KR100722321B1 - 모세관력 리소그래피와 자기조립단분자막을 이용한 단백질패턴 형성 방법 및 이를 이용하여 제조된 단백질칩 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단백질 패턴에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 모세관 현상을 이용하여 액상의 고분자를 패터닝하는 모세관력 리소그래피와 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriexothysilane: 3-APTES) 분자가 산화된 유리 기판 위에 일정한 각을 가지고 자발적으로 단분자막을 이루는 자기 조립 단분자막을 이용하여 PS의 패턴을 만들어 단백질이 선택적인 위치에만 고정화 되도록 유도하여 대량 생산이 용이하고 공정이 단순하면서 효율이 높은 바이오 센서의 기판을 만드는 것이다. 이를 위하여 본 발명은 비싼 광원이나 고온, 고압의 도움 없이도 패턴 형성이 가능한 모세관력 리소그래피 방식을 사용하였으며, 이는 모세관 현상만을 이용하여 빠르고 간단하게 패턴형성이 가능하다. 또한, 분자들이 서로간의 상호작용으로 일정한 간격을 유지하면서 일정한 각도를 가지고 표면에 단분자막을 형성하는 자기 조립 단분자막을 도입하여 패턴이 형성된 고르지 못한 표면에 도포가 가능하였고, 3-APTES의 아미노기에 의해 단백질의 고정화가 가능하게 하였다.
capillary force lithography, self assebled monolayer, CFL, SAM, vaporized toluene, 모세관력 리소그래피, 자기 조립 단분자막
Description
도 1은 단백질 패턴을 형성하는 제조공정과정을 개략적으로 나타낸 단면도.
도 2는 기화된 톨루엔으로 표면을 개질하는 모형도.
도 3은 본 발명에 따라 완성된 단백질 패턴의 이미지.
도 4는 본 발명에 따라 완성된 단백질 패턴의 결과를 분석하기 위한 형광현미경 이미지.
도 5는 여러 가지 조건으로 제조된 기판의 성능을 분석하기 위한 형광현미경 이미지.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
1 : 유리 기판 2 : 폴리스타이렌(PS) 층
3 : PDMS 도장 4 : 3-APTES
5 : BSA-FITC 단백질 6 : 톨루엔
7 : 유리 영역 8 : 폴리스타이렌 영역
9 : 모세관력 리소그래피 후 남은 PS 잔존물
본 발명은 단백질 패턴 형성 방법 및 이 방법에 의해 제조되는 단백질 기판 및 단백질칩에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 모세관 현상을 이용하여 액상의 고분자를 패터닝하는 모세관력 리소그래피(Capillary Force Lithography: CFL)와 3-APTES(3-aminopropyltriexothysilane: 3-아미노프로필트리에톡시실란) 분자가 산화된 유리 기판 위에 일정한 각을 가지고 자발적으로 단분자막을 이루는 자기 조립 단분자막(Self-Assembled Monolayer: SAM)을 이용하여 폴리스타이렌(poly-styrene: PS)의 패턴을 만들어 단백질이 선택적인 위치에만 고정화되도록 유도하여 대량 생산이 용이하고 공정이 단순하면서 효율이 높은 단백질 패턴 형성 방법 및 상기 방법으로 제조된 단백질칩 기판, 그리고 상기 단백질 기판을 이용하여 제조된 단백질칩에 관한 것이다.
최근 인간 유전체의 구조가 거의 대부분 밝혀지면서 인체를 구성하는 기능연구에 대한 관심이 급증하고 있다. 이와 같이, 유전자의 기능을 규명하는 총체적인 연구 분야를 기능 제노믹스(Functional Genomics)라 정의하며, 이는 유전자를 실험재료로 사용하여 연구하는 제노믹스(genomics), 세포 내의 총체적인 단백질군을 대상으로 연구하여 유전자의 기능을 규명하는 프로테오믹스(proteomics), 그리고 이 두 분야를 공통적으로 원하는 바이오인포매틱스(bioinformatics)로 구분되어 진다. 최근까지만 하더라도 유전자나 세포의 기능연구에 대한 분자생물학적인 접근은 대 부분 단일 유전자나 그 유전자가 발현하는 mRNA의 발현 조절을 중심으로 이루어졌으나, 요즘에는 단백질체를 중심으로 바뀌고 있는 추세이다.
단백질 패턴은 질병의 진단 시스템, 생체 마커 개발, 단백질 및 신약 연구 등에 있어서 단백질 펩티드 라이브러리(protein peptide library), 표적 단백질 분리 분석과 고속 처리 검색법 (high throughput screening) 등의 공법으로 이용된다. 특히 펩티드 라이브러리(peptide library) 공법은 합리적인 약물 제조에 있어서 사용되어 오던 기존의 방식과 다른 방식으로의 접근법으로 그 부가가치가 매우 큰 분야이며 생명 공학의 기초 기술로 개발되고 있다. 다음으로, 단백질 분석을 위해서 가장 많이 사용되는 방법으로는 항원-항체를 가장 많이 이용되는데 이를 위해서는 단일 클론 항체의 충분히 많은 양의 생산이 중요하다. 이를 위해서는 먼저 원하는 표적 단백질을 혈액으로부터 분리해내야 한다. 여기에 단백질 패턴의 특정 단백질에 대한 반응성을 이용하면 쉽게 가능하다.
