tiempo. De nuevo este período es típicamente también inferior a 30 minutos y preferiblemente de menos de 10 minutos. El dispositivo se lava entonces para separar cualquier posible marcador sin unir, y se determina cuantitativamente la señal.

Puede ser ventajoso para ciertos ensayos incorporar medios dentro del dispositivo microfabricado para eliminar substancias de interferencia potenciales tales como la interferencia de factor reumatoide. La eliminación del factor reumatoide se puede conseguir por contacto de la muestra de ensayo con un área de inmunoglobulina inmovilizada, por ejemplo antes de que la muestra de ensayo se ponga en contacto con la región de reacción.

Otro ejemplo de interferencia es HAMA (anticuerpos humanos anti-ratón); estos anticuerpos pueden causar graves problemas en la realización de ensayos que utilizan anticuerpos de ratón monoclonales. La solución tradicional es la de incluir aditivos caros a los reactivos de ensayo para contrarrestar el problema. En esta invención, se tiene la ventaja de eliminar la interferencia de HAMA por contacto de la muestra con regiones del dispositivo microfabricado para eliminar estos anticuerpos, antes de que la muestra alcance la región de reacción.

Más generalmente, se pueden proporcionar ligandos sobre parte del dispositivo, que unen los contaminantes. Esto resulta especialmente valioso cuando se deja una extensión definida de la superficie del dispositivo, por ejemplo, en canales. La capacidad de eliminar los componentes que interfieren potencia la precisión de los resultados generados.

Los marcadores de detección se pueden inmovilizar también sobre la superficie de moléculas dendrímeras. Las moléculas dendrímeras son de naturaleza polímera, sintetizadas por copulación repetida de pequeñas moléculas de construcción. Están comercialmente disponibles de Aldrich Chemicals en un intervalo de pesos moleculares con una selección de grupos funcionales terminales, por ejemplo, NH_{2} o COOH. Se pueden utilizar entonces reticuladores heterobifuncionales en unión de química de copulación convencional para preparar los conjugados de marcadores de detección. Para pequeñas moléculas de haptenos, por ejemplo agonistas \beta, esteroides anabólicos o antibióticos, se prefiere que se copule un pequeño dendrímero (preferiblemente no más de 16 grupos en la superficie) a un gran dendrímero (típicamente más de 64 grupos en la superficie). El hapteno de pequeño peso molecular (menos de 1.000 dalton) se copula con los grupos químicos sobre el pequeño dendrímero seguido de unión covalente del marcador de detección. El conjugado de dendrímero puede purificarse por diálisis y cromatografía de permeación de gel.

Los reactivos de ensayo contienen múltiples componentes (por ejemplo anticuerpos marcados con enzima, anticuerpos marcados con substancia fluorescente, anticuerpos inmovilizados con látex, conjugados de anticuerpo dendrímero-fluoróforo, conjugados de anticuerpo dendrímero-enzima, haptenos marcados con enzima, haptenos marcados con substancia fluorescente, etc.) son apropiados para paneles particulares de ensayo. Los paneles de ensayo posibles son muy diversos y se pueden elegir sobre la base de diagnóstico clínico (o diagnóstico veterinario) como apropiados. Por ejemplo, un panel deseable es el que sirve para detección de enfermedades infecciosas (por ejemplo, hepatitis, VIH, sífilis, etc.). Otros paneles incluyen hormonas de la fertilidad, marcadores cardiacos, proteínas de alergia, etc. Lo mismo que ocurre con los parámetros clínicos, se pueden detectar también grandes paneles de residuos de drogas.

La presente invención permite la identificación de compuestos individuales tales como antibióticos. Por ejemplo, se puede obtener un resultado cuantitativo hasta para 20 antibióticos sobre un dispositivo de área superficial de 1 cm^{2} de manera simultánea, en un orden de tiempo de minutos, típicamente, con una sensibilidad superior a la de los métodos de HPLC/GCMS y comparable a la de inmunoensayos convencionales de enzima de un solo parámetro. Este método se puede extender fácilmente a esteroides anabólicos, beta-agonistas, beta-bloqueantes, pesticidas, drogas terapéuticas, etc.

