DE3486027T2

DE3486027T2 - Testvorrichtung und verfahren.

Info

Publication number: DE3486027T2
Application number: DE8484303759T
Authority: DE
Inventors: Myron J Block; Tomas B Hirschfeld
Original assignee: Individual
Current assignee: Roche Diagnostics Corp
Priority date: 1983-06-13
Filing date: 1984-06-05
Publication date: 1993-06-09
Anticipated expiration: 2004-06-06
Also published as: EP0128723A2; JPS6036963A; US4558014A; DE3486027D1; EP0128723A3; EP0128723B1; JPH0750109B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft chemische und biochemische Verfahren und zwar speziell solche Testverfahren, bei denen das Volumen bezogen auf das gegebene Probenvolumen zumindest einer der enthaltenen flüssigen Phasen einer flüssigen Suspension bestimmt werden muß, ohne daß die Phasen physikalisch voneinander getrennt werden. Häufig besteht das Problem bei Testverfahren für flüssige Suspensionen in der Bestimmung des Volumens, bezogen auf das Gesamtvolumen, von einem oder mehreren Bestandteilen. So wird zum Beispiel beim Milchtest die Bestimmung des Butterfettgehaltes häufig verlangt. Bei einem anderen Beispiel, dem Assay von Gesamtblut, wird der Prozentsatz des Zellvolumens (üblicherweise als PCV oder Hämatocrit ausgedrückt) gewünscht. Derartige relative Volumina werden üblicherweise nach der physikalischen Trennung der bestehenden Phasen einer Suspension beispielsweise durch Zentrifugation bestimmt.
Ein solcher Trennschritt ist nicht nur ein typischer Vorbereitungsschritt zur Bestimmung der einzelnen Phasen einer Suspension, sondern auch ein vorbereitender für weitere Tests. Um wieder beim Bluttest zu bleiben, so verlangt eine große Anzahl von Vorschriften Serumproben, wobei das Blut zuerst zentrifugiert werden muß, um vom Serum die Zellen, die nahezu 50% des Volumens ausmachen, zu trennen. Das bedeutet, daß jede Vorschrift, die die Verwendung von Gesamtblut erlaubt, um das Zellvolumen korrigiert werden muß, um die Meßdaten mit denen von Serumproben vergleichen zu können, die die übliche Verkörperung klinischer Daten darstellen. Dies betrifft in gleicher Weise andere Testverfahren, bei denen eine bestehende Phase einer Suspension bestimmt werden muß.
Eine bestimmte Gruppe von Testverfahren, bei denen die vorliegende Erfindung angewendet werden kann, sind Immunoassays. Immunoassays, bei denen Aliquots einer Probe mit einem oder mehreren Reagenzien verschieden reagieren um Antigen-Antikörper oder ähnliche Komplexe zu bilden, die dann gemessen werden können, um die Probe auf die Anwesenheit und den Titer einer vorgegebenen Menge eines Komplexes zu testen, sind wohlbekannt. Typische Immunoassays sind solche, bei denen ein spezifischer Antikörper eingesetzt wird, um die Menge des entsprechenden Antigens (oder umgekehrt) zu bestimmen. Darüber hinaus wurde diese Technik auch auf die Bestimmung von Haptenen (einschließlich Hormone, Alkaloide, Steroide und ähnliches) ausgeweitet, genauso wie auf Antigene, Antikörper-Fragmente (z. B. FAB) und vollständige Antikörper; und auf dieser breiten Basis sollte die hier vorgestellte Erfindung verstanden werden.
Es ist gut bekannt, daß empfindliche Immunoassays Tracer-Techniken einsetzen, bei denen ein markierter Bestandteil des Komplexes in das Reagenz eingebracht ist, das nicht eingebaute markierte Reagenz vom komplexierten getrennt wird, und der Komplex (oder das nicht komplexierte Reagenz) durch Messung des Markers bestimmt wird. Sowohl Radioisotope als auch Fluoreszenzmarker wurden eingesetzt, um Bestandteile von Immunoassay-Reagenzien zu markieren, wobei die Markierung durch einen Gammstrahlenzähler oder ein Fluorimeter nachgewiesen werden kann. Die vorliegende Erfindung bezieht sich jedoch nur auf solche Immunoassays, die auf Fluoreszenzmessung basieren.
Die Trennung des nicht komplexierten Anteils des markierten Bestandteils vom komplexierten Anteil wird normalerweise durch Immobilisierung einer vorher festgelegten Komponente des Komplexes an eine feste Phase (z. B. die Innenwandung des Testgefäßes, Glas- oder Polymerperlen, oder ähnliches) erreicht, dabei hofft man die Reaktivität der Komponenten bei der Komplexbildung nicht zu behindern. So kann z. B. Antikörper wie Immunglobulin G (IgG) an eine feste Phase, z. B. Glas, durch eine Silyl-Komponente wie 3-Aminopropyltrimethoxy-Silan bei Verwendung von bifunktionalen Reagenzien wie Phenyl-diisothiocyanat gebunden werden. Jeder gebildete Komplex, der die immobilisierte Verbindung enthält, kann dann physikalisch vom nicht in Reaktion getretenen komplementären Anteil, der in Lösung bleibt, getrennt werden durch Absaugen oder Dekantieren von Flüssigkeit aus einem Röhrchen oder durch Eluieren derselben durch ein entsprechendes Bett. Eine Alternative hierzu wie z. B. in meiner Europäischen Patentanmeldung No. 83304821.8/0103426 gezeigt, ist die "Total-Reflexions- Fluoreszenz" (TRF) und das Fluoreszenz-Tunneling. Beide Verfahren können eingesetzt werden, um die Anregung und Messung der Fluoreszenz auf eine extrem dünne Schicht, die an die feste Phase angrenzt, zu beschränken und dadurch die Trennung der immobilisierten markierten Verbindung von der in Lösung verbleibenden optisch zu erreichen.
Die bisher beschriebenen Methoden sind auf eine Anzahl immunologischer Verfahren beschränkt. Beim Kompetitions-Immunoassay z. B. besteht das Reagenz aus einer bekannten Menge eines markierten Komplements (z. B. Antigen) und der immobilisierten Komponente des Komplexes (in diesem Fall dem Antikörper). Das Reagenz wird mit einer festgelegten Probenmenge gemischt, die das nichtmarkierte, zu bestimmende Komplement enthält. Beide, markiertes und nichtmarkiertes Komplement, heften sich im Verhältnis ihrer relativen Konzentrationen an die immobilisierte Komponente des Komplexes. Nach Inkubation über eine festgelegte Zeit werden die flüssige Probe und das Reagenz getrennt. Der an der festen Phase immobilisierte Komplex wird dann mit Strahlung einer dahin gewählten Wellenlänge bestrahlt, daß der Marker zu Fluoreszenz angeregt wird, die dann gemessen wird. Die Intensität der Fluoreszenz des immobilisierten Komplexes ist umgekehrt proportional zur Konzentration des getesteten nichtmarkierten Komplements.
Als Alternative kann ein Assay derart durchgeführt werden, daß eine bestimmte Vergleichsmenge entsprechend dem zu bestimmenden Anteil immobilisiert wird (z. B. eine Substanz, die immunologisch ähnlich reaktiv ist) und die Probe mit einer bekannten Menge des markierten Komplements reagiert. Das markierte Komplement sowohl mit der unbekannten Menge des entsprechenden Anteils in der Probe als auch mit mit der immobilisierten Vergleichsmenge. Auch in diesem Fall ist die Intensität der Fluoreszenz des immobilisierten Komplexes umgekehrt proportional zur Konzentration des zu bestimmenden (freien) Anteils.
Sogenannte "Sandwich"-Immunoassays können bei multivalenten Komplementen durchgeführt werden, das an die immobilisierte Verbindung angeheftete Komplement reagiert danach mit einem markierten Analogen der immobilisierten Verbindung. Damit kann ein bivalentes Antigen an einen immobilisierten Antikörper gebunden werden und danach mit einem Antikörper, der Fluoreszenzmarker trägt, reagieren und ein Antikörper - Antigen - markierter Antikörper Sandwich bilden, das dann vom markierten Antikörper, der nicht reagiert hat, getrennt werden kann. Die Intensität der Fluoreszenz des so gebildeten immobilisierten Komplexes ist direkt proportional zur Konzentration der zu bestimmenden Substanz.
Eine Reihe von Problemen ergibt sich beim Fluoreszenz-Assay von biologischen Flüssigkeiten. So sind z. B. Erythrozyten hoch absorbierend. Aus diesem Grund werden bei bekannten Methoden des Fluoreszenz-Assays von Blut die Proben üblicherweise zentrifugiert und der Test mit dem Überstand, dem Serum, durchgeführt. Die Zentrifugation nimmt in der Regel 15 bis 30 Minuten in Anspruch, eine Zeitspanne, die mit einigen klinischen Verfahren bei denen Testergebnisse rasch vorliegen müssen (sogenannte "stat"-Verfahren) unvereinbar sein kann. In solchen Fällen erlauben bekannte Microsampling-Techniken und Zentrifugen Serumextraktionen in weniger als einer Minute; aber solche Zentrifugen sind noch nicht in allen klinischen Laboratorien verfügbar, und in jedem Fall ist die Serumextraktion, wie auch immer durchgeführt, ein zusätzlicher Arbeitsschritt und eine mögliche Fehlerquelle. Desweiteren ist eine Serumextraktion nicht in allen Fällen möglich wo ein schnelles Testergebnis wünschenswert ist (z. B. mobile Nothilfesysteme, Pflege im eigenen Heim und ähnliches).
Das Total-Reflexions-Fluoreszenz Testverfahren wie in der schon zuvor erwähnten EP-A-0103...(No. 83304821.8) beschrieben, erlaubt Tests von optisch dichten Proben, da hier ein extrem dünner Proben-Layer untersucht wird. Während damit Fluoreszenztests von Gesamtblut im Prinzip möglich sind, beschränken sich klinische Erfahrungen im allgemeinen auf Serumproben, und daraus folgt, daß zum Vergleich von Gesamtblut-Testverfahren mit den üblichen experimentiellen Daten eine Quantifizierung des Serumvolumens einer Probe erfolgen muß. Diese Überlegung trifft auch auf andere biologische Flüssigkeiten zu, wie z. B. Speichel, wobei die gesammelte Probe typischerweise ein disperses System mit einem unbekannten Verhältnis zwischen suspendiertem Material darstellt (z. B. ein unbekanntes Verhältnis von Bläschen zum Flüssigvolumen im Speichel).

