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Die Menge des Bestlmmungsllganden wird aus der festgestellten Menge
des Testllganden abgeleitet, da bel
der genannten Sandwich-Methode
dle belden Mengen Insgesamt dlrekt proportional zuelnander sind. Für Eichungszwecke
werden parallele Tests jeweils gegen einen bekannten Standard durchgeführt.
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Bel der erwähnten kompetitiven Methode kann dle Menge des Bestlmmungsllganden
als umgekehrter Proportionalwert festgestellt werden, wenn der Bestlmmungsligand
entweder gleichzeitig oder nacheinander mit einer bekannten Menge Testllgand und
einer Begrenzungsmenge des Rezeptors kontaktlert wird. Wenn slch Rezeptorligand
und Testllgand immunologisch blnden, Ist dle festgestellte Menge des Testllganden
in einem blnären Komplex mit dem Rezeptor umgekehrt proportional zur vorhandenen
Menge des Bestlmmungsllganden.
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Bel der Indlrekten Methode blndet slch elne definlerte Überschußmenge
des Testliganden Immunologisch entweder an den Bestlmmungsllganden oder an den Rezeptorllganden.
Dle überschüssige Menge des nicht mit dem Bestlmmungsllganden verbundenen Testllganden
wird immunologisch von dem Rezeptorliganden gebunden; aus der Menge des Testllganden
in diesen binären Komplexen kann dle vorhandene Menge des Bestlmmungsllganden errechnet
werden.
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Dle oben genannten drei Methoden lassen sich wle folgt darstellen,
wobei mit R der Rezeptorligand, mit A der Bestlmmungsllgand und mit T der Testllgand
bezelchnet ist.
| 1. R + A #RA |
| 2. RA + T # RAT Sandwich |
| 1. R + A + T # RA + RT gleichzeitig |
| kompetitiv |
| 1. R + A RA nacheinander |
| 2. RA + T . RA + RT |
| 1. A + T + R AT nacheinander |
| 2. AT + R . AT + RT > indirekt |
| 1. A + T + R .- AT + RT gleichzeitig |
Die verschledenen oben erwähnten Immunbestimmungsmethoden leiden unter einer Reihe
von Ungnaulgkelten, die aus Ungenauigkeiten der Menge des In einer bestimmten Verfahrensstufe
vorhandenen Rezeptorllganden resultieren. Bei den an der Oberfläche eines Applikators
vorgenommenen Immunbestimmungen mittels Fluoreszenzmessung können z. B. Ungenaulgkeiten
In den endgültigen Testergebnissen auftreten, wenn die Menge des ursprünglich an
dle Testoberfläche gebundenen Rezeptorllganden schwankt. Ähnllch können auch dann
Ungenaulgkelten auftreten, wenn Im Verlauf des Transportes oder während der Immunbestlmmung
selbst elne gewlsse Menge des Rezeptorliganden von der Testoberfläche verlorengeht.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eln Immunbestlmmungsverfahren
zu entwlckeln, das die geschllderten Nachtelle der bekannten Verfahren nicht aufweist.
Dlese Aufgabe wlrd durch die Merkmale im Kennzeichen des Anspruchs 1 gelöst. Vortellhafte
Ausgestaltungen werden durch die Merkmale der Unteransprüche aufgezeigt.
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Bel dem erflndungsgemäßen Verfahren werden mindestens drel Liganden
verwendet. Diese drel Liganden werden wie folgt bezeichnet: Zunächst gibt es den
Bestimmungsliganden, für dessen Feststellung oder Messung das Bestlmmungsverfahren
ausgelegt Ist. Als zweites wird eln Prüf- oder Testllgand benutzt, der In der erwãhnten
Weise markiert Ist und in einem Komplex quantitativ bestimmt wird, um die Menge
eines vorhandenen Bestimmungsliganden abzulelten. Als drittes gibt es den Rezeptorliganden,
der in der erwähnten Welse markiert Ist und der slch Immunologisch an den Bestlmmungsllganden
und/oder den Testilganden bindet.
