HRP980215A2 - Device and apparatus for the simultaneous detection of multiple analytes - Google Patents

Description

Oblast izuma

Ovaj izum odnosi se na element i uređaj za istovremenu detekciju višestrukih analiza.

Stanje tehnike izuma

Tradicionalno, strukturno različite analize vršene su pomoću specifičnih postupaka, npr. imunološki pokus enzima, tekuća kromatografija visoke performanse, plinska kromatografija, enzimski postupci i kolorimetrijski postupci. Ovi su postupci uglavnom postupci jedne analize, tj. jednog testa.

Automatizacija analitičkih postupaka općenito je usmjerena na analizatore masovnog i slučajnog pristupa, gdje se izvršava više analiza sa pojedinačnim test uzorcima korištenjem sekvencijalnih pojedinačnih postupaka testiranja. Ovo zahtjeva primjenu više pakiranja pojedinačnih alata za testiranje. Nadalje, analiza zahtjeva korištenje više tipova opreme, npr. kliničkih kemijskih analizatora, HPLC, GCMS, instrumenata automatiziranog imunološkog pokusa ili atomskih apsorpcijskih elemenata.

Sustav za višestruke analize treba uključiti sredstvo za omogućavanje istovremenih analiza pojedinih analiza u test uzorku. Ova analiza treba osigurati rezultate koji identificiraju pojedinačne analize i koji omogućavaju kvantizaciju svake pojedinačne analize u tom test uzorku. Postupak višestruke analize zahtjeva se vrlo često, međutim dati kriteriji općenito se vrlo teško mogu zadovoljiti.

Kod sustava za višestruke analize, tipičan supstrat sadrži više pojedinačnih reakcijskih test mjesta od kojih svako posjeduje različiti vezivni ligand. Test uzorak kontaktira svaku od reakcijskih zona, pa se zato opseg tehnika detekcije primjenjuje za identifikaciju prisutne analize. Važno je da korišteni postupak detekcije omogući kvantizaciju svake pojedinačne analize.

Za proizvodnju višestruko analitičnih nizova prostorno različitih područja biološki aktivnih liganada na supstratu, najčešće se koristi pristup koji se realizira preko fotolitografskih tehnika. Suspstrat je presvučen sa fotolabilnim vezivom. U teoriji, ovo vezivo treba postati reaktivno prema vezivnom ligandu praćenjem zračenja sa svjetlošću prikladne valne dužine. Prostorna rezolucija postiže se postavljanjem fizičke maske (normalno proizvedene od kroma). Uzorak otvora u maski određuje uzorak vezivanja oblasti na supstratu.

Za svaki biološki ligand koji se treba imobilizirati, opći protokol je: zračenje prvih mjesta, inkubacija ozračenog supstrata sa prvim ligandom koji se treba imobilizirati, ispiranje radi uklanjanja labavo vezanog liganda, blokiranje nereagiranih mjesta aktiviranih sa fazom zračenja, i zračenje oblasti gdje se drugi biološki ligand treba imobilizirati sa slijedećim ponovljenim fazama kao za prvi ligand. Prostorna rezolucija diktirana je sa kontroliranjem mjesta zračenja, ili sa kontroliranjem mjesta zračenja pomoću koherentnog UV izvora svjetlosti iz lasera, ili pomoću više fizičkih maski i nekoherentnog izvora svjetlosti. Ovo čini da je zadatak imobilizacije više bioloških liganada proces koji troši vrijeme. Drugi nedostatak fotolitografskog pristupa je potreba za skupim fizičkim maskama ili laserskim izvorom svjetlosti. Nadalje, tu je visok stupanj nespecifičnog vezivanja.

Na primjer, primjena arilazida, fluoro-arilazida i benzofenona združena je sa visokom stupnjem nespecifičnog vezivanja. Visoko nespecifično vezivanje rezultira u pokusu sa visokom donjom granicom mjerljivosti, što značajno reducira dinamički opseg svakog višestruko analitičkog opsega. Nespecifično vezivanje je veliko zbog pasivne apsorpcije molekula na površini neaktiviranog fotolabilnog veziva preko ionskih interakcija, Van der Waals-ova sila, itd.

WO-A-9516204 opisuje fotolitografski postupak za reduciranje problema združenih sa visokim nespecifičnim vezivanjem. U ovom postupku, molekula površinskog vezivanja bio je avidin, a fotolabilnia molekula bio je fotobiotin ili njegov derivat. Kako se zahtjeva reducirano nespecifično vezivanje, ova tehnika još zahtjeva sekvence trošenja vremena, kao što je opisano gore. Imobilizacija mnoštva od 20 izdvojenih bioloških loganada moglo bi zahtijevati ukupno 80 faza, podrazumijevajući osnovni zahtjev faza zračenja, vezivanja, blokiranja i ispiranja za svaki izdvojeni ligand koji se treba imobilizirati.

Prostorna rezolucija također je postignuta sa pasivnom apsorpcijom. Na primjer, USA-5432099 opisuje vezivanje liganda na površinu supstrata preko kombinacije ionskih interakcija, hidrofobnih interakcija i Van de Waals-ovih sila. Postupci pasivne apsorpcije zavisni su od promjena u pH, temperaturi, ionskoj jačini i tipa korištenog supstrata, što kontrolu procesa vezivanja čini težom. Glavni nedostatak sa ovim postupkom je osjetljivost dijela slabo imobiliziranog liganda koji se treba desorbirati za vrijeme faze ispiranja ili faze inkubacije biološkog pokusa, što rezultira u lošoj preciznosti intra ili inter pokusa.

Unakrsno vezivo korišteno u mnogim publikacijama je glutaraldehid. Ovo vezivo ima mnoge nedostatke, uključujući tendenciju proteina za unakrsno vezivanje, što je najvjerojatnije mijenja funkciju proteina. Daljnji nedostatak je taj da postupak sprezanja treba uključiti fazu redukcije koja troši vrijeme i potencijalno je vrlo opasna, npr. ako se kao redukcijsko sredstvo koristi natrij cianoborohidrid. Korišteni su heterobifunkcionalna veziva ali u mnogim slučajevima ona uključuju potrebu za slobodnim sulfidril grupama u proteinu koji se treba vezati. Ovo zahtjeva modifikaciju proteina prije imobilizacije.

Za pokus višestruke analize, poželjno je da se osiguraju i kvalitativni i kvantitativni rezultati. Pokusi višestrikih analiza bili su raspoloživi za, na primjer antibiotike. Ovi su široko bazirani na pokusima mikrobialne inhibicije, gdje antibiotik prisutan u uzorku inhibira bakterijski rast i formira zonu čišćenja koja je proporcionalna koncentraciji antibiotika prisutnog u uzorku. Međutim, ovaj postupak ne može osigurati bilo kakvu indikaciju kako da se identificira antibiotik, ili da se točno odredi njegova koncentracija. Isto tako, postupci mikrobialne inhibicije vrlo su spori, tj. kompletan proces traje nekoliko dana.

Postupci kemijskog ekraniziranja takvi kao što je tekuća kromatografija visoke performanse (HPLC) ili kromatografija masene spektrometrije plin/tekućina (GCMS/LCMS) teže da prilagodbu ekstremne strukturna raznovrsnost/polarnost svake grupe antibiotika, npr. penicilina, sulfonamida, aminoglikozida, tetraciklina, itd. Dalje, kromatografski postupci zahtijevaju ekstenzivno dobivanje uzorka, da bi odnosi signal/šum bili takvi da se mogu postići granice zahtjevane detekcije.