Gegenstand der Erfindung

Es ist demzufolge ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Apparatur und Methoden zur Quantifizierung der relativen Volumina von bestehenden Phasen einer flüssigen Suspension bereitzustellen, ohne eine physikalische Trennung der Phasen vorzunehmen.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, eine Apparatur und Methoden für einen Fluoreszenz-Immunoassay bereitzustellen, wobei die Trennung einer suspendierten Phase von der Probe vor der Messung nicht notwendig ist.
Es ist auch ein Ziel der Erfindung, für Immunoassays aus Gesamtblut, Speichel und dergleichen eine einzige Apparatur bereitzustellen, die die Messungen der relativen Volumina der wichtigen Fraktion der Probe (z. B. Serum, etc.) kompensiert.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Diese und weitere Ziele werden mit der dargelegten Erfindung erfüllt, die eine Testvorrichtung und Methode mit vollständiger interner Fluoreszenz verwendet, um ein dünnes feststellbares Schicht-Volumen einer mehrphasigen Suspension, aus der die suspendierte Phase wegen ihrer Größe und Form tatsächlich ausgeschlossen ist, zu definieren. Fluoreszenzbestimmungen einer bekannten Menge eines fluoreszierenden Materials werden in ein bekanntes Volumen der Probe, die das bestimmte Volumen enthält, eingeführt; dies erlaubt die Quantifizierung der Volumina der suspendierten und suspendierbaren Phasen.
Erfindungsgemäß ist eine Testvorrichtung vorgesehen für ein Assay einer Suspension einer Probe, die einen Komplex unter Einschluß eines Fluoreszenz-Markers bilden kann, der in der Lage ist, Fluoreszenzstrahlung innerhalb eines ersten Frequenzbandes zu emittieren als Reaktion auf eine Anregungsstrahlung mit einem ersten vorgegebenen Frequenzband, wobei die Testvorrichtung ein längliches optisches Element mit einer total reflektierenden Innenfläche beinhaltet, das durchlässig für Anregungsstrahlung ist, die bei ihrer Ausbreitung durch dieses optische Element eine Welle an einer Oberfläche dieses optischen Elementes hervorruft, um Fluoreszenz in fluoreszierendem Material anzuregen, das in einer Zone angebracht ist, die unmittelbar zu dieser Oberfläche des optischen Elementes benachbart ist, und wobei dieses optische Element durchlässig für diese Fluoreszenz ist, sowie mit einer hohlen, länglichen Hülle, die sich im Abstand von dieser Oberfläche befindet und diese umschließt, dadurch gekennzeichnet, daß eine vorbestimmbare Menge eines Fluoreszenzmaterials im Zwischenraum zwischen diesem optischen Element und dieser Hülle vorgesehen ist, das in nur einer flüssigen Phase dieser Probenlösung lösbar ist und das in der Lage ist, wenn es derart gelöst ist, Fluoreszenzstrahlung innerhalb eines zweiten Frequenzbandes zu emittieren, wenn es von Anregungsstrahlung innerhalb eines zweiten Frequenzbandes angeregt wird.
Weiterhin ermöglicht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der relativen Volumenanteile der die Bestandteile einer flüssigen Suspension bildenden Phasen, unter Verwendung eines optischen Elementes, das durchlässig für Anregungsstrahlung ist, die Fluoreszenz innerhalb eines Fluoreszenzmaterials anregen kann, das in nur einer flüssigen Phase dieser Probenlösung lösbar ist, wobei dieses optische Element auch durchlässig für Fluoreszenzstrahlung dieses Fluoreszenzmaterials ist, mit folgenden Verfahrensschritten:
Eintauchen einer bekannten Fläche des optischen Elementes in die zu testende Probenlösung;
Steuern dieses Eintauchvorganges des optischen Elementes derart, daß sichergestellt ist, daß diese bekannte Fläche vollständig mit einer dünnen Schicht bekannter Dicke der Probenlösung bedeckt ist;
Einbringung einer vorgegebenen Menge des Fluoreszenzmaterials in dasjenige Volumen der Probenlösung, das durch diese bekannte Fläche und deren bekannte Dicke gebildet ist;
Inkubation dieses Volumens der Probenlösung im optischen Element über einen Zeitraum, der über derjenigen Zeitspanne liegt, die erforderlich ist, um Diffusionsprozesse ablaufen zu lassen, die das Fluoreszenzmaterial innerhalb dieses Volumens verteilen;
Aussetzung des optischen Elementes einer Strahlung in Form einer Oberflächenwelle, um die Fluoreszenz dieses Fluoreszenzmaterials anzuregen, das in dieser einen Flüssigkeitsphase gelöst ist, und
Messung der Intensität dieser Fluoreszenzstrahlung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays vorgesehen, unter Verwendung eines optischen Elementes, das durchlässig für Anregungsstrahlung ist, mit deren Hilfe Fluoreszenz eines Fluoreszenz-Markers hervorgerufen werden kann, der ein Bestandteil eines Antigen-Antikörper-Komplexes ist, der innerhalb einer Probenlösung bestimmt werden soll, wobei dieses optische Element ebenso durchlässig für Anregungsstrahlung ist, die Fluoreszenz eines zweiten Fluoreszenzmaterials anregen kann, das in einer der flüssigen Phasen der Probenlösung gelöst ist, und wobei dieses optische Element auch durchlässig für Fluoreszenz dieses Markers und des zweiten Fluoreszenzmaterials ist, und wobei dieses optische Element ausgewählte Bestandteile dieses Antikörper-Antigen- Komplexes innerhalb einer bekannten Fläche seiner Oberfläche angebracht hat, mit folgenden Verfahrensschritten:
Eintauchen des optischen Elementes in die zu testende Probenlösung, um diesen Komplex zu bilden;
Steuerung des Eintauchvorgangs des optischen Elementes derart, um sicherzustellen, daß diese bekannte Fläche vollständig mit einer dünnen Schicht bekannter Dicke der Probe beschichtet ist;
Einführung einer vorbestimmten Menge des zweiten Fluoreszenzmaterials in dasjenige Volumen der Probenlösung, das durch diese bekannte Fläche einerseits und deren Dicke andererseits bestimmt ist;
Inkubation des eingetauchten optischen Elementes über eine Zeitspanne oberhalb derjenigen Zeit, die erforderlich für Diffusionsprozesse ist, um dieses Volumen abzudecken;
Aussetzen dieses optischen Elementes der Anregungsstrahlung, um dadurch mit Hilfe einer Oberflächenwelle Fluoreszenz des Markers in dem Komplex anzuregen, der an dem optischen Element angebracht ist sowie des zweiten Fluoreszenzmaterials, das in dieser einen Flüssigkeitsphase gelöst ist, und
Messung der relativen Intensitäten dieser Fluoreszenz.
Die bevorzugte Realisierung (der Erfindung) für die Verwendung bei Immunoassays besteht aus einem Einwegartikel, einer Kapillarröhre mit präzisem Durchmesser über die ganze Länge, die eine näherungsweise axial angeordnete optische Faser enthält, auf die ein Monolayer mit einer Komponente des Antikörper-Antigen-Komplexes (z. B. Antikörper) immobilisiert ist. Der Einwegartikel wird mit einer inerten Verdünnungslösung versehen, die mit einer bekannten Menge markierten Komplements zur immobilisierten Komponente (z. B. fluoreszenzmarkiertes Antigen) und einer bekannten Menge eines zweiten Fluoreszenzmaterials, das z. B. bei einer unterschiedlichen Wellenlänge fluoresziert als der Marker, vorbeladen ist. Das zweite Fluoreszenzmaterial wird danach ausgewählt und geladen, daß es mit den Bestandteilen der Probe nicht reagiert, aber vollständig im angenommenen Volumen des relevanten Teils der Probe löslich ist (z. B. der Serumanteil im Gesamtblut oder der Flüssiganteil im Speichel). Das zweite fluoreszierende Material wird auch nach der Diffusionsrate gewählt, die mindestens so groß sein muß wie die der markierten Substanz und deren Komplement.
In einer bevorzugten Testdurchführung wird die Faser in die zu untersuchende Probe getaucht und verbleibt dort eine ausreichende Zeitspanne, damit beide, das zweite fluoreszierende Material und die markierte Substanz mit ihrem Komplement durch das gesamte Volumen zwischen der Faser und der Kapillarwand diffundieren kann. Das gesamte Probenvolumen, durch das das fluoreszierende Material diffundieren kann, ist definiert durch die Geometrie der Faser und der Kapillarröhre. Da die Menge des zweiten fluoreszierenden Materials vorbestimmt ist, ist die Konzentration des zweiten fluoreszierenden Materials im suspendierbaren flüssigen Anteil der Probe ein Maß für das Flüssigvolumen, das umgekehrt proportional zum Gesamtvolumen ist.
Messungen beider fluoreszierender Materialien werden mit Total Reflexions Fluoreszenz durchgeführt, wobei ein Ende der Faser sowohl belichtet als auch gemessen wird und zwar innerhalb der numerischen Apertur der Faser. Nur der Teil des fluoreszierenden Materials, der sich innerhalb der Oberflächenwelle befindet, fluoresziert, und demzufolge wird nur das gemessen, das in die Faser zurückgeleitet wird. Daraus folgt, daß alles was vom Fluoreszenzmarker (sowohl an die Faser immobilisiert als auch in der Flüssigkeit suspendiert) oder vom zweiten fluoreszierenden Material (jetzt vollständig in der suspendierbaren Flüssigkeit gelöst) gemessen wird, sich innerhalb ein paar hundert Angstrom der Faser befindet. In der Tat stellt die Beschränkung der Fluoreszenzmessung auf eine schmale Zone, die an die Faser angrenzt, sicher, daß die Messung in erster Linie die flüssigen Bestandteile der Probe erfaßt, während das Volumen der suspendierten Phase (z. B. Blutzellen oder Blasen) nahe der Faser durch die Geometrie der suspendierten Phase teilweise limitiert ist.
Durch geeignetes optisches Filtern können die Fluoreszenzsignale des Markers und des gelösten fluoreszierenden Materials einzeln dargestellt werden, wobei das Signal des Markers einen Titer der immunologisch reaktiven Anteile im Gesamtvolumen der Probe darstellt, und wobei das Signal, das auf das zweite fluoreszierende Material zurückzuführen ist, eine Messung erster Ordnung der Konzentration dieses Materials ist und dadurch des Gesamtvolumens der gelösten Flüssigkeit darstellt. Ein Beobachtungskanal, der die abgeschwächte Totalreflexion der Fluoreszenz-Anregungswellenlänge mißt, kann auch verwendet werden, um jegliche Abschwächung, die auf suspendierte absorbierende Partikel in der Flüssigkeit an der Faser zurückzuführen ist, messen zu können, und erlaubt dadurch eine Korrektur zweiter Ordnung der Bestimmung der Konzentration in der Probe.
Da der Testkit dieser Erfindung die notwendigen Reagenzien in den notwendigen Mengen und Verdünnungen enthält, und da das Gesamtvolumen der Probe durch die Konstruktion vorgegeben ist und den suspendierten Anteil ausgleicht, braucht das anwendende technische Personal wenig Übung oder Geschick zur Durchführung des Assays, es sind weder Trennungsschritte, noch genaue volumetrische-, unterschiedliche Ablese-, oder Zeitmeßapparaturen notwendig.
Insofern, als Fasern und Kapillaren mit präzisem Durchmesser und Bohrung leicht und billig zu erwerben sind, und da das Beschicken und Beladen der Faser während der Herstellung leicht überprüft werden kann, wird angenommen, daß der Einwegartikel dieser Erfindung zu vernünftigen Preisen hergestellt werden kann.
Andere Gegenstände dieser Erfindung sind offensichtlich, bzw. werden nachstehend behandelt. Die Erfindung schließt dementsprechend die Testvorrichtung mit der Konstruktion, der Kombination der Elemente und der Anordnung der Teile ein; das Verfahren schließt die einzelnen Schritte und das Verhältnis von einem oder mehreren dieser Schritte in Auswirkung auf die anderen ein, die in der folgenden detaillierten Offenbarung erläutert werden, und deren Schutzumfang durch die Patentansprüche gegeben ist.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Für ein besseres Verständnis des Charakters und der Gegenstände der vorliegenden Erfindung wird auf die folgende detaillierte Beschreibung verwiesen, die in Zusammenhang mit den folgenden Abbildungen zu sehen sind, wobei:
Abbildung 1: stellt einen Längsschnitt eines Einweg-Immunoassay-Testkits dar, der eine bevorzugte Verwirklichung der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung darstellt;
Abbildung 2: stellt wie Abb. 1 die Ansicht einer alternativen Verwirklichung des Immunoassay-Testkits der vorliegenden Erfindung dar;
Abbildung 3: stellt eine schematische Ansicht eines Ausschnitts des Testkits aus Abb. 1 (oder 2) dar und illustriert eine typische immunochemische Reaktion bei der Verwirklichung der Erfindung; und
Abbildung 4: stellt eine schematische Teilansicht und Blockdiagramm eines exemplarischen Fluorimeters für den Einsatz mit dem Immunoassay-Testkit der vorliegenden Erfindung dar.
In den Abbildungen beziehen sich gleiche Indexnummern auf gleiche Elemente.
Bezugnehmend auf die Terminologie werden in der detaillierten Beschreibung der Testvorrichtung dieser Erfindung Teile der Vorrichtung als "obere" und "untere" Teile bezeichnet. Dies wurde lediglich zur Bequemlichkeit und wegen der Bezugnahme der Beschreibung auf die skizzenhaften Darstellungen in den Abbildungen gewählt. Man wird besonders zu schätzen wissen, daß die Testvorrichtung in jeder Position und Orientierung funktioniert, und daß dies so bestimmt werden kann, liegt im Schutzbereich dieser Erfindung.
Man wird auch verstehen, daß die Darstellung in den Abbildungen schematisiert ist und kein Versuch unternommen wurde, tatsächliche Skalen oder Verhältnisse anzuzeigen.