상기 단백질체 연구에 필수적으로 이용될 수 있는 핵심기술이 단백질칩(protein chip)이다(Gavin MacBeath and Stuart L. Schreiber, Science, 289:1760~1763, 2000). 단백질칩은 수십 내지 수천 개의 단백질을 작은 기판상에 고정해 동시다발적으로 단백질의 결합을 분석하는 자동화기기 시스템이다. 이는 수십 내지 수천 개의 유전자를 기판상에 고정화시켜 동시다발적으로 유전자의 변화를 유전자간의 상보적 결합을 통하여 정량분석함으로써 유전자 발현이나 돌연변이를 검색하는 마이크로 어레이 DNA칩(microarray DNA chip)과 비슷하다(Yasuda, H., Lamage, C. E., J. A ppl. Polym. Sci.17: 201, 1973; Muguruma, H., Karube, I., Trends Anal. Chem.18: 62, 1999; Nalanishi, K., Muguruma, H., Karube, I., Anal. Chem.68: 1695, 1996; Miyachi, H., Hiratsuka, A., Ikebukuro, K., Yano, K., Muguruma, H., Karube, I., Biotechnol. Bioengin.69: 323, 2000) . 그러나 단백질칩은 상기 DNA칩으로는 알아내지 못하는 다음과 같은 부분을 분석할 수 있다.
첫째, 단백질-단백질간의 상호작용에 관한 정보를 얻을 수 있다. 세포 내 신호전달이나 조절은 단백질-단백질간의 상호작용의 형태로 나타나는데, 이를 단백질칩을 통하여서 분석할 수 있다.
둘째, 인간을 포함한 고등생물체로부터 효모에 이르기까지 단백질은 유전자와는 관계없이 번역 후 변형(post-translational modification)이 일어나는데, 인산화(phosphorylation), 산화(oxidation) 등과 같은 이차적인 수식에 관한 정보를 얻을 수 있다.
셋째, mRNA 생성 후 발생하는 문제점을 검출할 수 있다. 많은 질병이 전사(transcription) 후 조절이나 단백질의 생성, 그리고 단백질의 위치(localization)와 같은 문제점으로부터 야기되는데, mRNA를 검출하는 DNA칩으로는 이런 정보를 얻기가 힘들다.
넷째, mRNA가 단백질로 발현시 둘 사이의 정량적인 상관관계가 그리 높지 않을 수 있기 때문에, 경우에 따라 단백질에 관한 정확한 정보를 제공할 수 없다는 DNA칩의 한계를 단백질칩을 통하여 극복할 수 있다.
다섯째, DNA칩으로 규명되는 유전자의 염기서열의 차이가 직접적인 질병을 의미하거나, 표현형의 차이를 나타내지 않는다. 더욱이 비슷한 특성을 가진 아미노산으로 의 돌연변이는 대개 단백질의 고유특성을 유지하기 때문에, 질병이나 표현형의 차이를 유발하지 않는다. 그러나 단백질칩을 이용하면 직접적인 질병 및 표현형의 차이를 나타내는 단백질을 규명할 수 있다.
단백질칩을 이용하면 단백질-단백질간의 상호관계에 관한 데이터 생성이 가능하며, 신약 개발시 시간 및 비용의 절감효과를 가져올 수 있는데, 한 예로 현재의 유전자를 이용한 치료약 개발보다 걸리는 시간을 비약적으로 단축시킬 수 있다. 또한, 단백질칩은 산업적 수요뿐 아니라, 질환 진단, 환경 모니터링, 유해성 검진 등 잠재수요도 대단히 크다.
이러한 장점들로 인해 DNA칩보다 더 큰 시장을 형성할 것이라 예상되어 단백질칩에 대한 개발이 절실히 요구되고 있다.
단백질칩의 구성을 살펴보면, 단백질칩은 크게 센서칩(Sensor chip)과 단백질 결합 분석 장치(Detection system)로 구성된다. 이 중 센서칩이 단백질칩의 핵심부분으로, 단백질칩의 발전 속도를 결정하고 있는 주요 요인이 되고 있는 부분이다. 상기 센서칩은 수십 내지 수백 개의 단백질이 작은 표면에 일정한 배열로 결합된 것인데, 대부분 슬라이드 크기의 유리나 플라스틱을 이용한다.
