CN1178063C - 测定多种被分析物的固态元件的生产方法和应用、及包括该元件的系统 - Google Patents

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Abstract

生产用于对多种被分析物进行测定的固态元件的方法，所述固态元件包括一个基底和许多离散的反应位点，每个位点支承一个与基底共价结合的配体，其中在上述反应位点之间的基底表面相对于被分析物是惰性的，所述方法包括如下步骤：对所有的所述表面进行活化并且使其成为疏水性的；和在被活化的、疏水性的表面上施加一系列配体，而形成离散的反应位点。前述方法获得的固态元件及其应用。一种包括所述元件的分析多种被分析物的系统。

Description

测定多种被分析物的固态元件的生产 方法和应用、及包括该元件的系统
                        技术领域
本发明涉及一种同时测定多种被分析物的元件和装置。
                        背景技术
通常借助于一些特殊方法如酶免疫测定法、高效液相色谱法、气相色谱法、酶法和比色法对结构各异的被分析物进行分析。这些方法多数是对一种被分析物采用一种测试方法。
分析方法的自动操作常常集中在分批和随机选取顺序采用独立的试验方法对单个试样进行多项分析的分析装置上。这就需要采用多包专用的试剂盒。此外，还需要使用各类设备如临床化学分析设备、HPLC、GCMS、自动免疫测定装置或原子吸收仪器进行分析。
多种被分析物系统应包括能对一个试样中的各种被分析物同时进行分析的装置。上述分析应能鉴别出该试样中的各种被分析物，并能对每种被分析物给出定量结果。虽然现在常有声称为能分析多种分析物的方法，但却不能满足上述两个要求。
在多种被分析物系统中，常规的基底含有若干独立的试验反应位点，每个位点都具有不同结合的配体。试样与各反应区接触，然后利用一套检测技术鉴别所存在的被分析物。重要的是所采用的方法应能对每种不同被分析物进行定量分析。
为了在一个基底上产生生物活性配体的空间上不同区域的多种被分析物阵列，最常用的是采用光刻处理技术。用一种不耐光的连接剂(linker)涂覆上述基底。理论上，上述连接剂应只在用某一适合波长光照射后才对结合配体产生反应。通过在基底上放置一种物理掩膜片(通常由铬制成)而获得空间分辨率。掩膜片中孔的图形确定了基底上结合区域的图形。
为了固定每个生物配体，一般拟定的步骤是：照射第一位点，与待固定的第一配体一起保温被照射的基底，洗去松散结合的配体，保护通过上述照射步骤激活的未反应位点，照射待固定的第二生物配体区，象处理第一配体那样顺序地重复上述步骤。借助于来自激光器的相干紫外线光源或借助于一些物理掩膜片和非相干光源控制照射的位点可确定空间分辨率。这使固定很多生物配体的工作成为一种费时间的过程。上述光刻处理技术的另外的不足之处是需要昂贵的物理掩膜片或激光器光源。此外，具有高度的非特异结合。
例如采用芳基叠氮化物、氟代芳基叠氮化物和苯酮伴有高度非特异结合。高度非特异结合使测定本底高，明显减少各种被分析物测定的动态范围。这种非特异结合主要由于通过离子相互作用、Van der Waals力等将分子被动吸附到非活化的不耐光交联剂表面上而产生的。
WO-A-9516204文献披露了一种减少与高度非特异结合有关的问题的光刻处理方法。在该方法中，上述表面结合分子是亲和素，上述不耐光的分子是光生物素或其衍生物。虽然该方法声称减少了非特异结合，但这种技术仍需按上述顺序进行，因而也很费时。若对于每个单一待固定配体基本上都需要经历照射、结合、保护和洗涤步骤，则固定二十个单独生物配体共需要80步。
通过被动吸附也能获得空间分辨率。例如，US-A-5432099中公开了通过离子相互作用，疏水性相互作用和Van der Waals力的结合将配体结合在基底表面的内容。被动吸附过程与pH值、温度、离子强度和所采用的基底类型的变化有关，这使结合过程的控制更困难。这种方法的主要缺点是生物测定的洗涤步骤或保温步骤期间一定比例的弱固定配体容易被解吸，因此内部测定精度和相互间的测定精度差。
在很多公开出版物中采用的交联剂是戊二醛。这种交联剂有很多缺点，其中包括很可能改变蛋白质功能的使蛋白质交联的倾向。另一缺点是，例如若采用氰基硼氢钠作为还原剂，上述偶联过程将包含既费时又可能非常有害的还原步骤。也曾采用异种双官能连接剂，但在很多情况下，这些连接剂要求在待结合的蛋白质上有自由的硫氢基。这将迫使蛋白质在固定之前进行修饰。
在测定多种被分析物时希望既提供定性结果又提供定量结果。例如目前多种被分析物测定已经用于抗生素的测定。这些测定主要是根据微生物抑制测定原理进行的，在上述测定中存在于试样中的抗生素抑制细菌生长并形成一个与试样中抗生素浓度成正比的间隙区。但是，这种方法对识别抗生素不能给出任何提示，或者不能精确测定抗生素的浓度。微生物抑制法也很慢，完成全过程需要数天。
曾力图使如高效液相色谱法(HPLC)或气相/液相色谱质谱法(GCMS/LCMS)之类的化学筛选方法适用各组抗生素如青霉素、磺胺类、氨基苷类、四环素等的结构差异性/极性的极端状态。此外，色谱法需要彻底的试样制备，以便获得能达到所要求的测量极限的信噪比。
可采用的分析多种被分析物的元件包括Triage[见ClinicalChemistry 38(9)：1678-1684(1992)]和Advisor[见Clinical Chemistry39(9)：1899-1903(1993)]。这些元件仅适用于定性分析。