Detaillierte Beschreibung

Die vorliegende Erfindung arbeitet im Total-Reflexions-Fluoreszenz, die mit Tunneling von Fluoreszenzstrahlung gekoppelt ist. Obwohl, wie noch beschrieben wird, die Erfindung unabhängig von anderen Tests durchgeführt werden kann, und dabei nur die relativen Volumina einer gewählten Phase einer Flüssigsuspension mengenmäßig erfaßt werden, kann sie auch vorteilhaft in andere Tests eingebaut werden. In letzterem Fall führt eine solche Kombination von Testvorrichtung und Methoden nicht nur zu offensichtlichen Vorteilen durch die Kombination (z. B. die Quantifizierung von mehreren Komponenten mit nur einer Testvorrichtung und Methode), sondern kann auch zur Vereinfachung der Vorschrift, die normalerweise für den anderen Test notwendig ist, führen. Immunoassays biologischer Flüssigkeiten sind solch ein Fall, da solche Flüssigkeiten normalerweise Suspensionen sind, und da die meisten Vorschriften eine Trennung der verschiedenen wesentlichen Phasen der Suspension als einen Vorbereitungsschritt für den Immunoassay vorschreiben. Aus diesem Grund steht eine bevorzugte Verwirklichung dieser Erfindung zum Immunoassay, und in Bezug auf eine solche Realisierung wird die Erfindung nun beschrieben. Der verwendete Einwegartikel entspricht dem schon in meiner Europäischen Patentanmeldung EP-A-0103426 (No. 83304821.8) beschriebenen und auf diese kann bezüglich weiterer Details der Grundstruktur und des Basisverfahrens zurückgegriffen werden.
In Abbildung 1 kann man den Längsschnitt eines Immunoassaytestkits 10 sehen, der in Übereinstimmung mit den Prinzipien der vorliegenden Erfindung angefertigt wurde. Kit 10 umfaßt eine optische Faser 12, eine Kapillarröhre 14 und einen Stopfen 16.
Die Faser 12 besteht aus einem länglichen im wesentlichen zylindrischen, optisch durchlässigen Körper, der so angepaßt ist, daß optische Strahlung, die an einem Ende der Faser innerhalb eines feststehenden Raumwinkels eindringt, sich über ihre ganze Länge durch mehrmalige innere Totalreflexion im wesentlichen rotationssymmetrisch zur Achse der Faser ausbreitet. Wie in der Technik der optischen Fasern gut bekannt, ist der maximale Eintrittswinkel B relativ zur Achse der Faser für die auf die Faser eintreffende Strahlung durch die Brechungsindices der Faser und des umgebenden Mediums vorgegeben. Für Strahlung, die sich anfangs durch ein Medium mit dem Brechungsindex n ausbreitet, und in eine Faser mit dem Brechungsindex n&sub1; eintritt, die von Material mit dem Brechungsindex n&sub2; umgeben ist, ergibt sich der maximale Eintrittswinkel aus der folgenden Gleichung:
N.A. = n&sub0;·sin B = (n&sub1;²-n&sub2;²)1/2, (1)
wobei N.A. die sogenannte numerische Apertur der Faser ist. Beispielsweise, aber nicht notwendigerweise, kann die Faser 12 aus irgendeinem optisch transparenten Material wie Glas, Quarz, Poplypropylen, Polyamin, Nylon oder ähnlichem bestehen, zum einen danach ausgewählt, daß sein Brechungsindex größer ist als der der zu testenden Flüssigprobe (üblicherweise eine wäßrige Lösung mit einem Brechungsindex um 1,33 oder eine Serumprobe mit einem Brechungsindex um 1,35) und zum anderen danach ausgewählt, daß das Material relativ unlöslich ist und nicht mit der Flüssigkeit reagiert. Obwohl auch andere Faserdurchmesser verwendet werden können, haben sich Durchmesser von 200 um als zufriedenstellend herausgestellt. Für die meisten Tests erscheint eine Faserlänge von 25 mm angemessen, es ist aber einsichtig, daß die Länge der Faser an den jeweiligen Test angepaßt werden kann.
Die Kapillarröhre 14 ist vorzugsweise eine optisch durchlässige Röhre, deren Material auch danach ausgewählt wurde, ob es bezüglich der zu testenden Flüssigkeit unlöslich und nichtreaktiv ist. Aus diesem Grund besteht die Kapillarröhre 14 vorzugsweise aus Glas, Quarz, Poplypropylen, Polyolefin oder ähnlichem. Bei einer bevorzugten Realisation besteht die Kapillarröhre 14 aus einer geeignet kreisförmigen zylindrischen Bohrung mit einem Innendurchmesser, der ein paar hundert um größer ist als der der Faser 12 (z. B. bei einem Faserdurchmesser von 200 um kann der Innendurchmesser der Kapillarröhre ungefähr 800 um betragen).
Der Stopfen 16 ist so gestaltet und dimensioniert, daß er auf ein Ende der Kapillarröhre 14 paßt, und daß er einen Endabschnitt 18 der Faser 12 weitgehend koaxial innerhalb der Kapillarröhre verankert. Außerdem bildet der Stopfen 16 eine fest abgegrenzte Oberfläche, um das Kit 10 in einem Fluorimeter zu positionieren, wie später beschrieben wird. An diesem Ende ist der Stopfen 16 vorzugsweise mit einem Flansch 20 versehen, dessen Außendurchmesser dem Außendurchmesser der Kapillarröhre 14 entspricht, sowie mit einem zentral angebrachten, zwingenähnlichen Fortsatz 21, mit einer koaxialen-zentralen Bohrung 22. Die Bohrung 22 durchdringt den Stopfen 16 vollständig und ist so dimensioniert, daß sie den Endabschnitt 18 der Faser 12 sicher hält. Bei einer bevorzugten Verwirklichung ist der Stopfen 16 um die Faser 12 geformt, wobei der Stopfen vorzugsweise aus einem Material mit niedrigem Brechungsindex wie Siloxan gefertigt ist. Der Stopfen 16 enthält außerdem eine oder mehrere zusätzliche Perforationen 23, die mit dem Inneren der Kapillarröhre 14 in Verbindung stehen.
Die Faser 12 durchsetzt den Stopfen 16 und wird von ihm so gehalten, daß sie bis auf das Endstück 18 vollständig in das Innere der Kapillarröhre 14 ragt, wobei die Stirnseite 24 des Endabschnitts 18 unbehindert und gleichzeitig mit dem äußeren Ende der Bohrung 22 fluchtend außerhalb der Kapillarröhre endet. Die Stirnseite 24 ist vorzugsweise plan und senkrecht zur Achse der Faser 12 ausgerichtet. Vorzugsweise ist die Stirnfläche 24 ebenfalls hoch transparent und frei von Flecken, die Licht streuen könnten, das auf die Stirnseite fällt. Zu diesem Zweck kann die Stirnfläche 24 optisch poliert sein, obwohl man herausgefunden hat, daß eine geschmolzene Quarzfaser gespalten werden kann, um eine adäquate optische Oberfläche zu erhalten. Die Stirnfläche 26 der Faser gegenüber der Stirnfläche 24 wird ebenfalls flach poliert oder gespalten und mit einer Spiegelbeschichtung versehen, die senkrecht zur Faserachse angebracht ist und dadurch bewirkt, daß in der Faser gefangene Strahlung die Faser zweifach durchläuft. Die Außenabmessungen von Faser 12, Kapillarröhre 14 und Stopfen 16 sind so gewählt, daß sichergestellt ist, daß sich das untere Ende der Faser innerhalb der Kapillarröhre befindet.
Man wird leicht verstehen, daß die Spiegelbeschichtung 28 nicht notwendig ist, wenn lediglich ein einziger Durchgang der Strahlung akzeptabel ist. Bei einer solchen Realisierung ist es jedoch notwendig, daß die Stirnfläche 26 lichtundurchlässig und außerhalb der Kapillarröhre 14 positioniert ist, oder auf andere Weise sichergestellt ist, daß sie während der Messung frei von Probenflüssigkeit ist, um das Probenvolumen auf die Region, die durch die Oberflächenwelle definiert ist, zu beschränken, wie dies aus der folgenden Diskussion der Arbeitsweise der Vorrichtung offensichtlich wird.
Bevor die Faser 12 in den Kit 10 montiert wird, wird sie, wie noch beschrieben wird, beschichtet und damit wird ein Bereich 30 ihrer zylindrischen Oberfläche für die Testdurchführung aktiviert. Bei einer bevorzugten Verwirklichung ist der aktivierte Bereich 30 auf eine vorgegebene Länge der Faser 12 beschränkt durch eine chemisch und optisch inerte Beschichtung 32, die über beide Enden der Faser hinausreicht, z. B. aus einem Silikon mit niedrigem Brechungsindex aufweist. Es ist einleuchtend, daß die Abmessungen des aktivierten Bereichs 30 auf andere Art und Weise festgelegt werden können (z. B. durch Abdeckung der Faser während der Beschichtung), oder alternativ dazu könnte die Faser auf ganzer Länge aktiviert werden und die Länge der Faser sorgfältig bestimmt werden, die sich in der Kapillarröhre 14 befindet.
Wenn wir uns nun der Abbildung 3 zuwenden, können wir eine stark schematisierte Darstellung eines Abschnitts des Längsschnitts des Kits 10 innerhalb des aktivierten Bereichs 30 der Faser 12 sehen, der mit einer Probe 43 zur Analyse gefüllt ist.
