EP1173762A1 - Verfahren zur diagnose von krankheiten und pathologischen zuständen - Google Patents

Verfahren zur diagnose von krankheiten und pathologischen zuständen

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EP1173762A1
EP1173762A1 EP00927039A EP00927039A EP1173762A1 EP 1173762 A1 EP1173762 A1 EP 1173762A1 EP 00927039 A EP00927039 A EP 00927039A EP 00927039 A EP00927039 A EP 00927039A EP 1173762 A1 EP1173762 A1 EP 1173762A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polymer
sample
linker
substance
ingredients
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00927039A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Götz NOWAK
Elke Bucha
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Haemosys GmbH
Original Assignee
Haemosys GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Haemosys GmbH filed Critical Haemosys GmbH
Publication of EP1173762A1 publication Critical patent/EP1173762A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T436/200833—Carbonyl, ether, aldehyde or ketone containing
    • Y10T436/201666—Carboxylic acid

Definitions

  • the invention relates to methods for simple and rapid measurement of pathological conditions, but also pathophysiological and physiological data of the organism, which utilize the interaction of functional plastic surfaces with specific linkers, as described in WO 98/46648.
  • the aim of the present invention was therefore to use a specific form of interaction to provide semi-quantitative, but also quantitative detection methods which deliver results within a few minutes, the Accuracy is comparable with the methods described above and which can therefore expect a new quality of bed-side diagnostics.
  • the described immobilization of recognition structures allows a quick, semi-quantitative determination of substances by means of a competition mechanism described in detail below. Surprisingly, it was also found that the immobilization according to this method results in an extraordinarily high occupancy density with the substance to be diagnosed. As a result, the use of common absorption methods such as UV / Vis or IR absorption spectroscopy much easier.
  • molecular recognition structures which are capable of highly specific interactions with substances to be diagnosed are bound to a linker which has a structural element capable of hydrogen bonding.
  • Linkers that can be used for the disclosed methods are molecules that have at least two functional groups L1 and L2.
  • One of these functional groups (L1) must be able to form hydrogen bonds and thus allow the anchor to bind to the polymer surface.
  • the functional group L2 is chosen so that a link can be established between the linker and the substance to be immobilized. In order to be able to apply several substances to the polymer surface simultaneously, the simultaneous one Multiple linkers with different groups L2 can be used. However, it is also possible to use linkers of one type that have several L2 groups that are the same or different. Linkers which have several identical or different groups L1 can also be used in the same way.
  • L1 and L2 are preferably connected by an alkyl chain or a polyether.
  • Structural element L1 is preferably a polar hydrogen atom, as is present, for example, in OH, SH, NH or PH bonds. This structural element is preferably located on a sufficiently water-soluble connection as a linker, which further carries the structural element L2. L1 is particularly preferably attached at the end of the linker.
  • the functional group by means of which the substance, preferably covalently, can be bound to the linker (L2) is, for example, a succinimidyl succinate, succinimydyl propionate, nitrophenyl carbonate, trisylate, epoxide, aldehyde, isocyanate or a maleimide.
  • Polyalkylene glycols, polyalkyleneimines, polyalkylene amines or polyalkylene sulfides, and also polyoxazillins are preferably used as linkers, polyalkylene glycols being particularly preferred.
  • Polyethylene glycols (PEG) are particularly preferably used.
  • the compounds mentioned preferably have a molecular weight of 0.5-50 kDa.
  • polymer surfaces that can be used for the method according to the invention are also described in WO 98/46648.
  • Homopolymers or copolymers are used for the production of which at least one type of monomer is used which, in addition to a polymerizable double bond or a polycondensable functional group, contains a further carbonyl group in the form of a ketone or a carboxylic acid derivative which does not adhere to the polymer sationsreaction takes part.
  • the polymer preferably contains a structural element of the formula (A):
  • radicals R can be the same or different and represent an alkyl or aryl radical or a hydrogen atom.
  • the alkyl radical can be linear or branched and preferably consists of 1 to 20 carbon atoms.
  • the aryl radical preferably consists of 6 to 18, particularly preferably 6 to 12, carbon atoms.
  • alkyl radical is a straight-chain or branched, optionally substituted C 8 alkyl radical, for example a methyl, ethyl or propyl radical.
  • optional substituents include one or more halogen atoms, eg fluorine, chlorine, bromine or iodine atoms or hydroxyl, C ⁇ -6 alkyl or C ⁇ . 6 -alkoxy or C ⁇ -6 alkylthiol.
  • the aryl radical is particularly preferably a monocyclic or bicyclic, optionally substituted aryl radical, which can optionally contain one or more hetero atoms.
  • aryl radicals are phenyl, 1- or 2-naphthyl, indenyl or isoindenyl radicals.
  • heteroatom-containing aryl groups are C 3-9 - heteroaryl, containing heteroatoms selected from oxygen, sulfur or nitrogen atoms.