Raspoloživi uređaji za višestruke analize uključuju Triage (vidjeti: "Clinical Chemistry", 38(9), 1678-1684, (1992.)) i Advisor (vidjeti: "Clinical Chemistry" 39(9):1899-1903, (1993.)). Ovi uređaji prikladni su samo za kvalitativnu analizu.

Triage uređaj koristi se za istovremenu detekciju panela od sedam upotrijebljenih lijekova iz ljudskog urina. Svaki uređaj sposoban je analizirati samo jedan uzorak urina. Na kraju postupka operator vizualno ispituje svaku od test zona specifičnog lijeka na prisustvo crvene trake. Sve faze protokola pokusa operator mora izvršiti ručno. Također nema čvrste kopije raspoloživog test rezultata.

Advisor uređaj sličan je u svojoj primjeni sa Triage uređajem. Advisor uređaj pokazuje pet različitih klasa upotrijebljenih lijekova. Uređaj radi korištenjem principa pokusa sastavljanja, sa pojedinačnim kanalima za svaki lijek. Sve faze protokola pokusa izvršava operator. Negativni uzorci imaju sastavljene čestice, dok pozitivni uzorci lijeka osiguravaju uzorak nesastavljenih čestica.

Većina biosenzori/mikro-proizvedenih uređaja za biološku primjenu koristili su silicij kao supstrat. Drugi koriste supstrate od stakla ili kvarca. Silicij ima vrlo kontroliranu kristalografsku strukturu sa dobro definiranim kristalnim ravninama. Uniformnost supstrata silicija čini ga idealnim izborom za razvoj test uređaja za višestruku analizu.

Međutim tamni supstrati, takvi kao što je silicij, daju tzv. efekte crnog tijela. U slučaju detekcije sa fluoroescencijom, u kojoj se fluorofor eksitira korištenjem svjetlosti određene valne dužine, tamni supstrat može apsorbirati energiju svjetlosti incidentne eksitacije, čime se smanjuje emisija svjetlosti od fluorofora.

Kratki pregled izuma

Prema ovom izumu, element za izvršavanje višestruko analitičkih pokusa sadrži supstrat i mnoštvo diskretnih reakcijskih mjesta, od kojih svako nosi ligand kovalentno vezan na supstrat, i u kojemu je površina supstrata između reakcijskih mjesta inertna u odnosu na analizu. Ovaj izum tako osigurava poluvodički element za višestruku analizu koji pokazuje vrlo malo, ili uopće nema nespecifično vezivanje.

Element iz ovog izuma može se dobiti aktiviranjem površine prikladnog supstrata, primjenjivanjem niza liganada na diskretna mjesta na površini. Ako se želi, mogu se blokirati druga aktivna mjesta. Ligandi se mogu primijeniti u vodenom sistemu, a to je i poželjno ako se druga područja vraćaju hidrofobno. Ligandi se mogu vezati na supstrat preko veziva. Posebno je poželjno da aktivna površina reagira sukcesivno sa organosilanom, bifunkcionalnim vezivom i ligandom.

Kao dio ovog izuma, bifunkcionalna unakrsna veziva koriste se za osiguravanje vrlo efikasnog sprezanje kemikalija između organosilana kovalentno imobiliziranih na mikro-proizvedeni silicij ili keramičke supstrate. Biološki ligandi mogu se tako imobilizirati u višestruko analitičkim nizovima.

Ovaj izum uklanja potrebu za više pojedinačnih test reagens alata, a time i više pojedinih tipova instrumenata, čime se olakšava istovremena detekcija više analiza na jednom uzorku. Izum osigurava jedan integrirani analizator sposoban da omogući istovremenu detekciju širokog opsega kemikalija. Dalje, test reagensi mogu se snabdijevati u kombiniranom formatu za određeni panel analiza.

Kao dio izuma, mnoštvo bioloških liganada imobilizira se na uzorak prostorno definiranih točaka ili linija pomoću mikrofluidnog raspršivanja liganda na kemijski aktivnom supstratu.

Biološki aktivni ligand kovalentno je vezan na supstrat. Efikasnost sprezanja biološkog liganda može biti takva da je kemijska reakcija završena unutar nekoliko minuta. Postupak imobilizacije može osigurati da biološki ligand zadržava svoju biološku aktivnost, i u kratkom terminu i u dugom terminu.

Ovaj izum također osigurava integrirani sustav analizatora za istovremenu detekciju širokog opsega analiza u višestruko analitičkom formatu. Sustav analizatora projektiran je za maksimalnu pogodnost krajnjeg korisnika, sa sposobnošću dobivanja višestruke analitičke identifikacije i kvantizacije od svakog test uzorka. Poželjni sustav analizatora je kombinacija X-Y translacijske platforme, jedinice za upravljanje uzorkom, kontrolnog sredstva upravljanje tekućine/toka, temperaturno kontrolirane tamne kutije, CCD kamere, i softvera za obradu slike. Platforma se može združiti sa koračnim motorom, radi postizanja pozicionirane točnosti od, recimo 10 µm, za element(e) pozicioniranja u svakoj fazi analitičkog postupka.

Opis crteža

U slijedećim crtežima:

- Slika 1 pokazuje formiranje površine neuniformnog supstrata;

- Slika 2 pokazuje kemijsko aktiviranje grupa na površini supstrata;

- Slike 3, 5 i 6 pokazuju kovalentnu imobilizaciju liganda na površini supstrata;

- Slika 4 pokazuje primjenu čestica lateksa na površini supstrata;

- Slike 7-11 ilustriraju elemente za sjedinjavanje spojnih čipova izuma;

- Slike 12-14 su shematski pregledi sustava prikladnog za analizu elementa iz izuma; i

- Slika 15 pokazuje kalibracijske krivulje za analize izvedene pomoću izuma.

Opis izuma

Suspstrat koji se koristi u elementu ovog izuma može biti, na primjer, od silicija, kvarca, stakla ili keramike. Keramički supstrati (aluminij oksid) osiguravaju odličnu alternativu supstratima od silicija, budući da se obje tehnike detekcije, fluorescentna i hemiluminescentna, mogu uspješno koristiti. Ova saznanja bila su neočekivana, jer kristalografija keramičkih materijala ne bi ih mogla napraviti neposrednim izvorom supstrata.

Keramički supstrat može se proizvesti tako da se osigura opseg veličine zrna od 1 µm do 30 µm. Poželjna veličina čestica korištenog keramičkog supstrata u ovom izumu manja je od 20 µm, poželjno manja od 10 µm. Reducirana veličina čestica daje mnogo bolju uniformnost površine koja dalje osigurava poboljšane performanse u biološkim pokusima. Druge važne karakteristike keramičkih supstrata uključuju toleranciju topografije površine, poroznost, vakuumsku gustoću i nultu apsorpciju vode.

Poželjni keramički materijal sadrži 94 % aluminij oksida (Al2O3) sa veličinom čestica u opsegu od 4-8 µm. Materijal je vakuumski gust, i kada je samljeven ima topografiju površine od 0,6 do 0,8 µm. Uniformnost površine može se poboljšati sa procesom poliranja, radi dobivanja površine sa varijacijom od 0,4-0,5 µm. Daljnje poboljšanje postiže se sa brušenjem i poliranjem, radi dobivanja površine sa varijacijom od 0,05-0,1 µm.