Die Oberfläche der Faser 12 innerhalb des Bereichs 30 ist mit einer Vielzahl von Bindungsstellen 44 versehen, wovon an einige ein Teil 46 des zu bestimmenden Antigen-Komplexes gebunden ist. (Die Bezeichnung Teil eines Antikörper-Antigen-Komplexes bezieht sich auf einen immunologisch reaktiven Teil eines solchen Komplexes, und beinhaltet sowohl Haptene, vollständige Antigene und Antigen-Fragmente (FAB), als auch vollständige Antikörper). Die Bindungsstellen 44 sind so gewählt, daß sie die Teile 46 immobilisieren, ohne die Reaktivität (z. B. die Affinität und Avidität) dieser Teile, die für die Komplementbildung des Komplexes wichtig ist, merklich zu beeinflussen. In einer bevorzugten Verwirklichung besteht die Faser 12 aus Glas oder Quarz, die Bindungsstellen 44 sind die reaktiven Gruppen einer Silyl-Komponente wie 3-Aminopropyltrimethoxysilan und die Teile 46 sind ein Antikörper wie z. B. Immunglobulin G (IgG). Wie schon zuvor über diese spezielle Kombination einer festen Phase erwähnt, kann eine Bindungsstelle 44 und ein Teil 46 über das Carboxylende des Antikörpers aneinander gebunden werden, und damit bleiben die Aminoende des Antikörpers für die Antigen-Bindung frei. Das Verfahren zur Vorbereitung der Glasoberfläche von Faser 12, die Anheftung der Silyl-Komponente und die kovalente Bindung eines Antikörpers durch die Silyl-Komponente an das Glas, wurden von Weetall (U.S. Patent 3,652,761) beschrieben, dort kann auch eine Beschreibung anderer Silyl-Komponenten und Verfahren gefunden werden, mit denen die Carboxyl-, die Amino- und andere reaktive Gruppen eines Antikörpers oder Antigens (oder deren Fragmente) kovalent an verschiedene anorganische Materialien gebunden werden können. Es sollte beachtet werden, daß auch eine Vielzahl von Methoden zur Immobilisierung von Antigenen und Antikörpern an Polymeren vorhanden ist, und daß Fachleuten klar ist, daß Bindungsstellen 44 für Antigen oder Antikörper auch an Polymerfasern einzurichten sind. Wenn die Faser 12 z. B. aus Nylon (Polyamid) besteht, könnte die Bindung in Form einer Substitution eines geeigneten Radikals für die Wasserstoffbrückenbindung an die funktionale Gruppe des Polymers bestehen.
Es sollte ebenfalls beachtet werden, daß die Bindungsstellen 44 auch Spacergruppen enthalten könnten, wie in der Technik bekannt, um einen ausreichenden Abstand zwischen der Faser 12 und den Teilen 46 sicherzustellen, um sterische Hinderungen beim Antikörper-Antigen-Bindungsprozeß zu minimieren. Die Bindungsstellen 44 könnten z. B. eine Polyethylen-Kette enthalten, wie sie beispielsweise vorliegt, wenn 1,6-Diaminohexan oder 6-Aminohexansäure an die Faser 12 durch eine Peptidbindung gebunden sind, und eine freie primäre Amino- und eine freie Carboxylgruppe für eine kovalente Bindung an ein Carboxyl- oder Amino-Ende eines Protein-Anteils 46 zur Verfügung steht. Beide Koppelverbindungen enthalten zwischen den Enden eine Kohlenstoffkette aus 6 C-Atomen und trennen dadurch den Anteil 46 von der Faser 12 mit einem entsprechenden Abstand. Ähnlich geeignete Bindungs- und Spacer- Materialien sind von Gebieten der Immunoassay-Technik und der Affinitäts-Chromatographie gut bekannt.
Vorzugsweise wird die Faser 12 mit einem Teil 46 versehen, der besetzte Bindungsstellen aufweist, und der mit dem Bezugszeichen 46C versehen ist, wobei diese Teile zum Teil mit markiertem Komplement 50 für ein Kompetitions-Immunoassay versehen sind. Folglich ist der Teil 46 bei einem Ausführungsbeispiel ein Antikörper, wobei eine Vorladung markierten Antigens oder Haptens in der Beschichtung der Faser 12 enthalten ist. Jede der markierten Komponenten 50 ist mit einer vorgegebenen Menge Fluorophor 52 versehen und stellt damit einen Marker dar. Die spezifischen fluoreszierenden Komponenten, die als Marker geeignet sind, schließen Fluoreszin, Tetramethylenrhodamin, Chelate seltener Erden, und ähnliches ein. Methoden zur Bindung von Fluoreszenzmarkern an Proteine sind in der Technik gut bekannt und viele der im Handel erhältlichen fluoreszierenden Komponenten besitzen Proteinbindungsstellen. Bei Kompetitions-Assays ist vorzugsweise ein festgelegter Anteil der Bindungsstellen 44 mit einem immunologisch inerten Protein 56 wie Albumin versehen.
Die aktive Region der Faser 12 ist ebenfalls mit einer festgelegten Menge an immunologisch inertem fluoreszierendem Material 57 beschichtet. Das fluoreszierende Material 57 ist danach ausgewählt, daß es mit der Probe oder dem Reagenz nicht reagiert, und trotzdem in der suspendierbaren Phase der Probe löslich ist. Dies bedeutet für Tests mit Gesamtblut, daß das fluoreszierende Material 57 so ausgewählt ist, daß es mit Protein nicht reagiert und im Blutserum löslich ist. Desweiteren ist dieses fluoreszierende Material 57 danach ausgewählt, daß es bei einer unterschiedlichen Wellenlänge fluoresziert wie der Fluoreszenz-Marker, der an das Komplement 50 gebunden ist. Außerdem ist das fluoreszierende Material 57 so ausgewählt, daß es nicht quencht oder durch den Fluoreszenz-Marker gequencht wird. Um also Strahlungsquenchen zu vermeiden, muß jede der fluoreszierenden Verbindungen, die in einem Test eingesetzt wird, danach ausgewählt werden, daß das Absorptionsmaximum des einen nicht in der Nähe des Emissionsmaximums des anderen fluoreszierenden Materials liegt (z. B. das fluoreszierende Material 57 und der Marker des markierten Komplements 50 sind jeweils mit der Maßgabe ausgewählt, daß ihr Anregungs-Band sich nicht mit dem Fluoreszenz- Emmissionsband des anderen überschneidet).
Verbindungen, die als fluoreszierendes Material 57 verwendet werden können, schließen Verbindungen wie Thodamin B (C.I. No. 45170), Akridin Orange (C.I. No. 46005), Berberin Sulfat (C.I. No. 75,160), Methylenblau (C.I. No. 52,015), Thionin (C.I. No. 52000), Pyren, Astrazon Orange R, verschiedene Cyanine (wie 3,3 Diethyloxadicarbocyanin-Jodid), Quinacrin, Ethidium Bromid und viele andere ein. Das fluoreszierende Material 57 ist mit einer ausreichenden Menge, die leicht gemessen werden kann, aber nicht ausreichend ist für Selbst- Absorption, eingebracht. Unter diesen Umständen wird das fluoreszierende Material 57 vollständig im erwarteten Volumen der suspendierbaren Flüssigkomponente der Probe löslich sein. Als Richtlinie und gegebenenfalls in Abhängigkeit zu ändern vom Material und der Probe, so wie es von denen, die im Umgang mit Fluoreszenztests bewandert sind, verstanden werden wird, kann das fluoreszierende Material 57 typischerweise derart eingebracht werden-, daß eine 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;&sup6; molare Lösung in einem Volumen reiner Flüssigkeit entsteht, die den Zwischenraum zwischen dem aktiven Bereich 30 der Faser 12 und der benachbarten Wandung der Kapillarröhre 14 ausfüllt. Das fluoreszierende Material 57 ist beispielsweise über Wasserstoffbrückenbindung schwach an Faser 12 gebunden.
Die Beschichtung kann so hergestellt werden, daß eine festgelegte Oberflächenzusammensetzung entsteht, indem man Adsorptionsphänomene ausnützt, wie folgt: Bei einer Beschichtungs-Lösung, die die geeigneten Konzentrationen der Reagenzien enthält, wird lediglich die Immersion der Faser, die mit den geeigneten Oberflächenbindungsgruppen 44 versehen ist, einen Monolayer chemisch gebundenen Proteins produzieren. Das Verhältnis zwischen, sagen wir, Immunoglobulin und inertem Protein in dieser Schicht wird gegeben sein (ist aber nicht identisch mit) durch ihr Verhältnis in der Lösung. Jede teilweise Besetzung der Immunoglobuline-aktiven Stellen mit markiertem Antigen wird natürlich in der Lösung erhalten bleiben.
Nach dem Eintauchen wird die Faser aus der Beschichtungslösung entnommen. Um den anhaftenden Flüssiglayer von der Einlagerung zusätzlichen Reagenzes zu bewahren, wird die Faser dann schnell gewaschen, bevor Verdunstung eintreten kann. Die Proteinschicht, die kovalent gebunden ist, wird durch diesen Prozeß nicht verdrängt. Um die Bindung von mehr als einer Proteinschicht zu verhindern, darf das bifunktionale Reagenz die Netto-Ladung des Proteins nicht verändern (dies kann gesteuert werden, indem der pH-Wert der Beschichtungslösung angeglichen wird) und keinen zu langen Spacerarm besitzen.
Das Testkit 10 soll mit dem Fluorimeter 59 verwendet werden (Fig. 4). Das Fluorimeter 59 besteht aus einer Lichtquelle 60, einem Strahlungssplitter 62, einer Abbildungsoptik 64, Filtern 66A, 66B und 66C, Detektoren 67A, 67B und 67C, einem Referenzdetektor 68, Verstärkern 70A, 70B und 70C und einer Anzeige 72.