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Bei den bevorzugten lmmunbestlmmungsverfahren gemäß der Erflndung
tragen die Rezeptor- und Testliganden fluoreszlerende Markierungen. Der markierte
Rezeptorligand wird an eine Oberfläche gebunden. Dle an der Oberfläche Infolge der
immunologischen Wechselwlrkungen untereinander verbundenen Test- und Rezeptorliganden
können auf einfache Art und Weise einer Fluoreszenzmessung unterworfen werden. Bei
dlesen bevorzugten Verfahren wlrd elne Fluoreszenzmessung der Oberfläche vorgenommen,
wie sle bereits aus den folgenden US-PS bekannt Ist: 39 92 631, 39 99 948, 40 20
151, 40 25 310, 40 56 724 und 40 67 959.
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Gemäß der Erfindung wird eine hervorragende Verbesserung bei Immunbestimmungsmethoden
sowohl hinsichtlich der Genaulgkelt als auch hinsichtlich der Bequemlichkeit des
Verfahrens erzielt, denn es wird ein marklerender Bestandtell an den Rezeptorllganden
gebunden, welcher vom marklerenden Bestandtell des Test-Ilganden unabhängig blelbt
und bel der Immunbestlmmung unabhängig vom marklerenden Bestandtell des Testllganden
festgestellt werden kann.
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Durch das direkte Markleren des Rezeptorilganden kann der Rezeptorligand
unmlttelbar festgestellt und gemessen werden, ohne das normale Immunbestlmmungsverfahren
zu stören. Das hat folgende Vortelle: 1. Der marklerende Bestandtell am Rezeptorllganden
kann als Qualitätskontrolle benutzt werden, um sicherzustellen, daß elne kontrolllerte
Menge des Liganden bei der ursprünglichen Herstellung der Assayreagentien an elne
Testoberfläche gebunden wurde.
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2. Es können im Labor elnes Kunden Tests vorgenommen werden, mit denen
der marklerende Bestandtell am Rezeptorllganden festgestellt wlrd, um sicherzustellen,
daß während des Transportes kelne Reaktionstellnehmer beschädlgt wurden, und um
ein Instrument zum Feststellen des Testliganden zu elchen.
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3. Schließlich kann, was möglicherweise am wlchtlgsten ist, der Rezeptorligand
während des Immunbestimmungsverfahrens unabhängig von der quantltatlven Feststellung
des Testliganden quantltatlv bestlmmt werden, so daß dle erfindungsgemäßen Immunbestlmmungsverfahren
selbstelchend gemacht werden können.
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Das Feststellen und Messen der Menge des am Rezeptorliganden vorhandenen
markierenden Bestandtells kann auf verschiedene bekannte Weise mit bekannten Einrichtungen
erfolgen, da schon früher radloaktlve und fluoreszlerende Marklerungsstoffe benutzt
worden sind. Bein Auslegen des jeweiligen Tests, wenn der Rezeptorligand vor der
Inkubation des Rezeptorliganden mit anderen Liganden festgestellt werden soll, sollte
jedoch eln marklerender Bestandteil am Rezeptorllganden benutzt werden, der den
chemlschen Ablauf belm anschließenden Bestimmungsverfahren nicht stört. Wenn also
ein Rezeptorllgand aus Gründen der Qualitätskontrolle oder zum Elchen eines Instruments
vor der Inkubation benutzt werden soll, kann es slch als unpraktisch erwelsen, den
Rezeptorliganden mit einem Enzym als Marklerungsstoff zu kennzeichnen.