  • Monocyclic heteroaryl radicals include, for example, pyrolyl, furyl, thienyl, imidazolyl, N-methylimidazolyl, N-ethylimidazolyl, benzothiazolyl, quinazolinyl, naphthylpyridinyl, quinolyinyl, isoquinolinyl and tetrazolyl radicals.
  • a preferred polymer containing such groups is a polyalkyl methacrylate
  • PAMA polymethyl methacrylate
  • PEMA polyethyl methacrylate
  • PMMA Polymethyl methacrylate
  • PEMA polyethyl methacrylate
  • poiypropyl methacrylate e.g. Polyvinyl acetate, polycyclohexyl methacrylates or polyphenyl methacrylate can also be used. Polymethyl methacrylate is particularly preferably used.
  • Copolymers or polymer mixtures of any proportions of the abovementioned polymers with one another or with one or more further polymer components, for example polystyrene, polyacrylonitrile or polyamides, can also be used.
  • the proportion of monomers which have a structural element (A) in such copolymers is preferably at least 20%, particularly preferably at least 40% and very particularly preferably at least 60%.
  • microtiter plates, cuvettes or test sample tubes for diagnostic analysis devices made from the polymers described are used. Structures are present on the surface of these sample containers, which form strong bonds with the linkers. Surprisingly, the bond occurs when the linker only comes into contact with the polymer surface, without the need for elevated temperatures or the use of catalysts or other reaction-accelerating reagents.
  • the resulting bond is of excellent stability and cannot be dissolved in aqueous solutions by shifting the pH in a range from 2 to 13.
  • the bond is also resistant to rinsing with salt solutions of high ionic strength (2n glycine, 2n urea).
  • Linker-coupled specific recognition structures such as antigens, antibodies, enzymes or other special opponents for a substance to be diagnosed can be applied to the polymer surface.
  • the binding density on the surface is remarkably high.
  • layers of 100-300 nm thickness are formed depending on the PEG chain length used (see Fig. 1). These layers do not impair the transparency of the polyalkyl methacrylate material used, so that the transmission of visible, ultraviolet or infrared light is generally not disturbed.
  • the Specific recognition structures bound to the linker have no significant influence on light transmission. Due to the high
  • Area density of the bound biomolecules enables a direct, exact measurement of the substances to be detected in blood, plasma or other body fluids.
  • the measurement can therefore be carried out by means of absorption measurements at a
  • Wavelength occur, which is characteristic of the substance to be diagnosed and which should be in the UV, visible or IR range of the spectrum.
  • the new diagnostic procedure used enables a further original detection process.
  • a defined quantity of the substance to be detected is added to the measurement sample.
  • Special marking or detection agents are bound to this added detection substance.
  • these are dyes, preferably intensive vital dyes or radioactive markers, either with the naked eye or at certain wavelengths in photometers, spectrophotometers, fluorescence measuring devices, luminescence measuring devices, but also in liquid scintillation counters or ⁇ - Countem, be recorded qualitatively.
  • the added defined amount of the labeled interaction partner should occupy a certain part of the available binding sites on the polymer surface covered with linkers and recognition structures.
  • This competition mechanism can be exactly quantified and is linearly correlated in ranges of at least between 25 and 200% of the normal value, so that the concentration of the detection substance added can consequently be between 25 and 200%.
  • a microtiter plate or a reaction vessel is no longer coated on the same basis as described above, but rather stirring devices, such as paddles, whisks, spatulas or the like, which consist of functional polymer, used (Fig. 2).
  • stirring devices such as paddles, whisks, spatulas or the like, which consist of functional polymer, used (Fig. 2).
  • Monoacrylate adhesive single-layer glued to any plastic surface, can be used. This method is also suitable for using
  • Reaction vessels, microtiter plates or stirring tools which do not consist of the functional polymers described above, but are only coated with such polymers in an additional working step.
  • the stirring tools which should preferably have flat surfaces in order to enable simple evaluation, are provided with linker-coupled detection structures during production or before they are used. A defined amount of these binding partners must be applied to the surface.
  • the binding partner which is color-coded in the visible range (preferably red, blue or black) is added to the sample in a defined amount.
  • the colored measuring surface of the mixer is compared with the aid of a color comparator test (color comparison test) with regard to the intensity of the detection color (Fig. 3).
  • the graded color scale was previously quantified by a color intensity calibration of the system. Well-graded quantity steps of the substance to be detected are obtained in the color comparator test and a largely quantitative statement about the substance content in the solution can be made quickly and easily.
  • the preferred functional polymer material is polymethyl methacrylate, since all containers made of this material are commercially available and can usually be used immediately and without further processing.
  • the surface can also be modified using known plasma etching processes in order to enable better binding of polyethylene glycol-bound substances on this PMMA surface. In normal cases, however, it is sufficient to use the smooth, unchanged surface of the PMMA materials. If other polymers, but also glass, are used, the route of surface coating with the help of immobilization of microparticles is chosen. Porous, monodisperse polyalkyl methacrylate particles are used for this, but preferably polymethyl methacrylate or polybutyl methacrylate particles should be used.