Die Lichtquelle 60 liefert optische Strahlung einer geeigneten Frequenz, die entsprechend dem Fluorophor als verwendeten Marker und dem fluoreszierenden Material 57 ausgewählt wurde, um Fluoreszenz in beiden Komponenten des Reagenzes anzuregen. Lichtquelle 60 liefert diese Strahlung vorzugsweise nur über einen engen Wellenlängenbereich, der nach maximaler Fluoreszenz ausgewählt wurde. Deshalb schließt die Lichtquelle 60, zusätzlich zur bevorzugten Wolfram- Halogen Lampe und angeschlossener Energieversorgung, einen Bandpaß- Filter ein. Alternativ dazu kann die Lichtquelle 60 andere Quellen enthalten, wie eine Quecksilberlampe, eine Blitzlichtlampe oder einen Laser. Die Lichtquelle 60 schließt auch eine geeignete strahlenformende Blende und Optik ein, wie sie in dieser Technik bekannt sind, um die Abbildungsoptik 64 mit einem Strahl der geeigneten Vergenz so zu bestrahlen, daß die Optik eine Abbildung der Blende der Quelle auf die Endfläche 24 der Faser 12 erzeugt, ohne daß Strahlung auf die Endfläche unter einem Einfallswinkel auftrifft, der größer ist als der, der der entsprechenden Numerischen Apertur der Faser entspricht.
Zwischen Lichtquelle 60 und Optik 64 ist der Strahlungssplitter 62 angeordnet. Er besteht aus einer der weit verbreiteten optischen Systeme, die eine Vielzahl ähnlicher Strahlen von einem Ort auf eine Vielzahl von Orten reflektieren und übertragen können. Hierzu enthält der Strahlungssplitter 62 partial-reflektierende Spiegel oder ähnliche Bauteile, und ist so ausgelegt, daß anregende Fluoreszenzstrahlung hoher Frequenz (kurze Wellenlänge) aus der Lichtquelle 60 zur Optik 64 und von der Optik 64 zum Filter 66C projiziert wird, während Strahlung mit niedriger Frequenz (große Wellenlänge) von der Optik 64 zu den Filtern 66A und 66B projiziert wird. Der Strahlungssplitter 62 ist auf übliche Art und Weise so ausgelegt, daß die Strahlung einer ausgewählten Frequenz von der Lichtquelle 60 auf den Referenzdetektor 68 projiziert wird.
Die Optik 64 ist so ausgelegt, daß die Lichtquelle 60 auf die Stirnfläche 24 der Faser 12 so abgebildet wird, daß gerade die gesamte Stirnfläche mit dem Bild der strahlenformenden Blende der Quelle beaufschlagt ist, wobei der maximale Einfallswinkel eines Strahls danach ausgewählt wird, daß er nicht größer ist als der bei der entsprechenden numerischen Apertur der Faser. Die Optik 64 ist so gestaltet, daß sie praktisch die gesamte Strahlung, die aus der Stirnfläche 24 innerhalb der numerischen Apertur der Faser austritt, sammelt, und die Stirnfläche auf die Photodetektoren 66A, 66B und 66C abbildet. Als eine Hilfe zur richtigen Positionierung der Faser 12 enthält das Fluorimeter 59 Positionierungseinrichtungen, wie z. B. eine Aperturplatte 65, die so dimensioniert ist, daß sie den Fortsatz 22 des Stopfens 16 aufnimmt und die Stirnfläche 24 relativ zur Optik 64 passend ausrichtet.
Die Detektoren 67A und 67B enthalten Photodetektoren, von denen jeder so ausgerichtet ist, daß er über den Strahlensplitter 62 und die Filter 66A und 66B ein Abbild der Stirnfläche 64 der Faser 12 erhält, das von der Optik 64 auf die Detektoren projiziert wird. Die Filter 66A und 66B sind zwischen dem Strahlensplitter 62 und den entsprechenden Detektoren 67A und 67B angeordnet und so ausgewählt, daß die Strahlung, die auf die entsprechenden Photodetektoren fällt, auf die Emissionsmaxima des Fluoreszenzmarkers im markierten Komplement 50 und des fluoreszierenden Materials 57 begrenzt wird, und die Fluoreszenz des anderen Materials unterdrückt wird. So wird z. B., wenn der Marker aus Fluoreszin besteht und das fluoreszierende Material 57 Ethidium Bromid ist, das Filter 66A so ausgewählt, daß ein Strahlungsband mit einer Wellenlänge von etwa 520 nm (entsprechend dem Fluoreszenzmaximum von Fluoreszin) durchgelassen wird, und daß ein Strahlungsband zwischen 580 und 700 nm (entsprechend dem Fluoreszenzmaximum von Ethidium Bromid) ausgebildet wird. Bei einer derartigen Kombination von fluoreszierenden Substanzen wird ein dichroischer Strahlungssplitter verwendet, der 520 nm-Strahlung reflektiert und Strahlung zwischen 580 und 700 nm durchläßt. Die Strahlungsbänder durchgehender und reflektierter Strahlung sind beim Filter 66B komplementär zu denen vom Filter 66A. Im Ergebnis wird dadurch Strahlung des Fluoreszenzmarkers von der Optik 64 aufgenommen und fällt auf den Detektor 67A, und Fluoreszenzstrahlung vom fluoreszierenden Material 57 fällt auf den Detektor 67B.
Beide Detektoren 67A und 67B enthalten vorzugsweise einen Photomultiplier (der mit ausreichender Energieversorgung und optischen Blenden ausgestattet ist, um das Blickfeld des Detektors auf die Stirnfläche 24 zu beschränken, wie in der Technik üblich), der seine maximale Empfindlichkeit im Bereich des Fluoreszenz-Peaks des Markers bzw. des fluoreszierenden Materials 57 besitzt. Die Detektoren 67A und 67B sind desweiteren mit Sperrfiltern versehen, entsprechend den Bandpaßfiltern der Lichtquelle 60.
Der Filter 66C und der Detektor 67C sind ebenfalls so angeordnet, daß sie von Strahlung aus der Stirnfläche 24 der Faser 12 beleuchtet werden, die die Optik 64 und den Strahlungssplitter 62 durchlaufen. Der Filter 66C ist so ausgewählt, daß er nur die einfallende Strahlung an den Detektor 67C weiterleitet, die innerhalb des Durchgangs-Bandes des Filters der Lichtquelle 60 liegt, und der Detektor 67C ist so ausgewählt, daß er für diese Strahlung maximale Empfindlichkeit besitzt. Der Detektor 67C ist ebenfalls mit der nötigen Energieversorgung und Sichtfeldbegrenzungen (nicht gezeigt) versehen, um sein Blickfeld auf die Stirnfläche 24 der Faser 12 zu beschränken.
Der Referenzdetektor 68, vorzugsweise eine Photodiode, ist so angeordnet, daß er Strahlung von der Lichtquelle 60, die durch den Strahlungssplitter 62 hindurch geht, auffängt. Der Referenzdetektor ist so ausgewählt, daß seine maximale Empfindlichkeit in der spektralen Region der Lichtquelle 60 nach Durchlaufen des Strahlungssplitters 62 liegt und schließt geeignete Sektorenbegrenzungen und eine Optik ein, sein Blickfeld auf die Quelle begrenzt.
Die Quotienten-Verstärker 70A, 70B und 70C bestehen aus einem aus einer Anzahl gut bekannter elektronischer Bausteine, von denen jeder ein Ausgangssignal liefert, das proportional zum Verhältnis zweier Eingangssignale ist, und sind so mit dem Ausgang des Referenzdetektors 68 und jeweils einem der Detektoren 67A, 67B und 67C verbunden, daß Signale abgegeben werden, die zum Verhältnis des jeweiligen Ausgangssignals der Detektoren 67A, 67B, 67C zum Ausgangssignal des Referenzdetektors proportional sind. Jeder Verstärker kann z. B. ein Verstärker mit variabler Verstärkung sein, der das Ausgangssignal jeweils eines der Detektoren 66 verstärkt und dessen Verstärkungsfaktor umgekehrt proportional zum Ausgangssignal des Referenzdetektors 68 ist.
Die Ausgangssignale der Quotienten-Verstärker 70A, 70B und 70C werden der Anzeige 72 zugeführt und bilden deren Eingangssignale. Die Anzeige 72 ist eines von solchen Geräten, das drei sichtbare Signale proportional zu jedem von drei elektrischen Eingangssignalen erzeugen kann, und könnte z. B. aus mehreren Meßinstrumenten oder digitalen Anzeigeelementen, einem Mehr-Kanal-Band-Registriergerät, oder etwas ähnlichem bestehen.
Der Testkit 10 ist in erster Linie für den Einsatz bei flüssigen Suspensionen vorgesehen, obwohl er auch, wie man leicht verstehen kann, bei Proben eingesetzt werden kann, bei denen die unterschiedlichen Phasen getrennt worden sind. Der Begriff "Suspension" bedeutet, so wie er hier verwendet wird, ein nicht-homogenes physikochemisches System, das aus zwei oder mehr physikalisch verschiedenen und mechanisch trennbaren Anteilen (den sogenannten "Phasen" des Systems) besteht, die gemischt aber nicht ineinander gelöst sind. Die verschiedenen Phasen der Suspension können aus den gleichen oder verschiedenen Aggregatzuständen bestehen (z. B. gasförmig, flüssig oder fest), obwohl, wie deutlich werden wird, die suspendierbare Phase (auch bekannt als die zusammenhängende oder externe Phase oder das Dispersionsmedium) flüssig sein muß, zumindest für einen Teil der Testdurchführung mit der Testvorrichtung dieser Erfindung.
Während der Testdurchführung wird der Testkit 10 in eine Probe, die untersucht werden soll, getaucht. Die Perforationen 23 erlauben, daß die Kapillarröhre 14 durch Kapillarkräfte gefüllt wird, wenn ihr Ende in die Probe taucht (beim vorgeschlagenen Röhrchendurchmesser ist es von Vorteil, wenn die Faser zum Füllen schräg gehalten wird).