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Es können unterschiedliche Paare marklerender Bestandteile am Rezeptorliganden
und am Testliganden In einem bestlmmten Verfahren verwendet werden, bei dem die
beiden markierenden Bestandteile unabhängig voneinander sind und unabhängig voneinander
festgestellt werden können. Einer der beiden Liganden kann also z. B. mit einem
fluoreszlerenden Bestandtell marklert sein, während der andere Ligand mit einem
Radloisotop oder einem Enzym markiert wlrd. Elner der Liganden kann auch mit einem
Enzym und der andere entweder mit einem Radlolsotop oder einem fluoreszlerenden
Stoff markiert sein, und es kann einer der Liganden mit einem radioaktiven und der
andere mit einem fluoreszierenden Stoff oder mit einem Enzym markiert seln.
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Wenn geeignete Elnrichtungen zur Verfügung stehen, können auch andere
markierende Bestandteile benutzt werden, dle Strahlung von bestimmter Wellenlänge
aussenden oder absorbieren.
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Außerdem können Rezeptor- und Testllganden mit ähnlichen Arten markierender
Bestandteile versehen sein, dle jedoch unabhängig voneinander feststellbar sind.
Elner der beiden Liganden kann z. B. mit Jod 125 und der andere mit Kobalt 57 markiert
sein. Ferner kann elner der Liganden mit einem fluoreszierenden Bestandteil, z.
B. Fluoreszelnlsothlocyanat (FITC) und der andere Ligand mit einem anderen fluoreszlerenden
Bestandteil, wie Tetraäthylrhodamlnisothiocyanat (RITC) oder Tetramethylrhodamlnisothlocyanat
(TRITC) markiert sein, wobei die belden fluoreszierenden Bestandteile so gewählt
sind, daß Ihre Fluoreszenz unterschiedliche Wellenlängen hat, so daß sle getrennt
feststellbar slnd.
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Erflndungsgemäß wlrd bevorzugt, zwel fluoreszlerende Bestandteile
zu verwenden, nämlich Fluoreszeln- und Tetramethylrhodamlnisothlocyanat, da der
Test bei Verwendung dieser beiden fluoreszlerenden Bestandteile in einem auf dem
Markt erhältlichen, sehr empfindlichen Fluorometer vorgenommen werden kann, wozu
lediglich unterschiedliche Fliteranordnungen zum Erregen und Feststellen der unterschiedlichen
Wellenlängen der Probe In das Fluorometergerät elngesetzt werden.
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Dle Benutzung von zweifach markierten Liganden gemäß der Erfindung
kann für dle vielfältigsten Immunbestlmmungsmethoden mit elner Vlelfalt unterschiedlicher
Rezeptor- und Testliganden vorteilhaft selo dle dazu dlenen, dle unterschiedlichsten
Antlgene, Antikörper oder Haptene als Bestimmungsilganden festzustellen.
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Gemäß der Erflndung können z. B. Bestlmmungen unter Verwendung folgender
Rezeptor-, Test- und Bestimmungsllganden vorgenommen werden: Receptor Testligand
Bestimmungsligand Anti-gentamicin-TRITC Gentamicin-FITC Gentamycin Anti-tobramycin-TRITC
Tobramycin-FITC Tobramycin Anti-phenobarb ital-TRITC Phenobarb ital-FITC Phenobarb
ital Anti-phenobarbital-TRITC Phenobarbital-FA Phenobarbital Anti-theophyllin-TRITC
Theophyllin-FITC Theophyllin Anti-diphenylhydantoin-TRITC Diphenylhydantoin-FITC
Diphenylhydantoin Anti-diphenylhydantoin-FITC Diphenylhydantoin- Diphenylhydantoin
Umbelliferon Anti-herpes-TRITC Anti-herpes-FITC Herpes Virus Anti-CMV-TRITC Anti-CMV-FITC
CMV Anti-Säurephosphatase-TRITC Anti-Säurephos- Säurephosphatase phatase-FITC Anti-Säurephosphatase-TRITC
Säurephosphatase-FITC Säurephosphatase Röteln-Antigen-TRITC Anti-Human IgG-FITC
Human Antiröteln Röteln-Antigen-TRITC Anti-Human IgM-FITC Human Antiröteln Digoxin-TRITC
Anti-digoxin-FITC Digoxin Anti-digoxin-TRITC Digoxin-FITC Digoxin HEp-2 Cells-TRITC
Anti-human IgG-FITC Human-Antinucleare Antikörper Antidigoxin-TRlTC Digoxin-protein-FITC
Digoxin Anti-digoxin-FITC Digoxin-protein- Digoxin Umbelliferon
Fortsetzung
Receptor Testligand Bestimmungsligand Anti-gentamycin-FITC '25IGentamicin Gentamycin
Anti-gentamycin-57Co 125IGentamycin Gentamycin Anti-gentamycin-FITC Gentamycin-ß-D-galacto
Gentamycin sidase Anti-gentamycin-Evansblau Gentamycin-FITC Gentamycin Anti-gentamycin-FITC
Gentamycindansyl Gentamycin Anti-gentamycin-FITC Gentamycin-coumarin 120 Gentamycin
Abkürzungsschlüssel: FITC - Fluoreszeinisoth iocyanat CMV - Cytomegalovirus TRITC
- Tetramethylrhodaminisothiocyanat FA - Fluoreszeinamin Wle schon erwähnt, können
erfindungsgemäß gewisse Immunbestlmmungsmethoden selbstelchend gestaltet werden.