Para el análisis puede ser adecuada la quimioluminiscencia, bioluminiscencia o fluorescencia. El sistema de detección es, preferiblemente, una cámara de dispositivo conectado a la carga (CCD) equipado para medir tanto la luz fluorescente como la quimioluminiscente. En pocas palabras, la cámara de CCD recoge la señal luminosa generada por las áreas de ensayo sobre el dispositivo microfabricado y la convierte en unidades luminosas relativas (RLUs).

Los sistemas de detección basados en la fluorescencia se pueden leer directamente, utilizando filtros ópticos apropiados para el fluoróforo de marcado

Un reactivo quimioluminiscente adecuado es el luminol, que se puede analizar a una longitud de onda de 433-445 nm. La quimioluminiscencia se puede observar también basándose en la detección de moléculas biológicas marcadas con fosfatasa alcalina de detección empleando 1,2-dioxietano.

Para facilitar la detección de analitos, esta invención utiliza preferiblemente un sistema de detección quimioluminiscente utilizando una cámara de CCD. Se prefiere una cámara iluminada por detrás, para mejorar la eficacia de la captura a la longitud de onda de la luz generada por la reacción luminosa quimioluminiscente (aproximadamente 433-445 nm en el caso de luminol).

El sistema completo se puede accionar por un ordenador personal donde un programa específicamente diseñado controla la tabla X-Y, unidad dispensadora, manejo de la muestra, control de temperatura, tiempos de incubación y cámara de CCD. Las Figuras 12-14 muestran la organización de tal sistema.

La Figura 12 ilustra esquemáticamente la interacción de un ordenador personal (PC) que tiene dos unidades de control 31, 32. La unidad 31 está en comunicación con un sistema de formación de imagen de CCD representado en 33. La unidad 32 está en comunicación con una unidad dispensadora y una tabla de traducción X-Y con la bandeja de la muestra representada por 34 y 35, respectivamente.

La Figura 13 es una representación sistemática de la tabla de traducción X-Y. Esta figura muestra una plataforma de muestra 41 montada sobre un actuador lineal 42. La traducción X-Y está bajo el control de motores de velocidad gradual, 43, 44, conectados a los respectivos accionadores 45, 46. La traducción está limitada por sensores de "posición de reposo" 47, 48.

La sensibilidad de las moléculas biológicas marcadas y ciertas moléculas sin marcar a la luz puede hacer necesario realizar los ensayos en ausencia de luz. La ausencia de luz se consigue por construcción de la caja de manera estanca a la luz. El entorno estanco a la luz tiene también preferiblemente temperatura controlada, por ejemplo dentro de \pm0,2ºC ó preferiblemente dentro de \pm0,1ºC, para asegurar una precisión y exactitud del ensayo satisfactorias.

La Figura 14 muestra el aparato en vistas en perspectiva, plano de parte y vistas de lados en sección. En particular, la Figura 14A muestra el depósito de almacenamiento de reactivo 51, una puerta hermética a la luz 52 y un cuerpo de cámara 53 con cubierta móvil 54. La pieza mayor de la cámara puede ser externa al alojamiento. La lente de la cámara está colocada en una abertura del alojamiento.

La Figura 14B presenta las muestras, en la configuración, en una bandeja de muestras 55 y, en la configuración, el área de residuos 56 y el área de formación de imagen 57. La cámara 53 está situada sobre estas áreas. La Figura 14C muestra, además del depósito 51, la cámara 53, la tabla X-Y 41 y el motor de velocidad gradual 43, una bomba dispensadora 58.

El diseño del sistema mostrado en la Figura 14 se basa en soportes de cremallera para muestras 3x3 de las que se pueden mantener 20 al mismo tiempo. Esto significa que, si se colocan 20 regiones de reacción individuales sobre cada 1 cm^{2} de dispositivo micromanufacturado, se puede realizar un total de 3600 análisis simultáneamente en una sola muestra. Alternativamente, se pueden analizar 180 muestras simultáneamente para 20 parámetros de ensayo diferen-
tes.