Auf diese Weise wird ein bestimmtes Volumen der Probe in die Kapillarröhre 14 gezogen, wann immer sie in die Lösung getaucht wird und sich vollständig füllen kann. Tatsächlich ist eine volle Kapillarröhre nicht unbedingt notwendig, es genügt, wenn der gesamte aktive Bereich 30 der Faser 12 mit Flüssigkeit bedeckt ist. Dieser Zustand kann dadurch verifiziert werden, indem man durch die Wandung der Kapillarröhre 14 beobachtet, wie die Probe die obere, inaktivierende Beschichtung 32 der Faser bedeckt. Daraus folgt, daß es nicht notwendig ist, die Länge der Kapillarröhre oder ihre vollständige Füllung genau festzulegen.
Wenn die Faser 12 in die Probe taucht, beginnt sich das fluoreszierende Material 57 in der gelösten flüssigen Phase der Probe zu lösen, und tendiert durch Diffusion zu einer gleichmäßigen Verteilung im Volumen der suspendierbaren Phase, die zwischen dem aktiven Bereich 30 der Faser 12 und der gegenüberliegenden Wandung der Kapillarröhre 14 enthalten ist. Zur selben Zeit diffundieren das markierte Komplement 50 und die hier interessierenden immunologisch reaktiven Bestandteile innerhalb der Probe von der Faser weg bzw. auf sie zu. Die Geschwindigkeit, mit der sich eine gleichförmige Verteilung von fluoreszierenden Materials 57 innerhalb der suspendierbaren Phase einstellt, hängt von der Größe des fluoreszierenden Materials, der Temperatur und der Viskosität der Probe ab. Bei typischen Werten dieser Parameter, wird eine gleichmäßige Verteilung innerhalb einiger hundert um des aktiven Bereichs 30 bei Inkubationszeiten von ungefähr 15 Minuten erreicht. Eine gleiche Zeitspanne ist für ein Gleichgewicht zwischen den immunologischen Reaktanten, die an die Faser immobilisiert sind, notwendig. (Abbildung 3 spiegelt die Situation wieder bevor das Gleichgewicht erreicht ist; die Beladung des fluoreszierenden Materials 57 an der Faser 12 wird vorzugsweise so gewählt, daß beim Gleichgewicht mit einer mittleren Probe ungefähr die Hälfte des fluoreszierenden Materials in Lösung ist).
Das Gesamtvolumen der Probe, in der das fluoreszierende Material 57 gleichmäßig in der suspendierbaren Phase innerhalb einer solchen Inkubationszeit gelöst wird (und das Volumen der suspendierbaren Phase, die mit den interessierenden immunologisch reaktiven Anteilen gespült ist), stimmt im wesentlichen mit dem Volumen überein, das sich zwischen Faser 12 und Kapillarröhre 14 über der Länge des aktiven Bereichs befindet. Das große Längen-Durchmesser Verhältnis des aktiven Bereichs 30 stellt sicher, daß während der Inkubationszeit, die um ein vernünftiges Maß die minimal erforderliche Inkubationszeit überschreitet, die Länge des Probenvolumens, in dem das fluoreszierende Material 57 verteilt ist, mit der Länge des aktiven Bereichs 30 nahezu identisch ist.
Im hier betrachteten Fall stellt dieses Gesamtvolumen der Probe nicht das hier interessierende Volumen der Probe dar, da Einschlüsse 74 (Abbildung 3), die frei von den immunologisch bedeutsamen Anteilen sind, in der Probe 43 suspendiert sind. Das als Datenbasis angestrebte Volumen entspricht dem Volumen der suspendierbaren flüssigen Phase, die die Einschlüsse 74 (einer oder mehrerer) suspendierter Phasen umgibt. Im Fall von Gesamtblut bestehen die Einschlüsse 74 aus Zellen (hauptsächlich Erythrozyten mit bikonkaver scheibenförmiger Gestalt mit einem Durchmesser von ungefähr 7,5 um), die 50% oder mehr des Gesamtvolumens der Probe ausmachen, während die suspendierbare Flüssigkeit (in diesem Fall Serum) dementsprechend das restliche Volumen erfaßt. Das fluoreszierende Material 57, das danach ausgewählt wurde, daß es mit den Einschlüssen 74 nicht reagiert und auch nicht darin löslich ist (oder im Fall von Zellen so ausgewählt, daß es zumindest nicht mit der Zellmembran reagiert oder diese durchdringt), ist lediglich in der suspendierbaren Flüssigkeit fein verteilt. Da eine vorgegebene Menge des fluoreszierenden Materials 57 sich gleichmäßig und fein in der suspendierbaren flüssigen Phase verteilen konnte, die in dem definierten Volumen zwischen dem aktiven Bereich 30 und der gegenüberliegenden Innenwandung der Kapillarröhre 14 enthalten ist, ist die Konzentration des fluoreszierenden Materials ein Maß für das Volumen der suspendierbaren flüssigen Phase.
Man wird folglich verstehen, daß die Konzentration des fluoreszierenden Materials 57, und deshalb (läßt man Quenchen außer Betracht) die verfügbare Fluoreszenz pro Volumeneinheit der suspendierbaren Flüssigkeit in Abhängigkeit vom Material, umgekehrt proportional variiert wie das Gesamtvolumen der suspendierbaren Phase, in der das fluoreszierende Material verteilt wurde, ein Minimum besitzt, entsprechend den fehlenden Einschlüssen 74 einer suspendierten Phase und verursacht durch die Geometrie der Faser 12 und der Kapillarröhre 14, sowie der Menge fluoreszierenden Materials, das im Einwegartikel 10 vorgeladen wurde, und ein Maximum besitzt, entsprechend diesen Parametern und der dichtesten Packung, die bei den jeweiligen Einschlüssen der suspendierten Phase erreicht werden kann. Bei den empfohlenen Konzentrationen ist ein Eigenquenchen des fluoreszierenden Materials 57 vernachlässigbar. Daraus folgt, daß die Fluoreszenzmessung eines bekannten Volumens der suspendierbaren flüssigen Phase eine Messung des Gesamtvolumens der getesteten suspendierbaren Phase darstellt.
Nach der Inkubation wird das Testkit 10 in das Fluorimeter 59 gebracht, wobei der Stopfen 16 mit der Apertur-Platte 65 so zusammenwirkt, daß die Stirnfläche 24 der Faser 12 in einer geeigneten Position bezüglich der optischen Achse des Fluorimeters ausgerichtet wird. Strahlung einer Wellenlänge, die so ausgewählt wurde, daß sie Fluoreszenz-Strahlung im Fluorophor 52 und fluoreszierenden Material 57 anregt, wird von der Lichtquelle 60 erzeugt, und wird durch den Strahlungssplitter 62 und die Optik 64 so geleitet, daß sie auf die Stirnfläche 24 der Faser 12 innerhalb des Raumwinkels auftrifft, der durch die numerische Apertur der Faser definiert ist. Diese Strahlung wird folglich durch die Faser 12 mit oder über dem kritischen Winkel weitergeleitet (wie durch den Strahl 54 in Abbildung 3 dargestellt), indem sie sich durch vollständige innere Reflexion entlang der Länge der Faser fortpflanzt. Im Ergebnis wird in der Probe 43, die an die Faser angrenzt, eine Oberflächenwelle erzeugt.
Wie bei den schon zuvor erwähnten anhängigen Anmeldungen 406, 324 und 410, 340 führt eine kompetitive Bindung von markierten Komponenten 50 und unmarkierten Komponenten 54 an die an die Faser angehefteten Abschnitte 46 zu fluoreszierenden markierten Komplexen 46C, die im Verhältnis zu der relativen Konzentration von markierten zu unmarkierten Komponenten stehen. Angeregt durch die Oberflächenwelle, fluoreszieren die markierten, Komplexe 46C, die unmittelbar an die Faser 12 angrenzen. Ein Teil der Fluoreszenzstrahlung dringt in die Faser ein und breitet sich innerhalb der Faser entlang von Pfaden aus, die den kritischen Winkel überschreiten, wie z. B. durch den Strahl 56 in Abbildung 3 dargestellt. Ein großer Teil dieser vollständig reflektierten Fluoreszenz-Strahlung verläßt die Faser an deren Stirnfläche 24, wo sie von der Optik 64 gesammelt und über den Strahlungssplitter 62 und den Filter 66A zum Detektor 67A geleitet wird. Der Filter 66A läßt nur solche Strahlung zum Detektor 67A durch, die innerhalb des Weltenlängenbands der maximalen Fluoreszenz des markierten Komplexes 46C liegt. Der Detektor 67A wiederum liefert ein elektrisches Signal, das proportional zur Intensität dieser Fluoreszenz ist. Der Strahlensplitter 62 läßt auch Strahlungsanteile der Lichtquelle 60 durch, um den Referenzdetektor 68 zu bestrahlen, der ein elektrisches Signal abgibt, das proportional zur Strahlungsintensität der Lichtquelle ist. Das Verhältnis dieser beiden elektrischen Signale wird durch den Quotienten-Verstärker 70A verarbeitet, so daß ein um Strahlungsschwankungen der Quelle korrigiertes elektrisches Ausgangssignal entsteht, das proportional zur Intensität der Fluoreszenz des immobilisierten markierten Materials ist und das dann von der Anzeigeeinheit 72 abgebildet wird.
Auf ähnliche Art und Weise regt die Oberflächenwelle Fluoreszenz bei dem Anteil des fluoreszierenden Materials 57 an, der unmittelbar an die Faser 12 angelagert ist. Der Anteil dieser Fluoreszenz, der in die Faser 12 zurücktunnelt und sie an ihrer Stirnfläche 24 verläßt, fällt über die Optik 64, den Strahlungssplitter 62 und den Filter 66B auf den Detektor 67B. Der Quotienten-Verstärker 70B liefert, durch die Verarbeitung der Signale vom Detektor 70B und vom Referenzdetektor 68 ein Signal, das proportional zur Fluoreszenz ist, die dem Anteil an fluoreszierendem Material 57, das an Faser 12 angelagert ist, entspricht, korrigiert um Licht-Intensitäts-Schwankungen. Auch dieses Signal wird auf der Anzeigeeinheit 72 dargestellt.