Triage元件用于同时从人的尿液中检测七种滥用药物。每个元件只能分析一个尿液试样。在测试过程结束时，测试人员用肉眼检查每个药物特异试验区中是否有红线存在。拟定的所有测试步骤必须由测试者手动完成、也没有所得试验结果的硬拷贝。
Advisor元件与Triage元件的应用类似。Advisor元件可鉴别五种不同类别的滥用药物。该元件利用凝聚反应测定原理进行操作，对每种药物采用单独的通道。拟定的所有测试步骤也由测试者完成。阴性试样有凝聚颗粒，而阳性药物试样提供颗粒的未凝聚图形。
生物学上应用的大多数生物传感器/微型制造元件都采用硅作为基底，另外也有用玻璃或石英作为基底的。硅具有完全可控制的晶体结构，这种结构具有准确限定的晶面。硅基底的均匀性使其成为开发多种被分析物测试元件的理想选择。
但是象硅这样的深色基底产生所谓黑体效应。在用荧光检测的情况中，用特定波长的光激发荧光团，深色基底可吸收入射的激发光能，因此减少了来自荧光团的光发射。
                        发明内容
本发明提供一种生产用于对多种被分析物进行测定的固态元件的方法，所述固态元件包括一个基底和许多离散的反应位点，每个位点支承一个与基底共价结合的配体，其中在上述反应位点之间的基底表面相对于被分析物是惰性的，所述方法包括如下步骤：对所有的所述表面进行活化并且使其成为疏水性的；和在被活化的、疏水性的表面上施加一系列配体，而形成离散的反应位点。
本发明还提供由上述方法获得的、用于对多种被分析物进行测定的固态元件及其在测定多种被分析物中的应用。
本发明还提供一种分析多种被分析物的系统，它包括上述固态元件、一个移动平台、一个试样处理系统、一个液体试剂输送系统、一个温度控制的暗盒、一个CCD摄相记录仪和图像处理装置。
按照本发明，用于测定多种被分析物的元件包括一个基底和大量离散的反应位点，每个位点支承一个与基底共价结合的配体，其中所述反应位点之间的基底表面相对于被分析物是惰性的。因此，本发明提供了一种固态的多种被分析物的测定元件，这种元件几乎或根本没有非特异结合。
本发明的元件可以通过激活合适的基底表面并将配体阵列施加到上述表面上的离散位点上而制备。如果需要，可以保护其它活性区。可以使上述配体在含水系统中施加，若使上述其它区域成为疏水性的则更好。可以通过连接剂将配体结合在基底上。具体地说，最好使激活表面顺序地与有机硅烷、双官能连接剂和配体反应。
作为本发明的一部分，为了在共价固定在微型制造的硅基底或陶瓷基底上的有机硅烷之间提供高效偶联化学性质，采用了双官能交联剂。因此，可使生物配体固定在多种被分析物的阵列中。
本发明不需要多种单独试验的试剂盒和各类仪器，因此，有利于在一个单个试样上同时进行多种被分析物测定。本发明提供了一种单独一体化的、能同时进行化学的宽范围测定的分析仪。此外，试验用试剂可以以用于具体的被分析物组的组合形式提供。
作为本发明的一部分，借助于在化学激活的基底上的配体微观流体分配，使若干生物配体以点或线状空间限定图形的形式固定。这些生物配体与基底共价结合。生物配体的偶联能力可使化学反应在几分钟内完成。上述固定过程可以确保生物配体在短期和长期内均保持其生物活性。
本发明还提供一种能同时测定以多种被分析物形式出现的大范围的被分析物的一体化分析器系统。该系统可给最终使用者带来极大的方便而且能从每个试样中鉴别出多种被分析物并给出定量分析。这种优选的分析器系统由一个X-Y移动平台、一个试样处理单元、液体调节/流动控制装置、一个温度控制的暗盒、一台CCD摄相记录仪和图象处理软件组成。上述平台可与步进电机相连，以便在分析过程的每一阶段使定位装置的定位精度能达到10μm。
                        附图说明
图1示出了不一致的基底表面的形成；
图2示出了基底表面上的基团的化学激活状况；
图3、5和6示出了配体共价固定在基底表面的状况；
图4示出了在基底表面使用的胶乳颗粒；
图7-11示出了用于结合实现本发明的基片的元件；
图12-14是适用于本发明的分析元件的系统示意图；
图15为由本发明的装置测定的被分析物的标定曲线。
                      具体实施方式
用在本发明的元件中的基底例如可以是硅、石英、玻璃或陶瓷材料的。由于可成功地使用荧光和化学发光检测技术，陶瓷基底(氧化铝)是硅基底的极好的代用品。由于陶瓷材料晶体学不会使其直接选作基底，上述发现是出人意料的。
可将陶瓷基底加工成具有一定的粒径(1-30μm)。本发明中使用的陶瓷基底的优选粒径小于20μm，最好小于10μm。减小粒径更有利于改进表面均匀度，这反过来又能提高生物测定性能。陶瓷基底的其它重要特性包括表面构形公差、空隙率、真空度和不吸水。
优选的陶瓷材料含94％的、粒径范围在4-8μm的氧化铝(Al2O3)。这种材料具有真空气密性，研磨后表面不平度为0.6-0.8μm。通过抛光处理可改善其表面均匀度，以使表面变化为0.4-0.5μm。通过磨光和抛光可进一步改善表面的均匀度，使表面变化性在0.05-0.1μm的范围。
业已发现，某些陶瓷基底的性能与粒径的特性有关。最大粒径为8μm(例如粒径为4-8μm)的陶瓷材料具有优良测定性能，较大粒径的材料则不太满意。相对于4-8μm基底得到的结果，评估了粒径约为1μm的陶瓷基底，没有得到改善的结果。由于颗粒非常小的陶瓷其材料费用将大大提高(接近5倍)，所以采用上述粒径是非常有利的。
用厚度精确的氧化膜(例如厚100nm的氧化膜公差为±2nm)可制成适合的硅基底。上述氧化膜厚度可为50-500nm，优选小于200nm，最好在100nm的范围。