Nađeno je da su performanse nekih keramičkih supstrata zavisne od karakteristika veličine zrna. Superiornije performanse pokusa nađene su za keramičke materijale koji imaju veličinu zrna do 8 µm, tj. 4-8 µm. Nađeno je da rezultati za materijale većih veličina zrna nisu tako zadovoljavajući. Ispitivani su i keramički supstrati sa veličinama zrna od približno 1 µm, koji nisu dali poboljšane rezultate u odnosu na one postignute za 4-8 µm supstrat. Ovo je prikladno, jer je cijena materijala značajno viša (približno 5 puta) za vrlo malu keramičku česticu.

Prikladni supstrati silicija dobivaju se sa filmom oksida točne debljine, tj. tolerancija od ± 2 nm za 100 nm film oksida. Film oksida može biti debljine 50-500 nm, poželjno manje od 200 nm, a najpoželjnije u oblasti od 100 nm.

Supstrat se može formirati kao dio poluvodičkog mikro-proizvedenog mikro-strojnog elementa, razvijenog za široki opseg panel testova za primjene veterinarskih i kliničkih dijagnostika. Svaki poluvodički test element ima niz reakcijskih oblasti. Svaka reakcijska oblast specifična je za pojedinačnu analizu. Reakcijska oblast može biti u obliku točke, kanala, jame, udubljenja, otvora ili sobe. Reakcijske oblasti proizvode se sa imobiliziranjem bioloških molekula na supstrat.

Tipično, element iz izuma je površine do 1 cm2. Površina svakog reakcijskog mjesta obično će biti manja od 1 mm2.

Poželjno je da se proizvede čvrsti supstrat da se osigura zamršena mreža vrata, soba, kanala, otvora, jama itd. Također može biti prikladno napraviti nosače unutar kanala ili otvora.

Takve nepravilnosti mogu pomoći da se postigne maksimalna površina oblasti interakcija između vezanih bioloških liganada i test reagenasa, što jako reducira vremena inkubacije za usporedne imunološke pokuse i slične sendvič imunloške pokuse.

Kao alternativa ili dodatak, za recimo jame ili kanale na supstratu od silicija ili keramike, površina se može također mikro-proizvoditi za spajanje nanolitra sa mikrolitrom miješanja sobe/rezervoari/kanali. Na primjer, površina silicija prvo se oksidira da se formira sloj oksida. Zatim se nanosi sloj fotorezista, i od toga se pravi željeni uzorak. Poslije formiranja uzorka na sloju oksida, fotorezist je uklonjen. Silicij je zatim urezan, npr. korištenjem HF, i uklonjen je film oksida. Finalno, film oksida porastao je uniformno preko cijele silicijske pločice.

Ilustrativni proces prikazan je na slici 1. U fazi (i), pločica 1 od silicija je oksidirana da se osigura sloj 2 oksida; u fazi (ii), sloj 3 fotorezista je nanesen; u fazi (iii), primjena svjetlosti osigurava uzorkovani sloj oksida; u fazi (iv), fotorezist je uklonjen; u fazi (v), pločica 1 je urezana; u fazi (vi), film oksida je uklonjen; i u fazi (vii) kontinuirani film 2 oksida je ponovo formiran.

Poželjno je kovalentno imobiliziranje bioloških liganada. Mogu se koristiti interakcije pasivne apsorpcije, ali su one osjetljive na promjene u pH, temperaturi i ionskoj jačini, i mogu u nekim trenucima rezultirati u oslobađanju slabo vezanih liganada za vrijeme faza inkubacije i ispiranja, čime se doprinosi lošoj ponovljivosti pokusa. Naravno, poslije postupka imobiliziranja poželjno je da biološki ligand zadrži maksimalnu aktivnost.

Prije bilo kojeg kemijskog aktiviranja, površine supstrata trebaju biti potpuno čiste. Prva faza poželjno uključuje čišćenje površine sa sonikacijom u alkalnom deterdžentu, praćeno sa zamornim ispiranjem sa dvostruko ioniziranom vodom. Supstrati se zatim tretiraju sa otopinom kromne kiseline. Otopina kromne kiseline dalje čisti površinu i otvara površinu epoksidne grupe, kako je pokazano na slici 2. Epoksidne grupe mogu također biti otvorene i na drugi način, npr. sonikacijom tokom 1 sata.

Tako formirane površinske hidroksilne grupe su zatim raspoložive za derivatizaciju. Na primjer, kako je pokazano na slici 3, niz reakcija obuhvaća primjenu organosilana, zatim (hetero) bifunkcionalnog unakrsnog veziva Z-R-Y, za formiranje visoko reaktivnog intermedijera, i funkcionaliziranog liganda, radi dobivanja kovalentnog imobiliziranja.

Detaljnije, u organosilanima formule (RO)3Si-(CH2)n-X, svaki R je alkil ili druga hidrokarbil grupa, takva kao što je CH3 ili CH2CH3; n je cijeli broj, npr. 1 do 18; i X je funkcionalna grupa, takva kao što je epoksicikloheksil, NH2, CHO, OH, SH, p-klorobenzil, m-klorobenzil, Br, Cl, -NH-CH2-CH2-NH2, 2,3-epoksipropoksi, -N=C=O, -N=C=S ili p-klorosulfonilfenil. Ovi organosilani mogu biti izabrani tako da osiguraju ili reaktivnu terminalnu grupu sposobnu za formiranje kovalentne vezu sa biološkim molekulima, ili manje reaktivni dio takav kao što je NH2, gdje je potrebno dalje aktiviranje sa bifunkcionalnim vezivom da se osigura prikladna završna grupa. Orgasnosilani koji posjeduju terminalne elektrofilne funkcionalne grupe ne zahtijevaju aktiviranje sa bifunkcionalnim unakrsnim vezivom, jer se biološki ligandi mogu imobilizirati kovalentno preko nukleofilnih grupa na biološkim ligandom.

U slučaju da organosilani posjeduju nukleofilne grupe, tada se može koristiti bilo koje mnoštvo bifunkcionalnih unakrsnih veziva, da se osigura vrlo reaktivna kemijska grupa preko koje se bioloških molekula, ili se ligand može kovalentno vezati. Ovaj izum uključuje primjenu bioloških veziva koja se mogu koristiti u masovnoj proizvodnji kemijski aktivnih supstrata, i dovoljno su stabilni da dozvole skladištenje dugog termina prije kovalentnog pričvršćenja biološkog molekula ili veziva liganda. Poželjna veziva su ona koja su inertna na normalne atmosferske uvjete, a koja su istovremeno dovoljno reaktivna za formiranje kovalentne veze sa funkcionalnim grupama biološkog liganda koga treba imobilizirati u vrlo kratkom periodu vremena (tipično < 10 minuta).