상기 센서칩에 있어서, 그 핵심기술은 단백질을 칩의 표면에 결합시키는 단백질 고정화 기술이다. 단백질 고정화 기술은 특성에 따라 다음과 같이 세 가지로 나눠진다. 첫 번째는 카르복시메틸-덱스트란(CM(carboxymethyl-dextran)을 이용하여 특정 단백질을 센서칩의 표면에 고정하는 방법으로, 가장 널리 이용되고 있는 방법이다. 그 중 아민(amine)결합이 가장 보편적으로 이용되며, 산성을 띠는 단백 질이나 DNA 등을 결합시키기 위한 티올(thiol)결합이나, 아비딘-바이오틴(avidin-biotin)결합이 이용되기도 한다. 두 번째는 다수의 동일 특성을 띠는 단백질군을 결합할 수 있도록 센서칩의 표면을 처리하는 방법이다. 세 번째는 불특정 다수의 단백질을 결합시키는 방법으로, 폴리라이신(polylysine)이나 calix crown(칼릭스 크라운)을 예로 들 수 있다.
그러나 상기 센서칩의 핵심기술인 단백질을 기판에 고정화시키는데 있어, 비특정 표면 고정화(nonspecific surface immobilization), 고체 표면에의 고정화에 따른 단백질의 생물학적 활성의 상실, 상대적으로 낮은 활성물질의 표면 농도, 표면이탈에 따른 분석신호의 소멸 등의 기술적 어려움이 있는바, 그 해결이 시급한 실정이다.
두 개의 다른 특성을 가진 표면을 만들기 위해서 종래의 기술로는 감광성 물질에 자외선을 쏘여주어 개질 시키는 경우와 다른 종류의 물질을 붙이는 방법이 있다. 감광성 물질 또한 광학적인 방법으로 공정이 비싸고 단순하지 않다.
단백질을 기판에 고정화시키는데 있어서 가장 필요한 기술은 나노미터 크기의 소자를 만들기 위한 신뢰성 있는 패터닝기술이다. 이러한 패터닝 기술로서, 종래의 기술로는 광학적인 방식이나 형틀을 붙여서 패턴을 만드는 방법이 사용되었으나 몇 가지 단점이 있다.
광학적인 방식을 이용한 방법으로서, 현재까지 사용되어 왔고 가까운 미래까지 주요 기술로 사용될 노광공정(photolithography)은 해상도 면에 있어서 100nm 정도의 한계를 가지고 있다. 이는 100nm이하의 크기에서 일어나는 빛의 간섭문제 때문인데 90년대 중반부터 이러한 노광공정을 대체하기 위해 많은 노력이 있었다. 경제적인 문제만 없다면 100nm이하의 해상도를 갖는 광학 리소그래피 방법은 벌써 개발되어 있는 상황이며, 예를 들어 전자빔 리소그래피(electron-beam lithography), 엑스선 리소그래피(X-ray lithography), 주사 탐침 리소그래피(scanning probe lithography) 등이 그러한 방법의 예이다. 그러나 광학적인 방법에 의한 패턴 방식은 비싼 광원을 사용해야하고 장비도 많이 사용되어야 한다는 단점이 있다. 또한 이 방식에서 사용되는 빛 차단 물질은 비 환경 친화적이라 다른 기술의 도입이 필요하다.
그리고 형틀을 붙여서 패터닝하는 경우는 상당히 좋은 결과를 얻을 수 있지만 패턴의 크기가 작아지면 불가능하다는 단점이 있고 틀과 기판 사이로 단백질 용액이 스며드는 현상을 차단해야하는 것이 거의 불가능하다.
종래기술로서, 2002년 11월 26일 특허 허여된 미국특허 US 6,485,984, 칼릭스크라운 유도체, 이의 제조 방법, 이를 이용하여 준비된 칼릭스크라운 유도체의 자기 조립 단분자막 및 칼릭스크라운 유도체의 자기 조립 단분자막을 이용하여 단백질 단분자막을 고정하는 방법(Calixcrown derivatives, a process for the preparation thereof, a self-assembled monolayer of the calixcrown derivatives prepared by using the same and a process for immobilizing a protein monolayer by using the self-assembled monolayer of the calixcrown derivatives)에서는 자기 조립 단분자막을 이용하여 기판 위에 단백질을 고정시키는 방법을 개시하고 있다. 그러나 상기 종래 기술에서는 선택적으로 원하는 위치에 단백질을 고정시키지 못하였으며, 공정이 복잡하고 패턴 형성이 명확하지 못하였다.
또한, 종래 기술로서 감광성인 폴리에틸렌글리콜을 모세관력 리소그래피를 이용하여 패터닝한 후 PDMS 도장을 덮고 자외선을 조사하여 경화시킨 후 플루오로카본 (flourocarbon) 플라즈마로 에칭한 다음, 단백질을 선택적인 위치에 고정화하는 기술이 개시되었다(Microstructures of poly ethylene glycol by molding and dewetting, K.Y. Suh, R. Langer, Appl. Phys. Lett., Vol. 83, No. 8, 1668, 2003). 그러나 상기 기술은 자외선을 조사하여야 하기 때문에 복잡하고 패터닝 속도가 느리기 때문에 저렴하게 바이오 센서의 기판을 제공하는 것이 곤란하였다.
