CN115651966B - 一种双抗体介导的pcr检测微量生物标志物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微量蛋白质分子检测技术领域，尤其是涉及一种双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法，包括以下步骤：以单克隆捕获抗体包被微量孔板，得到包被微量孔板；向微量孔板中加入待测样本，得到捕获抗体‑抗原免疫复合物；继续向微量孔板中加入生物素化单克隆检测抗体，得到捕获抗体‑抗原‑生物素化检测抗体免疫复合物；向微量孔板中加入DNA标准工作液，得到捕获抗体‑抗原‑生物素化检测抗体‑DNA免疫复合物；将步骤S4所得微量孔板进行PCR扩增，并对PCR扩增后产物进行荧光信号检测。本发明将抗原抗体结合的高特异性与PCR反应的高灵敏度相结合，可以检测到几百个拷贝的蛋白质分子，其检测范围宽、灵敏度高、精密度好。

Description

一种双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法

技术领域

本发明涉及微量蛋白质分子检测技术领域，尤其是涉及一种双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法。

背景技术

许多疾病尤其是早期疾病，因其病理性生物标志物（蛋白质分子）产生量极少，且产生的部位与血液之间受到自然生物屏障的阻隔，致使其在血液中的含量极低。这种现象在中枢神经系统病变（如AD、PD）、眼内病变、早期原位癌等类型疾病中广泛存在。

目前，常用的蛋白类生物标志物的检测方法包括酶联免疫吸附法、电化学分析法、化学发光免疫分析法和免疫荧光技术等。这些检测方法均有各自的优缺点，但大多方法是基于抗原抗体之间的免疫反应实现的。而抗原与抗体的特异性结合是免疫反应的基础，一般采用酶或者荧光素等标记抗体以提供检测信号，常见的检测方法如酶联免疫、荧光免疫、化学发光等能满足大部分的检测需求。但是，这些技术均无法对极微量甚至单分子蛋白质进行操作，仅能检测大量蛋白质分子的宏观表现，在微量蛋白质分子检测方面灵敏度有限，因而无法实现对许多疾病尤其是早期疾病病理性生物标志物的有效检测。

近1年来，新出现了单分子免疫阵列技术，可以实现对单个蛋白质分子的识别与检测，但其技术复杂、设备昂贵、且无法摆脱对单分子免疫阵列芯片的依赖，导致检测成本高，无法广泛普及应用。

鉴于此，本发明提出了将抗原抗体结合的高特异性与PCR的高灵敏度相结合，以实现对极微量蛋白质分子信号的放大，达到高通量、低成本检测的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法，该检测方法实现了对极微量生物标志物高灵敏度和高特异性的检测。

本发明提供一种双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法，包括以下步骤：

S1、以单克隆捕获抗体包被微量孔板，得到包被微量孔板；

S2、向微量孔板中加入待测样本，得到捕获抗体-抗原免疫复合物；

S3、继续向微量孔板中加入生物素化单克隆检测抗体，得到捕获抗体-抗原-生物素化检测抗体免疫复合物；

S4、继续向微量孔板中加入DNA标准工作液，得到捕获抗体-抗原-生物素化检测抗体-DNA免疫复合物；

S5、将步骤S4所得微量孔板进行PCR扩增，并对PCR扩增后产物进行荧光信号检测，以确定待测样本中抗原的含量。

在本发明的双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法中，首先，以单克隆捕获抗体包被微量孔板，在微量孔板上预埋捕获抗体；将待测样本加入包被微量孔板中，使待测样本中的抗原与捕获抗体进行特异性结合，以在包被微量孔板的固相界面形成捕获抗体-抗原免疫复合物；继续向微量孔板中加入生物素化单克隆检测抗体，这里的生物素化单克隆检测抗体为生物素化的针对待测抗原另一位点的单克隆抗体，因此，加入该检测抗体后，会在微量孔板固相界面形成双抗夹心免疫复合物，双抗夹心免疫复合物通过捕获抗体与微量孔板表面结合成为固相的一部分；继续向微量孔板中加入DNA标准工作液，这里的DNA标准工作液为一个亲和素分子与一个生物素化DNA分子相结合的亲和素偶联生物素化DNA的溶液，在免疫PCR生物反应中直接使用该DNA标准工作液不仅简化了生物反应步骤、减少了孵育次数、缩短了反应时间、提高了检测效率，而且可以确保模板DNA分子数量与待测抗原的数量相等，使得实验过程和计算过程更为简化、检测结果更为精确；最后，将步骤S4所得微量孔板进行PCR扩增，并对PCR扩增后产物进行荧光信号检测，以确定待测样本中抗原的含量，原始模板DNA的拷贝数与抗原的拷贝数相同，因此，通过原始模板DNA的含量即可计算出抗原的含量。

