SE448260B

SE448260B - Forfarande for genomforande av immunoassay

Info

Publication number: SE448260B
Application number: SE8007978A
Authority: SE
Inventors: J H Chen; R T Maggio; D Rehbinder
Original assignee: Whittaker Corp
Priority date: 1979-03-19
Filing date: 1980-11-13
Publication date: 1987-02-02
Also published as: WO1980002076A1; DE2953610C1; EP0026176B1; CA1137410A; SE8007978L; EP0026176A4; DE2953610T1; GB2057685B; EP0026176A1; GB2057685A; JPS55126856A

Description

_15 20 30 en lösning innehållande icke-bundna testligander. , 7 448 260; 'immobiliserad receptorligand för bildning av ett första komplex, Den märkta testlíganden binds därefter till assay-liganden í kom- plexet för bildning av sandwich-komplexet (testliganden kan vara identisk med receptorlíganden och är i själva verket ofta det), och märkningsbeståndsdelen i sandwich-ligand-komplexet detekteras kvantitativt för härledning av mängden av ingående assay-ligandl - i-_ Y Detekteringen genomföres lämpligen genom mätning av fluoresceran- de ljus, eftersom en flnorescerande märkningsbeståndsdel användes, eller Spektrofotometriskt,_när en optisk densitetsändring eller u Vâglängdsändring uppträder genom-flnorescensundertryckandee Detek- teringen kan fordra separation av liganderna anordnade i sand- gr wichstruktur från içke-bundna lígander och detta âstadkommes van- ligen genom separation av receptorliganden uppburen på en yta från Mängden assay-lígand härledas från den detekterade mängden itestligand; eftersom dessa två mängder i allmänhet är direkt pro-i aportionella mot varandra i sandwíchmetoden. Parallella tester mot kända standardprover användes för kalibrering: g g Mängden_assay-ligand kan härledas.såsom det inverterade för- hâllandet med den konkurrerande metoden som angivits ovan, varvid assayliganden bringas i kontakt antingen simultant eller i följdi med en känd mängd av testligand och en begränsande mängd av recep- .tor- När receptorn och testliganderna binds immunologiskt, är mäng- den av testligand som detekteras i ett binärt komplex med recep- torn omvänt proportionell mot mängden av ingående assay-ligand.

Enligt den indirekta metoden kommer en begränsande mängd avg testliganden att.bindas immunologiskt till antingen.assay-1iganden°'-e eller receptorliganden. Mängden av testliganden i binära komplex av test-och receptorligander utgör ett inverterat mått pâ mängden av assay-ligand ingående i en jämviktsblandning av de tre ligan- derna. f I _ Z Z Ovan diskuterade tre metoder kan representeras med följande e ekvationer, vari R betecknar receptorlíganden, A betecknar assay- liganden och T betecknar testliganden. 10 l.,noggrannhet med avseende på mängden av receptorligand som ir -15, 25 aning genomföras på receptor- och testliganderna som är immun 'mätning av ytan såsom beskrivas närmare i följande ame ik 'te cantskrifteri:3>992e631;e3 999_9A8; å É i a i 448 260 1. =Éf+ïAÛí ~f+ i_ RA- 2; -_RA;+»T“ -f» ~1,1 ïRe+*A +'T -a' RA + Sandwich RT Simultant}Konkurrer“:de 1, R ; A -4-a RA .a ¶ 2. RAe+ T -f-9 RA + RT-sekvens 1.i .A +rT1: -4-A Ar »a Z . ¶ 2. AT +.R i-_"-9 AT + ET Sekvens _Indirekt 1.i iAi4 T¿+ R -+++ AT~+ RT simulzan-J Enligt en föredragen!immunoassay-teknik enligt uppfinnigen azel göres testliganderna av fluorescerande material och receptor- iliganden'binds till en yta, varpå en mängd av testliganáen uçpsan- las till följd av samverkan av de olika ligandena. F1uorescensnät~ l c e;is¿t _" flucres:ens~ sammanbundna"“å' tan} Denna föredra=na_teknik innefattar > I o "I" A 020 151; u 025 310; een U 067 959f' ¶ ¶ Z _ .gi ~ e De olika immunoassayfmetoderna vartill hänvisats ovan uppvisar vissa brister med avseende på noggrannneten som beror på bristanie i ett visst förfarandesteg; Om exempelvis fluoroinxunoassaymetc genomföras på ytan av en bärare, kan bristande noggrannhet :ei =v- seende på slutliga testresultat uppträda, när det finns l mängden av receptorliganden som ürsprungligen biràs_til P ïan. Likartat kan bristande noggrannhet up stå, när en v reoe torlieand är förlorat från test'tan under transport eller P e E _ . t under själva immunoassag-förloppet.