Bifunkcionalno vezivo može biti, na primjer, fosgen, tiofosgen, N,N-disukcinimidil karbonat, ksililendiamin, 1,6-diaminoheksan, 1,12-diaminododekan, 1,6-diizocianatoheksan, 1,12-diizocianatatododekan, 1,4-fenilenditioizocianat, cianurik klorid, tereftaldehid, p-nitrobenzoil klorid, sulfanilna kiselina, 2-fluorometilpiridinium p-toluensulfonat, 3- aminofenilborna kiselina, p-bromofenilborna kiselina, dietil pirokarbonat, etil kloroformat, p-bromoanilin, p-bromofenil hidrazid, p-bromobenzaldehid, 1,2-etilen glikol p-bromobenzaldehida, N,N'-karbonildiimidazol, tereftaloil klorid, epiklorohidrin, 1,4-diidobenzen, 1,4-dibromobenzen ili N-hidroksisukcinimid derivat, npr. od p-aminobezoeve kiseline, p- bromobenzoeve kiseline, p-bromofeniloctene kiseline, p-bromoetilbenzoeve kiseline, p-bromometilbenzoeve kiseline, p- formilbenzoeve kiseline, p-hidroksimetilbenzoeve kiseline, 1,2-etilen glikol p-formilbenzoeve kiseline, p- bromofenilpropionske kiseline ili p-hidroksifenilpropionske kiseline. Fotolabilno ukršteno vezivo može se koristiti za reakciju sa organosilanom koji ima nukleofilnu ili elektrofilnu terminalnu grupu. Unakrsno vezivo je, na primjer, N-hidroksisukcinimid p-azidobenzoeve kiseline ili p-aminobenzofenona.

Umjesto bifunkcionalnih veziva, ili kao dodatak primjeni bifunkcionalnih veziva, također se može kovalentno imobilizirati sloj lateks čestica. Promjer lateks čestica je poželjno manji od 500 nm, i poželjnije manji od 150 nm. Lateks čestice mogu imati opseg fukcionalnih grupa, npr. -CH2Cl, -CHO, p-klorofenil, p-klorostiril, -N=NH, -NH-NH2 ili -NH2. Lateks čestice mogu biti inkubirane u koncentraciji od približno 0,5 do 1 % m/z sa supstratima modificiranim sa prikladnim organosilanom, sa ili bez prisustva bifunkcionalnog veziva, kako je gore opisano.

Slika 4 pokazuje dvije sheme za imobiliziranje lateksa. To može biti praćeno ili sa aktiviranjem lateksa sa sekundarnim vezivom, i imobiliziranjem biološkog molekula, ili direktnim kovalentnim imobiliziranjem, recimo, antitijela.

Kao alternativa primjeni polistiren lateks čestica je kovalentno imobiliziranje bioloških liganada na derivate polietilen glikola već postavljenih na silanatni supstrat. Na primjer, PEG derivati sa dvije elektrofilne grupe takve kao što su epoksi ili karbonilimidazol, reagiraju sa silanom koji ima terminalnu -NH2 grupu, takvu kao što je APTES, na izabranom supstratu. Prikladni reakcijski niz pokazan je na slici 5.

Može biti prikladno da se kovalentno imobilizira biološki ligand direktno na sloj silana, čime se izbjegava potreba aktiviranja silana sa polimernim materijalima ili bifunkcionalnim vezivima. Organosilani trebaju biti osjetljivi na nukleofilni napad sa kemijskom grupom (npr. NH2, SH, OH ili NH=NH2) na biološkom ligandu. Organosilani koji su prikladni za direktno vezivanje biološkog liganda mogu sadržavati halid, epoksi, izocianato, aldehid ili tozilat funkcionalne grupe. Takve je i reakcija pokazana na slici 6, gdje E je elektrofilna grupa na organosilanu. Primjeri E su Br, Cl, -O-CH2-CH=CH2, -NCO, -CHO i p-klorosulfonilfenil.

Organosilani koji posjeduju elektrofilne grupe, tj. glicidoksi, također imaju prednost da su manje osjetljivi na polimerizaciju za vrijeme postupka silanacije zbog odsustva nukleofilnih grupa raspoloživih za napad metoksi ili etoksi funkcije organosilana. Zbog toga površina supstrata ne treba sadržavati polimeriziran organosilan.

Kemija površine osigurava sredstvo postizanja prostorne rezolucije pomoću brze kinetike formiranja kovalentnih veza između površine kemijske funkcionalne grupe i prikladne kemijske grupe prisutne u sterilno povoljnom položaju na biološkoj molekuli koja se treba imobilizirati. Biološka molekula poželjno je prisutna na površini supstrata sa mikrofluidnim raspršivačem u obliku pojedinačnih kapi ili niza kapi koje formiraju liniju. Volumen raspršenja je reda 1 do 100 nl, poželjno manji od 50 nl, npr. približno 10 nl. Brzina formiranja kovalentnih veza je takva da se kovalentna imobilizacija postiže u minutama, prije nego raspršena kap ili linija ispari na površinu. Pozicijska točnost na koju se kap ili linija tekućine isporučuje treba imati toleranciju od ± 20 µm.

Posebno, ako su ligandi primijenjeni u vodi, također je poželjno da se razvije površina koja je hidrofobna, radi sprečavanja bilo koje lateralne difuzije raspršene kapi ili linije. Ova osobina doprinosi odličnom kvalitetu točke i reproduktivnosti, te omogućava veći broj točaka bioloških molekula koje se kovalentno imobiliziraju po jedinici površine područja.

Ovaj izum nadilazi probleme združene sa konvencionalnom fotolitografijom, sa omogućavanjem formiranja prostorno različitih točaka bioloških liganada bez zahtjeva za UV svjetlost ili fizičkim maskama. Kako je naznačeno gore, prostorna rezolucija može se postići sa tehnikama mikro-raspršivanja. Važan faktor je brza kinetika reakcije kovalentnog sprezanja, radi osiguranja visoko efikasnog sprezanja biološkog liganda u prostorno posebnoj oblasti, eliminiranjem lateralnog skretanja imobiliziranog biološkog liganda.

Nereagirani kemijski dijelovi na supstratu mogu se tada blokirati, npr. korištenjem molekula blokiranja poznatih stručnjacima. Takve prikladne molekule uključuju proteine takve kao što su kazein, goveđi albumin serum, laktalbumin, itd., ili blokatore male molekulske težine takve kao što su glicin, glutamin, itd.

Mogu se koristiti također fotolabilna veziva. Na primjer, organosilan na površini supstrata reagira u tamnom sa fotolabilnim vezivom (npr. benzofenon, arilazidi, itd.) Površina je tada točkasta sa biološkim ligandima kao se želi, a kovalentno pričvršćivanje postiže se praćenjem kratkog perioda zračenja sa UV svjetlošću ili dužeg perioda sa vidljivom svjetlošću. Preostale oblasti na površini supstrata blokirane su korištenjem blokatora sličnih onim sa opisanim molekulama kao gore, u prisustvu UV ili vidljive svjetlosti.

Biološki molekuli imobilizirani na supstratu mogu se stabilizirati, npr. sa inkubacijom u otopini šećera (npr. trehaloza) tokom kratkog vremena (1 sat), praćeno sa sušenjem na 37 °C tokom 16 sati. Stabilizirani supstrati mogu se tada hermetički zatvoriti u vrećice od folije i skladištiti. Imobilizirane biološke molekule stabilni su za više od 6 do ili 12 mjeseci, npr. čak i do preko 2 godine kada se skladište na +2 °C do +8 °C.

Elementi se mogu postaviti u opsegu raznih nosača koji uključuju karakteristike koje kontroliraju miješanje test reagensa. Tok tekućih test reagenasa može se postići sa kapilarnim privlačenjem, centrifugalnom silom, vakuumskom silom ili elektroosmotskim tokom. Primjena elektroosmotskog toka može izbjeći potrebu za ventilima, tako da se ne koriste pokretni mehanički dijelovi.