上述基底可以构成固态微型制造的微型机械元件的一部分，这种元件用于兽医和临床诊断应用的广泛的评审试验。每个固态试验元件都有一系列反应区。对于一种单独的被分析物各反应区是特定的。上述反应区可以为点状、沟道状、小凹状，凹坑状、井道状或腔室状。通过将生物分子固定在基底上可制得上述反应区。
通常，本发明元件的面积最大达1cm2。每个反应位点的面积常常小于1mm2。
最好将固态基底制成具有点、腔室、沟、井道、小凹等的交错网络。在沟或井道内形成柱状物也是很有利的。这种凹凸不平的结构有利于使结合的生物配体和试剂之间相互作用的表面面积最大，并能大大缩短在竞争免疫测定法和夹层免疫测定法等中的保温期。
作为比如说硅或陶瓷基底上的小凹或沟的一种可供选择的情况或附加情况，其表面可微型制造成腔室/储器/沟道混合的毫微升和微升的结合。例如，首先使硅表面氧化形成氧化层。然后沉积一层光刻胶层，从该层形成所需图形。在上述氧化层上形成图形后，除去上述光刻胶层，再用例如HF蚀刻硅并除去氧化膜。最后，使氧化膜均匀地生长在整个硅片上。
图1示出了所说明的过程。在步骤(i)中，使硅片1氧化，以形成氧化层2；在步骤(ii)中，沉积光刻胶层3；在步骤(iii)中，利用光形成具有图案的氧化层；在步骤(iv)中，除去光刻胶；在步骤(v)中，蚀刻片1；在步骤(vi)中，除去氧化膜；在步骤(vii)中再形成连续的氧化膜2a。
最好使生物配体共价固定。可以采用被动吸附相互作用，但被动吸附易受pH值、温度和离子强度变化的影响，在某些情况下，在保温步骤和洗涤步骤期间可能释放弱结合的配体，从而使测定重复性差。当然希望在固定过程之后，生物配体保持最大的活性。
在任何化学激活之前，应清洁基底表面。上述第一步最好包括在碱性去污剂中通过声处理清洁表面，接着再用双倍去离子水彻底清洗。然后用铬酸溶液对基底进行处理。如图2所示，铬酸溶液既能进一步清洁表面又能打开表面环氧化物基团。当然也可以用其它方式例如进行1小时声处理打开环氧化物基团。
这样形成的表面羟基可供衍生。例如，如图3所示，反应顺序包括采用有机硅烷，然后再用(杂)双官能交联剂Z-R-Y，以形成高活性中间物，最后采用官能配位体，产生共价固定。
更详细地说，在式(RO)3Si-(CH2)n-X的有机硅烷中，每个R是一个如CH3或CH2CH3之类的烷基或烃基；n是一个整数，如1至18；X是官能团，如环氧环己基，NH2，CHO，OH，SH，对氯苄基，间氯苄基，Br，Cl，-NH-CH2-CH2-NH2，2，3-环氧丙氧基，-N＝C＝O，-N＝C＝S或对氯磺酰基苯基。可选择这些有机硅烷以提供一种能与生物分子形成共价键的反应性端基，或一种反应性较差的部分(如NH2，这时必须进一步用双官能交联剂活化以提供一种合适的端基)。由于可以通过生物配体上的亲核基团使生物配体共价固定，所以具有末端亲电子官能团的有机硅烷不必用双官能交联剂激活。
在具有亲核基团的有机硅烷的情况中，可以采用多种双官能交联剂中的任一种，以提供一种生物分子或配体可通过它共价结合的很有反应性的化学基团。本发明包括利用双官能连接剂，这些连接剂能用于批量生产化学活化基底且足够稳定，因而在生物分子或结合配体的共价结合之前可长期保存。最好连接剂在正常大气情况下不起反应，而在很短的时间内(通常＜10分钟)又能与待固定的生物配体官能团充分反应形成共价键。
上述双官能连接剂例如可以是碳酰氯，二氯硫化碳，N，N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，亚二甲苯基二胺，1，6-二氨基己烷，1，12-二氨基十二烷，1，6-二异氰酸基己烷，1，12-二异氰酸基十二烷，1，4-亚苯基二硫代异氰酸酯、氰尿酰氯，对苯二甲醛，对硝基苯甲酰氯，磺胺酸、对甲苯磺酸2-氟甲基吡啶鎓，，3-氨基苯基硼酸，对溴苯基硼酸，焦碳酸二乙酯，氯甲酸乙酯，对溴苯胺，对溴苯基酰肼，对溴苯甲醛，对溴苯甲醛的1，2-亚乙基二醇，N，N’-羰基二咪唑，对苯二甲酰氯，表氯醇，1，4-二碘苯，1，4-二溴苯或例如对氨基苯甲酸、对溴苯基甲酸、对溴苯基乙酸、对溴乙基苯甲酸、对溴甲基苯甲酸、对甲酰苯甲酸、对羟甲基苯甲酸的N-羟基琥珀酰亚胺衍生物，对甲酰苯甲酸、对溴苯基丙酸或对羟苯基丙酸的1，2-亚乙基二醇。可以用不耐光的交联剂与具有亲核或亲电子基团的有机硅烷反应。上述交联剂例如是对叠氮苯甲酸或对氨基二苯酮的N-羟基琥珀酰亚胺。
作为一种替换或使用双官能连接剂之外，共价固定一层胶乳颗粒也是很有利的。上述胶乳颗粒的直径优选小于500nm，最好小于150nm。上述胶乳颗粒可以具有一些功能团，如-CH2Cl，-CHO，对氯苯基，对氯苯乙烯基，-N＝NH，-NH-NH2或NH2。可以在约0.5％至1％w/v的浓度下与由合适的有机硅烷改性的基底一起在有或没有如上所述的双官能连接剂的条件下保温上述胶乳颗粒。
图4示出了固定胶乳的两种反应示意图。两者中任一种反应之后可以是用第二种连接剂激活胶乳并固定生物分子，或者比方说，直接共价固定抗体。
使用聚苯乙烯胶乳颗粒的替换方式是将生物配体共价固定在已与硅烷化基底(Silanated substrate)结合的聚乙二醇衍生物上。例如，将具有两种亲电子基团(如环氧或羰基咪唑)的PEG衍生物与具有-NH2端基的硅烷(如APTES)在挑选的基底上进行反应。一种合适的反应顺序如图5所示。
直接将生物配体共价固定在硅烷层上也是很有利的，这样就不需要用聚合材料或双官能连接剂激活硅烷。所述有机硅烷应该易受化学基团(如NH2，SH，OH或NH＝NH2)的亲核攻击。适用于直接结合生物配体的有机硅烷可以具有卤化物，环氧、异氰酸基、醛或甲苯磺酸酯官能团。这类反应如图6所示，其中E是有机硅烷上的亲电子基团。E的例子是Br，Cl，-O-CH2-CH＝CH2，-NCO，-CHO和对氯磺酰苯基。