  • a common monoacrylate adhesive which is brought to a defined flow with the help of volatile solvents, is applied to the surface to be coated and then applied in eddy current or. Pouring process coated with a single layer of microparticles (see Fig. 2).
  • This method has the advantage that the defined area application of the adhesive means that an exact number of polyalkyl methacrylate microparticles is bound and thus a precisely limited area can be allocated for the binding process.
  • Polyethylene glycol-linked binding partners e.g. pure polyethylene glycol
  • Polyethylene glycol-linked binding partners can bind known amounts of recognition structures with full saturation of the specific binding sites of the polyalkyl methacrylate on the microparticle layer.
  • 0.2 ml of 3% Na citrate is placed in a blood collection syringe or Monovette.
  • 2 ml of a phosphate buffer are added, which contains 50 nmol of the protein to be detected, which is coated with acridine red or the like. was colored.
  • the pre-analysis is complete.
  • the amount of sample mixture required for the measurement process is then used for either quantitative or bed-side methods.
  • a suitable amount of the sample mixture is filled into the corresponding wells of the microtiter plate, into a reaction tube for a photometer or into a cuvette for a spectrophotometer, which has been specially processed beforehand using one of the methods described above.
  • the measuring cuvette or the microtiter plate is rinsed with buffer, as a rule 3 times with microtiter plates, with cuvettes and measuring tubes at least a double rinsing with about ten times the volume, based on the amount of detection used.
  • a correspondingly compatible detection method (microtiter plate reader, automatic analyzer, photometer) can then be used.
  • the usual dose-effect measurement options are available for the quantification of the test arrangements (calibration curves, digital measured value acquisition and data processing). - 10 - With the semi-quantitative direct measurement in the bed-side capable one-step
  • the procedure is as follows: The sample mixture is transferred to a suitable reaction vessel. The PAMA is then coated
  • Stirring device (spatula, stirring stick, slide or similar), on which the special reaction partner is firmly bound, is moved in this sample mixture for 5 (10) min, then transferred to a buffer reservoir, which is intended for rinsing or washing, washed there and finally by means of Color comparator quantified.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Krankheiten, pathologischen Zuständen sowie physiologischen Messgrössen, das auf der Immobilisierung von Erkennungsstrukturen mittels spezieller Linker auf spezifischen funktionellen Polymeroberflächen beruht.

Description

VERFAHREN ZUR DIAGNOSE VON KRANKHEITEN UND PATHOLOGISCHEN ZUSTÄNDEN
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur einfachen und schnellen Messung krankhafter Zustände, aber auch pathophysioiogischer und physiologischer Daten des Organismus, die die Wechselwirkung funktioneller Kunststoffoberflächen mit spezifischen Linkern ausnützen, wie sie in WO 98/46648 beschrieben ist.
Das augenblicklich angewandte Management zur Quantifizierung von zu diagnostizierenden Parametern, welche im Organismus z.T. nur in ng-Mengen bzw. picomolaren Konzentrationen vorkommen, wird immer aufwendiger, und die hierbei benutzten Methoden sind kosten- und zeitintensiv. Zum Beispiel sind die seit längerem im Gebrauch befindlichen ELISA's und hiervon abgeleitete Techniken dadurch gekennzeichnet, dass sie zwar relativ geringe Stoffmengen nachweisen, aber einen unverhältnismäßig großen Kosten- und Zeitaufwand erfordern.
Das ist vor allem darin begründet, dass mit Hilfe von spezifischen Antikörpern, die in Organismen außerhalb des menschlichen Körpers gegen proteinartige Substanzen des Menschen erzeugt wurden, der nachzuweisende Stoff spezifisch erkannt werden muss. Die Detektion dieses stoffspezifischen Fremdeiweißantikörpers erfolgt dann z.B. mit Hilfe eines unspezifischen, gegen das Eiweiß des Tieres gerichteten weiteren Antikörpers, an dem eine entsprechende Erkennungsstruktur gebunden wurde, die mit Hilfe modernster Detektionsmethoden, im wesentlichen radioaktiven Methoden, aber auch spektralphotometrisch erfassbaren Messmethoden, quantifiziert wird. Zur Detektion werden kostenaufwendige Diagnosegeräte benutzt, wie ELISA-Reader, Spektralphotometer, Liquid-Szintillation-Counter u.a., die zudem einen relativ hohen Personal- und Kostenaufwand zur Betreibung und Wartung erfordern.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es daher, mit Hilfe einer spezifischen Interaktionsform halbquantitative, aber auch quantitative Detektionsverfahren bereitzustellen, die innerhalb von wenigen Minuten Ergebnisse liefern, deren Exaktheit mit den oben beschriebenen Methoden vergleichbar ist und die somit eine neue Qualität der bed-side-Diagnostik erwarten lassen. Die erfindungsgemäßen
Verfahren nützen dazu das in der WO 98/46648 beschriebene Prinzip der
Immobilisierung von spezifischen Erkennungsstrukturen wie z.B. Antigenen, spezifischen Antikörpern, aber auch von Enzymen oder Inhibitoren von Enzymen, mittels eines Linkers auf Polymeroberflächen.