미국특허출원 USSN 20030062334호(2003년 4월 3일 출원, Method for forming a micro-pattern on a substrate by using capillary force)에서는 모세관력 리소그래피를 이용하여 다양한 방식으로 고분자 패턴을 만드는 방법을 개시하고 있다. 그러나 상기 종래 기술에서는 모두 액상으로 이루어져 있기 때문에 얇은 고분자 막을 패턴하는 것이 곤란하며, 모세관력 리소그래피 공정 후 잔존물이 발생하기 때문에, 상기 종래 기술을 생체 물질 패턴 형성에 사용하는 것이 곤란하다.
또한 종래 기술로서, 운모 기판위에 3-aminopropyltri exothysilane (3-APTES)의 자기 조립 단분자막을 도포하고 활성화되어 있는 아미노기에 단백질을 고정화시키는 기술이 개시되어 있다(Immobilization and condensation of DNA with 3-aminopropyltri ethoxysilane studied by atomic force microscopy, Z. Liu, Z. Li, H. Zhou, G. Wei, Y. Song, L. Wang, Journal of Microscopy, Vol. 218, 233-239, 2005). 그러나 상기 종래 기술은 운모와 같은 고가의 재료를 사용하고, 선택 적인 위치에 단백질을 고정하기가 곤란하다.
이와 같이 종래 기술들은 얇은 고분자 막에 패턴을 형성하는 것이 곤란하고, 선택적인 위치에 단백질을 고정하지 못하며, 재료가 고가이고, 장치가 복잡하다는 문제점들을 가진다.
따라서, 본 발명은 상기 종래 기술이 가지고 있는 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 모세관 현상을 이용하여 액상의 고분자를 패턴하는 모세관력 리소그래피와 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriexothysilane: 3-APTES) 분자가 산화된 유리 기판 위에 일정한 각을 가지고 자발적으로 단분자막을 이루는 자기 조립 단분자막을 이용하여 폴리스타이렌(PS)의 패턴을 만들어 단백질이 선택적인 위치에만 고정화 되도록 유도하여 대량 생산이 용이하고 공정이 단순하면서 효율이 높은 바이오 센서의 기판을 만드는 것이다.
이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 모세관력 리소그래피를 통한 폴리스타이렌(PS)의 패턴 형성, 상기 단계 후 부가 가스(O2)를 첨가한 플루오로카본 (fluorocarbon) RIE를 통한 PS 잔존물의 제거, 상기 단계 후 O2 플라즈마를 이용한 표면의 개질, 상기 단계 후 기화된 톨루엔(toluene)을 이용한 산화된 PS 영역의 표면 성질의 재생, 상기 단계 후 유리 영역에 단백질을 선택적으로 고정화하는 단계로 이루어진 것이 특징이다.
종래에는 패턴을 형성하기 위해, 일반적으로 광학적인 방법인 광학적인 리소그래피 방식을 통해서 패턴을 형성 하던가 크기가 큰 경우에는 형틀로 구역을 구분하여 단백질을 원하는 위치에 고정시켰다. 하지만 광학적인 방법의 경우 비싼 광원을 사용해야하고 많은 장비도 필요로 되기 때문에 공정의 단순화가 필요하다. 또한 형틀을 붙여서 단백질을 고정하는 방식은 크기가 작아져서 마이크로 단위로 만들 때는 그 방법이 불가능하다. 현재 사용되고 있는 이러한 방법들의 문제점을 보완하고자 본 발명에서는 모세관력 리소그래피라는 방법을 사용하였다.
단백질을 고정하는 방법은 물리적으로 흡착시키거나 화학적으로 결합시키는 방법이 있다. 종래의 기술로는 물리적인 흡착을 많이 했지만 유체내에서의 사용이 필요한 만큼 화학적인 단백질 고정화를 통해 강한 결합을 만들어야한다. 이를 위해 본 발명에서는 사용하는 물질로서 3-APTES를 사용하였으며, 이 물질은 말단에 NH2기을 가지고 있고 자기 조립 단분자막을 형성한다.
본 발명에서는 공정을 저렴하게 만들고 생산성은 높일 수 있으며 전체공정이 간단하고 고효율을 지향하도록 저렴한 재료를 사용하였고 모세관력 리소그래피, 자기 조립 단분자막 그리고 기화된 톨루엔(toluene) 공정을 사용한 것에 특징이 있다.
이하 첨부된 도면을 참조로 본 발명을 설명한다.
도 1은 단백질 패턴을 위한 전 공정을 간단히 표현한 공정도로서, 도 1a부터 도 1e는 모세관력 리소그래피 방법을 이용하여 패턴을 형성하는 것을 나타내고 도 1f는 CF4/O2 RIE와 O2 플라즈마 표면 산화를 나타낸다. 도 1g는 3-APTES가 유리 영역위에만 선택적으로 도포된 것을 나타내고, 도 1h는 선택적으로 도포된 3-APTES 위에 단백질 또한 선택적으로 고정화된 것을 도시한다.