由于缺少使有机硅烷的甲氧基或乙氧基起反学反应的亲核基团，在硅烷化过程中具有亲电子基团(如缩水甘油氧基(glycidoxy))的有机硅烷还有不易受聚合作用的影响的优点。因此，基底表面不应当含聚合的有机硅烷。
借助于在表面化学官能团和以空间上有利的位置存在于待固定的生物分子上的合适化学基团之间形成共价键的快速动力学，上述表面的化学性能可提供一种获得空间分辨率的途径。通过微量流动分配器以单独液滴或形成线状的一串液滴的形式使生物分子最好出现在基底的表面。被分配的体积在1至100nl的量级，最好低于50nl，例如接近10nl。在表面上蒸发上述被分配的液滴或线状液滴之前，形成共价键的速度可在数分钟内实现共价固定。被供给的液滴或线状液体的位置精度公差应为±20μm。
尤其是如果在水中施加配体，还希望表面是疏水性的，以防止被分配的液滴或液线横向扩散。这种性质可提供极好的点质量和再现性，并能在每单位表面面积有较多的待共价固定的生物分子点。
本发明可克服传统光刻法所存在的缺陷，通过能形成生物配体的空间上不同的点，不需要紫外光或物理掩膜片。如上所指出的那样，借助于微量分配技术可得到空间分辨率。共价偶联反应的快速动力学是一个重要的因素，以便确保在空间上不同区内高效偶联生物配体，消除被固定的生物配体横向离开。
然后，例如用本领域普通技术人员公知的保护分子可保护基底上未进行反应的化学部分。这类合适的分子包括如酪蛋白，牛血清清蛋白，乳清蛋白等蛋白质，或如甘氨酸，谷氨酰胺等低分子量的保护剂。
还可以采用不耐光的连接剂。例如用不耐光的连接剂(如二苯酮，芳基叠氮化物等)在黑暗中与基底表面上的有机硅烷进行反应。然后，如果需要可用生物配体在表面标出点位置，再用紫外线短时间照射或用可见光长时间照射而实现共价结合。在有紫外线或可见光的情况下，用类似于上面所描述的分子的保护剂保护基底表面的其它区域。
例如通过在糖溶液(如海藻糖)中短期(1小时)保温，然后在37℃下干燥16小时，可使基底已固定的生物分子稳定。然后将稳定处理的基底密封在装有干燥剂的箔袋中并贮存。将其存放在+2℃至+8℃下时，在6个月或12个月以上(如长达并超过二年)上述被固定的生物分子都是稳定的。
可将上述元件安装在具有控制试剂混合效率的特点的多种不同承载部件内。通过毛细吸力，离心力、负压力或电渗流可使液态试剂流动。利用电渗流可以不需用阀门，因此不用活动的机械部件。
通过将玻璃片与微型制造的表面结合可形成闭合的沟道。在与玻璃片结合之前将生物分子共价固定在上述表面上。一些结合工艺(如阳极结合)将使温度升高，从而可能破坏生物分子。因此，结合工艺应不使被固定的生物分子变性。一种合适的方法是间接结合，如通过合适的胶粘剂(如环氧胶粘剂)将上述晶片与玻璃片结合。
可将上述元件放在合适的承载部件中，图7和8示出了不同的承载部件。作为例子，图8示出的元件的尺寸为48.62mm×48.62mm，它包括一些内径为10mm、外径为12.82mm的井道。井道中心到中心的距离为15.36mm。
上述元件可具有增强试剂、试样等混合的特点。图9中所示的元件包括试剂加入部位11，试剂沟道12和试验反应位点13。
图10中的元件包括试剂贮存部分21、供给导管22、试剂供给沟道试验部位23和排除物贮存部分24。图11示出了具有类似部分的四沟道试验结构。
本发明提供一种用于对分子量在很广范围、结构各异且极性的多种被分析物同时进行定量测定的完全成一体的系统。所得到的被分析物组适于临床/兽医诊断或药物筛选。
根据被分析物选择结合配体，这是本领域普通技术人员所熟知的。合适的被分析物包括：
抗生素，如四环素、磺胺类、离子载体类(ionophores)、氨基苷类、青霉素或氟喹诺酮类(fluoro quinolones)；
激素，如黄体化激素(LH)，催乳激素(PL)，促卵泡激素(FSH)，或促甲状腺激素(TSH)；
心脏损伤的标记，如肌红蛋白、碳酸酐酶、肌钙蛋白I，糖原磷酸化酶BB，CK-MB，脂肪酸结合蛋白或肌钙蛋白T；
传染病的标记；
过敏反应标记；
滥用药物；
酶；
病毒；
核苷酸；和
肽。
例如，一组是用于检测磺胺类抗生素。本发明提供了用于同时定量鉴定比如说多达20种磺胺的方法。其它例子包括心脏病、传染病和受孕组。
本发明可以同时测定比如说多达二十种结构上没有相似性的被分析物。可测试的试样基质包括血清、血浆、尿液、胆汁、粪便、组织、水和食料。试样的体积要求很小，通常＜1.5μl/被分析物。上述试剂如酶标记抗体、酶标记半抗原、荧光标记抗体或荧光标记半抗原可以全部盛放在一个单一的试剂容器中，可明显降低处理液体的要求。
在对例如黄体化激素、促卵泡激素、催乳激素、促甲状腺激素等的夹层测定中，将上述试样与测定缓冲剂一同加入并进行短时间保温，通常保温时间少于30分钟，最好少于10分钟。紧接着是洗涤步骤，加入标记的测定抗体的混合物并再保温一段时间。这段时间通常也短于30分钟，最好短于10分钟。然后对元件进行洗涤，以便除去任何未结合的标记物并量化上述信号。
对某些测定来说，为了除去潜在的干扰物如类风湿因子的干扰在微型制造的元件中采取某种手段是有利的。例如在试样与反应区接触之前通过将试样与固定的免疫球蛋白的区域结合可以除去类风湿因子。
另一例子是HAMA(人抗小鼠抗体)干扰，这类抗体在利用单克隆小鼠抗体的测定性能方面可引起严重问题。为了消除这些问题，传统的办法是在试剂中加入昂贵的添加剂。在本发明中，具有通过使试样与微型制造的元件上的一些区域接触而除去HAMA干扰的优点，从而可在试样达到反应区之前除这些抗体。