Unter Einbeziehung dieses Prinzips konnten neuartige Methoden der Diagnostik von Erkrankungen, Körperfunktionsstörungen, aber auch von physiologischen bzw. pathophysiologischen Messdaten entwickelt werden. Solche Messungen zur Funktionsfähigkeit oder Störung der Körperfunktion werden in der laborchemischen, mikrobiologischen oder enzymologischen Diagnostik in der Humanmedizin, aber auch in der Veterinärmedizin sowie in den biologischen Wissenschaften eingesetzt.
Die beschriebene Immobilisierung von Erkennungsstrukturen erlaubt eine schnelle, halbquantitative Bestimmung von Substanzen mittels eines im Folgenden detailiert beschriebenen Kompetitionsmechanismusses. Überraschenderweise wurde aber auch gefunden, dass die Immobilisierung nach diesem Verfahren eine außerordentlich hohe Belegungsdichte mit der zu diagnostizierenden Substanz zur Folge hat. Dadurch wird der Einsatz von gängigen Absorptionsmethoden wie z.B. UV/Vis oder IR-Absorptionsspektroskopie wesentlich erleichtert.
Wie in WO 98/46648 beschrieben, werden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung molekulare Erkennungsstrukturen, die zu hochspezifischen Wechselwirkungen mit zu diagnostizierenden Substanzen fähig sind, an einen Linker gebunden, der ein zur Wasserstoffbrückenbindung fähiges Strukturelement aufweist.
Linker, die für die offenbarten Verfahren eingesetzt werden können, sind Moleküle, die mindestens zwei funktionelle Gruppen L1 und L2 aufweisen. Eine dieser funktionellen Gruppen (L1 ) muss zur Bildung von Wasserstoffbrücken fähig sein und so die Bindung des Unkers an die Polymeroberfläche ermöglichen. Die funktionelle Gruppe L2 wird so gewählt, dass eine Bindung zwischen dem Linker und der zu immobilisierenden Substanz hergestellt werden kann. Um mehrere Substanzen gleichzeitig auf der Polymeroberfläche aufbringen zu können, ist die gleichzeitige Verwendung mehrerer Linker mit unterschiedlichen Gruppen L2 möglich. Jedoch besteht auch die Möglichkeit, Linker eines Typs einzusetzen, die mehrere Gruppen L2 besitzen, die gleich oder unterschiedlich sind. Gleichermaßen können auch Linker eingesetzt werden, die mehrere gleiche oder unterschiedliche Gruppen L1 aufweisen. Bevorzugt sind L1 und L2 durch eine Alkylkette oder einen Polyether verbunden.
Strukturelement L1 ist bevorzugt ein polares Wasserstoffatom, wie es beispielsweise in OH-, SH-, NH- oder PH-Bindungen vorliegt. Dieses Strukturelement befindet sich bevorzugt an einer ausreichend wasserlöslichen Verbindung als Linker, der weiter das Strukturelement L2 trägt. Besonders bevorzugt ist L1 endständig am Linker angebracht.
Die funktionelle Gruppe, mittels derer die Substanz, bevorzugt kovalent, an den Linker gebunden werden kann (L2) ist beispielsweise ein Succinimidylsuccinat, Succinimydylpropionat, Nitrophenylcarbonat, Trisylat, Epoxid, Aldehyd, Isocyanat oder ein Maleinimid.
Funktionelle Gruppen L2, mittels derer die bevorzugten Linker zur Anbindung einer Substanz modifiziert werden können, sind z.B. im Katalog der Firma Shearwater Polymers, Inc., 2307 Spring Branch Rd., Huntsville, AL 35801 (USA) beschrieben.
Bevorzugt werden als Linker Polyalkylenglykole, Polyalkylenimine, Polyalkylenamine oder Polyalkylensulfide, sowie Polyoxazilline eingesetzt, wobei Polyalkylenglykole besonders bevorzugt sind. Insbesondere bevorzugt werden Polyethylenglykole (PEG) eingesetzt. Die genannten Verbindungen besitzen vorzugsweise ein Molekulargewicht von 0,5-50 kDa.