作为本技术方案优选地，步骤S1具体包括：使用PBS将捕获抗体稀释至1 ug/mL，配制得到包被液，向微量孔板的管孔中加入100μL包被液进行包被，将包被好的微量孔板于2-8℃下保存18-24h，并依次进行洗涤、封闭和干燥，得到包被微量孔板。

本发明对于洗涤、封闭和干燥的步骤具体不作严格限定，其中，洗涤时，尽量吸去微孔中的液体，再加入一定量的PBS缓冲液，将微量孔板置于水平摇床上振荡清洗，吸去微孔中的液体，重复洗涤数次；封闭时，向微孔中加入150μL含5%BSA的PBS，进行封闭，封闭完成后于18-28℃环境中放置2h以上；干燥时，吸去酶标板内的封闭液，置于干燥间内，从上往下依次整齐码放在干燥架上，孔口朝上，干燥18-24h。

作为本技术方案优选地，步骤S2具体包括：向微量孔板中加入待测样本，并于37℃下孵育30min，吸去微孔中液体，并使用PBS缓冲液洗涤多次，得到捕获抗体-抗原免疫复合物。

在待测抗原的捕获反应中，因本发明主要用于极低浓度外周血生物标志物含量的检测，因此，待测样品可以直接加入微量孔板中。然而，当所检测样品中待测抗原的含量较高时，可根据样品中待测抗原的含量使用PBS缓冲液进行不同倍数的稀释，以扩大检测范围。

作为本技术方案优选地，步骤S3具体包括：继续向微量孔板中加入生物素化单克隆检测抗体，并于37℃下孵育30min，吸去微孔中液体，并使用PBS缓冲液洗涤多次，得到捕获抗体-抗原-生物素化检测抗体免疫复合物。

其中，所使用的生物素化单克隆检测抗体为使用N-羟基丁二酰亚胺酯标记的单克隆检测抗体。并且本发明生物素化单克隆检测抗体的具体制备步骤包括：

（1）在超滤柱中加入400μl 标记反应溶液（0.1M PBS pH 7.2），加入1mg检测抗体，混匀；

（2）4℃，6000rpm，离心2min，弃滤液；于超滤柱中再加入200μl 标记反应溶液，混匀，4℃，6000rpm，离心2min；

（3）复步骤（2） 6-7次；

（4）混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min；将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4℃，6000rpm，离心2min，收集液体；

（5）取50μl PBS于超滤柱中混匀，静置1min；倒置超滤柱，4℃，6000rpm，2min，收集液体；

（6）步骤（4）与步骤（5）的收集的滤液合并，用标记反应溶液调节检测抗体浓度到2mg/ml，4℃放置备用；

（7）将生物素配置成浓度为20mg/ml的溶液，按照生物素与抗体分子摩尔比1:20的比例加入检测抗体溶液，室温反应1h；

（8）使用葡聚糖凝胶分离纯化/透析袋或者超滤管去除游离生物素及其他试剂，得到生物素化单克隆检测抗体。

这里的生物素化单克隆检测抗体使用时，可根据相关使用说明选择一定浓度的缓冲液进行稀释。

作为本技术方案优选地，步骤S4具体包括：继续向微量孔板中加入DNA标准工作液，并于37℃下孵育30min，吸去微孔中液体，并使用PBS缓冲液洗涤多次，得到捕获抗体-抗原-生物素化检测抗体免疫复合物。