Enligt föreliggande uppfinning uppnås en avsevärd fërbät :r;:5 ¿av kvaliteten av immunoassayfíörloppet-samt avsevärda förbättringar med avseende på enkelhet och noggrannhet av immunoassay-förlcççet genom att till receptor-liganden binds en märkningsbeståndsdel some förblir oberoende av märkningsbeståndsdelen av testliganden cc: som kan detekteras i immunoassay-förloppet oberoende av märkningstestånisa delen på testliganden}i ' l I i _70 . 15 35 _en fluorescerande beståndsdel¿ Z' " Vi V 1 V V di- rekt detektering och mätning av receptorlíganden utan att detta ínterfererar med det normalagímmunoassay-förloppet och varvid föl-e 1. Märkníngsbeståndsdelen på receptorldganden kan användgs_ såsom en kvalítetskontrell för bestämning av att en reglerad mängd av ligenden_har bundíts till en testyta under ursprunglig frem-d ställning av àssay-reagensen. 2. Tester kan genomföras avseende detektering av märkningsbe- ställande ay att reagensen ej har skadats under transport och för detektering av testlíganden. , och eventuellt viktigast, kan receptorliganden ídetekteras kvantitativt_under ett ímmunoassay-förlopp oberoende av ¶ så att ímmnnoassay-för- loppen kan göras självkalibrerandeiä V ' 1 ' 1 _ Detekteríng och mätning ev mängden av märkningsbeståndsdel på receptorlíganden kan genomföras på känt sätt med känd utrustning på sådant sätt som fluorescerande märkningssubstanser har använts med andra lígander bör emellertid en märkningsbeståndsdel på recep-d med likartede typer av märkníngsbeståndsdeïar som kan detekteras_dd oberoende av varandra. Exempelvis kan en av líganderna märkas med såsom fluoresceínisotíocyanat (FITC), under det att-den.andra liganden kan märkas med en annan fluoresceë rande beståndsdel, såsom tetraetylrodamínísotíocyanat (RITC) eller tetrametylrodamínisotiocyanat (TRITC), varvid de två utvalda ¶ fluorescensbeståndsdelarnafluorescerar vid olika râglängder och sålunda kan detekteras separat. d ' 'inte interfererar med_kemín av efterföl- * , 10 ífav ett flertal olika añtigener -15 íﬁ' O +5¶% ¶}¶44s 260 ¶nl1g§ qppfinningen föredràgçs användñing av de hl tvâ .lucrescens- besëåndsdelarnaAfluofescein óch r ¶ tétfaüetylrodaminisotíocya_ som test med användning av åessa två fluorescensbestårdsèelar G nomföraš1i'en'mycket.känslig fluorometer, som för närvaranâ f;nns . tillgänglig på markñadén helt enkelt genom att i fluoromecern lnföres lika fíltèrsammansättníhgar för excitering och dëteknering av vid olika yåàlängder. ”¶¶ Anväñdningen.aV ånpbelmärkta ligander i enli kan vara fördelaktigﬁ i¶ - :~ ~, 'I -..L s@y~¿or_cpp men =,@ ghet :ed uppflnningen ett flertal olika immunoas och teàtligahdér, utformad ,¶añtikr§p§ar eller flertal Qlika receptorf e hapten assayflígander. ¶ immunåassay-fërloppec_genomföras uppfilningeñ med följàhde uppsättning ligandér: I _ Exempelvis¶kan n av réceptor-, ¶Receptor-märksubstans Testligand-märksubstans An:i~gentamicin-TRITC Geñtamicin-FITC Ger:an;c;r An:i>conr¿mycin-THITC Tobramycin-FTTC Tebraxgcin ¶ Anti-féhcbarbital~ Fenobarbital-FITC Fen::ar:;:el :ffs-mc ' - L;'._VA- _ i ' f .' _. _ '. . _ 4- - - :_ M An:i-fenobarb1tal- renooarbztal-FA :enocars+»al 'TRITC ¶ ¶ An+:-ﬁ@0f§1iiﬁ~TRITC Û An:ièdifeny1-hvda,- co:n~zR:Tc _ Ah:i-cifenyl-nydán-¶ ¶9ifeny1nyd¿ntoin~ï B:fen;lhyë&“==1ﬂ :Qin-FITC » " Ümbelliferon ßnﬂﬂ-hefpes-TRITC ânci-herpes-FITC nerpesvlrus Anzi-cmv>ïa:Tc Anti-CMV-FITc_ omv Anti~s"ra~fosfatas~ ¶Antí~syra-fosfatasf Syra-fcsfatàs THÉTC _ FIfC P : Anzi-syra-fasfatas-¿ Syra*fosfafas~FITC f¶Syra-fcsfatas Ta:Tc¶ ¶ ¶ ¶ -~ W ¶' _ ¶ ¶ ' V _ Rubella-Añtigen-;*'¶ Anti-HumànèIgG- ¶¶Iumán-Anti-rubella TH:Tc¶ ¶-ï1Tc - '10 15 20 25 55 H0 ee1443ae25Û' r . I » ~ e Re°9Pï0P'mäPKSubSbanSf>Testligand~märksubstans Assay~1ig¿pd Ruoella-Åntigen- 'Anti¿Human-IgM; 7 I TRITC: _ pf vi FITC o'> " nigoxin-TRITC Human-Anti-rubella p p Anti-aigoxin¿FIwc *tnigoxih a Anti-digbxin-Tnïrce nigoxin-Fïmc ' nigoxin TRITC . _ -. V _ - _ I e V , HEp-2~ce11er~- p »>f'Anti-human-IgG- Human-Anti-kärna TRITC _, ~ _. _ "f'FITC f Antikroppar Anti-dígoxin- S* fDigoxin-protein Digoxin TRITC~ f' ¿*f' FITC _' ~ Ånﬁi-digoXin~ p , .Digoxin-proteín- Digoxin FITCa ett _e¿ _Umbel1iferon e a p ._ v . . 