Funktionelle Polymeroberflächen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind ebenfalls in WO 98/46648 beschrieben. Zum Einsatz kommen Homo- oder Copolymere, zu deren Herstellung mindestens ein Monomertyp eingesetzt wird, der neben einer polymerisierbaren Doppelbindung oder einer polykondensierbaren funktionellen Gruppe eine weitere Carbonylgruppe in Form eines Ketons oder eines Carbonsäurederivats enthält, die nicht an der Polymeri- sationsreaktion teilnimmt. Bevorzugt enthält das Polymer ein Strukturelement der Formel (A):
wobei die Reste R gleich oder verschieden sein können und einen Alkyl- oder Arylrest oder ein Wasserstoffatom darstellen. Der Alkylrest kann linear oder verzweigt sein und besteht bevorzugt aus 1 bis 20 Kohlenstoffatomen. Der Arylrest besteht bevorzugt aus 6 bis 18, besonders bevorzugt aus 6 bis 12 Kohlenstoffatomen. Der Rest X ist fakultativ und bedeutet O, N oder CH2. Für den Fall X = N trägt N zusätzlich zu dem in Formel (A) vermerkten einen weiteren Rest R, der unabhängig von den anderen Resten R wie vorstehend definiert ist.
Besonders bevorzugt als Alkylrest ist ein geradkettiger oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Cι-8-Alkylrest, beispielsweise ein Methyl-, Ethyl- oder Propylrest. Beispiele für gegebenenfalls vorhandene Substituenten umfassen ein oder mehrere Halogenatome, z.B. Fluor-, Chlor-, Brom- oder lodatome oder Hydroxylgruppen, Cι-6-Alkylreste oder Cι.6-Alkoxyreste oder Cι-6-Alkylthiolreste. Der Arylrest ist besonders bevorzugt ein monocyclischer oder bicyclischer, gegebenenfalls substituierter Arylrest, der gegebenenfalls ein oder mehrere Hetero- atome enthalten kann. Beispiele für solche Arylreste sind Phenyl, 1- oder 2-Naphthyl, Indenyl- oder Isoindenylreste. Beispiele für heteroatomhaltige Arylreste sind C3-9- Heteroarylreste, die Heteroatome, ausgewählt aus Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatomen, enthalten. Monocyclische Heteroarylreste umfassen beispielsweise Pyrolyl-, Furyl-, Thienyl-, Imidazolyl-, N-Methylimidazolyl-, N-Ethylimidazolyl-, Benzo- thiazolyl-, Chinazolinyl-, Naphthylpyridinyl-, Chinolyinyl-, Isochinolinyl- und Tetrazolylreste. Ein bevorzugtes Polymer, das solche Gruppen enthält, ist ein Polyalkylmethacrylat
(PAMA) mit einem Alkylrest, der vorzugsweise 1-6 C-Atome umfasst, wie z.B. Polymethylmethacrylat (PMMA), Polyethylmethacrylat (PEMA) oder Poiypropylmeth- acrylat. Weiterhin können Polyvinylacetat, Polycyclohexylmethacrylate oder Polyphenylmethacrylat eingesetzt werden. Besonders bevorzugt wird Polymethylmethacrylat eingesetzt.
Auch Copolymere oder Polymermischungen aus beliebigen Anteilen der vorstehend genannten Polymere untereinander oder mit einer oder mehreren weiteren Polymerkomponenten, beispielsweise Polystyrol, Polyacrylnitril oder Polyamiden können eingesetzt werden. Bevorzugt beträgt der Anteil der Monomere, die ein Strukturelement (A) aufweisen an solchen Mischpolymeren mindestens 20 %, besonders bevorzugt mindestens 40 % und ganz besonders bevorzugt mindestens 60 %.
Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren werden Mikrotiterplatten, Küvetten oder Messprobenröhrchen für diagnostische Analysegeräte aus den beschriebenen Polymeren verwendet. An der Oberfläche dieser Probenbehältnisse sind Strukturen vorhanden, die mit den Linkern feste Bindungen eingehen. Erstaunlicherweise tritt die Bindung bei bloßem Kontakt der Linker mit der Polymeroberfläche auf, ohne dass erhöhte Temperaturen oder der Einsatz von Katalysatoren oder anderer reaktionsbeschleunigender Reagentien nötig wäre. Die entstehende Bindung ist von ausgezeichneter Stabilität und kann in wässrigen Lösungen durch Verschiebungen des pH-Werts in einem Bereich von 2 - 13 nicht gelöst werden. Auch gegen das Spülen mit Salzlösungen hoher lonenstärke (2n Glycin, 2n Harnstoff) ist die Bindung resistent. So können Linker-gekoppelte spezifische Erkennungsstrukturen wie Antigene, Antikörper, Enzyme oder andere spezielle Gegenspieler für eine zu diagnostizierende Substanz auf die Polymeroberfläche aufgebracht werden. Die flächenseitige Bindungsdichte auf der Oberfläche ist dabei bemerkenswert hoch. Bei Verwendung von PAMA und PEG bilden sich je nach verwendeter PEG-Kettenlänge Schichten von 100-300 nm Stärke (s. Abb. 1). Diese Schichten beeinträchtigen nicht die Transparenz des verwendeten Polyalkylmethacrylatmaterials, so dass in der Regel die Transmission von sichtbarem, ultraviolettem oder infrarotem Licht nicht gestört wird. Auch die endständig an die Linker gebundenen spezifischen Erkennungsstrukturen haben keinen signifikanten Einfluss auf die Lichttransmission. Bedingt durch die hohe
Flächendichte der gebundenen Biomoleküle ist eine direkte exakte Messung der zu detektierenden Substanzen im Blut, Plasma oder anderen Körperflüssigkeiten möglich. Die Messung kann demzufolge mittels Absorptionsmessungen bei einer
Wellenlänge erfolgen, die für die zu diagnostizierende Substanz charakteristisch ist und die im UV, sichtbaren oder IR-Bereich des Spektrums liegen sollte.