作为本技术方案优选地，所述DNA标准工作液为亲和素偶联生物素化DNA的溶液；

其中，所述亲和素偶联生物素化DNA的制备方法包括：以生物素标记的引物对对质粒DNA进行扩增，得到生物素化DNA；将相对过量的亲和素溶液快速搅拌，向其中缓慢滴加入生物素化DNA溶液，反应得到复合物；采用分子筛层析法对复合物进行层析分离，得到一个亲和素分子与一个生物素化DNA分子相结合的亲和素偶联生物素化DNA。

首先，生物素化DNA为以生物素标记的引物对，对质粒DNA（pUC19) 进行扩增，得到的生物素化DNA；生物素标记的引物对是用生物素标记的dATP或dUTP通过DNA聚合酶标记在DNA分子上形成的。具体制备方法如下：

（1）在一离心管或PCR管内加入100ng-1μg的 DNA模板，再加入适量UltrapureWater，至总体积为34μL；

（2）加入10μL 5×Random Primer in Buffer，混匀；

（3）沸水浴加热5分钟，或在PCR仪上100℃加热5分钟；

（4）立即放置到预先准备好的冰水浴中至少保持2-3分钟；

（5）加入5μL Biotin-Labeling Mix；

（6）加入1μL Klenow Fragment，混匀；

（7）37℃孵育1小时或过夜(不宜超过20小时)，37℃孵育过夜可以显著增加生物素标记DNA的产量，因此优选为孵育过夜(12-20)小时；

（8）加入3μL探针标记终止液，混匀，终止标记反应；至此标记反应已经全部完成，标记好的DNA保存在-20℃。

其次，向相对高浓度大体积的亲和素溶液中缓慢滴入相对低浓度小体积的生物素化DNA溶液（5~20滴/min），利用poisson分布的数学规律和亲和素活性位点与生物素结合的生物学反应特性（专一、迅速、稳定），可形成相对较高浓度的目标物质（1个亲和素分子与1个生物素化DNA分子结合）和相对极低浓度的杂质（1个亲和素分子与多个生物素化DNA分子结合），且形成的目标物质和杂质都非常稳定。其中，目标物质占绝大多数（90%以上），而除上述目标物质和杂质外，反应体系中还存在大量未与生物素化DNA分子结合的游离亲和素分子。具体地，这里亲和素和生物素化DNA的摩尔比为（1.8-2.5）：1，且亲和素溶液和生物素化DNA溶液的体积比为（1.8-2.5）：1。

最后，使用分子筛层析法对上述反应体系产物进行层析分离，以去除杂质及游离的亲和素，得到纯化的一个亲和素分子与一个生物素化DNA分子相结合的亲和素偶联生物素化DNA。

使用时，通过缓冲液稀释纯化的亲和素偶联生物素化DNA，取样并以定量PCR法测定其准确浓度，进行标定，即可得到具有精确浓度数值的DNA标准工作液。

为对反应体系产物进行层析分离，以去除杂质及游离的亲和素，得到纯化的一个亲和素分子与一个生物素化DNA分子相结合的亲和素偶联生物素化DNA。本发明创造性的提出了分子筛层析法，并且在层析分离时，使用柱状分子筛，固定相为葡聚糖凝胶SephadexG-200，同时分子筛的内经与高度比值为1:20-1:100， 并优选为1:100。上样过程中，控制上柱样品的体积为总柱体积的1%-5%，并优选为1%；层析过程中保持柱压低于0.15MPa、流速在0.5-2.0mL/min。此外，样品上柱前通过高速离心或过滤，以除去杂质，防止分子筛阻塞。