Zatvoreni kanali mogu se formirati sa vezivanjem staklene ploče sa mikro-proizvedenom površinom. Biološke molekule kovalentno su imobilizirane na površini prije vezivanja staklene ploče. Mnogi postupci vezivanja, npr. anodno vezivanje, uključuju povišene temperature koje mogu da uništiti biološke molekule. Zato su za imobilizirane bioloških molekula potrebne prirodne tehnike vezivanja. Jedan prikladan postupak je indirektno vezivanje, npr. gdje se pločica vezuje na staklenu ploču sa prikladnim ljepilom, npr. epoksi ljepilom.

Elementi se mogu postaviti na prikladni nosač. Na slikama 7 i 8 ilustrirani su razni takvi nosači. Pomoću primjera, dimenzije elementa pokazanog na slici 8 su 48,62 × 38,62 mm, uključujući zidove koji imaju unutrašnji promjer od 10 mm i vanjski promjer od 12,82 mm. Razmak centra do centra zidova je 15,36 mm.

Elementi mogu uključiti dodatne karakteristike za poboljšane miješanje test reagenasa, uzoraka, itd. Ovo je ilustrirano na slici 9, gdje element sadrži mjesto 11 dodavanja reagensa, kanal 12 reagensa, i test reakcijska mjesta 13.

Na slici 10, element sadrži rezervoare 21 reagensa, cijev 22 sa više otvora za isporuku, kanal test mjesta 23 za isporuku reagensa, i neupotrijebljen rezervoar 24. Slika 11 pokazuje 4-kanalnu test strukturu sa sličnim dijelovima.

Ovaj izum osigurava kompletno integrirani sustav za istovremenu, kvantativnu detekciju analiza širokog opsega molekulskih težina, strukturne raznovrsnosti i polarnosti. Paneli analize raspoloživi su kao prikladni za kliničke/veterinarske dijagnoze ili prikazivanje lijeka.

Vezivni ligandi biraju se zavisno od analiza, kao što je poznato stručnjacima. Prikladne analize uključuju:

- antibiotike, npr. tetracikline, sulfonamide, ionofore, aminoglikozide, peniciline ili fluorokinoline;

- hormone, npr. luteinising hormon (LH), prolactin (PL), hormon stimuliranja mjehura (FSH) ili hormon stimuliranja tiroide (TSH);

- markere srčanog oštećenja, npr. mioglobin, ugljena anhidraza, tropinin I, glikogen fosfrilaza BB, CK-MB, protein vezivanja masne kiseline ili troponin;

- markere infektivnog oboljenja;

- markere alergije;

- nepravilnost lijekova;

- enzime;

- viruse;

- nukleotide; i

- peptide.

Na primjer, jedan panel je za detekciju antibiotika sulfonamida. Ovaj izum osigurava postupak za istovremenu kvatitativnu identifikaciju, recimo, do 20 pojedinačnih sulfonamida. Drugi primjeri uključuju panele srčanih, plodnosti i infektivnih oboljenja.

Izum čini mogućim da se istovremeno detektira, recimo, do 20 analiza, koje ne moraju imati strukturnu sličnost. Uzorci matrice koji se mogu testirati uključuju serum, plazmu, urin, žuč, fekalije, tkivo, vodu i hranu. Volumen zahtjevanog uzorka je vrlo mali, tipično < 1,5 µl/analiza. Svi test reagensi, npr. enzimom označena antitijela, enzimom označeni hapteni, fluorescentno označena antitijela ili fluoroescentno označeni hapteni, mogu biti sadržani u jednom rezervoaru reagensa, čime se dramatično reduciraju zahtjevi tekućeg rukovanja.

U sendvič pokusima, npr. luteinising hormon, prolactin, hormon stimuliranja mjehura ili hormon stimuliranja tiroide, itd., uzorak se dodaje zajedno sa puferom pokusa, i inkubiraju se tokom kratkog perioda koji je tipično manji od 30 minuta, a poželjno manji od 10 minuta. Praćenje faze ispiranja, koktel označenih antitijela detekcije dodaje se i inkubira tokom slijedećeg perioda vremena. Ovaj period je opet tipično manji od 30 minuta, i poželjno manji od 10 minuta. Element se zatim ispire radi uklanjanja bilo koje nevezane oznake, i signal se kvantizira.

Može biti prikladno za neke pokuse da uključe mogućnost unutar mikro-proizvedenog elementa za uklanjanje potencijalnih interferenata, takvih kao što je reimatski faktor interferencije. Uklanjanje reumatskog faktora može se postići sa kontaktiranjem test uzorka sa područjem imobiliziranog imunoglobulina, na primjer prije kontaktiranja test uzorka sa domenom reakcije.

Dalji primjer je HAMA (ljudska antitijela anti-miša) interferencija. Ova antitijela mogu izazvati više problema u performansi pokusa koji koriste monoklonalna antitijela miša. Tradicionalno rješenje je da se uključe skupi dodatci u test reagensima radi suzbijanja problema. U ovom problemu, prednost je uklanjanje HAMA interferencije sa kontaktiranjem uzorka sa oblastima mikro-proizvedenog elementa, radi uklanjanja ovih antitijela, prije nego uzorak dostigne oblast reakcije.

Općenito, ligandi se mogu osigurati preko dijela elementa koji vezuje prljavštinu. Ovo je specijalno vrijedno tamo gdje je definirano širenje ostavljeno na površini elementa, npr. u kanalima. Sposobnost uklanjanja komponenti koje prave smetnje poboljšava točnost dobivenih rezultata.

Oznake detekcije mogu se također imobilizirati na površini dendrimer molekula. Dendrimer molekule polimerne su prirode, a sintetizirane sa ponovljivim sprezanjem malih formirajućih molekula. One su komercijalno raspoložive od Aldrich Chemicals-a u opsegu molekulskih težina sa izborom terminalnih funkcionalnih grupa, npr. NH2 ili COOH. Heterobifunkcionalna veziva mogu se tada koristiti u vezi sa kemijom konvencionalnog sprezanja za dobivanje konjugata oznake detekcije. Za male hapten molekule, npr. β-agoniste, anabolične steroide ili anitibiotike, poželjno je da se mali dendrimer (poželjno ne više od 16 grupa površine) spregne na veliki dendrimer (tipično više od 64 grupa površine). Hapten male molekulske težine (manje od 1000 Daltona) spregnut je na kemijske grupe na malom dendrimeru praćeno sa kovalentnim pričvršćivanjem oznake detekcije. Dendrimer konjugat može se pročistiti sa dijalizom i kromatografijom prodiranja gela.

Test reagensi sadrže više komponenti (npr. enzimom označena antitijela, fluorescentno označena antitijela, lateks-imobilizirana antitijela, dendrimer antitijela-fluorofor konjugati, dendrimer antitijela-enzim konjugati, enzimom označeni hapteni, fluorescentno označeni hapteni, itd.) kao prikladne za određene panele testova. Paneli mogućih testova vrlo su različiti, a mogu se izabrati na bazi kliničke dijagnoze (ili veterinarske dijagnoze), kako je prikladno. Na primjer, poželjan je panel za detekciju infektivnih oboljenja (npr. hepatitis, HIV, sifilis, itd.). Drugi paneli uključuju hormone plodnosti, srčane markere, proteine alergije, itd. Isto kao za kliničke parametre, tu je također moguće da se detektiraju veliki paneli ostataka lijeka.