Die Größe der gemessenen fluoreszierenden Zone, die durch die Oberflächenwelle und Fluoreszenz-Tunneling gebildet wird, bildet zusammen mit den Abmessungen des aktiven Bereichs 30 der Faser 12 in erster Näherung ein festes Volumen der suspendierbaren flüssigen Phase, wobei die Dünne des Layers den Prozentsatz dieses Volumens, der durch einen Einschluß einer festgelegten Form besetzt werden kann, beschränkt. Betrachtet man z. B. eine Konzentration von ungefähr 50% des Volumens von 7,5 um großen Kugeln, die sich in Kontakt mit der Oberfläche der Faser 12 verteilen. Bei einer solchen Situation ist jede 220 u³ große Kugel von einem durchschnittlich 440 u³ großen Volumen an suspendierbaren Flüssigkeit umgeben. Dieses Volumenverhältnis wird bei kubischer wie bei hexagonaler Packung leicht erreicht, und daraus folgt, daß es auf der Faseroberfläche einen etwa 56 u² umfassenden Bereich suspendierbarer Flüssigkeit für jeden (infinitesimalen) Kontaktpunkt mit einem kugelförmigen Einschluß gibt. Innerhalb von ungefähr 1000 ngstrom der Faseroberfläche hat jeder sphärische Einschluß ein Volumen von ungefähr 0,1 u³, wobei es bei jedem Einschluß ungefähr 5,5 u³ an suspendierbarer Flüssigkeit gibt. In einem solchen Fall liegt ein vernachlässigbarer Fehler in der Annahme des Gesamtvolumens der getesteten suspendierbaren Flüssigkeit darin, daß es nicht möglich ist, die Verringerung der gemessenen Fluoreszenz durch nichtfluoreszierende Einschlüsse im angenommenen festen Volumen der suspendierbaren Flüssigkeit zu berücksichtigen. Tatsächlich kann erreicht werden, daß Fluoreszenzzonen mit Halbwertsdicken in der Größenordnung von ein paar hundert Angstrom meßbar sind. Aus diesem Grunde könnte eine höhere Genauigkeit in der Volumenbestimmung im Prinzip erreicht werden, in der Praxis kann die beim oben genannten Beispiel angenommene Genauigkeit nicht erreicht werden, da sich wahrscheinlich ein plastisches Fließen bei den interessierenden Einschlüssen einstellen wird.
Um den Absorptionsverlust in der nutzbaren Zone der Fluoreszenzanregung zu kompensieren, wird die Absorption der Probe, die an die Faser 12 angelagert ist, durch abgeschwächte Total-Reflexion bestimmt. Der Anteil der Intensität der Oberflächenwelle, der in der Probe 43 absorbiert wird, führt zu einer ähnlichen Verringerung der Intensität der total-reflektierten Strahlung innerhalb der Faser. Die Strahlung, die sich innerhalb der Faser von der Stirnfläche 24 zur Stirnfläche 26 ausbreitet, wird reflektiert durch die Spiegelbeschichtung 28 und (abzüglich Reflexion und Absorptionsverluste) zur Stirnfläche 24 zurückgeworfen. Die Optik 64 bildet diese Strahlung über den Strahlensplitter 62 auf den Detektor 67C ab. Der Filter 66c schränkt den spektralen Bereich, der vom Detektor 67C erfaßt wird, auf die Wellenlängen ein, die den Filter der Lichtquelle 60 passieren. Auf diese Weise erfaßt der Detektor 67C die Strahlung, die auf die Lichtquelle 60 zurückzuführen ist und beim zweimaligen Durchgang durch die Faser 12 oder sonstwo im System nicht verloren ging. Das elektrische Ausgangssignal vom Detektor 67C wird vom Quotienten-Verstärker 70C ins Verhältnis gesetzt zum Ausgangssignal des Referenzdetektors 68, wodurch ein Ausgangssignal entsteht, das proportional zur Transmission im System, korrigiert um Schwankungen der Lichtquelle ist. Auch dieses Signal wird auf der Anzeigeeinheit 72 dargestellt. Die Transmission, geeicht nach bekannten Systemverlusten, ist ein Maß für die Absorption durch die Probe 43. Während ein Prozentsatz dieser Verluste auf die Absorption anregender Strahlung durch die fluoreszierenden Materialien in der Probe zurückzuführen ist, sind solche Verluste bezogen auf die hier wichtigen Konzentrationen gering. Auf diese Weise können stark absorbierende Einschlüsse 74, wie z. B. Erythrozyten, innerhalb der Oberflächenwelle leicht durch abgeschwächte Total-Reflexion gemessen und quantifiziert werden. Es ist anzuerkennen, daß die vorliegende Erfindung weder auf die bisher beschriebene Apparatur noch auf die schon erwähnten experimentellen Vorgaben beschränkt ist. Während die Probe in der Röhre 14 durch Kapillarkräfte zurückgehalten wird, sobald die Röhre aus der Probe entfernt wird, könnte die freie Oberfläche der Probe durch Verdunstung eventuell das Volumen der Probe in der Röhre verringern. Deswegen könnte es vorteilhaft sein, die Röhre mit einem nichtfluoreszierenden Kitt zu versiegeln, sobald die Probe genommen ist. Alternativ dazu kann die Probe vor rascher Verdunstung geschützt werden, indem eine Verengung 90 am Ende der Kapillarröhre 114 angebracht ist (Abbildung 2). Diese Verengung 90 ist auf den Bereich beschränkt, der gegenüber dem unteren inerten Bereich 32 der Faser 12 liegt, und weist typischerweise einen minimalen Innendurchmesser auf, der ungefähr 100 um größer ist als der der Faser (z. B. bei einem bevorzugten Faserdurchmesser von 200 um, betrüge der Innendurchmesser dieser Verengung 90 ungefähr 300 um). Im übrigen ist Testkit 110 identisch mit Testkit 10.
Man wird auch erkennen, daß ein Teil der Reagenzien, speziell das fluoreszierende Material 57, als in die Kapillare gepacktes Pulver vorliegen kann (für eine solche Verwirklichung empfiehlt sich die Kapillarröhre 114 von selbst). Das fluoreszierende Material 57 kann jedoch auch als Belag auf der Faser oder an der Innenwandung der Kapillarröhre 14 als Reagenzbeschichtung 130 vorliegen (dargestellt in Abbildung 2).
Man kann auch verstehen, daß andere Reagenzien wie Puffer, Anticoagulantien und ähnliches in die Kapillarröhre 14 eingebracht werden können oder die Faser oder die Kapillarröhre damit beschichtet werden kann.
Desweiteren sollte vermerkt werden, daß der Faserdurchmesser nicht nur über die gesamte Länge konstant sein muß, sondern auch von Einwegartikel zu Einwegartikel. Sonst würde die Reagenzmenge variieren, obwohl die Gesamtmenge der Probe von Test zu Test gleichbleibend wäre. Diese Genauigkeitsbedingung kann vermieden werden, wenn das markierte Antigen auf der Innenwand der Kapillare als Reagenzbeschichtung 130 vorliegt (Abbildung 2). Das würde das Erfordernis eines konstanten Durchmessers sowohl der Faser als auch der Kapillare abschwächen, da eine Zunahme des Durchmessers der Kapillare nicht nur den Reagenzbedarf sondern auch die Probenmenge erhöhen würde, wohingegen bei der Faser eine resultierende Zunahme in der Anzahl der Bindungsstellen durch die Verringerung in der Anzahl der Reflexionen kompensiert würde (vorausgesetzt, der Beleuchtungsdurchfluß war auf den minimalen Faserdurchmesser eingestellt).
Es ist ebenfalls einleuchtend, daß die Faser 12 und die Röhre 14 eine andere Form als exakt kreisförmig-zylindrisch besitzen könnten, so wäre z. B. ein Paar paralleler Platten in einem kapillaren Abstand denkbar.
Nochmals soll darauf hingewiesen werden, daß die Testvorrichtung und die Methoden der vorliegenden Erfindung nicht auf Immunoassays beschränkt sind, sondern auch bei Tests eingesetzt werden können, bei denen eine Korrektur der relativen Volumina der Phasen einer Suspension notwendig ist, oder wobei eine zusätzliche Messung eines solchen Volumens gewünscht wird.
Wie schon zuvor erwähnt, kann die Methode und Testvorrichtung auch bei lediglich einem einzigen Reagenz eingesetzt werden (lösliches fluoreszierendes Material 57), um nur die relativen Volumina der Phasen einer Suspension zu quantifizieren. Das bedeutet, wenn die Suspension Gesamtblut ist, kann ein fluoreszierendes Material, das serumlöslich ist, verwendet werden, um das Zellvolumen oder Hämatocrit zu bestimmen. Für solche Anwendungen wäre der aktive Bereich 30 der Faser 12 üblicherweise nicht mit immobilisierten Abschnitten 46 von Antigen oder Antikörper versehen, noch würde der Testkit 10 markiertes Komplement 50 enthalten. Man wird auch verstehen, daß zur bloßen Quantifizierung der relativen Volumina der Phasen einer Suspension, ein vereinfachtes Fluorimeter 59 eingesetzt werden kann, das keinen Übertragungsweg (Filter 66A, Detektor 67A und Quotienten-Verstärker 70A) entsprechend dem Strahlungsbereich mit der maximalen Fluoreszenz des Markers des markierten Komplements enthält.