作为本技术方案优选地，步骤S5中，待测样品中抗原的拷贝数为原始模板DNA的拷贝数，因此，通过原始模板DNA的含量即可计算出待测样品中抗原的含量。

作为本技术方案优选地，步骤S5中，对原始模板DNA的扩增是原位扩增。

作为本技术方案优选地，所述微量孔板为PCR孔板。

本发明的双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法，至少具有以下技术效果：

1、本发明的双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的检测技术将抗原抗体结合的高特异性与PCR反应的高灵敏度相结合，将传统的酶联免疫法、化学发光法、电化学发光发、免疫荧光法推进到单分子检测的水平，在实际应用中可以检测到血液中极微量的生物标志物，甚至可以检测到几百个拷贝的蛋白质分子，其检测范围宽、灵敏度高、精密度好，特别适用于极低浓度的外周血生物标志物等含量特别少抗原分子的检测，为中枢神经系统病变等早期的诊断提供了准确而灵敏的参数，使得此前无法检测到的生物标志物有了一个可靠的检测手段，从而极大提高了人类对许多疾病的早期认识，为早诊断、早干预提供了依据；

2、在本发明双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法中所使用的DNA标准工作液为亲和素偶联生物素化DNA的溶液，这里的亲和素偶联生物素化DNA中亲和素与生物素的连接关系为一个亲和素分子与一个生物素化DNA分子相结合，将该DNA标准工作液直接应用于免疫PCR的生物反应中，不仅简化了生物反应步骤、减少了孵育次数、缩短了反应时间、提高了检测效率，而且可以确保模板DNA分子数量与待测抗原的数量相等，使得实验过程和计算过程更为简化、检测结果更为精确，本发明可用于人体外周血、脑脊液、尿液、唾液、泪液、羊水、分泌物等体液微量生物标志物的分析测定。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、制备DNA标准工作液

1、生物素化DNA的制备

（1）在一离心管或PCR管内加入100ng-1μg的 DNA模板，再加入适量UltrapureWater，至总体积为34μL；

（2）加入10μL 5×Random Primer in Buffer，混匀；

（3）沸水浴加热5分钟，或在PCR仪上100℃加热5分钟；

（4）立即放置到预先准备好的冰水浴中至少保持2-3分钟；

（5）加入5μL Biotin-Labeling Mix；

（6）加入1μL Klenow Fragment，混匀；

（7）37℃孵育过夜（12）小时；

（8）加入3μL探针标记终止液，混匀，终止标记反应，得到生物素化DNA。

2、亲和素偶联生物素化DNA的制备

向浓度为1.0mol/mL，体积为40mL的亲和素溶液中缓慢滴入浓度为0.25mol/mL，体积为10mL的生物素化DNA溶液中，于常温条件下反应0.5h；将上述反应产物进行层析分离，其中，分子筛层析具体实验条件为：固相为葡聚糖凝胶Sephadex G-200的柱状分子筛，内经与高度比值为1:100，上柱样品的体积为总柱体积的1%。流动相为PBA缓冲液，层析过程中保持柱压低于0.15MPa、流速在0.5~2.0mL/min。最后，得到纯化的一个亲和素分子与一个生物素化DNA分子相结合的亲和素偶联生物素化DNA（分散在PBA缓冲液中）。

3、DNA标准工作液的配制与标定

以上述经过分子筛纯化的亲和素偶联生物素化DNA（分散在PBA缓冲液中），取样，以定量PCR法测定其准确浓度，进行标定，得到准确浓度的DNA标准工作液，具体的精确浓度数值由定量PCR仪测得。

二、方法学验证

实验材料：

IL-6抗体对和cTnI抗体对，均购自原料生产商；

生物素及链霉亲和素；

稀释缓冲液（PBS）；

IL-6及cTnI的质控样本；

实验设备：

荧光PCR仪、电子天平、微量移液器

实验方法：

选择常规高灵敏度检测项目白介素6（IL-6）及心肌肌钙蛋白I（cTnI），平行检测质控样本，通过检测结果的线性相关性及重复性指标进行方法学验证。

实施例1

S1、使用PBS将捕获抗体稀释至1 ug/mL，配制得到包被液，向微量孔板的管孔中加入100μL包被液进行包被，将包被好的微量孔板于2-8℃下保存18-24h，吸去微孔中的液体，再加入一定量的PBS缓冲液，将微量孔板置于水平摇床上振荡清洗，吸去微孔中的液体，重复洗涤数次；向微孔中加入150μL含5%BSA的PBS，进行封闭，封闭完成后于18-28℃环境中放置2h以上；吸去酶标板内的封闭液，置于干燥间内，从上往下依次整齐码放在干燥架上，孔口朝上，干燥18-24h，得到包被微量孔板；