Wenn z. B. elne Fluoreszenzmessung durch Beleuchten einer Oberfläche und quantltatlve
Feststellung des von der Oberfläche abgegebenen fluoreszierenden Llchts erfolgt,
kann dle Fluoreszenzverstärkung an der Grenzfläche zwlschen der Oberfläche und dem
Fluorometer durch eine Anzahl von Faktoren beeinflußt werden.
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Optlsche Merkmale der Oberfläche selbst können dlese Verstärkung beeinflussen,
wenn z. B. unter der Oberflãche eine reflektierende Unterschicht vorgesehen Ist.
Hat dle Oberfläche elne reflektierende Unterschicht, dann kann, allgemeln gesagt,
die Fluoreszenzemlsslon der Oberfläche größer setn, weil a) das auftreffende Licht,
welches durch die Oberfläche hindurchtritt, zurückgeleltet wird, um die Fluoreszenzemlsslon
zu verstärken und b) well dle anfangs In dle Oberfläche gerlchtete Fluoreszenzemission
herausreflektlert werden kann. In ähnlicher Welse kann die Fluoreszenzverstärkung
an der optlschen Zwischenfläche durch Merkmale des Fluorometers, beispielsweise
die Sauberkelt der Llnsen, dle elektronlsche Verstärkung oder das Alter der Komponenten
und dgl. beelnflußt werden. Die Fluoreszenzverstärkung Im System kann auch in Abhängigkeit
von elner Anzahl von Verfahrensfaktoren schwanken, z. B. In Abhängigkeit von der
Menge des ursprünglich an dle Oberfläche gebundenen Reagens, der Lagerungszelt des
Produktes oder von Schwlngungsbeschädlgungen während des Transportes u. dgl.
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Da eine so unermeßlich große Anzahl von Faktoren die Fluoreszenzverstärkung
an der Grenzfläche zwischen dem Fluorometer und der Oberfläche beelnflussen kann,
Ist es bei vielen Fluoro-lmmunbestlmmungsmethoden üblich geworden, für ein ausgedehntes
Eichungsverfahren zu sorgen, damlt der Fluorometer periodisch mit standardlsierten
Oberflächen gekelcht wlrd.
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Durch dle bevorzugte Ausführung gemäß der Erflndung werden dle Effekte
dieser Verstärkungsfaktoren dadurch kompensiert, daß beide marklerenden Bestandteile
im Komplex gemessen werden. Dabei wird die unbekannte Menge des vorhandenen Bestlmmungsllganden
als Funktlon des Verhältnisses der quantitativen Messungen beider marklerender Bestandteile
bestlmmt. Soweit nämlich eln belleblger Faktor, der die Verstärkung an der Zwlschenfläche
zwlschen der Oberfläche und dem Fluorometer beelnflußt, bel belden Messungen derselbe
ist, hebt slch die Wlrkung dieses Faktors Im Verhältnis auf, so daß slch dle Notwendigkeit
zum Eichen für den Ausgleich dleses Faktors erübrigt.