12 ' , _. _ , _ ÅHﬁl-g@ﬂﬁam1c1n- 51-Gentamlcln Gentamlcln. _FITce2 var e r p Antí'ëentamícin-5700 125I-Gent ' ' H7' “ a _ e __¿ - - amlcun Gentamlcln e ' Anti-gentamícín-1 =¿ Gentamicin-ß?D- Gentamicinïj pï a på FITC . H :_- _,aaga1aktosidas 1 p_. i - å Anti-gentamicin-kr Gentanicin-FITCpa ' Gentamicinj 7 5 Evans-blått_ *_ _ a _ Anti-gentamicinfv 7Gentamicindansyl Gentamicin . _ “ eFITcaa_ _ = e ee_ a ~ «~ Anti-gentamícin- Gentamicin-kumarin p Gentamicin. e_F1Tca e 120* o ' “ p Beteckníngar:_. *fFITCk r fluoresceinisotiocyanat E o CMV _ffCytomegalovírue g TRITC - tetrametyIrodaminisotiocyanat pEA j - fluoresceinamin Såsomfindikerate=ovan kan enligt.uppfinningen vissa ímmunoaseay- förlopp göras asjälvkaiibrerandek När šålunda en fluorescensmät-, ning genomföres genom belysning av en yta och kvantitativ detekteringp av fluoreseensljnstemítterat från ytan, finns det ett antal faktorer som kan påverka det optiska utbytet vid gränsytan mellan ytan och fluorometern. Optiska egenskaper av ytan i sig kan påverka utbytet, _ exempelvis när ytan nppvisar en reflekterande underbeläggning. Om y- tan uppvisar en reflekterande underbeläggning, kommer-generellt fludï trescensemission från_ytan att vara högre, eftersom (a) infallande p ljns som passerar genom_ytan återvänder och förnöjer_fluorescensemissio- _ nen och (b) fluorescensemiseion initiellt riktad in i ytan kan re- tflekteras ut. På likartat sätt kan utbytetfvid den optiska gränsytanp påverkas-genomtkaraktcristíkapförafluorometern,"såsomyrenhetsgraden av íínserna, elektroniskt utbyte eller åldern av komponenterna och 1iknande¿ Det optiska utbytet íïsystemet kan också variera beroende' 'på ett antal förfarandefaktorer, såsom mängden_av ett reagens som »'71 ﬁ n* ' 'fin lO .l5 201 i 251. _30 a 55 NO 7 448 260 I initiellt binds till ytan; produktens hållbarhet, vibrationsskador _ under_transport och liknande. g rPå grund av det stora antal faktorer, som kan påverka utbytet. e vid gränsvtan mellan ytan och fluorometern har det enligt många fluo- roimmunoassay-metoder varit rutin, att ett omfattande kalibrerings- förlopp genomförts för kalibrering av fluorometern periodvis medge ,standardiserade ytor. Enligt en föredragen utföringsform av uppfinning- ﬂïkan effekten àv förstärkningsvariationen vid ëränsytan melf -lan ytan ooh fluorometern kompenseras genom att dessa variationer ntar'ut¿varandra, när de uppträder vid mätningen av bägge märknings- abeståndsdelarna. Detta är speciellt effektivt, när bägge märkbestands~ ' delarna mäts efter inkubering och också när mätningen genomföras med samma instrument. _ Enligt en föredragen form av uppfinningen detekteras följaktligenë nfluorescensmärksubstans på receptorliganden och en f1uorescensmärksub~ 'stans på testligandenkvantitativt, under det att dessa är bundna till 5-varandra, och företrädesvis medelst samma fluorometer och den mängd av assay-liganden som ingår i ett okänt prov bestämmes såsom en funk- tion av förhållandet av de kvantitativa mätningarna av de tvâ märka* fningssubstansernal"Den effekt varmed någon faktor-påverkar förstärk- ningenvid gränsvtan'mellan ytan och fluorometern är densamma i bagge mätningarna och följaktligen kommer effekter av denna faktor att ta ut varandra i förhållandet, vilket eliminerar behovet av kalibrering för kompensation av denna faktor, _ 4 I _ I följande två exempel genomfördes immunoassay-förloppet med användning av konkurrerande teknik. Märkningsbeståndsdelar användes på såväl_receptor¥ som.testliganderna,nämligen tetrametylrodaminisó- tiocyanat-märkt antikropp för receptorliganden och fluoresceinisotio- - cyanat-märkt hapten för testliganden.