S2、向微量孔板中加入质控样品IL-6，并于37℃下孵育30min，吸去微孔中液体，并使用PBS缓冲液洗涤多次，得到捕获抗体-抗原免疫复合物；

S3、继续向微量孔板中加入生物素化单克隆检测抗体，并于37℃下孵育30min，吸去微孔中液体，使用PBS缓冲液洗涤多次，得到捕获抗体-抗原-生物素化检测抗体免疫复合物；

S4、继续向微量孔板中加入DNA标准工作液，并于37℃下孵育30min，吸去微孔中液体，并使用PBS缓冲液洗涤多次，得到捕获抗体-抗原-生物素化检测抗体免疫复合物；

S5、将步骤S4所得微量孔板进行PCR扩增，对PCR扩增后产物进行荧光信号检测，确定待检测样本中抗原的含量。

实施例2

所使用的质控样品为cTnI，其他同实施例1，

对照例1

不采用DNA标准工作液，其他与实施例1基本完全相同；

其中，DNA连接的具体方法为：

将生物素分子连接检测抗体，之后与亲和素混合，最后再与生物素化DNA混合，最终形成检测抗体偶联DNA标记的免疫复合物。

对照例2

不采用DNA标准工作液，其他与实施例2基本完全相同；

其中，DNA连接的具体方法为：

将生物素分子连接检测抗体，之后与亲和素混合，最后再与生物素化DNA混合，最终形成检测抗体偶联DNA标记的免疫复合物。

对照例3

采用申请号为202111063586.2，名称为《一种检测芯片、设备及方法》的中国发明专利公开的方法对质控样品IL-6进行检测，具体方法如下：

S1、待检测样本从第一进样口进入第一反应区，待检测样本中的抗原与预埋在第一反应区的第一抗体进行特异性结合形成抗原抗体对，其中，预埋的第一抗体上标记有DNA片段；

S2、抗原抗体对进入第二反应区，接枝于第二反应区的第二抗体捕获抗原抗体对，形成双抗夹心；

S3、对双抗夹心进行PCR扩增；

S4、对PCR扩增后产物进行荧光信号检测，以确定待检测样本中抗原的含量。

对照例4

采用常规免疫PCR检测方法对质控样品cTnI进行检测，具体操作步骤为：

（1）加样：取足够数量的微孔板（包被有单克隆抗体），固定于框架上，分别加入50μl校准品及待测样本，记录各孔位置，用封板膜覆盖，37℃温育30min；

（2）洗板：吸干孔内液体，每孔加入350μl洗液，每次洗涤间隔5-10s，重复冲洗5次，最后在干净的吸水纸上拍干；

（3）加未纯化的DNA标记工作液：每孔加入100μl未纯化的DNA标记工作液，用封板膜覆盖，37℃温育30min；

（4）洗板：吸干孔内液体，每孔加入350μl洗液，每次洗涤间隔5-10s，重复冲洗5次，最后在干净的吸水纸上拍干；

（5）PCR反应：YBR Green1染料10ul，上游引物1ul ，下游引物 1ul， dNTP1ul ，Taq聚合酶2ul ，ddH₂O 30ul，总体积 50ul震荡混匀；将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃，2分钟预变性，然后按93℃，1min，55℃，1min，72℃，1min，共40做个循环，最后72℃，7min延伸；

（6）根据标准曲线可计算出待检样本的浓度值。

表1 实施例1、对照例1和对照例3的检测结果

表2 实施例2、对照例2和对照例4的检测结果

结合实施例1-2及对照例1-2、4的结果可知，采用本发明的DNA标准工作液进行单分子检测，检测结果明显优于采用常规方法的对照组，这是因为DNA标准工作液中一个链霉亲和素与一个生物素偶联的DNA分子结合，均一性强，在检测过程中信号值会与待测物的浓度呈较强的相关性（CV均低于5%）；但是对照例1-2及4常规工作液会存在一个链霉亲和素与多个生物素偶联的DNA分子结合的结构，进而导致溶液异质性强，最终在检测过程中会出现信号值不够稳定，且重复性差的现象（CV 都超过10%）。