Como se ha indicado antes, el analito se puede marcar. También se puede marcar el ligando, permitiendo un análisis por ocupación fraccionaria.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1 Ensayo de sulfonamida

En este ejemplo, se inmovilizaron por unión covalente 12 anticuerpos individuales, cada uno de ellos específico para una sulfonamida individual, por interacciones de contacto sobre regiones discretas de un substrato cerámico (óxido de aluminio) plano que tiene una superficie modificada químicamente. Se realizó un ensayo de analito múltiple, utilizando un formato de inmunoensayo competitivo.

Mas detalladamente: se limpiaron por ultrasonidos substratos cerámicos (1 cm x 1 cm) empleando un detergente alcalino (RBS35, 5% volumen/volumen) seguido de agua doblemente desionizada y se colocaron después en HCl 6 M durante 16 horas. Se colocaron entonces las pastillas en ácido crómico durante 1 hora en un baño ultrasónico.

Se lavaron exhaustivamente los substratos con agua doblemente desionizada y acetona y luego se secaron en estufa a 120ºC durante 2 horas. Después de este pre-tratamiento, los substratos se trataron con silano utilizando un órgano silano \gamma-glicidoxipropil trimetoxisilano (10% v/v) en tolueno anhidro, 4-dimetilaminopiridina (1,25 g/l) y trietilamina (1% v/v). Esta mezcla se refluyó durante 4 horas y después se dejó durante toda la noche a temperatura ambiente. Los substratos se lavaron con tolueno y acetona antes de curarse durante 4 horas a 120ºC.

Después de la etapa de curado, se colocaron los substratos en recipientes y se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se necesitaron para el análisis a la mancha de anticuerpos de sulfonamida. Los anticuerpos de sulfonamida se mancharon mediante un dispensador BIODOT XY3000. Las 12 sulfonamidas ensayadas fueron sulfadoxina, sulfametizol, sulfacloropiridazina, sulfametoxipiridazina, sulfamerazina, sulfapiridina, sulfisoxazol, sulfatiazol, sulfametazina, sulfaquinoxalina, sulfadimetoxina y sulfadiazina.

Para cada anticuerpo de sulfonamida se dispensaron volúmenes de aproximadamente 20 nl. Los 12 anticuerpos de sulfonamida que formaban 12 áreas discretas sobre el substrato de 1 cm^{2} se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Los substratos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,2) que contenía 2% de caseína (peso/volumen) y después se bloquearon en el mismo agente tampón a +2-8ºC. Después de lavar con PBS que contenía PEG300 (0,05% volumen/volumen), se colocaron los dispositivos en un soporte.

Se añadieron patrones de sulfonamidas múltiples (200 \mul) y una mezcla de conjugados de peroxidasa de rábano picante (100 \mu) al dispositivo adecuado que tenía los pocillos de reacción y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los patrones contenían 5, 10, 50 y 100 ng/ml para cada una de las 12 sulfonamidas.

Después se lavaron los dispositivos de sulfonamidas múltiples con tampón PBS/PEG para eliminar el exceso de reactivos y se introdujeron 300 \mul de substrato quimioluminiscente (luminol (1,4 mM)/urea peróxido de hidrógeno (9,6 mM) por cada dispositivo. Se formaron imágenes en los dispositivos empleando una cámara de CCD con un tiempo de exposición de hasta 4 minutos. Se obtuvieron curvas patrón para cada una de las 12 sulfoanmidas individuales. Las curvas de calibrado para cada una de las 12 sulfonamidas individuales están representadas gráficamente en la Figura 15. El valor del tanto por ciento de B/B_{0} llevado al eje X representa el porcentaje del valor de RLU (unidad luminosa relativa) del patrón cero causado por cada patrón de sulfonamida individual (llevado sobre el eje de las Y como log_{10})

Ejemplo 2 Ensayo de hormonas

En este ejemplo, se llevó a cabo un ensayo de analito múltiple para 3 hormonas de elevado peso molecular, es decir, prolactina (PL), hormona estimulante de folículos (FSH) y hormona luteinizante (LH). Este ejemplo represente un ensayo de analito múltiple para un inmunoensayo en sandwich. No se observó reactividad cruzada significativa cuando se determinaron las tres hormonas en el mismo panel.

