DE2905433A1

DE2905433A1 - Verfahren zur bestimmung von antigenen und antikoerpern

Info

Publication number: DE2905433A1
Application number: DE19792905433
Authority: DE
Inventors: Shinichiro Matsumoto; Shiro Morita; Masanobu Sawai; Tadamitsu Sudo
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1978-02-16
Filing date: 1979-02-13
Publication date: 1979-08-30
Also published as: GB1598532A; JPS54109494A; FR2417770B2; DE2905433C2; FR2417770A2; US4313929A

Description

darin, ein einfaches und präzises Verfahren anzugeben, mit dem es gelingt, Antigene und Antkörper quantitativ zu bestimmen.

Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst, das darin besteht, ein Antigen oder einen Antikörper oder eine Mischung davon mit dem entsprechenden Antikörper und/oder Antigen, der bzw. das auf unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μπι vorliegt bzw. an diese Trägerteilchen fixiert ist, in einem flüssigen Medium umsetzt, die erhaltene Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,8 bis 2,4 μπι an einem oder mehreren Zeitpunkten nach Beginn der Reaktion bestählt oder belichtet und die Intensität des durch die Reaktionsmischung gestreuten Lichtes mißt.

Von der Anmelderin wurden bereits Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern vorgeschlagen, gemäß denen die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung gemessen wird statt, wie im vorliegenden Falle, die Intensität des gestreuten Lichtes (siehe die DE-OS 27 3 6 805 (bzw. die

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japanische Patentanmeldung Nr. 97158/76) und zwei weitere japanische Patentanmeldungen, die am 14. Februar 1978 von der Anmelderin und der Firma Teikoku Hormone Mfg. Co.Ltd. angemeldet wurden). 5

Das erfindungsgemäß angewandte Licht besitzt eine Wellenlänge im Bereich, von 0,8 bis 2,4 μπι, das in den nahen Infrarotbereich oder einen Teil des sich unmittelbar daran anschließenden sichtbaren Bereiches fällt. Von dem Licht aus dem oben angegebenen Wellenlängenbereich ist besonders bevorzugt das Licht des nahen Infrarotbereiches mit einer Wellenlänge im Bereich von 1,0 bis 1,8 μπι.

Es hat sich nunmehr gezeigt, daß, wenn man ein Antigen und/oder einen Antikörper, das bzw. der in einer ■~ Probe vorliegt, mit dem entsprechenden Antikörper und/oder Antigen, der bzw. das auf Mikroteilchen aus einem unlöslichen Trägermaterial mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μια, der vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 1 μπι und noch bevorzugter im Bereich von 0,2 bis 0,8 μπι liegt, umsetzt, um eine Agglutination der Mikroteilchen zu bewirken, und die erhaltene Reaktionsmischung mit Licht aus dem oben angegebenen nahen Infrarotbereich bestraht, dessen Wellenlänge um einen Faktor von mindestens 1,5 und noch bevorzugter von mindestens 2 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, die Intensität des durch die oder von der Reaktionsmischung gestreuten Lichtes in guter Abhängigkeit mit dem Fortschreiten der durch die Antigen-Antikörper-Reaktion verursachten Agglutination zunimmt. Somit ist es erfindungsgemäß wesentlich, die Wellenlänge des angewandten Lichtes und den durchschnittlichen Durchmesser der Trägerteilchen in

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— 5 —

geeigneter Weise derart auszuwählen, daß eine bestimmte Korrelation zwischen der Konzentration eines bestimmten Antigens oder Antikörpers oder einer Mischung davon {einschließlich des daraus gebildeten Reaktionsprodukts) in einer Probeniösung und der Intensität des durch die Reaktionsmischung gestreuten Lichtes erreicht wird.

Wenn ein Lichtstrahl auf einen halbtransparenten Körper fällt, wird ein Teil des Lichtes gestreut, während ein Teil des Lichtes absorbiert und ein Teil des Lichtes durchgelassen werden. Wenn I für die Intensität des einfallenden Lichtstrahls, I für die Intensität des gestreuten Lichtes, ϊ₌ für die Intensität des absorbierten Lichtes und I_fc für die Intensität des durchgelassenen Lichtes stehen, so besteht, folgende Beziehung?