Exempel 1 >Ytkvalitetsreglering-och oberoende detektering av recepfr torliganden under aimmunoassayförlopp demonstrerades i TH-assay.

Tetrametylrodaminisotiocyanat - anti-TH framställdes på följande sättzn i till en lösning av 250 pl anti¿Tu~Ige-fraktion från (NHu)2souëfä11~ I ning; EH mg/ml, och l00 ul av 0,lM natriumfosfat, pH 9,72 sattes 5 nl TRITC (2,28 mg/ml i 0;l M natríumfosfat, pH 9,72 nyberedd). Bland- ningen omrördes vid H OC över natten. Produkten renades genom en_ _*íSefadek G-504150 kolonn (lÄ_cm x l_cm§, eluerades med PBS,pH 7¿H; *Eluatet tillvaratogs i lüedroppars fraktioner. Fraktionerna innehål- flande produkten kombinerades. Absorbansen mättes vid 280 nm och 555 nmy-R/p bestämdes enligt följande ekvation: l0~ 15 i5d44se2605 . Rkp-=ïëë555 k iá _¶ }OD _ ~ ' 280 x f1f0,885xJ 555) R/é = 0,~5 - ' Ernåiien Tñïiqèànti-T4 spådde: med icke märkt anti~IM till 5 R/p av 0,008Ä, 9,68 mg protein/ml (ekvivalent med icke märkt anti-'fl a TH IgGÉfraktion-titerjav 2,5). Ä0 ul (287 pg) anbringades såsom >7 fläckar på 10 provanordningar av_den'allmänna_tyn som sälješ kommere ciellt av Intefnational Diagnostic Technology, Inc. under Varube- teckningen_StíQ®. Provanordningarna som användes i dessa tester upp- visade en bäraryta med ett mått av ca 283 omg av penjodataktiverad ¿ celluloea} StiQ®-provanordningarna torkades och reducerades med .