Das zur Anwendung kommende neue Diagnoseverfahren ermöglicht einen weiteren originellen Detektionsvorgang. Nach der Gewinnung der zu verwendenden Probenflüssigkeit bzw. während der Probenaufbereitung wird der Messprobe eine definierte Quantität des zu detektierenden Stoffs zugesetzt. An diesen zugesetzten Detektionsstoff sind spezielle Markierungs- oder Detektionsmittel gebunden. In der Regel sind dies Farbstoffe, bevorzugt intensive Vital-Farbstoffe oder radioaktive Marker, die entweder mit dem unbewaffneten Auge oder bei bestimmten Wellenlängen in Photometern, Spektralphotometern, Fluoreszenz-Messgeräten, Lumineszenz-Messgeräten, aber auch in Liquid-Szintillation-Countern oder γ- Countem, qualitativ erfasst werden. Die zugesetzte definierte Menge des markierten Interaktionspartners sollte einen bestimmten Teil der vorhandenen Bindungsplätze auf der mit Linkern und Erkennungsstrukturen belegten Polymeroberfläche besetzen. Dadurch ist gewährleistet, dass die im Blut vorhandenen unbekannten Quantitäten des zu detektierenden Stoffes mit dem speziell gefärbten Detektionsstoff um die Besetzung der Bindungsstellen konkurrieren. Dieser Kompetitionsmechanismus ist exakt quantifizierbar und in Bereichen mindestens zwischen 25 und 200 % des normalen Wertes linear korreliert, so dass die gesuchte Konzentration des zugegebenen Detektionsstoffs demzufolge zwischen 25 bis 200 % liegen kann. Je mehr der nachzuweisende Bindungspartner in der untersuchten Körperflüssigkeit vorhanden ist, umso weniger wird von dem zugegebenen markierten Interaktionspartner gebunden. Durch dieses Verfahren ist es möglich, sowohl quantitative Untersuchungsverfahren mit Hilfe der oben genannten Nachweismethoden zu führen, als auch ultraschnelle, halbquantitative Tests in Form eines Farbkomparatortests bereitzustellen. Für diese bed-side-Anwendung wird auf der gleichen Grundlage wie oben beschrieben nun nicht mehr eine Mikrotiterplatte oder ein Reaktionsgefäß beschichtet, sondern Rührgeräte, wie Paddel, Quirl, Spatel o. ä., die aus funktionellem Polymer bestehen, benutzt (Abb. 2). Es können weiterhin auch monodisperse Mikropartikel aus diesen Kunststoffen, z.B. aus
Polyalkylmethacrylat (0 5-200 μm), die mit Hilfe von geeigneten Klebern, bevorzugt
Monoacrylatkleber, einlagig auf jede beliebige Kunststoffoberfläche geklebt werden, verwendet werden. Dieses Verfahren eignet sich auch zur Verwendung von
Reaktionsgefäßen, Mikrotiterplatten oder Rührwerkzeugen, die nicht aus den vorstehend beschriebenen funktionellen Polymeren bestehen, sondern erst im einem zusätzlichen Arbeitsschritt mit solchen Polymeren beschichtet werden.
Die Rührwerkzeuge, die vorzugsweise plane Flächen haben sollten, um eine einfache Auswertung zu ermöglichen, werden während der Produktion oder vor ihrer Anwendung mit Linker-gekoppelten Erkennungsstrukturen versehen. Dabei muss eine definierte Menge dieser Bindungspartner auf die Oberfläche aufgebracht werden. Der Probe wird der im sichtbaren Bereich farblich markierte Bindungspartner (vorzugsweise rot, blau oder schwarz) in definierter Menge zugegeben. Nach diesem präanalytischen Prozess wird der beschichtete Spatel o.a. in der Körperflüssigkeit (Blut, Plasma, Urin u.a.) für eine definierte Zeit gerührt, geschwenkt oder beweglich kontaminiert und danach mittels eines Wasch- bzw. Spülschrittes von eventuell vorhandenen Blutbestandteilen oder störenden Farbveränderungen befreit. Anschließend wird die gefärbte Messfläche des Rührgeräts mit Hilfe eines Farbkomparatortests (Farbvergleichstest) hinsichtlich Intensität der Detektionsfarbe verglichen (Abb. 3). Die abgestufte Farbskala ist vorher durch eine Farbintensitätseichung des Systems quantifiziert worden. Man erhält damit gut abgestufte Quantitätsschritte des zu detektierenden Stoffs im Farbkomparatortest und kann problemlos und rasch eine weitgehend quantitative Aussage über den Stoffgehalt in der Lösung treffen.
