DE2509215C2

DE2509215C2 - Fluorometer

Info

Publication number: DE2509215C2
Application number: DE2509215A
Authority: DE
Inventors: Richard Alan Redwood Calif. Harte
Original assignee: International Diagnostic Technologies Inc
Current assignee: International Diagnostic Technologies Inc
Priority date: 1974-03-04
Filing date: 1975-03-04
Publication date: 1983-11-03
Also published as: JPS6132621B2; FR2263510B1; FR2263510A1; CA1033587A; JPS55121135A; JPS50130496A; DE2509215A1; DE2560288C2; GB1506017A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Fluorometer gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Ein solches Fluorometer eignet sich zum Nachweis von aus mit Fluorochromen markierten biologischen Medien oder Geweben stammenden Substanzen, insbesondere zum Nachweis von Antigenen, Antikörpern. Hormonen, Enzymen, Arzneimitteln u. dgl.

Die meisten durch Bakterien oder Viren verursachten Infektionskrankheiten erzeugen Antikörper im Blutserum des erkrankten Lebewesens. Diese geben einen gewissen Grad von Immunität gegen künftige Angriffe identischer Infektions?i»enzien oder Antigene. Ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines bestimmten Antigens besteht darin, es zu einem speziellen Antikörper hinzuzufügen, der sich an das Antigen bindet. Wenn der Antikörper vorher mit einem radioaktiven Element (ΛΖ/4-Verfahren) oder mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert worden war. der sich mit seinen immunologischen Eigenschaften verträgt, so kann der Kopplungskomplex mittels eines geeigneten Meßinstruments nachgewiesen und. im Falle eines fluoreszierenden Zusatzes, am besten halbquantitativ gemessen werden. In fast allen bisher bekannten Fällen erfolgt die Messung auf einem für visuelle Betrachtung eingerichteten Objektträger.

Dabei dient als Meßinstrument das Auge eines Laboratoriumstechnikers, der den Grad der Fluoreszenz wie 0, + I. + 2. + 3 oder -(- 4 notiert. In manchen Fällen, wo der Bluttiter oder die Konzentration der Antikörper gefordert wird, bereitet der Techniker eine Anzahl Objektträger vor; auf jedem ist das Testmaterial in anderer Konzentration aufgetragen.

Der Techniker kann dann eine +4-Reaktiön im Mikroskop feststellen, wenn das Blutserum oder das bakterienenthaltende Medium in destilliertem Wasser im Verhältnis 1:4 oder 1:16 oder 1:128 usw. verdünnt worden war. Es wäre von großem Vorteil für die medizinische und klinische Praxis, wenn ein Fluorometer selbsttätig und quantitativ den Titer rasch und genau ablesen könnte, ohne daß die Notwendig-

keit besteht, Verdünnungsreihen herzustellen.

Die konventionellen Fluorometer sind für flüssige Systeme vorgesehen und nicht in der Lage, aus biologischen Medien oder Geweben auf festen Oberflächen stammende fluoreszenzmarkierte Substanzen nachzuweisen. Ein Grund für diesen Mangel liegt in dem übermäßigen Verlust von beispielsweise mehr als 99% des emittierten Fluoreszenzlichies zwischen der fluoreszierenden Substanz und demjenigen Teil des Meßgerätes, der das Licht in ein elektrisches Signal umwandelt.

ϊη der US-PS 36 12 86b wird eine Apparatur zur Messung der Sauerstoffkonzentration in Flüssigkeiten oder Gasen durch Lösung der Lumineszenz beschrieben. Unter anderem kann die Diffusion des molekularen Sauerstoffs, aus der Flüssigkeit oder dem Gas in einen dünnen, die lumineszierende Schicht enthaltenden Film hinein erfolgen. In der Arbeit von G.Nielsen in Ärztl. LAB. 18, 133-142 (1972) wird eine Immunofluoreszenzmethode nach der Sandwich-Technik beschrieben, wie sie auch in der vorliegenden Anmeldung zur Anwendung gelangte.

Keiner der Literaturstellen ist jedoch die Erkenntnis zu entnehmen, daß zwecks Vermeidung von übermäßigen Verlusten an Fluoreszenz bei der Messung der emittierten Fluoreszenzstrahlung die Spaltabstände des Lichtwegs, der den Abstand zwischen der auf den festen Körper als Belag aufgetragenen Substanzprobe und der Wandlervorrichtung bildet, möglichst kleingehalten werden muß.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Fluorometer zu schaffen, das in der Lage ist, die aus an einen festen Körper gebundenen biologischen Medien oder Geweben stammende Fluoreszenz unter Vermeidung eines übermäßigen Verlustes zu messen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmale.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Fluorometers sind in den Patentansprüchen 2 bis 10 beschrieben.

Im folgenden ist die Erfindung anhand der Zeichnungen beispielsweise näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 eine schematische Ansicht von oben einer Ausführungsform der Erfindung, wobei die Kappe der Küvette entfernt ist;

Fig. 2 eine Teilschnittseitenansicht mit Blickrichtung auf die Schnittebene .7-2 Fig. 1:

F i g. 3 eine schematische Darstellung einer anderen Ausführungsform der Erfindung, bei welcher der Probenhalter Zylinderform aufweist;

Fig. 4 eine schematische Schnittansicht eines Probenhalters, der mit einem Antikörper beladen ist. an welchen gemäß einer Ausführungssform der Erfindung Antigen und fluoreszierender Antikörper gekoppelt ist. wobei der Deutlichkeit halber Größe und Dicke übertrieben dargestellt sind:

Fig. 5 eine schematische perspektivische Ansicht einer anderen Ausführungsform des Probenhalters in Form eines Spatels mit einem Griff;

F i g. 6 eine weitere Ausführungsform der Meßvorrichtungen gemäß Fig. 1 und 3;

F i g. 7 und 8 schematische Ansichten je eines Fluorometers in gegenüber Fig. 1 abgewandelter Ausführung;

F i g. 9 einen Querschnitt durch das gemeinsame faseroptische Kabel von Fig. 8 mit Blickrichtung auf die Ebene 10-10.