모세관력 리소그래피 방법을 이용한 패턴 형성은 도 1의 단계 a)에서 단계 e)까지의 패터닝을 의미하며 외부의 압력이나 고온이 없이 모세관 현상 만을 이용하여 패턴을 형성할 수 있어서 공정이 간단하고 빠르며 대량생산을 가능하게 한다. 패턴 형성을 위해 고분자로는 음이온중합 등을 통해 만들어진 폴리스타이렌(PS)을 사용하였다. 폴리스타이렌은 에칭에 대한 매우 좋은 저항성질을 가지고 있는데 이러한 성질은 RIE와 같은 패턴 전달 공정에서 매우 필수적인 요소이다.
도장으로는 폴리디메틸실란(polydimethylsilane: PDMS)을 사용하였다. 도장의 제작은 PDMS와 경화제를 질량10:1로 섞어 주고 형틀에 붙는다. 그 후 60℃에서 12시간동안 경화하여 떼어내면 PDMS 도장(3)이 만들어진다.
모세관력 리소그래피 공정은 다음과 같이 이루어진다. 먼저, 유리 기판(1)을 준비한다(도 1a). 그리고 상기 유리 기판(1) 위에 폴리스타이렌층(2)을 회전도포 한다(도 1b). 다음에, PDMS 도장(3)을 그 위에 올려놓고 120℃에서 20분간 놓아둔다(도 1c). 이와 같이, PDMS 도장(3)을 상기와 같은 온도 조건에서 폴리스타이렌층(2) 위에 올려두면, 폴리스타이렌층(2)이 물렁해지면서 모세관 오름 현상에 의하여 도장(3)의 빈 공간을 채운다(도 1d). 약 20분 경과후 꺼내어 상온에서 식힌 후 PDMS 도장(2)을 기판에서 떼어내면 원하는 패턴을 얻을 수 있다(도 1e).
이와 같은 방식으로, 유리표면이 노출되야 하는 부분(7)과 폴리스타이렌(PS)이 남아있는 표면(8)으로 분리된 패턴이 얻어져야 한다. 하지만 실제 공정을 진행하면 도 1e와 같이 폴리스타이렌 잔존물(9)이 남는다. 이를 제거하기 위해 반응성 이온 식각(Reactive Ion Etching: RIE)과 같은 비등방성 에칭 공정을 이용하였으며, 이때 반응가스로는 CF4/O2와 같은 부가 가스가 첨가된 플루오로카본 가스를 사용하였다. 전력은 0.01~1 W/cm3로 하고, 압력은 1 mtorr~10 torr의 CF4/O2와 같은 부가 가스가 첨가된 플루오로 가스 환경에서 플라즈마 상태로 진행하였다. 그 다음 표면의 산화를 위해 O2로만 0.01~1 W/cm3에서 압력은 0.001~10 torr를 O2의 공정 조건으로 플라즈마 하에서 진행하였다(도 1f).
위의 표면 산화 공정을 통해 유리 기판(1)뿐만 아니라 PS층(2)도 산화가 된다. 따라서 PS층(2)은 다시 본래의 특성인 소수성을 유지해야만 한다. 이를 위해 본 발명에서는 상기 기화된 톨루엔(toluene)을 이용하여 PS 표면 성질을 재생하였다. 이러한 PS 표면 개질은 도 2에 도시되어 있다. 도 2에 도시된 바와 같이, 반응기 내에 PS가 패턴 된 영역(2)과 유리 기판(1)을 뒤집어서 놓고 톨루엔(6)을 바닥에 넣어 놓는다. 120℃에서 5분간 놓아두면 기화된 톨루엔 분자(6)가 상승하게 되고 이러한 기화된 톨루엔 분자(6)에 의해 PS층(2)의 표면이 재구성(개질) 된다. 플라즈마와 산화작용으로 울퉁불퉁하고 OH기로 덮인 표면에 기화된 톨루엔(toluene)이 닿으면 PS층(2)이 녹으면서 OH 표면이 PS에 덮이고 매끄러워져서 표면 에너지가 낮아지고 소수성이 된다.
이와 같이, 모세관력 리소그래피 공정과 부가 가스가 첨가된 플루오로카본 RIE와 O2 플라즈마 표면 산화 공정을 거치면, 도 3에 도시된 바와 같이, 유리표면이 노출되야 하는 부분(7)과 폴리스타이렌(PS)이 남아있는 표면(8)으로 분리된 패턴이 얻어진다.
도 3과 같이 만들어진 PS 층(2)의 패턴을 물과 함께 섞인 2μmol 3-APTES 용액에 40분간 상온에서 담가둔 후 꺼내면, 도 3의 PS 영역(8)에는 3-APTES 단분자막이 형성되지 않고 산화된 유리표면(7)에만 3-APTES 단분자막이 형성되어진다(도 1g). 이렇게 표면 성질이 다르게 구분된 기판위에 BSA-FITC(bovine serum albumin - fluorescent isothiocyanate conjugate) 단백질을 150μl 떨어뜨리고 3시간 동안 상온에서 놓아두면 3-APTES에만 단백질이 고정되어진다(도 1h).