通常，可使配体覆盖元件的部分，它们能结合污染物。这对于在元件表面(如沟道中)限定地散布的情形是很重要的。这种去除干扰成分的能力可提高试验结果的精度。
也可使上述测定标记固定在枝状物分子表面。事实上，上述枝状物分子是聚合的，由小结构分子反复偶联而合成。它们可从AldrichChemicals购得，其分子量在一定范围并对端官能基团有所选择，如选择NH2或COOH。然后与传统的偶联化学方法一起采用杂双官能连接剂制备测定标记缀合物。对于小的半抗原分子(如β-兴奋剂，促蛋白合成甾类或抗生素)，最好使小的枝状物(最好不大于16个表面基团)与大的枝状物(通常大于64个表面基团)偶联。上述小分子量半抗原(小于1000道尔顿)与小枝状物上的化学基团偶联，随后是测定标记物的共价结合。可以通过透析和凝胶渗透色谱法对枝状物缀合物进行纯化。
适用于特定试验组的试剂含有多种组分(例如酶标记抗体、荧光标记抗体、胶乳固定抗体、枝状物抗体-荧光团缀合物、枝状物抗体-荧光团缀合物、枝状物抗体-酶缀合物、酶标记半抗原、荧光标记半抗原等)。可能的试验组是很不同的，可以根据临床诊断(或兽医诊断)选择合适的组。例如需要用于检查传染性疾病(如肝类、HIV、梅素等)的组。其它组包括孕激素(fertility hormones)、心脏标记、过敏反应蛋白等。除临床参数外，还可以测定药物残余物的大组。
本发明可以辨别如抗生素之类的各种成分。例如，通常在数分钟的时间范围内在表面面积为1cm2的元件上可同时定量分析多达20种抗生素，其灵敏度超过HPLC/GCMS方法，并可与传统的单参数酶免疫测定法相比。这种方法可以简单地扩展用于促蛋白合成甾类、β-兴奋剂，β-保护剂、杀虫剂、治疗用药物等。
为了进行分析，化学发光、生物发光或荧光也是适合的。检测系统最好装有一台电荷耦合元件(CCD)摄相记录仪以便测量荧光和化学发光。简单地说，上述CCD摄相记录仪收集从微型制造的元件上的试验区域发出的光信号，并将上述光信号转变成相对光单位(RLUs)。
采用用于标记的荧光团的滤光器可以直接察看以荧光为基础的检测系统。
合适的化学发光试剂是在波长为433-445nm的条件下可进行分析的鲁米诺。用1，2-dioxetane借助于测定碱性磷酸酶标记的生物分子也可观察到化学发光。
为了方便地测定被分析物，本发明最好利用采用了CCD的化学发光检测系统。为了在由化学发光反应发出的上述光波波长(在鲁米诺的情况下约433-445nm)条件下改进俘获效率，最好是一台背照式摄相记录仪(back-illuminated camera)。
整个系统可以由个人计算机操作，特殊设计的程序控制X-Y平台、分配器单元、试样处理、温度控制、保温时间和CCD摄相记录仪。图12-14示出了这种系统的结构。
图12示意地示出了具有两个控制单元31、32的个人计算机(PC)的相互配合情况。单元31与用标号33代表的CCD成像系统相连。单元32与分别用标号34和35代表的分配器单元和带有试样盘的X-Y移动平台相连。
图13示意地示出了X-Y移动平台，该图示出了一个装在线性致动器42上的试样平台41。X-Y移动在分别与驱动机构45、46相连的步进电机43、44的控制下。上述移动由“原位”传感器47、48限制。
标记生物分子和某些未标记生物分子对光的敏感性要求在没有光的条件下进行测定。通过形成不透光的方式实现无光条件。最好对不透光的环境进行温度控制，例如控制在温度变化±0.2℃或优选±0.1℃的范围，以确保满意的测定准确度和精度。
图14示出了装置的透视图、局部平面图和剖切的侧视图。具体地说，图14A示出了试剂存贮容器51、不透光的门52和带有可取下的罩54的摄相记录仪机身53。摄相记录仪的主要部件可放在上述壳体的外部。摄相记录仪的镜头放在壳体上的孔中。
图14B示出了处于试样盘55上的试样轮廓，概括地示出了废料区56和成像区57。摄相记录仪53装于这些区域的上方。图14C除容器51、照相记录仪53、X-Y平台41和步进电机43之外，还示出了分配器泵58。
图14示出的系统是根据在任何时候都能固定20个3×3的试样固定底架而设计的。这意味着如果在每1cm2的微型制造元件上有20个独立反应区，在一个试样上可同时完成总数为3600个分析。也可选择同时分析180个试样的20个不同试验参数。
如上所述，可以对被分析物进行标记。也可对配体进行标记，这样可通过部分占有率进行分析。
下面的实例举例说明了本发明。
例1磺胺类测定
在该例中，通过接触的相互作用将12种抗体共价结合固定在具有化学改性表面的平陶瓷(氧化铝)基底的离散区，所有每种抗体对单独的一种磺胺是特异的。利用竞争性免疫测定方式完成成多种被分析物的测定。
更详细地说，用碱性去污剂(RBS35，5％v/v)接着再用两倍去离子水对陶瓷基底(1cm×1cm)进行超声清洗，然后再放入6M HCl中达16小时。再把上述片放入超声槽中的铬酸中达1小时。
用双倍去离子水和丙酮对基底进行彻底清洗，然后将上述基底放入炉中在120℃条件下干燥两小时。经这种预处理后，用有机硅烷Y-缩水甘油氧基三甲氧基硅烷(10％V/V)在无水甲苯、4-二甲氨基吡啶(1.25g/L)和三乙胺(1％V/V)中使上述基底硅烷化。使这种混合物回流四小时，然后在室温下放置过夜。基底在120℃下固化四小时之前，用甲苯和丙酮对该基底进行洗涤。
固化步骤之后，将上述基底存放于容器中并贮存在室温下，直到需要标出磺胺类抗体的点位置为止。用BIODOT XY3000分配器标出磺胺抗体的点位置。被测定的十二种磺胺是：周效磺胺、磺胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪、磺胺甲氧嗪、磺胺甲嘧啶、磺胺吡啶、磺胺异噁唑、磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺地索辛和磺胺嘧啶。