Für eine bed-side Diagnostik sollte sichergestellt sein, dass mit drei, maximal vier Farbschritten die für diese Anwendung wesentlichen Bereiche (subtherapeutisch, therapeutisch, toxisch bzw. kritisch toxisch) zu erfassen sind. Alternativ können auch andere den klinischen Gegebenheiten angepasste Quantitätsschritte in den Test aufgenommen werden. Diese halbquantitative Methode ist als bed-side-Methode so konzipiert, dass sie innerhalb weniger Minuten als Single- bzw. one-step-Methodik ohne Benutzung von Hilfsmitteln, nur unter Durchführung eines einfachen und von jedem Ungeübten auch realisierbaren Verdünnungsschritts der entsprechenden
Ausgangslösung überall durchführbar ist ("point of care-Technik").
Solche single-step-Diagnoseverfahren wie auch die Bereitstellung der verwendeten Vorrichtungen werden im Folgenden beispielhaft an einem Polyethylenglykol/ Polyalkylmethacrylat-System verdeutlicht.
1. Methoden zur Polvethylenqlvkol-Kopplunα von Antikörpern, Antigenen, Wirkstoffen, Nukleinsäuren oder Teilen von DNA, rDNA, mDNA und anderen zur Diagnostik vorgesehenen Wirkstoffen werden z.B. bei J. Milton Harris (Ed.): Polyethylene glycol chemistry, 1992 Plenum Press, New York; oder bei Zalipsky S: Chemistry of polyethylene glycol conjugates with biologically active molecules, Advanced Drug Delivery Reviews 16: 157-182, 1995 beschrieben.
2. Herstellung bzw. Beschichtunq von in der Diagnostik verwendeten Behältnissen (Küvetten, Reaktionsgefäße), aber auch Rührern, Spateln, Südes u.a.
Bevorzugtes funktionelles Polymermaterial ist Polymethylmethacrylat, da alle Behältnisse aus diesem Material kommerziell erhältlich und meistens sofort und ohne weitere Bearbeitung benutzbar sind. Für spezielle Anwendungen kann man aber auch mit Hilfe von bekannten Plasmaätzverfahren die Oberfläche noch modifizieren, um so eine bessere Bindung von Polyethylenglykol-gebundenen Stoffen auf dieser PMMA-Oberfläche zu ermöglichen. Im Normalfall reicht es aber aus, die glatte unveränderte Oberfläche der PMMA-Materialien zu verwenden. Falls andere Polymere, aber auch Glas benutzt werden, wird der Weg über die Oberflächenbeschichtung mit Hilfe der Immobilisierung von Mikropartikeln gewählt. Hierzu werden poröse, monodisperse Polyalkylmethacrylat-Partikel verwendet, vorzugsweise jedoch sollten Polymethylmethacrylat- oder Polybutylmethacrylat- partikel zur Anwendung kommen. Auf die zu beschichtende Oberfläche wird ein gängiger Monoacrylatkleber, der mit Hilfe von leichtflüchtigen Lösungsmitteln auf eine definierte Fließfähigkeit gebracht wird, aufgetragen und danach im Wirbelstrombzw. Schüttverfahren mit einer einlagigen Schicht von Mikropartikeln beschichtet (s. Abb. 2). Diese Methode hat den Vorteil, dass durch den definierten Flächenauftrag des Klebemittels eine exakte Anzahl von Polyalkylmethacrylat-Mikropartikeln aufgebunden wird und dadurch auch eine genau begrenzte Flächenzuweisung für den Bindungsvorgang erfolgen kann. Durch geeignete Zusätze zu den
Polyethylenglykol-gekoppelten Bindungspartnern (z.B. reines Polyethylenglykol) kann man bekannte Mengen von Erkennungsstrukturen bei voller Sättigung der spezifischen Bindungsstellen des Polyalkylmethacrylats auf der Mikropartikelschicht aufbinden.
3. Analytik:
In eine Blutabnahmespritze bzw. Monovette werden 0,2 ml 3 % Na-Citrat vorgelegt. Zusätzlich werden 2 ml eines Phosphatpuffers zugesetzt, der 50 nmol des zu detektierenden Proteins enthält, das mit Acridinrot o.a. gefärbt wurde. Nach Entnahme von 1 ml Vollblut und Vermischen mit der genannten Probenvorlage ist die Präanalytik abgeschlossen. Anschließend wird die für den Messvorgang notwendige Menge Probengemisch entweder für quantitative oder bed-side-Verfahren benutzt. Bei quantitativen Messverfahren wird eine geeignete Menge des Probengemisches in die entsprechenden Vertiefungen der Microtiter-Platte in ein Reaktionsröhrchen für ein Photometer oder in eine Küvette für ein Spektralphotometer eingefüllt, die nach einem der oben beschriebenen Verfahren vorher speziell bearbeitet wurde. Dabei ist es wichtig, dass die aufgegebene Antikörpermenge, z.B. gegen Fibrinogen, auf der PMMA-Messvorrichtung genau definiert ist, um ein quantifizierbares Interaktionsprotokoll zu erstellen. Nach einer definierten Schüttet- oder Mischzeit wird die Messküvette bzw. die Mikrotiterplatte mit Puffer gespült, in der Regel bei Mikrotiterplatten 3x, bei Küvetten und Messröhrchen sollte zumindest eine zweifache Spülung mit dem etwa zehnfachen Volumen, bezogen auf die eingesetzte Detektionsmenge, erfolgen.