结合实施例1及对照例3的结果可知，在本实施例1的捕获抗体-抗原-生物素化检测抗体免疫复合物以及捕获抗体-抗原-生物素化检测抗体-DNA免疫复合物的制备过程中均为原位反应，整个过程无转移过程，有效确保了反应的准确性和完全性。

需要注意的是，本发明实施例中设定的检测范围为10-10000pg/mL，并研究了该范围内的线性相关系数，但并不意味着检测下限只能达到10pg/mL，检测上限只有10000pg/mL。

综上，本发明的检测技术可检测到极微量的生物标志物，其检测范围宽、灵敏度高、精密度好。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、以单克隆捕获抗体包被微量孔板，得到包被微量孔板；

S2、向微量孔板中加入待测样本，得到捕获抗体-抗原免疫复合物；

S3、继续向微量孔板中加入生物素化单克隆检测抗体，得到捕获抗体-抗原-生物素化检测抗体免疫复合物；

S4、继续向微量孔板中加入DNA标准工作液，得到捕获抗体-抗原-生物素化检测抗体-DNA免疫复合物；

S5、将步骤S4所得微量孔板进行PCR扩增，并对PCR扩增后产物进行荧光信号检测，以确定待测样本中抗原的含量；

步骤S4具体包括：继续向微量孔板中加入DNA标准工作液，并于37℃下孵育30min，吸去微孔中液体，并使用PBS缓冲液洗涤多次，得到捕获抗体-抗原-生物素化检测抗体免疫复合物；

所述DNA标准工作液为亲和素偶联生物素化DNA的溶液；

其中，所述亲和素偶联生物素化DNA的制备方法包括：以生物素标记的引物对对质粒DNA进行扩增，得到生物素化DNA；将相对过量的亲和素溶液快速搅拌，向其中缓慢滴加入生物素化DNA溶液，反应得到复合物；采用分子筛层析法对复合物进行层析分离，得到一个亲和素分子与一个生物素化DNA分子相结合的亲和素偶联生物素化DNA。

2. 根据权利要求1所述的双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法，其特征在于，步骤S1具体包括：使用PBS将捕获抗体稀释至1 ug/mL，配制得到包被液，向微量孔板的管孔中加入100μL包被液进行包被，将包被好的微量孔板于2-8℃下保存18-24h，并依次进行洗涤、封闭和干燥，得到包被微量孔板。

3.根据权利要求1所述的双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法，其特征在于，步骤S2具体包括：向微量孔板中加入待测样本，并于37℃下孵育30min，吸去微孔中液体，并使用PBS缓冲液洗涤多次，得到捕获抗体-抗原免疫复合物。

4.根据权利要求1所述的双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法，其特征在于，步骤S3具体包括：继续向微量孔板中加入生物素化单克隆检测抗体，并于37℃下孵育30min，吸去微孔中液体，并使用PBS缓冲液洗涤多次，得到捕获抗体-抗原-生物素化检测抗体免疫复合物。

5.根据权利要求4所述的双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法，其特征在于，所述生物素化单克隆检测抗体为使用N-羟基丁二酰亚胺酯标记的单克隆检测抗体。

6. 根据权利要求1所述的双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法，其特征在于，所述层析分离时，使用柱状分子筛，且固定相为葡聚糖凝胶Sephadex G-200。

7.根据权利要求1所述的双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法，其特征在于，所述亲和素和所述生物素化DNA的摩尔比为（1.8-2.5）：1，且所述亲和素溶液和所述生物素化DNA溶液的体积比为（1.8-2.5）：1。

8.根据权利要求1所述的双抗体介导的PCR检测微量生物标志物的方法，其特征在于，步骤S5中，抗原的含量通过原始模板DNA的拷贝数得出。