Die Erfindung betrifft ein Fluorometer zum quantitativen Nachweis zur Messung eines fluoreszierenden Substanzprobe, die als Schicht auf eine Oberfläche aufgetragen ist. Als »fluoreszierende Substanzprobe« wird eine Probe bezeichnet, die ein Material enthält, das von einem biologischen Medium oder Gewebe stammt und, allein oder in Kombination mit anderen Materialien, bei Anregung mit einer bestimmten

ίο Lichtwellenlänge fluoresziert, und wobei die fluoreszierende Substanzprobe eine feste Schicht bildet. Zu den üblichen fluoreszierenden Substanzproben gehören autofluorogene Stoffe aus einem biologischen Medium, wie z. B. Tetracycline, Stoffe, die aus solchen Medien stammen, die vor oder nach ihrer Isolierung mit Fluorochrora markiert wurden, die von Medien stammen, die in der Schicht mit homologen fluorochrommarkierten Stoffen, wie z. B. Antigen oder Antikörpern, von denen einer mit einem Fluorochrom markiert worden war, verknüpft wordr -i sind.

Die Beschreibung bezieht sich insbescnrtere auf die letztgenannten Substanzen.

Die in den Fig. 1, 2 und 4 beispielsweise dargestellte Ausführungsform umfaßt eine Kugel 10, vurzugsweise aus Kunststoff, wie z. B. einem Polyamid, die mit einem getrockneten Film oder Überzug 11 eines Antikörpers zu dem zu bestimmenden Antigen (z. B. Australia-Antigen) beladen ist. Da die Beschichtung sämtlicher Kugeln bei etwa der gleichen Temperatur von 37° C und für etwa die gleiche Inkubationsdauer von beispielsweise 30 Minuten erfolgt, wird jede Kugel etwa die gleiche Menge Antikörper tragen, was für quantitative Ergebnisse wichtig ist. Bei einer Kugel 10. wie sie in Fig. 4 gezeigt ist, beträgt, bei einem Durchmesser von 10 mm. die Gesamtfläche 314 mm². Was für ein Kunststoff auch benutzt werden mag. Kugel und Körper 10 ist jedenfalls kein Mikrokörper, hat vielmehr im allgemeinen ei^en Durchmesser in der Größenordnung von 5-20 mm, so daß eine Fläche von mindestens etwa 1 mm^: im Blickfe.d des Fluorometers liegt. Die Kugel wird in eiirc Küvette 12 fallen gelassen, die bei diesem Beispiel 12 mm Durchmesser hat. Wenn Fluoreszenz nachgewiesen und gemessen werden soll, während

sich die Kugel in der Küvette befindet, soifte die Küvette aus einem Material wie z. B. Glas bestehen, das bei der zu messenden Wellenlänge nicht fluoresziert und eine Durchlässigkeit von mehr als 30% des Fluoreszenzlichts verhindert. Die Kugel 10 wird mit 1 ml Serum 13 von einem Patienten oder einem anderen Subjekt bedeckt und die Küvette während tiner Inkubationsdauer von 5 Minuten bei Raumtemperatur sanft gethüttelt. Wenn Australien-Antigen 14 vorhanden ist. bindet es sich an den Antikörper 11 auf der Kugel 10. Eine Kappe 16 mit einer 5 n/m Bohrung 17 wird auf das offene Ende 18 der Küvette 12 gesetzt und die Küvette umgekehrt, so daß das Serum 13 auslaufen kann. Ferner ist eine kleine zweite Bohrung 20 in der kappe 16 vorgesehen, um einen LuftdurghtriU zu ermöglichen. Zweckmäßig ist die Innenfläche 21 des Bodens 22 der Küvette 12 abgerundet oder halbkugelförmig ausgebildet, so daß die Kugel 10 in ihrer Lage gehalten wird und nicht während des Fluoreszenztests herumrollt. Nach Inkubation mit dem Serum wird die Küvette ausgespült, beispielsweise mit einer wäßrigen Phosphatpufferlösung oder destilliertem Wasser, das dann gleichfalls aus dem 5 mm Loch 17 gegossen wird, während die

10 mm Kugel 10 in der Küvette 12 verbleibt. Danach wird in die Küvette 1 ml Antikörperlösung gegeben, die mit einer Substanz markiert ist. welche bei ultraviolettem Licht fluoresziert. Eine solche fluoreszierende Markierungssubstanz kann beispielsweise Natriumfluoreszeinisothiocyanat oder eine andere geeignete Substanz sein; Natriumfluoreszeinisothiocyanat, mit einer Anregung bei 460 Nanometer und einer Emission bei 520 Nanometer, ist besonders vorteilhaft. Das Material in der Küvette 10 wird dann erneut wie oben beschrieben inkubiert, die Flüssigkeit aus der Bohrung 17 ausgegossen und die Küvette und die Kugel wie oben beschrieben ausgespült. Die Kugel 10 trägt nunmehr das Antigen 14 und den daran haftenden fluoreszierenden Antikörper 23, falls Australia-Antigen vorhanden ist. Die Küvette 12 und die Kugel 10 sind nun bereit zum Einsetzen in das Fluorometer.