Anschließend kann ein entsprechend kompatibles Detektionsverfahren (Mikrotiter- plattenreader, Analysenautomat, Photometer) eingesetzt werden. Für die Quantifizierung der Versuchsanordnungen stehen die üblichen Dosis-Wirkungs- Messmöglichkeiten zur Verfügung (Eichkurven, digitale Messwerterfassung und Datenverarbeitung). - 10 - Bei der halbquantitativen direkten Messung in dem bed-side-fähigen one-step-
Verfahren wird folgendermaßen verfahren: Das Probengemisch wird in ein geeignetes Reaktionsgefäß überführt. Danach wird das PAMA-beschichtete
Rührgerät (Spatel, Rührstäbchen, Slide o.a.), auf dem der spezielle Reaktionspartner fest aufgebunden ist, in diesem Probengemisch für 5 (10) min bewegt, anschließend in ein Pufferreservoir überführt, welches zur Spülung bzw. Waschung vorgesehen ist, dort gewaschen und abschließend mittels Farbkomparator quantifiziert.

Claims

Patentansprüche:
1. Diagnoseverfahren, umfassend das in Kontakt bringen einer zu untersuchenden flüssigen Probe mit der Oberfläche eines Polymers, auf der Erkennungsstrukturen immobilisiert sind, welche spezifische Inhaltsstoffe der Flüssigkeit binden können, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymeroberfläche Carbonylgruppen in Form von Ketogruppen oder Carbonsäurederivaten aufweist und dass die Erkennungsstrukturen mittels eines Linkers immobilisiert sind.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , wobei das Polymer Polyalkylmethacrylat, Polyvinylacetat, Polycyclohexyimethacrylat ist, oder ein Copolymer, das Einheiten dieser Polymere enthält.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Oberfläche die Oberfläche einer Mikrotiterplatte, einer Küvette oder eines Messprobenröhrchens ist.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Linker ein Polyalkylenglykol, Polyalkylenimin, Polyalkylenamin oder Polyalkylensulfid ist.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Erkennungsstruktur ein Antigen, ein spezifischer Antikörper, ein Enzym oder ein Inhibitor von Enzymen ist.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Probe eine Körperflüssigkeit, ausgewählt aus Blut, Urin, Plasma oder Sperma ist.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polymer in Form von Partikeln vorliegt, die auf der Oberfläche eines beliebigen Materials aufgebracht sind.
. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, weiter umfassend die Zugabe einer markierten Substanz, die ebenfalls durch die Erkennungsstruktur gebunden werden kann, zu der Probe, wobei die Zugabe vor dem in Kontakt bringen der Probe mit der Polymeroberfläche erfolgt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Oberfläche die Oberfläche eines Rührgeräts ist, das in den Probenbehälter eingebracht wird.
10. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei die markierte Substanz im sichtbaren Bereich farblich detektierbar ist.
11.Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, weiter umfassend die Quantifizierung der zu bestimmenden Inhaltsstoffe mittels Farbvergleich mit einer Komparatorskala.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, weiter umfassend die Quantifizierung der zu bestimmenden Inhaltsstoffe mittels eines geeigneten Detektionsverfahrens.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7862849B2 (en) * 2003-10-17 2011-01-04 Massachusetts Institute Of Technology Nanocontact printing
US8383339B2 (en) * 2006-08-28 2013-02-26 Massachusetts Institute Of Technology Liquid supramolecular nanostamping (LiSuNS)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5767860A (en) * 1980-10-15 1982-04-24 Fuji Photo Film Co Ltd Material for multilayer analysis
US5017342A (en) * 1988-06-01 1991-05-21 Ortho Diagnostic Systems Inc. Device for immunoassay determinations
US4968604A (en) * 1989-07-20 1990-11-06 Neorx Corporation Method and test kit for detection of antibodies
US5244788A (en) * 1992-07-01 1993-09-14 Hubscher Thomas T Method and apparatus for performing determinations of immune rectants in biological fluids
US5578446A (en) * 1994-07-08 1996-11-26 Becton Dickinson And Company Analytical dipstick for improved mixing and reduced reagent volume
DE19715504C2 (de) * 1997-04-14 2000-10-26 Max Planck Gesellschaft PMMA-Membranen mit Polyethylenglykol-gekoppelten Wirksubstanzen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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