Los procedimientos de pretratamiento químico y silanación fueron exactamente como los descritos en el Ejemplo 1. Se inmovilizaron anticuerpos monoclonales de PL, FHS o LH individuales (se dispensaron aproximadamente 20 nl de anticuerpo) sobre áreas discretas del substrato modificado químicamente. Los ensayos del analito múltiple se realizaron sobre substratos de silicio y sobre substratos cerámicos con una superficie de epóxido como se ha descrito en el Ejemplo 1.

En el ensayo, se añadieron al dispositivo 150 \mul de un patrón múltiple LH/PL/FSH sobre base de suero y 150 \mul de un agente tampón de ensayo diluyente y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de una etapa de lavado, se añadieron 300 \mul de una mezcla de conjugados simples de LH-HRPO/PL-HRPO/FSH-HRPO y se incubó durante 15 minutos. Después se lavaron los dispositivos para separar el exceso de reactivos y se introdujo el reactivo quimioluminiscente (luminol (1,4 mM)/urea peróxido de hidrógeno (9,5 mM). Se formaron imágenes en los dispositivos utilizando cámara de CCD con un tiempo de exposición de hasta 4 minutos. Las curvas patrón de las hormonas se llevaron a un diagrama después de procesadas las imágenes.

Ejemplo 3 Ensayo de sulfonamidas

A diferencia del Ejemplo 1, se realizó un ensayo de sulfonamidas múltiples utilizando microcanales. El dispositivo se ilustra en la Figura 11. En este Ejemplo, los reservorios de adición de reactivos, 21, son de 2 mm x 2mm, y 300 \mum de profundidad (vol. 1,2 \mul), los canales 23 son cada uno de 5 mm de largo, 200 \mum de ancho y 100 \mum de profundidad (volumen 100 nl), y el reservorio 24 es de 1,9 mm x 8,6 mm y 300 \mum de profundidad (vol. 4,9 \mul).

La modificación química de la superficie se realizó como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se añadió el anticuerpo a cada uno de los canales y se incubó durante 2 horas a 37ºC. Se bloquearon entonces los substratos y se lavó como en el Ejemplo 1.

Se mezclaron un patrón de sulfonamidas múltiples (200 ml) y conjugados de peroxidasa de rábano picante-sulfonamida (100 \mul). Se tomó con la pipeta 1 \mul del reactivo resultante y se pasó a cada uno de los reservorios que suministraban cada sulfonamida al canal recubierto de anticuerpo. Los patrones contenían 10 o 100 ng/ml de todas las sulfonamidas como apropiados.

El reactivo fluía por acción capilar. Después de incubación durante 2 minutos, el substrato se lavó 5 veces con PBS/PEG y se añadió reactivo quimioluminiscente (luminol (1,4 mM)/urea peróxido de hidrógeno (9,6 mM).

Se formó la imagen en los dispositivos utilizando cámara de CCD con un tiempo de exposición de hasta 4 minutos. Los valores del porcentaje de B/B_{0} para las cuatro curvas de sulfonamida se dan en la Tabla 1.

TABLA 1

1

Se demostró la utilidad de esta invención en comparación con la fotolitografía por el grado de adsorción no específica de moléculas biológicas sobre un substrato foto-lábil (tratado con benzofenona). Los resultados se muestran en la tabla 2.