도 4는 도 3을 형광 현미경을 이용해 분석한 것으로 형광물질이 붙어 있는 단백질을 고정시켰기 때문에 도4와 같이 단백질이 많이 붙어 있는 영역인 PS 영역(8)은 단백질이 붙어 있지 않은 영역인 유리 영역(7)에 비해 상대적으로 값이 크다.
이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명에 따라 제조된 단백질 패턴 기판의 성능을 확인하고자 한다.
<실시예>
가로 2.8 cm × 세로 4.8 cm 크기의 유리 기판을 세척제에 씻어 준비한다. 상대적인 형광 값을 비교하기 위해 이하와 같이 4가지 종류의 기판을 준비한다.
기판 1 : 모세관력 리소그래피 공정에 의해 패턴 형성 후 O2 산화처리와 기화된 톨루엔에 의한 표면 처리 후 3-APTES와 단백질을 고정한 기판.
기판 2 : 기판 1에서 기화된 톨루엔에 의한 표면 처리 공정을 제외한 기판.
기판 3 : 기판 1에서 산화 처리와 기화된 톨루엔에 의한 표면 처리 공정을 제외한 기판.
기판 4 : 모세관력 리소그래피 공정만을 수행한 기판.
1-1) 기판 1의 준비
먼저, 유리 기판(1)을 준비한다. 그리고 상기 유리 기판(1) 위에 폴리스타이렌층(2)을 회전도포 하고, 다음에, PDMS 도장(3)을 상기 폴리스타이렌층(2) 위에 올려놓고 120℃에서 20분간 놓아둔다. 약 20분 경과 후 꺼내어 상온에서 식힌 후 PDMS 도장(2)을 기판에서 떼어낸다. 다음에 폴리스타이렌 잔존물(9)을 제거하기 위해 반응성 이온 식각(Reactive Ion Etching: RIE) 공정을 이용하였으며, 이때 반응가스로는 CF4/O2와 같은 부가 가스가 첨가된 플루오로카본 가스를 사용하였다. 전력은 0.01~1 W/cm3로 하고, 압력은 1 mtorr~10 torr의 CF4/O2와 같은 부가 가스가 첨가된 플루오로 가스 환경에서 플라즈마 상태로 진행하였다. 이렇게 하여 유리 기판(1)과 폴리스타이렌 영역(2)을 명확하게 구분한다. 다음에, 표면의 산화를 위해 O2로만 0.01~1 W/cm3에서 압력은 0.001~10 torr를 O2의 공정 조건으로 플라즈마 하에서 진행하였다. 반응기 내에 PS가 패턴 된 영역(2)과 유리 기판(1)을 뒤집어서 놓고 톨루엔(6)을 바닥에 넣은 다음, 120℃에서 5분간 놓아두면 기화된 톨루엔 분자(6)가 상승하게 되고 이러한 기화된 톨루엔 분자(6)에 의해 PS층(2)이 재구성(개질) 된다.
이와 같이 준비된 PS 영역(2)을 물과 함께 섞인 2μmol 3-APTES 용액에 40분간 상온에서 담가둔 후 꺼내면, 산화된 유리표면(7)에만 3-APTES 단분자막이 형성된다. 이렇게 표면 성질이 다르게 구분된 기판 위에 BSA-FITC(bovine serum albumin - fluorescent isothiocyanate conjugate) 단백질을 150μl 떨어뜨리고 3시간 동안 상온에서 놓아두면 3-APTES에만 단백질이 고정된다. 그 후에 세척하면 앞서 말한 기판 1을 얻을 수 있다.
1-2) 기판 2의 준비
기판 2의 준비는 기판 1의 준비 공정과 동일한 조건에서 준비되는데, 다만 기판 1의 준비 공정에서 톨루엔에 의한 표면 처리 공정만이 제외되었다. 이를 간략하게 설명하면 다음과 같다. 유리 기판(1)을 준비하여, 그 위에 폴리스타이렌층 (2)을 회전도포 하고, PDMS 도장(3)을 상기 폴리스타이렌층(2) 위에 올려놓고 120℃에서 20분간 놓아둔 후에 꺼내어, 상온에서 식힌 후 PDMS 도장(2)을 기판에서 떼어낸다. 다음에 반응성 이온 식각(RIE) 공정을 이용하여 폴리스타이렌 잔존물(9)을 제거한다. 다음에, 표면의 산화를 위해 O2로만 0.01~1 W/cm3에서 압력은 0.001~10 torr를 O2의 공정 조건으로 플라즈마 하에서 진행하였다. 이와 같이 준비된 PS 영역(2)을 물과 함께 섞인 2μmol 3-APTES 용액에 40분간 상온에서 담가둔 후 꺼내 산화된 유리표면(7)에만 3-APTES 단분자막이 형성시킨 다음, BSA-FITC(bovine serum albumin - fluorescent isothiocyanate conjugate) 단백질을 150μl 떨어뜨리고 3시간 동안 상온에서 놓아두어 3-APTES에만 단백질을 고정시킨 후 세척하면 기판 2를 얻을 수 있다.