In dem Fluorometer wird die Küvette 12 so angeordnet, daß ein faseroptisches Kabel 24 ultraviolettes Licht aus einer Lichtquelle 27 heranführt, wobei die Lichtquelle irgendeine beliebige sein kann; das Licht geht dann durch ein Gelatinefilter 28, das gewährleistet, daß nur Licht von der anregenden Wellenlänge die Kugel erreicht, dann durch die Wand der Küvette 12 hindurch und trifft auf die beschichtete Fläche der Kugel 10, worauf es die Fluoreszenz des gekoppelten Komplexes 23 anregt. Ein zweites faseroptisches Kabel 25 wird vorzugsweise in einem kleinen Winkel von weniger als 30° zu dem Kabel 24 angeordnet; danach geht die emittierte Fluoreszenz durch ein Gelatinefilter 30. das gewährleistet, daß nur emittierte Fluoreszenz einen Photoverstärker 29 über das faseroptische Kabel 25 erreicht. Die Photoverstärkerröhre 29 übersetzt die Intensität des emittierten Fluoreszenzlichtes in ein elektronisches Signal. Das Signal geht zu einem Filter 31. einem Prozessor 31a, der das Wechselstromsignai in ein Gieichstromsignal umwandelt, beispielsweise durch einen Spitzendetektor, und die Beziehung zwischen der Fluoreszenzlichtintensität und der Gleichspannung Iinearisiert wie z. B. durch einen Vierstufen-Diodenlinearisierer, f'nen Verstärker 32, einen Analog/Digital-Umsetzer 33 und dann an einem Digitalanzeigemeßgerät 34 wiedergegeben, das direkt in Titer geeicht ist (Fig. 7).

Bei der in Fig. 3 gezeigten Ausführungsform wird ein Zylinder 35 aus Polyamidkunststoff statt einer Kugel 10 verwendet. Der obere Teil des Zylinders 35 ist in diesem Falle mit einem Standard-Fluoreszenzüberzug 36 versehen, d. h. von der gleichen fluoreszierenden Substanz, wie sie benutzt wird, um den Antikörperüberzug 38 am unteren Teil des Zylinders 35 zu markieren. Der Standard-Fluoreszenzüberzug hat einen bekannten Titer, wie an der Anzeigevorrichtung gemessen, die bei dem Versuch oder der Probe verwendet wird - in diesem Falle bei dem beschriebenen Fluorometer. Zweckmäßig trennt ein freier Raum 37 rund um die Oberfläche des Zylinders 35 den oberen und den unteren Überzug 36 bzw. 38. Der untere Überzug 38 kann einen fuoreszenzmarkierten Streptokokken-Antikörper enthalten, der in der Weise hergestellt wurde wie oben bei der Kugel 10 beschrieben, abgegesehen davon, daß hier nur der untere Teil des Zylinders in die Körperflüssigkeit eingetaucht ist, um zu bestimmen, ob eines der vermuteten Antigene oder Antikörper in dem zu testenden Serum vorhanden ist. Bei dieser Ausfuhrungsform wurden wieder die Ultraviolettlichtquelle 27, das faseroptische Kabel 24 und das Filter 28 verwendet. Es sind zwei faseroptische Kabel 39 und 47 mit entsprechenden Filtern 38a und 47a vorgesehen. Ein solches Kabel 39 leitet Fluoreszenzlicht von dem Standard-Fluoreszenzüberzug zu der Photoverstärkerröhre 29, und das andere Kabel 47 leitet emittierte Fluoreszenz von dem unteren Überzug 38 zu der Photoverstärkerröhre 29. Eine Lochscheibe 46 mit Motorantrieb 45 bewirkt Umlauf ίο und Wechsel der Lichtströme von den Überzügen 36 und 38 zu der Röhre 29. Auf diese Weise wird ein direkter Vergleich zwischen dem Standard- und den Testüberzügen erhalten.

Bei der Ausführungsform nach F i g. 5 enthält die υ Küvette 12 einen wie ein Paddel ausgebildeten Probenhalter 40 mit einem Griff 41 am einen Ende, der aus der Küvette 12 herausragt, einen Schaft 42 und einen breiten flachen Kopf 43 am anderen Ende, der mit einem Überzug einer Probe (44) versehen ist. Bei dieser Ausführungsform verlaufen die beiden laseroptischen Kabel 24 (für Erregerlicht) und 25 (für emittiertes Fluoreszenzlicht) parallel oder unter einem Winkel von 0* zueinander. Zweckmäßig können die beiden Kabel 24 und 25 als Koaxialkabel ausgebildet und angeordnet sein. Die anderen Bestandteile der Vorrichtung sind die gleichen wie vorher beschrieben.