对于每种磺胺抗体采用的分配体积约为20nl。在1cm2的基底上形成12个离散区的12种磺胺抗体在37℃下保温2小时。用含有2％酪蛋白(w/v)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.2)清洗基底，并在+2-8℃下放在同样的缓冲剂中保护过夜。用含PEG300(0.05％v/v)的PBS清洗以后，将元件放在承载部件上。
将多种磺胺标样(200μl)和磺胺辣根过氧化物酶缀合物的混合物(100μl)加入合适的元件上的反应井道中，并在室温下保温15分钟。对于上述12种磺胺的每一种，上述标样包括5、10、50和100ng/ml。
用PBS/PEG缓冲液清洗多种磺胺元件以除去过量的试剂，并将300μl化学发光基质[鲁米诺(1.4mM)/尿素过氧化氢(9.6mM)]引入每个元件。用曝光时间长达4分钟的CCD照相记录仪使上述元件成像。对12种磺胺的每一种均可获得标准曲线。图15中的曲线分别表示12种磺胺中每一种的校准曲线。绘制在Y轴上的％B/Bo值代表由每种磺胺标样(作为log10绘制在X轴上)引起的零标样RLU(相对光单位)值的抑制％。
例2激素测定
在本例中，对三种大分子量激素(即催乳激素(PL)、促卵泡激素(FSH)和黄体化激素(LH))进行多种被分析物的测定。该例显示出用于夹层基础免疫测定(Sandwich-based immunoassay)的多种分析物测定。在同一组中测定上述三种激素时，看不出明显的交叉反应性。
化学预处理和硅烷化过程完全如例1中所描述的那样。在经化学改性的基底的离散区域上固定PL、FSH或LH单克隆抗体(被分配的抗体约20nl)。在具有如例1所述的环氧化物表面的硅基底和陶瓷基底两者上均进行多种分析物的测定。
在测定中，将150μl多LH/PL/FSH血清基标样和150μl稀释测定缓冲剂加入上述元件中，并在室温下保温15分钟。清洗步骤之后，将300μl LH-HRPO/PL-HRPO/FSH-HRPO缀合物的单缀合物混合物加入并保温15分钟。然后再对元件进行洗涤，以除去过量的试剂，并将化学发光试剂[鲁米诺(1.4mM)/尿素过氧化氢(9.6mM)]引入。用曝光时间长达4分钟的CCD摄相记录仪使上述元件成像。对图像进行处理后，对每种激素绘制出标准曲线。
例3磺胺测定
与例1相反，用微型沟道进行多种磺胺测定。元件如图11所示。在该例中，试剂加入容器21为2mm×2mm、300μm深(体积1.2μl)，沟道23各为5mm长、200μm宽和100μm深(体积100nl)，容器24为1.9mm×8.6mm，300μm深(体积4.9μl)。
如例1所述对表面进行化学改性。将抗体加入各沟道中并在37℃下保温2小时。然后象例1一样对基底进行保护和洗涤。
将多种磺胺标样(200μl)和磺胺辣根过氧化物酶缀合物(100μl)混合。将所得到的试剂1μl吸移到上述各容器中，以供给用于每种磺胺的抗体涂覆的沟道。合适的试样含所有磺胺类10或100ng/ml。
借助于毛细作用可使试剂流动。保温2分钟后，用PBS/PEG对基底清洗5次，并加入化学发光试剂[鲁米诺(1.4mM)/尿素过氧化氢(9.6mM)]。
用曝光时间长达4分钟的CCD摄相记录仪使上述元件成像。表1给出了四种磺胺曲线的％B/Bo值。
表1
    磺胺类                  ％B/Bo
    0ng/ml     10ng/ml     100ng/ml
    磺胺二甲嘧啶     100     14     7
    磺胺甲氧嗪     100     28     15
    磺胺喹噁啉     100     56     24
    磺胺甲嘧啶     100     40     22
通过生物分子在不耐光(用二苯酮处理过的)基底上的非特异吸附的程度证实了与光刻法相比本发明的效用。
其结果列在表2中。
表2
  小鼠IgG   用紫外灯照射(10分钟)   灰度均值(RLU)
  √√   √×   2236817586   2402220531
利用通过CCD照相记录仪检测的化学发光、利用抗小鼠HRPO缀合物检测小鼠IgG。当在没有光的情况下进行反应时，具有固定的二苯酮不耐光连接剂的硅或陶瓷基底应当不结合小鼠IgG。因为在紫外光下进行小鼠IgG结合时获得的灰度均值RLU的约80％是由于被动结合相互作用，因此出现非特异性结合。事实证明，按照本发明，通过共价相互作用固定的一系列生物分子更加特殊。
下面讨论的例子提供了共价结合的证据。在第一种情况中，用APTES对陶瓷基底进行硅烷化，然后与生物素-LC-磺基NHS进行反应。对照陶瓷基底不被APTES硅烷化，因此不形成与生物素衍生物的琥珀酰亚胺基酯反应的亲核-NH2端基。然后使上述基底与抗生物素蛋白-FITC缀合物反应，通过CCD摄相记录仪测定荧光。其结果列在表3中。
表3
 (生物素-LC-NHS)     APTES基底RLU(曝光1秒钟)   对照基底RLU(曝光1秒钟)
    0100μg/ml500μg/ml     2,4488,8817,922     NSNSNS
NS＝没有检测到荧光信号
这清楚地证实了生物素-LC-NHS的特异固定化。由于500μg/ml基底的RLU结果没有增加，被固定的生物素-LC-NHS的最高浓度约为100μg/ml。