1-3) 기판 3의 준비
기판 3의 준비는 기판 1의 준비 공정과 동일한 조건에서 준비되는데, 다만 기판 1의 준비 공정에서 산화 처리 공정과 기화된 톨루엔에 의한 표면 처리 공정만이 제외되었으며, 이를 간략하게 설명하면 다음과 같다. 유리 기판(1)을 준비하여, 그 위에 폴리스타이렌층(2)을 회전도포 하고, PDMS 도장(3)을 상기 폴리스타이렌층(2) 위에 올려놓고 120℃에서 20분간 놓아둔 후에 꺼내어, 상온에서 식힌 후 PDMS 도장(2)을 기판에서 떼어낸다. 다음에 반응성 이온 식각(RIE) 공정을 이용하 여 폴리스타이렌 잔존물(9)을 제거한다. 이와 같이 준비된 PS 영역(2)을 물과 함께 섞인 2μmol 3-APTES 용액에 40분간 상온에서 담가둔 후 꺼내 산화된 유리표면(7)에만 3-APTES 단분자막이 형성시킨 다음, BSA-FITC(bovine serum albumin - fluorescent isothiocyanate conjugate) 단백질을 150μl 떨어뜨리고 3시간 동안 상온에서 놓아두어 3-APTES에만 단백질을 고정시킨 후 세척하면 기판 3을 얻을 수 있다.
1-4) 기판 4의 준비
기판 3의 준비는 기판 1의 준비 공정과 동일한 조건에서 준비되는데, 다만 기판 1의 준비 공정에서 모세관력 리소그래피 공정만을 수행한 것이며, 이를 간략하게 설명하면 다음과 같다. 유리 기판(1)을 준비하여, 그 위에 폴리스타이렌층(2)을 회전도포 하고, PDMS 도장(3)을 상기 폴리스타이렌층(2) 위에 올려놓고 120℃에서 20분간 놓아둔 후에 꺼내어, 상온에서 식힌 후 PDMS 도장(2)을 기판에서 떼어내면 기판 2를 얻을 수 있다.
1-5) 성능 평가 결과
형광현미경으로 각각의 기판1, 2, 3 및 4를 분석한 결과는 표 1 및 표 2 그리고 도5와 같다. 표 1은 기판 1, 기판 2, 기판 3 및 기판 4 각각에 대한 형광 측 정 값을 나타낸 것이다. 표 2는 각각의 기판의 유리 영역(7)과 PS 영역(8)간의 형광 강도 차이 값을 나타낸 것이다. 도 5는 4개의 각각의 기판을 형광 현미경으로 촬영한 이미지를 도시한다.
| 강도( 기판1 ) | 강도( 기판2 ) | 강도( 기판3 ) | 강도( 기판4 ) | |
| 측정영역(유리영역) | 165.096 | 150.473 | 160.839 | 107.376 |
| 측정영역(PS영역) | 106.087 | 162.406 | 149.560 | 101.952 |
| 샘 플 | 조 건 | 형광 강도 차 (=│circle in - circle out│) |
| 기판 1 | 모세관력 리소그래피 + 산화 + 톨루엔 + 3-APTES + 단백질 | 59.009 |
| 기판 2 | 모세관력 리소그래피 + 산화 + 3-APTES + 단백질 | 11.933 |
| 기판 3 | 모세관력 리소그래피 + 3-APTES + 단백질 | 11.279 |
| 기판 4 | 모세관력 리소그래피 | 5.424 |
표 1에 나타난 바와 같이, 기판 1, 기판 2 및 기판 3은 형광 강도가 강하게 나오지만, 기판 4는 형광 강도가 상대적으로 상당히 약하다. 기판 4를 기준으로 삼아 상대적인 형광강도를 비교하였다. 표 1의 결과를 가지고 각각의 기판 1, 2, 3 및 4의 유리 영역 영역(7)과 PS 영역(8)의 형광 강도 차이를 표 2에 나타내었다. 표 2에 기재된 바와 같이, 기판 1이 가장 큰 형광 강도 차이를 나타내었는데, 이는 기판 1의 경우가 단백질의 불특정 표면 반응이 가장 적음을 의미한다. 도 5a 및 5b는 기판 4에서의 유리 영역(7)과 PS 영역(8)을 각각 형광현미경으로 촬영한 결과를 나타내고, 도 5c는 기판 3의 유리 영역(7)과 PS 영역(8)을 각각 형광현미경으로 촬영한 결과를 나타내고, 도 5d는 기판 2의 유리 영역(7)과 PS 영역(8)을 각각 형광현미경으로 촬영한 결과를 나타내고, 도 5e는 기판 1의 유리 영역(7)과 PS 영역(8)을 각각 형광현미경으로 촬영한 결과를 나타낸다. 표 2의 결과 수치와 도 5의 시각적인 결과를 통해 분석해 보면 기판 1의 경우가 다른 기판들보다 형광강도가 강하면서 유리표면(7)과 PS표면(8) 간의 형광 강도 차이가 가장 큰 것으로 나타났다. 이는 단백질의 고정화가 잘 되었으며, 선택적인 위치에 단백질 패턴 형성이 불특정 표면 반응 없이 잘 이루어졌음을 의미한다.