Allgemein gesprochen, bildet der mit einem Ringband versehene Zylinder von F i g. 3 eine mögliche Ausführungsform eines Probenhalters mit mehreren mit je einem Überzug versehenen Teilflächen zur raschen fluoremetrischen Mehrfachbestimmung. Die Form des Probenhalters kann beliebig sein, sofern sie eine Fläche einer fluorochrommarkierten Probe und mindestens eine weitere Fläche mit einer fluorochrommarkierten Substanz aufweist. Solche unterschiedlichen Flächen können eine Standardfläche von vorbestimmter Menge der gleichen Sübstanzari wie der fluorochrommarkierten Substanz aufweisen. * Auf diese Weise können die beiden verschiedenen Flächen wie z. B. die Bänder 36 und 38 von Fig. 3 betrachtet werden, um einen direkten Vergleich zwischen den Intensitäten der Standardfläche und der Testfläche zu ermöglichen.

Eine Möglichkeit zur Ausführung der vorstehend behandelten Mehrfachbestimmung besteht darin, daß mehrere faseroptische Kabel in Verbindung mit einem Lochscheibenrad und ein und derselben Photoverstärkerröhre benutzt werden. Wahlweise können auch doppelte Photoverstärkerröhren und faseroptische Kabel ohne das Lochscheibenrad benutzt wvden. Statt den oben erwähnten Probenhalter zum Nachweis fluorochrommarkierter Proben gegenüber Standardproben zu benutzen, können verschiedene Testproben gleicher oder unterschiedlicher Art auf einem einzigen Probenhalter in voneinander getrennten Flächen aufgebracht werden. Die Wellenlänge des Lichts, welche Fluoreszenz anregt, kann auch für verschiedene Flächen verändert werden, wie noch zu erläutern sein wird.

Fig. 7 zeigt eine abgewandelte Ausführungsform eines Fluorometers 60, bei dem ein einziges verzweigtes faseroptisches Kabel 61 die beiden getrennten Kabel 24 und 25 ersetzt. Ein Einbündelteil 62 des Kabels 61 führt zu einem festen Grundkörper 63 mit einer fluoreszierenden Fläche 64 und davon weg. Ein Zweig 65 des Kabels 61 überträgt Licht von einer Lampe 66 oder einer sonstigen Lichtquelle und einem

passenden (»Blau-«)Fi!ter67 zu der Fluoreszenzfläche 64. Ein zweiter Zweig 70 des gleichen Kabels 61 führt die emittierte Fluoreszenz von der Fläche 64 zu einem geeigneten (/>Grün-«)Filter 71 und von da durch eine Linse 72 zu einem Festkörper- oder Photoverstärker-Detektor 73. Die Arbeitsweise ist grundsätzlich die gleiche wie bei F i g. 1 mit leicht erkennbaren Unterschieden.

Fig. 8 zeigt eine andere abgewandelte Ausführungsform eines Fluorometers 80, bei der die Zweige 65 und 70 des faseroptischen Kabels 81 durch faseroptische Kabel 81, 82, 83 bzw. 84 ersetzt sind. Ein Einbündelteil 86 des Kabels führt zu einem einzigen Grundkörper 87 mit fluoreszierender Fläche 88 und davon weg. Die Zweige 81 und 82 übertragen Licht aus den Lampen 89 bzw. 90 oder anderen Lichtquellen zu den Fluoreszenzflächen 88. Die Zweige 83 und 84 des gleichen Kabels 86 leiten die cmiiiierie Fluoreszenz von der Fläche SS durch geeignete Linsen 91 bzw.92 zu dem Festkörper- oder Pho- :o toverstärker-Detektor93 bzw. 94.

Ein Verfahren zur Anwendung der Vorrrichtung nach F i g. 8, das sehr vorteilhaft ist, besteht darin, die Fläche 88 zu betrachten, welche eine Vielzahl von biologischen Substanzen in willkürlicher Verteilung enthält. Jede dieser Substanzen ist mit einem Fluorochrom markiert, das in Abhängigkeit von einer unterschiedlichen Lichtwellenlänge Fluoreszenz aussendet. So senden die Lampen 89 und 90 die unterschiedliche Fluoreszenz erregenden Wellenlängen aus, während die Mchrfachfluoreszenz gleichzeitig von den Detektoren 93 und 94 über die lichtleitenden Zweige 83 bzw. 84 empfangen wird. Die vielfältig mit Fluorchrom markierten Substanzen in willkürlicher Verteilung können auch gelesen werden, wenn das einfach verzweigte faseroptische Kabel von F i g. 7 benutzt u/irH In /in»c*»m Falltf» i»rc**l7t *»ini> mn7iap Ϊ umr\*·» /-wior

sonstige Lichtquelle die Lampen 89 und 90. und es werden mehrere Filter verwendet, um die richtigen Wellenlängen zur Anregung der entsprechenden Fluorochromc in den Proben zu erzeugen. In gleicher Weise können die lichtleitenden Kabel 83 und 84 durch ein einziges Kabel ersetzt werden, und die Detektoren 93 und 94 können durch einen einzigen Detektor ersetzt werden, sofern die Wellenlängen, auf welche der Detektor anspricht, mit den ausgewählten anzuregenden Fluorochrome synchronisiert sind.

Bei einem faseroptischen Kabel, das Licht von dem Lichteintrittsende neben der Probe zu der Wandlervorrichtung leitet, bilden der Abstand zwischen dem Lichteintrittsende und der Substanzprobe sowie sonstige Abstände jedweder Art zwischen dem optischen Kabel und der Wandlervorrichtung, Spaltabstände, welche zu Verlusten der emittierten Fluoreszenz führen.