在另一例中，使由APTES硅烷化的陶瓷基底与二酰肼连接剂反应。用高碘酸钠处理磺胺抗体，以使它们对酰肼连接剂活化。用乙酸钠缓冲剂pH5.5简单透析对照磺胺抗体。RLU结果列在表4(未处理)和表5(用高碘酸盐法处理)中。这些结果清楚地表明酰肼连接剂成功地与陶瓷表面结合。与共价固定磺胺抗体相比，上述对照抗体(不用高碘酸盐活化)的标准曲线很差。
由于共价或被动相互作用的结合％列在表6和7中。共价相互作用平均来说占总体结合的81.8％，这清楚地指示出磺胺抗体的共价结合
表4
  磺胺类     0ng/ml     10ng/ml     ％B/Bo     100ng/ml   ％B/Bo
  周效磺胺     2825     1456     51     NS   -
  磺胺甲噻二唑     3531     1257     36     NS   -
  磺胺氯哒嗪     6476     1585     24     NS   -
  磺胺甲氧嗪     1099     928     84     NS   -
  磺胺甲嘧啶     2177     1137     52     1224   56
  磺胺异噁唑     4879     1108     23     NS   -
  磺胺噻唑     2932     814     28     NS   -
  磺胺二甲嘧啶     NS     NS     --     NS   -
  磺胺喹噁啉     1041     828     79     968   93
  磺胺地索辛     804     NS     -     781   97
表5
  磺胺类   0ng/ml     10ng/ml     ％B/Bo   100ng/ml     ％B/Bo
  周效磺胺   10520     3240     31   2135     20
  磺胺甲噻二唑   17141     5689     33   4882     28
  磺胺氯哒嗪   24944     7565     30   2096     8
  磺胺甲氧嗪   14082     10509     74   5687     40
  磺胺甲嘧啶   12594     5521     43   3240     26
  磺胺异噁唑   24419     6686     27   2270     9
  磺胺噻唑   14279     4602     32   2353     16
  磺胺二甲嘧啶   3644     2810     77   2213     61
  磺胺喹噁啉   10575     6112     58   5588     53
  磺胺地索辛   5526     2554     46   1983     36
表6
磺胺类        磺胺抗体结合的百分比
  共价相互作用   被动相互作用
周效磺胺磺胺甲噻二唑磺胺氯哒嗪磺胺甲氧嗪磺胺甲嘧啶磺胺异噁唑磺胺噻唑磺胺二甲嘧啶磺胺喹噁啉磺胺地索辛平均     73.179.474.092.282.780.079.4-90.285.481.8     26.920.626.07.817.320.020.6-9.814.618.2
表7
磺胺类                       RLU
       共价        被动
  0   10ng/ml   0   10ng/ml
周效磺胺磺胺甲噻二唑磺胺氯哒嗪磺胺甲氧嗪磺胺甲嘧啶磺胺异噁唑磺胺噻唑磺胺二甲嘧啶磺胺喹噁啉磺胺地索辛   32756390203963229489284553848628837113311383813062   11131111328434134081107757748087753587165832   1950278244101793201140832010802951910   904135910517709881031675574548581
共价固定：直接定位在缩水甘油氧基硅烷表面上。
被动固定：直接定位在二氯二甲基硅烷反应表面上。
显然，共价法结果优于被动法。借助于磺胺抗体的酸预处理，被动法的结果可以提高约2倍，但仍然劣于共价法。
还利用X射线光子光谱学(XPS)在化学改性的硅和陶瓷基底上进行确证分析。从每个基底试样的两个任选的表面化学成分已确定的区域记录所测量的光谱，其结果见表8(给出原子％)。
表8
试样   区域 C      O      Si     Al     N    Cl     Ca
硅基底(未处理)   12 21.9   52.7   25.4   -      -    -      -23.0   51.0   26.0   -      -    -      -
经APTES硅烷化的硅基底   1212 55.5   23.3   10.5   -     10.2  0.5    -55.6   22.5   10.9   -     10.5  0.5    -51.3   25.6   13.0   -     7.2   2.9    -52.5   25.0   12.3   -     7.5   2.7    -
经FITC处理的APTES硅基底   12 58.7   25.0   9.6    -     6.1   0.5    -58.8   24.7   9.8    -     6.0   0.8    -