TABLA 2

2

Se detectó IgG de ratón utilizando conjugado HRPO anti-ratón empleando detección quimioluminiscente con cámara de CCD. Los substratos de silicio o cerámico que tenían inmovilizado el reticulador foto-lábil benzofenona inmovilizada no se unirán a la IgG de ratón cuando la reacción es en ausencia de luz. Sin embargo, tiene lugar una unión no-específica ya que aproximadamente el 80% de las RLU de promedio de gris alcanzado cuando se realiza la unión de IgG de ratón bajo luz UV es debido a interacciones de unión pasivas. Un ordenamiento de moléculas biológicas inmovilizadas a través de interacciones covalentes según esta invención queda demostrablemente más
nítido.

La evidencia de unión covalente se da en los ejemplos que se discuten después. En el primer caso, se silanataron los substratos cerámicos con APTES y se hicieron reaccionar con biotina-LC-sulfo NHS. El substrato cerámico de control no se silanató con APTES; por tanto no quedaron disponibles grupos NH_{2} nucleófilos terminales para reaccionar con el éster succinimidílico del derivado de biotina. Los substratos se hicieron reaccionar entonces con un conjugado de avidina-FITC y se determinó la fluorescencia con la cámara de CCD. Los resultados se dan en la
Tabla 3.

TABLA 3

3

{}\hskip0.5cm NS = no se detectó señal fluorescente

Esto demuestra claramente la inmovilización específica de biotina-LC-NHS. La concentración máxima de biotina-LC-NHS inmovilizada era de aproximadamente 100 \mug/ml, ya que no aumentaba el resultado de las RLU para el substrato de 500 \mug/ml.

En otro ejemplo, substratos cerámicos tratados silanados con APTES, se hicieron reaccionar con un reticulador de dihidrazida. Los anticuerpos de sulfonamida se trataron con peryodato de sodio para hacerlos reactivos al reticulador de hidrazida. Los anticuerpos de sulfonamida de control se dializaron simplemente frente a agente tampón acetato de sodio de pH 5,5. Los resultados de RLU se muestran en las Tablas 4 (no tratados) y 5 (tratados por el método de peryodato). Los resultados muestran claramente que el reticulador hidrazida se había unido con éxito a la superficie cerámica. Los anticuerpos de control (sin activación con peryodato)) dieron curvas patrón muy pobres cuando se compararon con los anticuerpos de sulfonamida inmovilizados covalentemente.

El porcentaje de unión debido a las interacciones covalente o pasiva se compara en la 6. Los valores de RLU para los patrones de cero y de 10 ng/ml se dan en la Tabla 7. La interacción covalente contribuía en una media de 81,8% a la unión global, lo que indicaba claramente la unión covalente de los anticuerpos de sulfonamida.

TABLA 4

4

TABLA 5

5

TABLA 6

6

TABLA 7

7

	Inmovilización covalente:	Manchas directas sobre superficie de glicidoxi silano
	Inmovilización pasiva:	Manchas sobre la superficie que ha reaccionado con diclorodimetilsilano

Queda claro que el método covalente da resultados superiores a los del método pasivo. Los resultados para el método pasivo se puede incrementar en aproximadamente 2 veces por pre-tratamiento con ácido de los anticuerpos de sulfonamida, pero esto es aún inferior al método covalente.

Se llevaron también a cabo análisis confirmatorios sobre substratos cerámicos y de silicio modificados químicamente utilizando espectroscopia de rayos X de fotón (XPS). Se registró la serie de espectros desde dos áreas al azar de cada muestra de substrato, de las que se determinaron las composiciones químicas de sus superficies. Véase Tabla 8 en cuanto a resultados (dados en porcentaje de átomos).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 8

8

Los resultados de la composición en átomos muestran muy buena conversión de los substratos de silicio y cerámicos originales con organosilano APTES, con buena reproducibilidad en la composición de la superficie indicada para las dos áreas ensayadas en cada muestra. Los substratos marcados con FITC mostraban un marcado del 70% y 77% de silicio y cerámico, respectivamente.