- NaCNBH3. Fluorescensmätñingar genomfördes med StiQ®-provanordningarna med en fluorometer som säljes av International Diagnostic Technology, Inc. under varubeteckningen FlAX® med användning av SÄO-nm filter i ex- citationskanalent och ett 570-nm filter i emissionskanalen. StiQ®- rodaminšignalen avlästeà¿i'$åVäl vått som torrt tillstånd efter ge- o nomdränkning med 0§0l?M:bofat under 20 min. StiQ®Fanordningarna inkuberades med 500 pl av 0,0l¿M bokat pH9 och FlTC-TH (7 ng TH- gfupp enligt RIA) under en timme. Rešultaten finns angivna i följande 5 tabell. o 5 1 o Z 1:Ü9 111 39 _, 3448 26013 Rodamihsignalïçfter_2O4minuters 1 _~§räﬂkning i borat _ _ » 2'StiQ® 1 Assay-signalförstärkning I Nrï - 8 ; %åt_ (utbyte 19)_ torr (utbyte 2,5) 92 155 33 1-_ 1 150 1 1 3 152 2138 Ü ~ 2 3 1nof32 3 1631 151,. ¿ _1 , 1 9155 _ _ 138 1 1h713_ _ 1 138 131 132 33 1§§ (utbyte 7,9) 1§9 (utbyte 1,9) _ 11â _É1u2 9 1- F.. f 150 , 137 ,_1331 3 11 VÄ- 126 ,1,, , 1u3 149 2 1 1 ' 1 11 1973 -, 9 1 3 132 *1ë¿3ï 3V"1 3Äu&1 3 33 3 ya 1-1 \ ' 4 _ . '@\Û Û\.\J_| J:\1~ï RJ f-\', standard- 1i¿ke3rea1geraa? 29,16 32,031 _ 19,2 A avvikçlåe redigeradbf" 1 f 8,38 í*10,6 É ll,H 'meåe19ärde icke redigerád§lH6,9 3 1HÄ,7 § lH0,l red1g@fadb'1'1i1u5,e 3 111,5 3 ä 142,13 11, 11, ,22 * -3 11~- 12,- 3 136 12 1 1 21,, 1 11 3 _-1 12 1 3 - 156 11331, 3' 733 " 1", » *S33 _ 1 Z 62 111 33 275'3I' '-_ 3 1- ss 1 ^ _ sv. 'a2- alla ÉtíQ® f värdeñ ingår, b ~«understrukna värden ingår ej 10: 15 20 e25 P g4?1S 2130 v"__1O 'g a cv för ssiQ® Nr lf- lo lassay-metoden5CV sänktes från 15,8 % till 8”%. ÉddaminfCV efter dränkníng i bo? 'I ' f ' prat i 20 min l _e ' X Assay-CV _ g¿; i ,våt det j torr er ”e 0 _ 1g- 10; ¿' eV ao %pet 22 %¿l 1 , E 13,8 %. d5f8.1Qf I » ,~ *if se fd d'g d'g -} _uteslutna~ e 5,8 % e» ?,H % g ' 8 % Aktiviteten av anﬁíèrh iatt märkt med Tales är densamma som för .icke märkt amﬁi-Tu (stiQ@-värden 11-och 12, timer 2,5, 287 ng/stiQ®).

Om bindningen antikropp -StiQ®~Sèhiff's bas ej reduceras med NaCNBH3 (StiQ® 13 óch 14), minskar assayësígnalen, vilket beror på lösgöïandet &Vg&ﬁÜiKP0PPdfrånd ytan. Detta kan lätt detekteras genom den för- svagade rodaminsignalen. gg I a lg K Icke-destruktivt QC har en uttalad effekt på förbättring av CV för immunoassay-meﬁoder smed användning av per odat-oxiderat papper.