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Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erflndung wlrd also ein
fluoreszierender Marklerungsstoff am Rezeptorllganden und eln unabhängig davon feststellbarer
fluoreszierender Markierungsstoff am Testliganden nach der Inkubatlon, während sie
Immunologlsch anelnander gebunden slnd, quantitativ festgestellt, wozu vorzugsweise
dasselbe Fluorometer verwendet wlrd.
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Bel den nachfolgend beschrlebenen belden Belsplelen wurden für den
Rezeptorliganden Antikörper, markiert mit Tetramethylrhodamlntsothlocyanat und für
den Testliganden Haptene, marklert mit Fluoreszelnlsothlocyanat, benutzt.
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Belspiel 1 Oberflächenqualltätskontrolle und unabhängige Feststellung
des Rezeptorllganden im Verlaufe eines Immunbestlmmungsverfahrens wurden in einem
T4-Assay gezelgt. Tetramethulrhodaminisothiocynat-Anti-T4 wurde wle folgt zubereltet:
Elner Lösung aus 250 ul Antl-T4-lgG-Fraktlon aus einer (NH4)2 SO4-Ausfällung 24
mg/ml und 100 ul 0,1 M-Natrlumphosphat, pH-Wert 9,72, wurden 5 ul TRITC (2,28 mg/ml
In 0,1 M-Natrlumphosphat, pH-Wert 9,72, frisch zubereltet) hinzugefügt. Das Gemlsch
wurde bel 4° C über Nacht gerührt. Das Produkt wurde mit Hllfe elner Sephadex G-50-150-Säule
(14 x 1 cm) gereinigt, mit PBS, pH-Wert 7,4, elulert, und das Eluat In 10 Tropfen-Fraktlonen
gesammelt. Dle das Produkt enthaltenden Fraktlonen wurden kombiniert. Die Absorption
wurde dann bel 280 und 555 nm gemessen. Dle Bestlmmung von R/p erfolgte gemäß folgender
Gleichung: R/p - ODsss x 12 OD280 x (1-0,88 x OD R/p = 0,45
Dann
wurde elne Verdünnung des erhaltenen TRITC-Antl-T4 mit nichtmarklertem Antl-T4 vorgenommen
bis auf R/p = 0,0084, 9,68 mg Proteln/ml (gleichwertlg mit einer nichtmarklerten
Antl-T4-IgG-Fraktlon mit dem Titer 2,5). 40 kl (287 g) wurden auf 10 Probennehmer
getüpfelt. Die bei diesen Versuchen verwendeten Probennehmer haben eine Stützfläche
innerhalb elnes Berelchs von ca. 0,283 cm2 aus mit Perjodat aktivierter Cellulose.
Dle Probennehmer wurden getrocknet und mit NaCNBH3 reduzlert. Fluoreszenzmessungen
an den Probennehmern wurden mit einem Fluorometer unter Verwendung eines 540 nm
Fllters Im Erregerkanal und elnes 570 nm Fllters Im Emlsslonskanal vorgenommen.
Das Rhodan@n-Signal des Probennehniers wurde sowohl naß als auch trocken nach einem
20mlnütlgen Einweichen in 0,01 M-Borat abgelesen. Dle Probennehmer wurden mit 500
lti 0,01 M-Borat, pH-Wert 9 und FITC-T4 (7 ng T4-Anteil mlttels RIA) eine Stunde
lang inkublert. Dle Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor.