Los métodos cuantitativos de medida de la fluorescencia sobre un substrato de silicio oscuro se compararon con los realizados sobre un substrato cerámico blanco (óxido de aluminio). Los resultados de RLU de la detección con dispositivo CCD para moléculas fluorescentes (FITC) unidas covalentemente a cada substrato se compararon con el método cuantitativo después de que las moléculas con FITC fueran despojadas por el método de Hook y col. (Langmuir 1991, Vol. 7, 142-151).

TABLA 9

9

El análisis cuantitativo del marcador fluorescente obtenido por despojado del substrato del marcador FITC y midiendo la señal con la cámara de CCD (Tabla 9) muestra que, a pesar de un aumento de 1000 veces de la señal del cerámico sobre el silicio, hay significativamente más moléculas de FITC presentes sobre el substrato de silicio.

Otro ejemplo de este fenómeno se muestra por los resultados que se recogen en la Tabla 10, de un ensayo de prolactina realizado sobre substratos de silicio y cerámico utilizando partículas de látex fluorescente unido a un anticuerpo de detección de prolactina como sistema de detección. Se dan los valores de RLU (exposición de 20 segundos).

TABLA 10

10

El comportamiento del cerámico proporcionaba resultados superiores al silicio utilizando este método de detección fluorescente. Los problemas del efecto de cuerpo oscuro sobre el silicio utilizando fluorescencia se pueden resolver, además, por empleo de quimioluminiscencia como método de detección. En una comparación entre ensayos idénticos para FSH llevados a cabo sobre silicio y cerámico, empleando detección por quimioluminiscencia, el primero requería un tiempo de exposición doble que el del cerámico para alcanzar el mismo valor de RLU.

En esta memoria descriptiva, se aplican las siguientes abreviaturas

APTES	=	aminopropiltrietoxisilano
CK-MB	=	sub-unidad MB de quinasa creativa
HRPO	=	peroxidasa de rábano picante
LC-sulfo-NHS	=	sulfo-N-hidroxisuccinimida de cadena larga
FITC	=	isotiocarbamato de fluoresceína

Claims

1. Un método para la producción de un dispositivo de estado sólido para realizar ensayos de analito múltiple, que comprende un substrato y una multiplicidad de lugares de reacción discretos llevando cada uno un ligando unido covalentemente al substrato, donde la superficie del substrato entre los lugares de reacción es inerte con respecto al analito, comprendiendo el método las etapas de:

: activar y volver hidrófoba la citada superficie; y

: aplicar a la superficie hidrófoba activada una serie de ligandos, para formar

: los lugares de reacción discretos, donde los ligandos se aplican en agua.

2. Un método según la reivindicación 1, donde la superficie del substrato no es uniforme, por lo que se puede obtener una señal potenciada por la interacción ligando-analito.

3. Un método según la reivindicación 2, donde la superficie del substrato comprende una serie de canales de reacción, pliegues, pilares, manchas, cámaras, hoyos, pocillos o concavidades.

4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el substrato es cerámico o de cuarzo o silicio.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el dispositivo tiene un área de menos de 1 cm^{2}.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el área de cada lugar de reacción es inferior a 1 mm^{2}.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además el bloqueo de la superficie activada, entre los lugares de reacción.

8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la aplicación de los ligandos comprende una etapa inicial de contacto de la superficie activada con un organosilano.

9. Un método según la reivindicación 8, donde el organosilano tiene la fórmula (RO)_{3}-Si-(CH_{2})_{n}-X, donde cada R es un grupo hidrocarbilo, n es un entero, y X es un grupo funcional.

10. Un método según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, que incluye la utilización de un reticulador bifuncional para facilitar la unión covalente de ligandos biológicos al organosilano.

11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10. donde se utiliza un reticulador foto-lábil para reaccionar con el organosilano que tiene grupo terminal nucleófilo o electrófilo.

12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que incluye derivación de la superficie con macromoléculas tales como partículas de látex de poliestireno, dendrímeros o grupos químicos que contienen polietilen glicol que facilitan la unión covalente de los ligandos.

13. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente la aplicación de ligandos que unen materiales cuya presencia interfiere el ensayo de un analito.