Med QC kunde tre utanförlíggande värden lätt utelämnas och imnuno-a ¿ Exempel 2'I detta exempel genomfördes tester med gentamicin.g ¿Koncentrationen av mårkningsbeståndsdelar från bägge líganderna' I lmättes efter inkubering och förhållandena av de två mätningarna be- _stämdes för korrelation med koncentrationen av gentamiein-assay-li-' gand. Testerna genomfördes med två typer av StiQ®-provancrdningar med olika optiska egenskaper. Den ena uppvisade vitt genomsynlígt lim mellan cellulosaacetatnitratpolymerytan och ett blått plast- substrat, under det att den andra uppvisade ett svart opakt líma StiQ®-anordningarna med vitt lim gav högre emlssionsmätningar. An- vändningen av de två typerna av StíQ®-provanordningar visar, hur bestämningen av förhållandet av märksubstansmätníngar kan kompensee ra variabelt utbyte i gränsytan mellan StiQ®~anordningen och fluoro-1 metern,' .Dessa tester genomfördes på följande sätt: en grupp av StiQ®- N ” provanordningarÉtillfördesjfläckar med IRITC-anti-gentamicin, tbrka- 'I des och tvättades och torkades åter) En uppsättning av assay-ligand- provanordníngar framställdes med följande kända koncentratíoner av gentamicinÉfl0, 20, HOQ 80, 160 óchg§2O Hg gentamicin/500 pl buffert u? Uf; ,l0 15 20- »tordníngafna men användning av FIAXQ-fluorometrar för erhållande av: 44sa260 iﬁnenållànqe o,o1=N”NaH¿PoÄ och 0,85 % Nacl vid pä 7,4. Till Q=~ -oiä provanofdningar sattes 100 pl av FITCrgentamicinlösning innehållande _66 ng gedtamicingrupp bestämd medelst radioimmunoassay. En grupp om 10 provaﬂordningar imkubefades med varje koncentration av assay-li? ganden under 30 min. Därefter uppmättes ytfluorescensen för provanﬂ a värden för fIuorescensen_(FSU) som uppstår av rodamin och fluoresceinf ' Rodaminen mättes med am exeitationsvåglängdfilter av 540 nm och ett emissionsvåglängdfiltef av 570 nm. Fluorescein mättes vid en excite- t'tíonsvågIångd av H75 nm och med ett emíssionsvåglängdfilter av SMO ' nm. Ingen fluofescensdämpning detekterades. För varje enskild kon- centration av assay-ligand genomfördes följande bestämningar av standardavvikelser, medelvärde och variationskoefficient.(CV): sepa- rat~för_flüorescein, rodamin och förhållandet av fluorescein till a rodamin på StíQ®-provanordningarna med såväl klart som svart lim. _Avsättning av dessa data i diagramform visar god korrelation och kompensation för olikheter i de optiska gränsytorna mellan StiQ®-i provanordningar och fluorometern, fastän det var nödvändigt att öka för~ . stärkningen¿ när StiQ®fanordningaP.med användning av svart lim skulle avläsas med en faktor av ca 3,25 för såväl flnoresceín- som rodamín- signalefna. i d “ I i 1 554242215260", 12, -Pfovánordningar med klart Iim 8 _ , 2 Gçnça- , Fluóï-b ,, mlcïn - receln / Stan* _ Pïovanordningw kqncçn-71 rgdaminc-5 7d8rdav4 Mädel-2 fcv % ,nr_ ,_ trat1on ,forhål1ande2 2v1kelse Varde 1 1 - 10 ' 1 pg/m1 4 8,0 1 7,50 177 4,1 2¶2 . 2* 2-2 j2R - 4,29 } 179,86 2,4 , . 1 .«A P/R 5 0,04 f 0,98 4,1 11--,z0ï-, 254 z ng/m1, 2, F,_ ,_ "2 5,8 _ 1168 5,5 2 48 2 ,'R 5, 5,' 5,25 182 2,9 V , 5 ,_5, 'F/R , 0,055 0,92 5,6 - 21 - 50 -5 5'4 pg/m1 , _F2 ' V 5,2 5 149 5,5 ¶ 2 ' R5 V 4 2,875 5 185 1,6 , K , ,F/R 5 2 0,02 0,81¶ 2,4 51 - 4052 8 pg/m1525 2- _ ¶¶ 5,55 2 _154,4 -5,9 ' I 2 222 R _ ,4,6 5 189 2,4 , _ 52 5 ¶,_ F/R5 5 ¶,0,026 5¶ 0,707 5,6 2241 -250 _ 16 pg/m1 F { 1, 22,52 121,06 1,9' 4 5 5 2 12 ~ 2,15 ¶;195,7' 1,1 . 5 _ 7 _, jF/R , 0,009 , 0,62 1,4 51 - 60.» 52 pg/m1 ,F , ' 2,72 > 98,6 2,8 8 ~ Ü ¿ 5 f 53 4 5,14 192,45 1,6 '¶ ¶ ' 2 'F/R _ ' 0,009 5 9,509 1,85 a 21 pfov , b ., 1 ll o ,f0§stärkn1ng '¶ II {w U -w förstärkning',1 41 ~ mig! lir 448- 268 888Pr0vañof0ningar*mèd svart lim .8Geñtaå ,1:F1u0¥ '"Stan- 1 91 , , 1, micin ' receín - dardav- Medel- Erovanord- koﬁcen- ,.rodamín- , víkel- Värde CV % ning nr¶ tration förhållande se 1,". 10 _' _ " 1188M11, ' 3,29 ' 185,11 1,8 , 93 ' 105,37 177,9 1,01 . .-6 = . _ -9 .'fF/R V81 0,02 ' 1,05 2,2 ' 208 ' 18/61 FL 5,96 11.61,7 ' 5,6 , 88 _ 8 R 86,59 , 170,6 3,8 f , 9 jF/R _ 0,032* 0,96 3,3 21 -150 ^ , ¿Ä pg/ml *JE 11,18 146,0 7,6, 8 6 -jR 7,05 166,11 11,1 6 ~, ,F/R 0,037 ._, 0,88 4,2 31 ' 40 8 us/ml1f' F 1 7,62 1 127,31 5,9 " ' TR- 7,5~7 169,11 1,1» 1 9 ; , ¿_ F/R j 0,02' 0,75 2,8 81 " 59 ' 16 ua/ml ïF“ '5;78“ 121,81 3,1 8 ' j-8 , _ 5,38 177,08 3,0 . ~ 1_ 9 _, 1 1,_ F/R 1 0,05 0,687 4,2 »51,- 60_ , 1832 ng/m1 __Ff 6,98 100,781 , 6,8 8 “ 6 8 868, 114,28 169,3 8,9 F/R 0,02 1 0,596 5,2 aíi'pr0v 'bvförstäfkping #73 C_först8rkning}= 1,; ,.-,_,,\. .