陶瓷基底(未处理)   12  27.2  46.3   11.3   13.3   -    1.4    0.527.1  46.6   9.6    14.8   -    1.1    0.7
经APTES硅烷化的陶瓷基底经FITC处理的APTES陶瓷基底   1212  47.0  31.6   13.4   2.6   5.4    -     -45.9   31.7   13.7   3.3   5.3    -     -52.0   29.3   11.3   2.4   5.0    -     -51.0   30.6   11.7   2.3   4.5    -     -
原子组成结果表明具有APTES有机硅烷的母体硅和陶瓷基底的非常好的转换性，对每个试样的两个试验区都显示出表面组成的良好的再现性。上述FITC标记的基底表明硅和陶瓷的标记分别为70％和77％。
将在深色硅基底上荧光测量的定量法与在白色陶瓷(氧化铝)基底上的荧光测量定量法进行比较。将上述由CCD测量到的共价结合到各基底上的荧光分子(FITC)的RLU结果与用Hook等人的方法(Langmuir 1991 Vol.7，142-151)除去FITC分子之后的定量方法进行比较。
表9
  基底  CCD曝光时间(秒)     灰度均值  除去的FITC分子数/基底
  (边1      边2)
  陶瓷     0.1   7483   7063     4.548×1015
  硅     10   753   612     1.412×1016
通过从基底除去FITC标记并由CCD照相记录仪测量信号而获得的荧光标记的定量分析表明，尽管陶瓷的信号增加超过硅1000倍，实际上在硅基底上存在有多得多的FITC分子。
表10的结果反映出这种现象的另一实例，该结果是用荧光胶乳颗粒与催乳激素测定抗体结合作为检测系统在硅和陶瓷基底上进行催乳激素测定而得出的。给出RLU值(曝光时间20秒)。
表10
    (催乳激素)标样             RLU
    硅基底     陶瓷基底
    550MIU/ml2200MIU/ml     814799     859416735
用这种荧光测定方法，测定结果表明陶瓷性能优于硅。此外，通过采用化学发光作为测定方法可解决用荧光在硅上的黑体效应问题。用化学发光测定对在硅和陶瓷上进行的FSH相同测定进行比较，前者需要的曝光时间比在陶瓷上获得相同的RLU值所需的时间长两倍。
在本说明书中，所使用的缩写说明如下：
APTES＝氨丙基三乙氧基硅烷；
CK-MB＝肌酸激酶MB亚基；
HRPO＝辣根过氧化物酶
LC-磺基-NHS＝长链磺基-N-羟基琥珀酰亚胺；
FITC＝异硫甲氨酸荧光素。

Claims (16)

1.一种生产用于对多种被分析物进行测定的固态元件的方法，所述固态元件包括一个基底和许多离散的反应位点，每个位点支承一个与基底共价结合的配体，其中在上述反应位点之间的基底表面相对于被分析物是惰性的，所述方法包括如下步骤：
对所有的所述表面进行活化并且使其成为疏水性的；和
在被活化的、疏水性的表面上施加一系列配体，而形成离散的反应位点；
其中加入配体包括使被活化的表面与有机硅烷接触的初始步骤，
所述有机硅烷具有式(RO)3Si-(CH2)n-X，式中每个R是烷基，n是1-18的整数，X是官能团；
其中使用微量流动分配器以单独液滴或形成线状的一串液滴的形成施加配体。
2.如权利要求1所述的方法，其中基底的表面是不一致的，从而从配体-被分析物相互作用中可获得增强的信号。
3.如权利要求2所述的方法，其中基底的表面包括一系列反应沟道、隆起、柱状物、点状物、腔室、小凹、井道或凹坑。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述基底材料是陶瓷、玻璃、石英或硅。
5.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述元件的面积小于1cm2。
6.如权利要求1、2或3所述的方法，其中各反应位点的面积小于1mm2。
7.如权利要求1、2或3所述的方法，该方法还包括对反应位点之间的被活化表面进行保护。
8.如权利要求1所述的方法，该方法包括使用能促进生物配体与有机硅烷共价结合的双官能交联剂。
9.如权利要求1所述的方法，其中用不耐光的交联剂与具有亲核或亲电子端基的有机硅烷反应。
10.如权利要求1、2或3所述的方法，该方法还包括加入结合那些干扰测定被分析物的材料的配体。
11.将可通过权利要求1-10任一项的方法获得的固态元件用于测定多种被分析物。
12.如权利要求11所述的应用，该应用包括观察与被分析物结合和/或未结合的位点阵列，并使上述信息与配体发生联系。
13.如权利要求11或12所述的应用，该应用包括用适于从化学发光光反应中测定光线的背照式电荷耦合元件(CCD)成象，被测定光的波长小于450nm。
14.如权利要求11或12所述的应用，其中所述被分析物从抗生素、激素、心脏损伤的标记、传染病标记、过敏反应标记、滥用药物、酶、病毒、核苷酸和肽中选取。
15.如权利要求11或12所述的应用，其中所述被分析物处于全血、血清、血浆、尿液、粪便、胆汁、组织或食料的试样中。
16.一种分析多种被分析物的系统，它包括可通过权利要求1-10任一项的方法获得的固态元件，一个移动平台、一个试样处理系统、一个液体试剂输送系统、一个温度控制的暗盒、一个CCD摄相记录仪和图像处理装置。
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