Es wurde gefunden, daß für die durchschnittliche Fluoreszenzintensität zumindest der kumulative Fluoreszenzverlust über alle roichen Spaltabstände in dem erwähnten Lichtweg nicht größer als 95% der zur Übertragung längs dieses Weges verfügbaren Fluoreszenz sein soll. Solche Verluste schließen nicht diejenigen Verluste ein, die durch das Betrachten nur eines Teils einer fluoreszierenden Oberfläche begründet sind. Hier ist zu berücksichtigen, daß ein solcher Verlust nur auf das Fluoreszenzlicht bezogen wird, das von der Probe in einem Flächenbereich emittiert wird, der definiert ist durch den auf die Probenfläche projizierten Umfang des Lichteintrittsendes. Wenngleich die Begrenzung der Verluste an Fluoreszenz bei den Spaltabständen auf 95% längs des gesamten Lichtweges eine bedeutende Verbesserung gegenüber den bisher bekannten Fluorometern ist, so ist es doch vorzuziehen, solche Verluste auf höchstens 50 bis 90% und optimal auf 10% oder weniger zu begrenzen. Bei Verlusten in dieser Größenordnung können selbst allerkleinste Mengen einer Probe nachgewiesen und quantitativ bestimmt werden.

Die vorstehenden Überlegungen beziehen sich in erster Linie auf Faseroptikkabel und Lichtröhre sowie mit der Bedeutung ihrer Nähe ausgedrückt durch den Spaltabstand - zu Oberflächen, von denen sie Licht empfangen und zu welchen sie Licht leiten.

Lichtleitsysteme können auch solche Komponenten wie Linsen zum Sammeln und Fokussieren des Lichts, Spiegel zu seiner Reflexion und Rückleitung sowie Öffnungen, durch welche das Licht nach Dispersion hindurch geht, enthalten. Wenn Komponenten wie diese Licht von einer Oberfläche empfangen, die es in eine Halbkugel strahlt, so ist der Anteil des Lichts, weiche sie auffangen, annähernd proportional demjenigen Teil des «-Raumwinkels, der definiert ist durch den Umfang der Fläche, den sie auf die Halbkugeloberfläche projizieren, die durch einen Radius, der dem Spaltabstand zwischen der lichtemittierenden Oberfläche und der das Licht aufnehmenden Komponente entspricht, bewirkt wird.

Aufgrund der vorstehenden Beziehung entspricht der Umfang, der einen Verlust von nicht mehr als 95" ο der emittierten Fluoreszenz zuläßt, einem solchen, der einem Raumwinkel von nicht weniger als annähernd 0,3 Steradiant bewirkt.

Ein anderes Verfahren, um einen Fluoreszenzverlust zu vermeiden, besteht darin, den Spalt zwischen dem Probenüberzug und dem Lichteintrittsende des Detektors von Festkörpern freizuhalten, die eine Übertragung von überschüssigem Fluoreszenzlicht verhindern. Es wurde gefunden, daß Glas oder gewisse Kunststoffe, wie z. B. Polystyrol, bei einer mäßigen Dicke von weniger als 1,27 mm (0,05 Zoll) einen Fluoreszenzverlust von weniger als 30% verursachen. Wenngleich es vorzuziehen ist, das Dazwischenfügen eines solchen Festkörpers zu vermeiden, sind solche Verluste doch in manchen Fällen tolerierbar. So kann es z. B. bei der Ausführungsform, die schematisch in Fig. 1 dargestellt ist, zweckdienlich sein, eine dünnwandige Küvette zu verwenden, um, ein mit einem Überzug versehene Kugel zurückzuhalten. In diesem Falle sollte die Küvette aus einem Material besteben, das keinen Verlust von mehr als 30% der Fluoreszenz verursacht.

F i g. 9 zeigt einen schematischen Querschnitt eines gewöhnlichen Faserbündels 86 des verzweigten Kabels 80, wobei die Fasern der verschiedenen Abzweigungen der Deutlichkeit halber vergrößert dargestellt sind. Solche Fasern werden schematisch durch einen mit vollen Linien gezeichneten Kreis, einen offenen Kreis, einen Kreis, der ein »x« enthält und einen Kreis, der ein »y« enthält, dargestellt. Die vier verschiedenen Arten von Fasern sind in dieser Anordnung ganz willkürlich verteilt. Um einen speziellen optischen Effekt zu erreichen, mag es erwünscht sein, sie schematisch auf konzentrischen Kreisen, wie sie hier nicht dargestellt sind, anzuordnen oder Fasern von unterschiedlichen Durchmessern zu benutzen.

Ein Studium des Fluorometers läßt erkennen, daß ein wichtiger Faktor, der zu dem prozentualen Verlust

beiträgt, das Verhältnis des Spaltabstandes zwischen der Probe und dem effektiven Durchmesser des Lichteintrittsendes des Empfängers für das emittierte Licht ist. Der Ausdruck »effektiver Durchmesser« bedeutet entweder den Durchmesser eines Lichteintrittsendes von kreisförmigem Querschnitt oder den entsprechenden Durchmesser eines nicht kreisförmigen Querschnitts. Die»:.r letztere Ausdruck kann angenähert werden mitteis der Formel

nd¹

Fläche:

Der effektive Durchmesser d' von nicht kreisförmigem Querschnitt ist definiert als / , Die