Ovaj izum dozvoljava identifikaciju pojedinih spojeva, takvih kao što su antibiotici. Na primjer, kvantitativni rezultat može se dobiti za do 20 antibiotika na površini područja elementa od 1 cm2 istovremeno, u vremenskom dijelu od 1 minute tipično, sa osjetljivošću većom od one za HPLC/GCMS postupke, a usporediv je sa onim za konvencionalni pojedinačni parametar enzima imunloškog pokusa. Ovaj postupak lako se može proširiti na anabolične steroide, β-agoniste, β-blokatore, pesticide, terapeutske lijekove, itd.

Za analizu mogu biti prikladni hemiluminescencija, bioluminescencija ili fluoroescencija. Detekcijski sistem je poželjno kamera sa CCD elementom, opremljena sa mjerenjem i fluorescentne, i hemiluminescentne svjetlosti. Ukratko, CCD kamera sakuplja signal svjetlosti generiran iz test područja na mikro-proizvedenom elementu, i konvertira ovaj u relativne jedinice svjetlosti (RLUs).

Fluorescentno bazirani detekcijski sistemi mogu se direktno čitati, korištenjem prikladnih optičkih filtara za označavanje fluorofora.

Prikladni hemiluminescentni reagens je luminol, koji je analiziran na valnoj dužini od 433-445 nm. Hemiluminescencija se može također primijetiti , bazirano na detekcijskim alkalnim biološkim fosfatazom označenim molekulama korištenjem 1,2-dioksetana.

Radi olakšanja detekcije analize, ovaj izum poželjno koristi hemiluminescentni detekcijski sistem, korištenjem CCD kamere. Poželjno je da je kamera osvijetljena straga, zbog poboljšanje efikasnosti hvatanja na valnoj dužini generirane svjetlosti sa hemiluminescentnom reakcijom svjetlosti (približno 433-445 nm u slučaju luminola).

Cijeli sistem može raditi sa osobnim računarom, gdje specifično dizajnirani programi kontroliraju X-Y tablicu, jedinicu raspršivača, upravljanje uzorkom, kontrolu temperature, vremena inkubacije i CCD kameru. Slike 12-14 pokazuju organizaciju takvog sustava.

Slika 12 ilustrira shematski interakciju osobnog računara (PC) koji ima dvije kontrolne jedinice 31,32. Jedinica 31 u komunikaciji je sa CCD sistemom slike, predstavljenim sa 33. Jedinica 32 u komunikaciji je sa jedinicom raspršivača i X-Y translacijskom tablicom sa blokovima uzorka predstavljenim sa 34 i 35, respektivno.

Slika 13 shematski predstavlja X-Y translacijsku tablicu. Ovaj crtež pokazuje platformu uzorka 41 postavljenu na linearni aktuator 42. X-Y translacija pod kontrolom je koračnog motora 43, 44 na respektivne pogone 45, 46. Translacija je ograničena sa "kućnim položajem" senzora 47, 48.

Osjetljivost označenih bioloških molekula i nekih neoznačenih bioloških molekula na svjetlost može učiniti potrebnim da se izvrše pokusi u odsustvu svjetlosti. Odsustvo svjetlosti postiže se konstrukcijom kućišta nepropusnog za svjetlost. Ambijent nepropustan za svjetlost također je temperaturno kontroliran, tj. unutar ± 0,2 °C, ili poželjno ± 0,1 °C, radi osiguranja zadovoljavajuće preciznosti i točnosti pokusa.

Slika 14 pokazuje aparat u perspektivi, pogled odozgo i bočni presjek. Posebno, slika 14A pokazuje kontejner 51 skladištenja reagensa, vrata 52 nepropusna za svjetlost i tijelo kamere 53 sa poklopcem 54 koji se može ukloniti. Glavni dio kamere može biti izvan kućišta. Objektiv kamere je u otvoru na kućištu.

Slika 14B pokazuje na skici uzorke na bloku 55 uzorka i, na skici, prazno područje 56 i područje slike 57. Kamera 53 postavljena je preko ovih područja. Slika 14C pokazuje, pored kontejnera 51, kameru 53, X-Y tablicu 41, koračni motor 43, i pumpu raspršivača 58.

Projekt sistema pokazanog na slici 14 baziran je na držačima postolja uzorka 3 × 3 od kojih se njih 20 može držati bilo kada istovremeno. Ovo znači, da ako je 20 pojedinačnih reakcijskih oblasti postavljeno na svakih 1 cm2 mikro-proizvedenog elementa, na jednom uzorku može se izvršiti ukupno 3600 analiza. Alternativno, 180 uzoraka može se analizirati istovremeno za 20 različitih test parametara.

Kako je gore naznačeno, analiza može biti označena. Ligand može biti također označen, pokazujući analizu sa frakcijskim zauzećem.

Izum ilustriraju slijedeći primjeri

Primjer 1

Pokus sulfonamida

U ovom primjeru, 12 pojedinačnih antitijela od kojih je svako antitijelo specifično za pojedini sulfonamid, imobilizirano je sa kovalentnim pričvršćenjem sa kontaktnim interakcijama na diskretne oblasti ravnog keramičkog (aluminij oksid) supstrata koji ima kemijski modificiranu površinu. Pokus višestruke analize izvršen je korištenjem usporednog formata imunološkog pokusa.

Detaljnije, keramički supstrati (1 cm × 1 cm) ultrasonično su očišćeni korištenjem alkalnog deterdženta (RBS35, 5 % z/z) praćeno sa dvostruko deioniziranom vodom, a zatim su postavljeni u 6M HCl tokom 16 sati. Čipovi su zatim stavljeni u kromnu kiselinu tokom 1 sata u ultrasoničnoj kadi.

Supstrati su potpuno isprani sa dvostruko deioniziranom vodom i acetonom, a zatim osušeni u peći na 120 °C tokom 2 sata. Praćenjem ovog pred-tretmana, supstrati su silanirani korištenjem organosilan Y-glicidoksipropil trimetoksilana (10 % z/z) u anhidriranom toluenu, 4-dimetilaminopiridinu (1,25 g/l) i trietilaminu (1 % z/z). Smjesa je refluksirana tokom 4 sata, a zatim je ostavljena preko noći na sobnoj temperaturi. Supstrati su isprani sa toluenom i acetonom prije fermentacije tokom 4 sata na 120 °C.

Poslije faze fermentacije, supstrati su postavljeni u kontejnere na sobnoj temperaturi do zahtjevanog mrljanja antitijela sulfonamida. Antitijela sulfonamida mrljana su korištenjem BIODOT XY3000 raspršivača. 12 ispitivanih sulfonamida bili su sulfadoksin, sulfametizol, sulfakloropiridazin, sulfametoksipiridazin, sulfamerazin, sulfapiridin, sulfizoksazol, sulfatiazol, sulfametazin, sulfakinoksalin, sulfadimetoksin, i sulfadiazin.

Za svako antitijelo sulfonamida korišten je volumen raspršenosti od približno 20 nl. 12 antitijela sulfonamida koji su formirali 12 diskretnih oblasti na 1 cm2 supstrata inkubirani su tokom 2 sata na 37 °C. Supstrati su isprani fosfatom puferiranom salinom (PBS) (pH = 7,2) koja sadrži 2 % kazeina (t/z), a zatim su blokirani u istom puferu preko noći na temperaruri od +2 °C do +8 °C. Poslije ispiranja sa PBS koji sadrži PEG300 (0,05 % z/z), elementi su postavljeni na nosač.