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Rhodamin-Signal eingeweicht in Borat, 20 Minuten Probennehmer naß
trocken Assay Signal Nr. (Verstärkung 10) (Verstärkung 2,5) (Verstärkung 8) 1 156
150 152 2 138 140 163 3 154 155 138 4 147 138 132 5 188 (Verstärkung 7,9) 189 (Verstärkung
1,9) 175 6 142 150 137 7 133 126 143 8 116 115 115 9 149 147 132 10 114 100 114
Standard- nicht redigiert a) 29,46 32,03 19,2 abweichung redigiert b) 8,38 10,6
11,4 Mittelwert nicht redigiert a) 146,9 144,7 140,1 redigiert b) 145,6 144,5 142,4
11 22 12 136 12 21 12 156 13 73 83 62 14 75 86 67 a) - alle Probennehmerwerte eingeschlossen
.b) - unterstrichene Werte ausgeschlossen CV's Probennehmer Nr. 1 bis 10 Rhodamin-CV's
ein- AssayCV's geweicht in Borat, 20 Minuten naß trocken (%) (%) (%) 1 bis 10 20
22 13,8 Ziffern 5.8.10 nicht 5,8 7,4 8 berücksichtigt.
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Dle Aktivität von Antl-T4, welches geringfügig mit TRITC markiert
war, Ist dle glelche wie dle von nicht marklertem Antl-T4 (Probennehmer Nummer 11
und 12, Tlter 2,5, 287 ug/Probennehmer). Wenn die Antlkõrper/Probennehmer Schiff
Base-Blndung nicht durch NaCNBH3 (Probennehmer 13 und 14) reduzlert wtrd, verringert
slch das Assay-Slgnal, resultierend aus der Ablösung des Antikörpers von der Oberfläche.
Dies ließ slch ohne welteres anhand des geschwächten Rhodamin-Signals erkennen.
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Dle zerstörungsfrele Qualitätskontrolle hat elne deutliche Wlrkung
auf die Verbesserung des VariatlonskoeS-zienten für Bestimmungen unter Verwendung
von mit Perjodat oxidlertem Papler. Für dle Qualitätskontrolle konnten ohne weiteres
drei außen liegende unabhängige Werte fallengelassen werden, und dle Variatlonskoemzienten
(CV) der Bestlmmung wurden von 13,8% auf 8% herabgesetzt.
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Belsplel 2 Bei dlesem Beispiel wurden Bestlmmungen für Gentamycln
vorgenommen. Die Konzentrationen von markierenden Bestandteilen belder Liganden
wurden nach der Inkubation gemessen und dle Verhältnisse der beiden Messungen bestlmmt,
um ste mit der Konzentration des Gentamycin-Bestimmungsllganden in Bezlehung zu
setzen. Es wurden Untersuchungen mit zwei Arten von Probennehmern unterschiedlicher
optischer Eigenschaften durchgeführt. Die eine Art von Probennehmer hatte weißen,
durchsichtigen Klebestoff zwlschen der polymeren Celluloseacetat-Nltrat-Oberfläche
und ein blaues Kunststoffsubstrat, während dle andere Art einen schwarzen, lichtundurchlässigen
Klebstoff aufwles.
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Die Probennehmer mit dem weißen Klebstoff ergaben höhere Emisslonsmessungen.
Die Verwendung dleser belden Arten von Probennehmern zelgt, wie die Bestlmmung des
Verhältnisses von Marklerungsmessungen dle unterschledllche Verstärkung an der Grenzfläche
zwischen dem Probennehmer und dem Fluorometer ausgleichen kann.
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Dlese Untersuchungen wurden In folgender Weise durchgeführt: Elne
Gruppe von Probennehmern wurde mit TRITC-Antl-Gentamycin betüpfelt, getrocknet und
gewaschen und erneut getrocknet. Ein Satz dleser Probennehmer wurde mit Bestlmmungsliganden
(Gentamycln) unter Verwendung folgender Gentamycln-Konzentratlonen zubereltet: 10,
20, 40, 80, 160 und 320 ng Gentamycin pro 500 u1 Puffer, der 0,01 N-NaH2PO4 und
0,85% NaCI enthlelt mit einem Wert von 7,4. Dlesen Probennehmern wurden 100 ul FlTC-Gentamyclnlösung
hinzugefügt, dle 66 ng Gentamycin-Antell gemäß RIA Bestlmmung enthielt. Eine Gruppe
von 10 Probennehmern wurde in jeder Konzentration des Bestimmungsliganden 30 Minuten
lang Inkublert. Anschlleßend wurde dle Oberflächenfluoreszenz der Probennehmer unter
Verwendung elnes Fluorometers gemessen, um Werte für dle von Rhodamin und Fluoreszeln
verursachte Fluoreszenz (FSU) zu erhalten. Rhodamin wurde mit einem Fllter von 540
nm für die Erregungswelienlänge und einem Filter von 570 nm für dle Emissionswellenlänge
gemessen.