Bezugnahme auf die Beziehung von Spaltabstand zu effektivem Durchmesser basiert auf der angenäherten Beziehung, daß die Intensität der Fluoreszenz umgekehrt proportional dem Quadrat des Abstandes von der fluoreszierenden Substanz ist. Bei dieser Annäherung wird nicht in Betracht gezogen, daß eine Vermehrung des aufgefangenen Lichtes dadurch bewirkt werden könnte, daß der Reflektanzwinkel möglichst klein gehalten wird, d. h. der Winkel zwischen dem der fluoreszierenden Substanz zwecks Anregung der Fluoreszenz zugeführten Licht und dem von dem Lichteintrittsende des Detektors empfangenen Licht. Es wurde gefunden, daß diesem Wert nicht die Bedeutung zukommt wie dem Spaltabstand. Es ist ersichtlich, daß der effektive Durchmesser des Lichteintrittsendes von Bedeutung ist, da eine Vergrößerung des Bereichs dieser Oberfläche eine entsprechende Zunahme an aufgefangenem Licht bewirkt.

Bei Anwendung der obigen Berechnungen entspricht ein Spaltabstand neben der Probe, der einen verlust von nicht mehr als etwa 95% der emittierten Fluoreszenz zuläßt, einem Verhältnis von Spaltabstand zu effektivem Durchmesser des Lichteintrittsendes von nicht mehr als etwa 5:1. Ähnliche Berechnungen können angestellt werden, um das theoretische Verhältnis anderer Prozentsätze an Fluoreszenzverlust zu bestimmen. Es ist zu beachten, daß dieses Verhältnis nur eine Annäherung darstellt. Die gleiche Formel eignet sich auch für andere Spaltabstände in dem Lichtweg, wie z. B. zwischen dem faseroptischen Kabel und dem Teil des Detektors, der das Licht in ein elektrisches Signal umwandelt sowie zwischen irgendwelchen Linsen und Spiegeln, die in dem Lichtweg angeordnet sein können.

Das verzweigte faseroptische System nach den Fig. 8-10 ist besonders wirksam, wenn man den Spaltabstand auf ein Minimum herabsetzt, um den Verlust an emittierter Fluoreszenz so weit wie möglich zu reduzieren. Dies basiert auf dem Grundsatz, daß die einzige Fläche der fluoreszierenden Substanz, die von dem Detektor aufgenommen werden kann, dort ist, wo das zur Anregung der Fluoreszenz auf die Substanz übertragene Licht sich mit dem Sichtbereich des Lichteintrittsendes des Detektors deckt. Dies kann mit getrennten faseroptischen Kabeln, wie in Fig. 1, erreicht werden, bis ein Spaltabstand auf relativ kleine Werte reduziert ist. Bei dieser Reduktion verkleinert sich die Deckungsfläche von total getrennten Licht anregenden und Licht emittierenden Kabeln kontinuierlich. Es ist ersichtlich, daß dies ein begrenzender Faktor für den Spaltabstand sein kann und demgemäß übermäßigen Fluoreszenzverlust für eine Substanzprobe in äußerst kleinen Mengen verursachen kann. Andererseits ermöglicht die Verwendung verzweigter Kabel mit je einer Vielfalt lichtübertragender Fasern, welchs in einem gemeinsamen Faserbündel am Lichteintrittsende endigen, das Fluorometer äußerst nahe an die fluoreszierende Probe heranzusetzen, ohne die Deckung zu beeinträchtigen. Die einzige Begrenzung ergibt sich dann, wenn der Spaltabstand annähernd Null wird, weil dann die feinen Fasern des

lu Faserbündels wie unabhängige Kabel wirken.

Das gemeinsame Faserbündel ist besonders wirksam bei Ausführungsformen mit mehreren Verzweigungen, wie es F i g. 9 zeigt. Kabel mit getrennten Lichtein- und -austrittsenden für jede Verzweigung des Kabels 80 erfordern einen beträchtlichen Spaltabstand, um eine genügende Dehnungsfläche zu sichern.

Die vorstehende Beschreibung bezieht sich auf faseroptische Kabel als bevorzugte Lichtleiter. Es können aber auch andere optische Leiter wie Lichtrohre und Linsen verwendet werden, wenn der Abstand nicht die Verwendung gemeinsamer faseroptischer Bündel erfordert.

Bisher wurde das neue Fluorometer anhand bestimmter fluorochrommarkierter biologischer Flüssigkeiten oder Gewebe beschrieben. Diese werden beim Testen von Körperflüssigkeiten wie Serum, Urin oder andere Flüssigkeiten verwendet, um das Vorhandensein von Krankheitserregern oder ihren Toxinen auszumachen, oder um Konzentrationen anderer Substanzen in der Flüssigkeit festzustellen. Im allgemeinen fallen solche fluoreszierenden Substanzproben in die Kategorie von Paaren von Stoffen, von denen jeder selektiv oder sterisch zu einer zweiten stofflieh entsprechenden Substanz paßt. Zu derartigen Paaren gehören Antigen-Antikörper, Enzym-Substrat, bindendes Protein-Hormon, bindendes Protein-Vitamin, Enzym-Inhibitoren usw. jedoch können auch andere fluoreszierende Substanzproben an ein

■ω Substrat durch Paarung gebunden werden, wie z. B. durch physikalischen Einschluß oder Sorption.