이상에서 설명한 것은 본 발명에 따른 하나의 실시예를 설명한 것이며, 본 발명은 상기한 실시예에 한정되지 않고, 이하의 청구범위에서 청구하는 바와 같이 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 변경실시 가능한 범위까지 본 발명의 범위에 있다고 할 것이다.
본 발명에 의하면 모세관력 리소그래피 기술을 사용하여 단백질이 선택적인 위치에만 고정화되도록 하는 효과를 가진다. 또한, 표면 개질을 통해서 두 가지의 성질을 가진 표면을 만들어 줌으로서 원하는 위치에 단백질의 화학적 흡착률을 높이고 원치 않는 위치에 단백질의 불특정 결합을 제거하는 효과를 가진다. 그리고 본 발명은 예를 들어, 폴리스타이렌과 같은 저렴한 재료를 사용하여 제조 비용을 감소시키며, 전체 공정이 간단하고 단순하여 대량 생산이 용이하도록 하여 효율이 높은 바이오 센서 기판을 만드는 탁월한 효과를 가진다. 본 발명에서는 휘발성이 매우 높은 톨루엔에 녹인 폴리스타이렌 용액을 이용하기 때문에 회전도포(spin-coating)가 가능하여 얇은 고분자 막에 패턴 형성이 가능하여, 생체 물질의 패턴 형성이 가능하다.
따라서, 본 발명을 통해서 단백질 패턴이 간단하고 저렴하게 생산 가능하여 생명 분야의 전반에 있어서 연구를 가속화시킬 것이다.
Claims (11)
- a) 유리 기판(1)을 준비하는 단계;b) 상기 유리 기판(1) 위에 폴리스타이렌층(2)을 회전도포 하는 단계;c) 폴리디메틸실란(polydimethylsilane: PDMS) 도장(3)을 이용하여 유리 영역(7)과 폴리스타이렌 영역(8)으로 분리하는 단계;d) 반응성 이온 식각(RIE) 공정을 이용하여 폴리스타이렌 잔존물(9)을 제거하는 단계;e) 산화된 유리표면(7)에만 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriexothysilane: 3-APTES) 단분자막을 형성시키는 단계; 및f) BSA-FITC(bovine serum albumin - fluorescent isothiocyanate conjugate) 단백질을 이용하여 상기 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriexothysilane: 3-APTES)에만 단백질을 고정시키는 단계를 포함하는 단백질 패턴 형성 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 단계 d) 후에 O2 플라즈마를 이용하여 표면을 산화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 패턴 형성 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 단계 d) 후에 O2 플라즈마를 이용하여 표면을 산화시키는 단계; 및 톨루엔(6)을 기화시켜 폴리스타이렌 영역(8)을 개질하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 패턴 형성 방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 c)에서 폴리디메틸실란(polydimethylsilane: PDMS) 도장(3)을 상기 폴리스타이렌층(2) 위에 120℃에서 20분간 놓아두는 것을 특징으로 하는 단백질 패턴 형성 방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 d)에서 반응가스로는 CF4/O2와 같은 부가 가스가 첨가된 플루오로카본 가스를 사용하고, 전력은 0.01~1 W/cm3로 하고, 압력은 1 mtorr~10 torr의 CF4/O2와 같은 부가 가스가 첨가된 플루오로 가스 환경에서 플라즈마 상태로 진행하는 것을 특징으로 하는 단백질 패턴 형성 방법.
- 제 2항 또는 3항에 있어서, 상기 표면 산화 단계는 O2 가스로 0.01~1 W/cm3에서 압력은 0.001~10 torr로 플라즈마 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 단백질 패턴 형성 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 톨루엔(6)은 반응기 내에 폴리스타이렌 영역(8)과 유리 영역(7)을 뒤집고, 바닥에 120℃에서 5분간 놓아두는 것을 특징으로 하는 단백질 패턴 형성 방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 e)에서 PS 영역(2)을 물과 함께 섞인 2μmol 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriexothysilane: 3-APTES) 용액에 40분간 상온에서 담가두는 것을 특징으로 하는 단백질 패턴 형성 방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 f)에서 BSA-FITC 단백질을 150μl 떨어뜨리고 3시간 동안 상온 상태에서 방치하는 것을 특징으로 하는 단백질 패턴 형성 방법.
- 제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 단백질칩.
- 삭제
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| CN103972388A (zh) * | 2014-05-09 | 2014-08-06 | 北京航空航天大学 | 制备尺寸可控的高取向有机小分子半导体单晶图案的方法 |
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