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Fluoreszein wurde mit 475 nm Erregungsweileniänge und einem Filter
von 540 nm für die Emissionswellenlänge gemessen. Es wurde keine Fluoreszenzunterdrückung
festgestellt. Für jede der verschiedenen Konzentratlonen des Bestlmmungsllganden
wurden folgende Bestlmmungen vorgenommen: Standardabweichung, Mittelwert und Varlatlonskoefflzient
(CV), und zwar getrennt für Fluoreszein, Rhodamin und das Verhältnis von Fluoreszeln
zu Rhodamln auf den Probennehmern mit dem klaren und mit dem schwarzen Klebstoff.
In elner Kurve der erhaltenen Daten Ist das gute gegenseltlge Verhältnis und der
Ausgleich für Unterschlede an der optlschen Grenzfläche zwischen den Probennehmern
und dem Fluorometer erkennbar, obwohl es nötig war, beim Ablesen der Probennehmer
mit dem schwarzen Klebstoff dle Verstärkung um elnen Faktor von ca. 3,25 sowohl
für dle Fluoreszeln- als auch für die Rhodamln-Slgnale zu erhöhen.
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Probennehmer mit klarem Klebstoff Probennehmer Gentamycinª) Fluoreszein
b), Standard- Durch- CV% Nr. Konzentration Rhodamin C), abweichung schnitt Fg/ml
Verhältnis 1-10 1 F 7,30 177 4,1 R 4,29 179,86 2,4 F/R 0,04 0,98 4,1 11-20 2 F 5,8
168 3,5 R 5,25 182 2,9 F/R 0,033 0,92 3,6 21-30 4 F 5,2 149 3,5 R 2,875 183 1,6
F/R 0,02 0,81 2,4 31-40 8 F 5,35 134,4 3,9 R 4,6 189 2,4 F/R 0,026 0,707 3,6 41-50
16 F 2,32 121,06 1,9 R 2,15 193,7 1,1 F/R 0,009 0,62 1,4 51-60 32 F 2,72 98,6 2,8
R 3,14 192,4 1,6 F/R 0,009 0,51 1,85 ) in der Probe b) VegsA,rtunf- 1,2 C) Vorflirkuns
- 2,1
Probennehmer mit schwarzem Klebstoff Probennehmer Gentamycin
a), Fluoreszein b), Standard- Durch- CV% Nr. Konzentration Rhodamin C), abweichung
schnitt g/ml Verhältnis 1-10 1 F 3,29 183,4 1,8 R 5,37 177,9 3,0 F/R 0,02 1,03 2,2
11-20 2 F 5,96 164,7 3,6 R 6,59 170,6 3,8 F/R 0,032 0,96 3,3 21-30 4 F 11,18 146,4
7,6 R 7,05 166,4 4,2 F/R 0,037 0,88 4,2 31-40 8 F 7,62 127,31 5,9 R 7,57 169,4 4,4
F/R 0,02 0,75 2,8 41-50 16 F 3,78 121,81 3,1 R 5,38 177,08 3,0 F/R 0,03 0,687 4,2
51-60 32 F 6,94 100,78 6,8 R 14,28 169,3 8,4 F/R 0,02 0,596 3,2 ') in der Probe
b) Verstärkung = 4 C) Verstärkung = 7,1