Claims

1. Testvorrichtung für ein Assay einer Suspension einer Probe, die einen Komplex unter Einschluß eines Fluoreszenz-Markers bilden kann, der in der Lage ist, Fluoreszenzstrahlung innerhalb eines ersten Frequenzbandes zu emittieren als Reaktion auf eine Anregungsstrahlung mit einem ersten vorgegebenen Frequenzband, wobei die Testvorrichtung ein längliches optisches Element (12) mit einer total reflektierenden Innenfläche beinhaltet, das durchlässig für Anregungsstrahlung ist, die bei ihrer Ausbreitung durch dieses optische Element (12) eine Welle an einer Oberfläche dieses optischen Elementes hervorruft, um Fluoreszenz in fluoreszierendem Material anzuregen, das in einer Zone angebracht ist, die unmittelbar zu dieser Oberfläche des optischen Elementes benachbart ist, und wobei dieses optische Element durchlässig für diese Fluoreszenz ist, sowie mit einer hohlen, länglichen Hülle (14), die sich im Abstand von dieser Oberfläche befindet und diese umschließt, dadurch gekennzeichnet, daß eine vorbestimmbare Menge eines Fluoreszenzmaterials (57) im Zwischenraum zwischen diesem optischen Element (12) und dieser Hülle (14) vorgesehen ist, das in nur einer flüssigen Phase dieser Probenlösung lösbar ist und das in der Lage ist, wenn es derart gelöst ist, Fluoreszenzstrahlung innerhalb eines zweiten Frequenzbandes zu emittieren, wenn es von Anregungsstrahlung innerhalb eines zweiten Frequenzbandes angeregt wird.

2. Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Element ein Glasfaserelement (12) ist, und daß die Hülle eine Röhre (14) ist, die so dimensioniert ist, daß sie zumindest teilweise die Glasfaser mit einem Abstand von kapillarer Dimension umschließt.

3. Testvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluoreszenzmaterial ein lösbares Reagens ist, mit dem zumindest ein Teil der Innenwandung der Röhre (14) beschichtet ist.

4. Testvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluoreszenzmaterial ein lösbares Reagens ist, mit dem zumindest ein Teil der Oberfläche der Glasfaser (12) beschichtet ist.

5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit weiteren Einrichtungen (59) zur Messung der relativen Intensitäten des ersten und des zweiten Frequenzbandes der beiden Fluoreszenzstrahlungen.

6. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der relativen Volumenanteile der die Bestandteile einer flüssigen Suspension bildenden Phasen, unter Verwendung eines optischen Elementes, das durchlässig für Anregungsstrahlung ist, die Fluoreszenz innerhalb eines Fluoreszenzmaterials anregen kann, das in nur einer flüssigen Phase dieser Probenlösung lösbar ist, wobei dieses optische Element auch durchlässig für Fluoreszenzstrahlung dieses Fluoreszenzmaterials ist, mit folgenden Verfahrensschritten:

Eintauchen einer bekannten Fläche des optischen Elementes in die zu testende Probenlösung;

Steuern dieses Eintauchvorganges des optischen Elementes derart, daß sichergestellt ist, daß diese bekannte Fläche vollständig mit einer dünnen Schicht bekannter Dicke der Probenlösung bedeckt ist;

Einbringung einer vorgegebenen Menge des Fluoreszenzmaterials in dasjenige Volumen der Probenlösung, das durch diese bekannte Fläche und deren bekannte Dicke gebildet ist;

Inkubation dieses Volumens der Probenlösung im optischen Element über einen Zeitraum, der über derjenigen Zeitspanne liegt, die erforderlich ist, um Diffusionsprozesse ablaufen zu lassen, die das Fluoreszenzmaterial innerhalb dieses Volumens verteilen;

Aussetzung des optischen Elementes einer Strahlung in Form einer Oberflächenwelle, um die Fluoreszenz dieses Fluoreszenzmaterials anzuregen, das in dieser einen Flüssigkeitsphase gelöst ist, und

Messung der Intensität dieser Fluoreszenzstrahlung.

7. Verfahren nach Anspruch 6, mit folgenden weiteren Verfahrensschritten:

Aussetzen des optischen Elementes einer Strahlung gegenüber der einzelne Phasen der Probenlösung in erheblichem Maß unterschiedliche individuelle Durchlässigkeiten aufweisen, um eine Oberflächenwelle dieser Strahlung in diesem Volumen zu erzeugen, und

Messung der Absorption dieser Strahlung durch die Probenlösung mit Hilfe abgeschwächter Totalreflexion.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß diese Absorption innerhalb eines Frequenzbandes liegt, das denjenigen Frequenzen entspricht, bei denen eine der individuellen Phase der Probenlösung im wesentlichen durchlässig ist und solche Frequenzen umschließt, bei denen die übrigen Phasen der Probenlösung absorbieren.

9. Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays unter Verwendung eines optischen Elementes, das durchlässig für Anregungsstrahlung ist, mit deren Hilfe Fluoreszenz eines Fluoreszenz-Markers hervorgerufen werden kann, der ein Bestandteil eines Antigen- Antikörper-Komplexes ist, der innerhalb einer Probenlösung bestimmt werden soll, wobei dieses optische Element ebenso durchlässig für Anregungsstrahlung ist, die Fluoreszenz eines zweiten Fluoreszenzmaterials anregen kann, das in einer der flüssigen Phasen der Probenlösung gelöst ist, und wobei dieses optische Element auch durchlässig für Fluoresenz dieses Markers und des zweiten Fluoreszenzmaterials ist, und wobei dieses optische Element ausgewählte Bestandteile dieses Antikörper- Antigen-Komplexes innerhalb einer bekannten Fläche seiner Oberfläche angebracht hat, mit folgenden Verfahrensschritten:

Eintauchen des optischen Elementes in die zu testende Probenlösung, um diesen Komplex zu bilden;

Steuerung des Eintauchvorgangs des optischen Elementes derart, um sicherzustellen, daß diese bekannte Fläche vollständig mit einer dünnen Schicht bekannter Dicke der Probe beschichtet ist;

Einführung einer vorbestimmten Menge des zweiten Fluoreszenzmaterials in dasjenige Volumen der Probenlösung, das durch diese bekannte Fläche einerseits und deren Dicke andererseits bestimmt ist;

Inkubation des eingetauchten optischen Elementes über eine Zeitspanne oberhalb derjenigen Zeit, die erforderlich für Diffusionsprozesse ist, um dieses Volumen abzudecken;

Aussetzen dieses optischen Elementes der Anregungsstrahlung, um dadurch mit Hilfe einer Oberflächenwelle Fluoreszenz des Markers in dem Komplex anzuregen, der an dem optischen Element angebracht ist sowie des zweiten Fluoreszenzmaterials, das in dieser einen Flüssigkeitsphase gelöst ist, und

Messung der relativen Intensitäten dieser Fluoreszenz.

10. Verfahren zur Durchführung eines Immunoassays nach Anspruch 9, mit folgenden weiteren Verfahrensschritten:

Aussetzen des optischen Elementes einer Strahlung mit einem ersten Frequenzband, über das einzelne Phasen der Probenlösung wesentliche Absorptionen aufweisen, zur Bildung einer Oberflächenwelle dieser Strahlung innerhalb dieses Volumens, und

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Frequenzband solchen Frequenzen entspricht, bei denen eine der individuellen Phasen der Flüssigkeitssuspension im wesentlichen durchlässig ist, und solche Frequenzen beinhaltet, bei denen die übrigen Phasen der Probenlösung absorbieren.