Višestruki sulfonamid standardi (200 µl) i koktel od sulfonamid hren peroksid konjugata (100 µl) dodani su u reakcijske otvore koji sadrže element kako je prikladno i inkubiraju se tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Standardi su sadržavali 5, 10, 50 i 100 ng/ml za svaki od 12 sulfonamida.

Zatim su višestruki sulfonamid elementi isprani sa PBS/PEG puferom, radi uklanjanja viška reagenasa, te je uvedeno 300 µl hemiluminescentnog supstrata (luminol (1,4 mM)/urea vodik peroksid (9,6 mM)) po elementu. Elementi su slikani korištenjem CCD kamere sa vremenom izlaganja do 4 minute. Standardne krivulje dobivene su za svaki od 12 pojedinačnih sulfonamida. Kalibracijske krivulje za svaki od 12 pojedinačnih sulfonamida predstavljene su grafički na slici 15. Na Y-osi nacrtana vrijednost % B/Bo predstavlja % inhibicije nulte standardne RLU (relativna jedinica svjetlosti) vrijednosti izazvane sa svakim pojedinačnim standardnim sulfonamidom (nacrtan na X-osi kao log10).

Primjer 2

Pokus hormona

U ovom primjeru pokus višestruke analize izvršen je za 3 hormona velike molekulske težine, npr. prolaktin (PL), hormon stimuliranja mjehura (FSH) i luteinising hormon (LH). Ovaj primjer predstavlja pokus višestruke alalize za sendvič bazirani imunološki pokus. Kada su 3 hormona određena u istom panelu nije primijećena značajna unakrsna reaktivnost.

Kemijski pred-tretman i postupci silanacije identični su onima kako je opisano u primjeru 1. Pojedinačna PL, FSH ili LH monoklonalna antitijela (približno 20 nl raspršenih antitijela) imobilizirani su na diskretne oblasti kemijski modificiranog supstrata. Pokusi višestruke analize izvršeni su na silicijskim i keramičkim supstratima sa epoksidnom površinom, kako je opisano u primjeru 1.

U pokusu u element je dodano 150 µl više Lh/PL/FSH serum baznog standarda i 150 µl razblaženog pokusnog pufera, te inkubirano tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Praćenjem faze ispiranja, dodano je 300 µl pojedinačnog koktela LH-HRPO/PL-HRPO/FSH-HRPO konjugata i inkubirano tokom 15 minuta. Nakon toga elementi su isprani radi uklanjanja viška reagenasa, pa je uveden je hemiluminescentni reagens (luminol (1,4 mM)/urea vodik peroksid (9,6 mM)). Elementi su slikani korištenjem CCD kamere sa vremenom izlaganja do 4 minute. Poslije obrade slika nacrtane su standardne krivulje za svaki od hormona.

Primjer 3

Pokus sulfonamida

Nasuprot primjeru 1, pokus višestruke analize također je izvršen korištenjem mikrokanala. Element je ilustriran na slici 11. U ovom primjeru, rezervoari 21 dodavanja reagensa su dimenzija 2 mm × 2 mm, i 300 µm duboki (volumen 1,2 µl); kanali 23 su svaki 5 mm dugi, 200 µm široki i 100 µm duboki (volumen 100 nl); a rezervoar 24 je dimenzija 1,9 mm × 8,6 mm, i 300 µm dubok (volumen 4,9 µl).

Kemijska modifikacija površine izvršena je kako je opisano u primjeru 1. U svaki od kanala dodano je antitijelo, te se inkubirani su tokom 2 sata na 37 °C. Supstrati su zatim blokirani i isprani kao za primjer 1.

Pomiješano su višestruki sulfonamid standardi (200 µl) i koktel od sulfonamid hren peroksid konjugata (100 µl). Dodan je 1 µl rezultantnog reagensa, pipetom u svaki od rezervoara koji snabdijevaju antitijelom prevučeni kanal za svaki sulfonamid. Standardi su sadržavali 10 ili 100 ng/ml svih sulfonamida, kako je prikladno.

Reagens je praćen sa kapilarnim djelovanjem. Poslije inkubacije tokom 2 minuta, supstrat je ispran 5 puta sa PBS/PEG i dodan je hemiluminescentni reagens (luminol (1,4 mM)/urea vodik peroksid (9,6 mM)).

Elementi su slikani sa korištenjem CCD kamere sa vremenom izlaganja do 4 minute. % B/Bo vrijednosti za krivulje 4 sulfonamida date su u tablici 1.

Tablica 1

[image]

Korisnost ovog izuma sa fotolitogrfaijom demonstrirana je sa stupnjem nespecifične aposrpcije bioloških molekula na fotolabilnom (benzofenonom tretiranom) supstratu. Rezultati su pokazani u tablici 2.

Tablica 2

[image]

Miš IgG detektiran je korištenjem anti-miš HRPO konjugata korištenjem hemiluminiescentne detekcije sa CCD kamere. Silicijski i keramički supstrati koji imaju imobilizirano benzofenon fotolabilno vezivo ne trebaju vezati miš IgG kada reagiraju u odsustvu svjetlosti. Međutim, događa se nespecifično vezivanje, jer se približno 80 % srednje sivog RLU postiže kada se miš IgG izvršava pod UV svjetlošću zbog pasivnih interakcija vezivanja. Niz bioloških molekula imobiliziranih preko kovalentnih interakcija prema ovom izumu vidljivo je izdvojeniji.

Potvrda za kovalentno pričvršćivanje je osigurana u primjerima niže diskutiranim. U prvom slučaju, keramički supstrati silanirani su sa APTES, i zatim reagirani sa biotin-LC-sulfo NHS. Kontrolni keramički supstrat nije silaniran sa APTES, pa zato nema terminalnih-NH2 grupa koje su raspoložive za reagiranje sa sukcinimidil esterom derivata biotona. Supstrati su zatim reagirani sa avidin-FITC konjugatom i fluorescentno određeni sa CCD kamerom. Rezultati su dati u tablici 3.

Tablica 3

[image]

NS = nije detektiran fluorescentni signal

Ovo jasno pokazuje specifičnu imobilizaciju biotin-LC-NHS. Maksimalna koncentracija imobiliziranog biotin-LC-NHS bila je 100 µg/ml, jer se rezultat RLU za 500 µg/ml supstrata nije povećao.

U daljnjem primjeru, keramički susptrati silanirani sa APTES reagirali su sa dihidrazid vezivom. Sulfonamid antitijela tretirana su sa natrij periodatom da se ona vrate reaktivna prema hidrazid vezivu. Kontrolna sulfonamid antitijela jednostavno su dijalizirana prema puferu natrij acetata pH = 5,5. Rezultati RLU pokazani su u tablici 4 (nije tretiran) i tablici 5 (tretiran sa postupkom periodata). Rezultati jasno pokazuju da je hidrazid vezivo uspješno vezano na keramičku površinu. Kontrolna antitijela (nema aktiviranja periodata) dala su vrlo loše standardne krivulje, u usporedbi prema kovalentno imobiliziranim sulfonamid antitijelima.

% vezivanja zbog kovalentnih ili pasivnih interakcija uspoređeni su u tablicama 6 i 7. Kovalentna interakcija doprinjela je prosječno 81,8 % ukupnog vezivanja, jasno označavajući kovalentno vezivanje sulfonamid antitijela.