Die Erfindung ist anwendbar zum Nachweis einer breiten Vielfalt von fluoreszierenden Substanzproben. Dazu gehören Drogen, die mißbraucht werden können, wie Morphium, Methadon, Kokain und Barbiturate; Drogen, die für die Kontrolle bestimmter chronischer Krankheiten oder Zustände gebraucht werden wie Digoxin (für Herzbeschwerden). Insulin (Diabetes), und Diphenylhydantoin (Epilepsie); Hormone wie Thyroxin und Triiodthyroxin; Steroidhormone wie Aldosteron, Cortisol, Testosteron, Östriol und Progesteron; Peptide und Protein-Hormone wie Adrenocorticotropin, Angiotensin, Gastrin, Chorion-Conadotropin, follikelstimulierende Hormone, Wachstumshormone, luteinisierende Hormone, Neurophysin, Laktationshormon der Plazenta und thyroidstimulierende Hormone; Vitamine wie Cyanocobalamin und Folsäure; Enzyme wie Chymotrypsin, Kreatinphosphokinase, alkalische Phosphatase und

Milchsäure-Dehydrogenase; Antigene wie carzinoembryonales Antigen, Hepatitis zugeordnetes Antigen und Alpha-Fetoprotein; Antikörper wie Anti-Toxoplasmose-Antikörper, Anti-Thyroid-Antikörper und Anti-Nuklear-Antikörper; Zellstrukturkörper wie

s? Bakterien, Pilze, Protozoen, Erythrozyten und Leukozyten; Serum-Protein wie Fibrinogen, Anti-hämophile Faktoren, Lipoprotein, Immunoglobuline und thyroxinbindendes Globulin; Zellabbauprcdukte wie

Myoglobine, bakterielle ToxinC und Lysozyme usw.

Es können auch andere Substanzen verwendet wer-(wn, soweit sie fluoreszieren oder fluoreszierend gemacht werden können, entweder durch direktes Markieren oder durch Bindung an fluoreszenzmarkierte spezifische Bindungsproteine, Substanzen, Inhibitoren, Enzyme, Antigene oder Antikörper. Sie können entweder vor oder nach direkter oder indirekter Markierung durch physikalische Adsorption, spezifische Proteinbildung. Immunosorption, Substrat- oder Inhibitorbindung, physikalischen Einschluß in die Poren einer Matrix, Ionenaustausch oder sonstige Verfahren auf eine Oberfläche aufgebracht werden.

Beispiel 1

Diese Meßreihen veranschaulichen die mehr als eine Größenordnung betragenden Verbesserungen der Empfindlichkeit des F!üöroiTicicrs gemäß der Erfindung einer fluoreszierenden Substanz auf einem festen Träger gegenüber Messungen, die in zwei bekannten, für diesen Zweck geeigneten Fluorometern gemacht werden, wobei deren Dünnschicht-Chromatographie-Plattenabtastvorrichtungen benutzt werden. Die verwendete Farbe war Fluoreszcin-Isothiocyanat (FITC), gelöst in Barbitualpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,6. Eine gemessene Anzahl verschiedener Verdünnungen wurde auf eine Polymethylmethacrylat-Oberfiäche aufget jpft und trocknen geladen. Die Tupfen wurden bei einer Wellenlänge von 480 nm angeregt und ihre Fluoreszenzemission bei einer Wellenlänge von 520 nm abgelesen Dabei ergaben sich folgende Ablesewerte:

Menge von PITC	Fluoreszenzsignal	Turner	(normalisiert*)
im Tupfen,	Dieses	rviixicii i!	Aminco-
Nanogramm	System	-	i Buwinaii
0,01	-	-	-
0,04	0,4	-	-
0,16	3,2	5,3	-
0.64	17,7	24,2	1,4
2,5	55,6	100,0	37,4
10.0	100,0	100,0

der emittierten Fluoreszenz auffängt, der durch einen 0,2 χ 2,0 cm Schlitz 7 cm weit weg und unter einem Winkel von 45° von der Probenoberfläche hindurchgeht. Das Aminco-Bowman-Fluorometer ist so aus-

gebildet, üaß es einen beträchtlichen Teil der emittierten Fluoreszenz in dem Lichteintrittsende eines etwa '/β Zoll-Durchmesser Faseroptikkabcls auffängt, das dicht an der Probe angebracht ist, aber es benutzt das faseroptische Kabel als Zusatzgerät zur Übertragung

ίο der aufgegangenen Emission auf einen Spiegel, der da angeordnet ist, wo normalerweise eine Küvette zur Beobachtung flüssiger Proben angebracht werden würde. Das von diesem Spiegel reflektierte Licht strahlt in drei Dimensionen und nur ein kleiner Teil

is davon fällt auf eine 0,2 cm χ 1 cm-Eintrittsöffnung, die erste Komponente in der weiteren Lichtleitvorrichtung, die etwa ³/·> Zoll von dem Spiegel entfernt angeordnet ist. Berechnungen zeigen, daß die erwähnten riuorornctcr nach Turner und ArnincG-Bcwrriari wegen der Anordnung beim Übertragen von mehr als 1% des emittierten Lichtes, welches von ihnen für den Detektor aufgenommen wird, versagen.