Claims

lt e c k n~a t därav, att en första ligand innefattande en fluor- eescerande'märkningsbestàndsdel bringas i kontakt med en andra ' ligand, innefattande en andra fluorescerande märkníngsbestånds- 'c ståndsdelarna fluorescerar vid olika våglängder; och att var och :ynzn-r-fw 448 Ht “ifm 1. ,.- d'Patentkrav ¿

1. Pörfarande för genomförande av inmunoassay, k äcn n e- MÖÃ, del, att den första och den andra líganden_bíndes samman medelst åtminstone en immunologisk bindning, varvid de två märkníngsbe-c en av märkníngsbeståndsdelarna detekteras kvantitatívt. ' _

2. Pörfarande enligt krav 1, k äkn n e t e c k n a t därav, d i att den_första líganden innehållande en fluorescerande märkníngs- Ü beståndsdel bríngas d kontakt med den andra liganden innehållande -en andra fluorescerande märkníngsbeståndsdel och en tredje ligandr så att den första och den andra_líganden binds indirekt genom dímmunologísk bindning av var och en till den tredje liganden.

3. Förfarande enligt krav 1, k ä n.n ett e c k n a t därav, att immunoassay»genomföras-genom att den första liganden innehål- lande en fluorescerande märkningsbeståndsdel anordnas uppburen på en yta, att märkníngsbeståndsdelen detekteras kvantitatívt, att d *den¿första líganden brïngas i kontakt med den andra liganden inne~ hållande den andra fluorescerande märkníngsbeståndsdelen för ímmu~ nologísk bindning an líganderna, och att den andra märkningsbe- ståndsdelen detekteras kvantitativt._ *

4. Pörfarande enligt något av föregående kran, klä n n e ~ t etc kan a t därav; att_märkningsbeståndsdelarna detekteras genom mätning av fluorescerande ljus från märkníngsbeståndsde- larna-med samma flnorometer. - 7 V* n”