Tablica 4

[image]

Tablica 5

[image]

Tablica 6

[image]

Tablica 7

[image]

Kovalentna imobilizacija: Direktno mrljanje na površini glikozid silana.

Pasivna imobilizacija: Direktno mrljanje na diklorodimetilsilanom reagiranoj površini.

Jasno, kovalentni postupak rezultira sa boljim rezultatima u usporedbi sa pasivnim postupkom. Rezultati za pasivni postupak mogu se poboljšati približno dva puta sa pred-tretmanom kiseline sulfonamid antitijela, ali ovo je još lošije od kovalentnog postupka.

Potvrdna analiza na kemijski modificiranim silicijskim i keramičkim supstratima također je izvršena korištenjem fotonske spektroskopije X-zraka (XPS). Procijenjeni spektri zabilježeni su iz dvije slučajne oblasti svakog uzorka supstrata, sa čije površine su određeni kemijski preparati. Z rezultate vidjeti tablicu 8 (datim u atomskim %).

Tablica 8

[image]

Rezultati atomskog preparata pokazuju vrlo dobru konverziju roditelja silicijskih i keramičkih supstrata sa APTES organosilanom, sa dobrom reproduktivnošću na površini preparata označenoj za dvije oblasti testirane na svakom uzorku. FITC-označeni supstrati pokazali su 70 % i 77 % označavanja silicija i keramike, respektivno.

Kvantitativni postupci fluorescentnog mjerenja na tamnom supstratu silicija uspoređeni su sa onim na bijelom keramičkom supstratu (aluminij oksid). RLU rezultati iz CCD detekcije za fluorescentne molekule (FITC) kovalentno vezane na svaki supstrat uspoređeni sa kvantitativnim postupkom poslije FITC molekula ispitani su sa postupkom Hook, i dr.: "Langmuir", svezak 7, str. 142-151, (1991.).

Tablica 9

[image]

Kvantitativna analiza fluorescentne oznake dobivene sa ispitivanjem FITC oznake od supstrata i mjerenje signala sa CCD kamerom pokazuje da, usprkos 1000-puta povećanju u signalu keramike u odnosu na silicij, ima realno značajno više FITC molekula prisutnih na supstratu silicija.

Slijedeći primjer ovog fenomena pokazan je sa rezultatima u tablici 10, iz prolaktin pokusa izvršenog na silicijskim i keramičkim supstratima korištenjem lateks čestica vezanih na antitijelu detektiranja prolaktina kao detekcijski sistem. Date su RLU vrijednosti (20 sek. izlaganja).

Tablica 10

[image]

Performanse keramike osigurale su superiorne rezultate u odnosu na silicij korištenjem ovog postupka fluorescentne detekcije. Dalje, problemi efekta crnog tijela na silicij korištenjem fluorescencije mogu se riješiti sa korištenjem hemiluminoescencije kao postupaka detekcije. U usporedbi između identičnih pokusa za FSH izvršenih na siliciju i keramiku, korištenjem detekcije hemiluminoescencije, ranije zahtjevano vrijeme izlaganja dva puta je duže od onog za keramiku za postizanje iste RLU vrijednosti.

U ovoj specifikaciji, primjenjuju se skraćenice:

APTES = aminopropiltrietoksisilan

CK-MB = podjedinica kreativne kinaze MB

HRPO = hren peroksidaza

LC-sulfo-NHS = dugi lanac sulfo-N-hidroksisukcinikida

FITC = fluoroescein izotiokarbamat

Claims (21)

1. Poluvodički element za izvršavanje višestrukih analiza, naznačen time što sadrži supstrat i mnoštvo diskretnih reakcijskih mjesta koja nose ligand kovalentno vezan na supstrat, gdje je površina supstrata između reakcijskih mjesta inertna u odnosu na analizu.

2. Element prema zahtjevu 1, naznačen time što je površina supstrata neuniformna gdje se pojačani signal može dobiti od interakcije ligand analiza.

3. Element prema zahtjevu 2, naznačen time što sadrži niz reakcijskih kanala, grebena, točaka, komora, jama, otvora ili udubljenja.

4. Element prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačen time što je supstrat od keramike, stakla, kvarca ili silicija.

5. Element prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačen time što ima oblast manju od 1 cm2.

6. Element prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačen time što je oblast svakog reakcijskog mjesta manja od 1 mm2.

7. Element prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačen time što se može dobiti sa procesom aktiviranja površine supstrata, i primjenom niza liganada na diskretnim oblastima na površini.

8. Element prema zahtjevu 7, naznačen time što postupak dodatno obuhvaća blokiranje drugih aktivnih oblasti.

9. Element prema zahtjevu 7, naznačen time što postupak obuhvaća povratak drugih hidrofobnih oblasti, a ligandi se primjenjuju u vodi.

10. Element prema bilo kojem od zahtjeva 7 do 9, naznačen time što primjena liganada obuhvaća početnu fazu kontaktiranja aktivne površine sa organoslinaom.

11. Element prema zahtjevu 10, naznačen time što organosilan ima formulu (RO)3Si-(CH2)n-X, gdje je svaki R hidrokarbil grupa, n je cijeli broj, a X je funkcionalna grupa.

12. Element prema zahtjevu 10 ili zahtjevu 11, naznačen time što postupak uključuje primjenu bifunkcionalnog unakrsnog veziva radi olakšanja kovalentnog učvršćenja bioloških liganada na organosilan.

13. Element prema bilo kojem od zahtjeva 10 do 12, naznačen time što se forolabilno unakrsno vezivo koristi za reakciju sa organosilanom koji ima nukleofilnu ili elektrofilnu terminalnu grupu.

14. Element prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 8, naznačen time što se može dobiti sa imobiliziranjem liganada na derivatiziranu površinu sa makromolekulama takvim kao što su polistiren lateks čestice, dendrimeri ili polietilen glikol koji sadrži kemijske grupe koje olakšavaju kovalentno pričvršćenje liganada.

15. Element prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačen time što dodatno sadrži ligande koji vezuju materijale čije prisustvo ometa pokus analize.

16. Element prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačen time što se primjenjuje za pokus višestruke analize.

17. Primjena elementa prema zahtjevu 16, naznačena time što obuhvaća promatranje niza mjesta na kojima se analiza vezuje i/ili ne vezuje, i korelira tu informaciju sa ligandima.

18. Primjena elementa prema zahtjevu 16 ili zahtjevu 17, naznačena time što obuhvaća slikanje sa CCD elementom koji je osvijetljen straga, prikladnog za detekciju svjetlosti od hemikuminoescentne reakcijske svjetlosti, gdje je valna dužina svjetlosti koju treba detektirati manja od 450 nm.

19. Primjena elementa prema bilo kojem od zahtjeva 16 do 18, naznačena time što su analize odabrane od antibiotika, hormona, markera srčanog oštećenja, markera infektivnog oboljenja, alergijskih markera, lijekova nepravilnih enzima, virusa, nukleotida i peptida.

20. Primjena elementa prema bilo kojem od zahtjeva 16 do 19, naznačena time što su analize na uzorku potpune krvi, seruma, plazme, urina, fekalija, žuči, tkiva ili hrane.

21. Sistem za višestruke analize, naznačen time što sadrži element prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 15, translacijsku platformu, sustav za upravljanja uzorkom, sustav za isporuke tekućeg reagensa, temperaturno kontroliranu crnu kutiju, CCD kameru i aparat za obradu slika.