Beispiel 2

Diese Messungen veranschaulichen die Wichtigkeit einer unbehinderten engen Nachbarschaft für die Erlangung eines maximalen Fluoreszenzsignals aus einer fluoreszierenden Substanz auf einer festen Oberfläche. Es wurde ein faseroptisches Bündel von '/■» Zoll Durchmeser benutzt, um einen Fleck oder Tupfen mit 6 mm Durchmesser zu messen. Die betrachtete Substanz enthält 1,0 Mikrogramm mit Fluoreszein-Isothyiocyanat markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-Globulin, aufgelöst in einer Phosphat-Pufferlösung mit dem pH-Wert 7,6 und aufgebracht auf einer mit Säure geätzten Polymethylmethacrylatoberfläche, die trokken gelassen wurde. Die Anregung und Betrachtung erfolgte durch willkürlich angeordnete Fasern in einem gegabelten faseroptischem Bündel oder optischen Faserbündel. Die anregende Wellenlänge betrug 480 nm, die gemessene Emission hatte eine Wellenlänge von 520 nm. Es wurde die folgende Ablesung erhalten:

·) berechnet in Prozenten des Signals von 10 0 Nano- *

gramm nach Subtraktion der Nullpunktablesung. _{der Fläche in mm}

Der unter Pegel der Nachweisbarkeit, der mit Hilfe der Erfindung erreichbar ist, entspricht großenteils der 0,8 mm-Annäherung des Lichteintrittsendes der so an der Probenoberfiäche angewendeten Faseroptik und der anschließenden Erhaltung der so eingefangenen Lichtenergie. Das Turner-Fluorometer ist in einer solchen Weise ausgebildet, daß es nur denjenigen Teil Fluoreszenzsignal in %
von Maximum

0,8 1,0 2,0 3,0 4,0 6,0 12,5 100,0

100,0

81,1

54,1

39,2

14,6

3,4

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Fluorometer zur Messung der Fluoreszenz einer aus einem biologischen Medium oder Gewerbe stammenden Substanzprobe, die an einen festen Körper (10) gebunden ist, mit einer Lichtquelle (27) zur Anregung der Fluoreszenz und einer Detektorvorrichtung zum Bestimmen der Intensität der emittierten Fluoreszenzstrahlung, die eine die Intensität der Fluoreszenzstrahlung in elektrische Signale umwandelnde Wandlereinrichtung (29) enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektorvorrichtung Einrichtungen (25) zum Übertragen des Fluoreszenzlichtes umfaßt, derart, daß der Abstand zwischen der auf den festen Körper (10) als Belag aufgetragenen Substanzprobe und der Wandlervorrichtung (29) einen Lichtweg bildet, dessen Spaltabstände so klein gehoben sind, daß der durch sie verursachte kumulative Verlust nicht meh·· ah 95% der zur Übertragung verfügbaren Fluoreszenz beträgt.

2. Fluorometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere getrennte Flächen (36, 38) mit unterschiedlichen Substanzproben in Abständen voneinander auf dem festen Körper (35) aufgetragen und die Detektorvorrichtung so ausgebildet ist, daß die Intensitäten der Fluoreszenz dieser verschiedenen Flächen nacheinander feststellbar sind.

3. Fluorr meter nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Intensitäten der Fluoreszenz der verschiedenen Flächen dadurch meßbar sind, daß die Flächen und das Lichteintrittsende der Detektorvorrichtung relativ z_einander bewegbar sind.

4. Fluorometer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektorvorrichtung mindestens zwei das Fluoreszenz-Licht übertragende Einrichtungen (39, 47) zugeordnet sind, und daß das fluoreszierende Licht durch die Lichtübertragungseinrichtungen gleichzeitig aufgenommen und abwechselnd der Eingangswert aus beiden Lichtübertragungseinrichtungen der Detektorvorrichtung zugeführt wird.

5. Fluorometer nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß abwechselnd Lichtstrahlen von verschiedenen Wellenlängen auf die Substanzprobe übertragbar sind und die unterschiedliche.

in Abhängigkeit von den verschiedenen Licht- jo strahlen unterschiedlicher Wellenlänge emittierte Fluoreszenz getrennt meßbar ist.

6. Fluorometer nach Anspruch 4 oder 5. dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtübertragungseinrichtung ein verzweigtes faseroptisches Kabel (81, 82, 86) mit einem gemeinsamen Lichteintrittsende umfaßt, und daß die getrennte Feststellung durch Umschalten zwischen den Kabeln vorgenommen wird, so daß jeweils eine Fluoreszenzintensität ablesbar ist.

7. Fluorometer nach Anspruch !.dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis des an den Substanzprobenbelag auf dem festen Körper angrenzenden Spaltabstandes zu dem effektiven Durchmesser des Lichteintrittsendes des Empfängers für das emittierte Licht nicht größer als 5:1 gewählt ist.

8. Fluorometer nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Übertragen des Fluoreszenzlichts mindestens ein faseroptisches Kabel aufweist.

9. Fluorometer nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein erstes faseroptisches Kabel

(24) zur Übertragung des Lichtstrahls vou der Lichtquelle (27) auf den Substanzprobenbelag vorgesehen und ein zweites faseroptisches Kabel

(25) der das emittierte Fluoreszenzlicht aufnehmenden Wandlereinrichtung (29) zugeordnet ist, und daß die Fasern des ersten und des zweiten Kabels in ein gemeinsames Faserbündel an dem Lichteintrittsende zusammenlaufen, so daß die auf den Substanzprobenbelag gerichteten Lichtstrahlen und die empfangene, von dem Substanzprobenbelag emittierte Fluoreszenz für die jeweils untersuchte Substanz im wesentlichen zusammenfallen.

10. Fluorometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der an den Substanzprobenbelag angrenzende Spaltabstand frei von festen Medien ist, die eine Übertragung von mehr als 30% des Fluoreszenzlichtes verhindern.