20

Da bei dem erfindungsgemäß angewandten System die

Absorption des Lichtes weitgehend vernachlässigt werden kann, kann die Gleichung 1 wie folgt geschrieben werden:

²⁵ 1=1+1"- i2)

Wenn der einfallende Lichtstrahl auf Mikroteilchen fällt, die in einer transparenten Flüssigkeit suspendiert sind, wie es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Fall ist₇ wird das Licht in sämtliche Raumrichtungen gestreut. Der Teil des gestreuten Lichtes, der nach vorne gestreut wird, das heißt in der Richtung des einfallenden Lichtes gestreut wird, vereinigt sich mit dem tatsächlich durchgelassenen Licht und ergibt damit das scheinbar durchgelassene Licht. Die Intensi-

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— & —

tat dieses scheinbar durchgelassenen Lichtes variiert mit dem Fortschreiten der Antigen-Antikorper-Reaktion, wie es genauer in den oben angesprochenen Anmeldungen der Anmelderin beschrieben ist.
5

Die vorliegende Erfindung betrifft nun die Messung der restlichen Komponenten des gesamten gestreuten Lichtes ausschließlich der Komponente, die parallel zu dem einfallenden Lichtstrahl gestreut wird iwobei die Inten- sität dieser parallelen Komponente als IJ" bezeichnet wird) das heißt mit anderen Worten des Lichtes, das in eine andere Sichtung als die des einfallenden Lichtstrahles gestreut wird (wobei die Intensität dieses Lichtes mit I' bezeichnet wird). Natürlich gilt

T5 hierbei die folgende Gleichung:

ⁿ Erfindungsgemäß geeignete unlösliche Trägertelichen schließen Mikroteilchen aus organischen Polymeren, die im wesentlichen in den für die erfindungsgemäße Messung verwendeten flüssigen Medium unlöslich sind und die einen durchschnittlichen Durchmesser innerhalb des oben angegebenen Bereiches aufweisen, beispielsweise Latices von organischen Polymeren, wie Polystyrol und Styrol-Butadien-Copolymere , die man durch Emulsionspolymerisation erhält; dispergierte Kokkenbakterien, wie Staphylokokken und Streptokokken, Bacillus prodigiosus, Sickettsia, Zellmembranfragmente etc.; sowie Mikroteilchen von anorganischen Oxiden, wie Siliciumdioxid, Siliciumdioxid-Aluminiumoxid und Aluminiumoxid,und feinpulverisierte Mineralien, Metalle und dergleichen ein.

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Erfindungsgemäß wird ein Antikörper oder ein Antigen, der mit dem Antigen und/oder dem Antikörper in der zu bestimmenden Probe reagiert, an den oben erwähnten unlöslichen Trägerteilchen, beispielsweise Latexteil-5 chen, fixiert (um das Trägermaterial zu sensibilisieren) Für diesen Zweck kann man den Antikörper oder das Antigen physikalisch und/oder chemisch an dem Träger adsorbieren oder fixieren.

Antikörper bestehen aus Proteinen, während Antigene

aus einem Vertreter einer Reihe von Substanzen bestehen, die beispielsweise Proteine, Polypeptide, Steroide, Polysaccharide, Lipide, Pollen, Staub und dergleichen einschließen. Es wurde bereits eine Reihe von Methoden

vorgeschlagen, um diese Antikörper oder Antigene und

insbesondere Antikörper auf unlöslichen Trägerteilchen festzulegen oder zu fixieren.

Wenn ein unvollständiges Antigen, insbesondere ein
Hapten, auf unlöslichen Trägermaterialien fixiert

werden soll, ist es vorteilhaft, die Trägermaterialien chemisch zu modifizieren, beispielsweise mit Hilfe
eines Kupplungsmittels, und anschließend das Antigen
chemisch an das modifizierte Trägermaterial zu binden.

25

Erfindungsgemäß kann man die unlöslichen Trägerteilchen (beispielsweise die Latexteilchen), die mit einem Antikörper oder einem Antigen sensibilisiert worden sind (welche Teilchen nachstehend als "sensibilisierte

Trägerteilchen¹¹ bezeichnet werden) in Form einer Suspension verwenden, die diese Teilchen in einer relativ hohen Konzentration von mindestens 0,05 Gew.-%,
vorzugsweise von 0,1 bis 1 Gew.-% und noch bevorzugter von 0,2 bis O,6 Gew.-% enthält, um solche Bedingungen zu schaffen, daß das Antigen oder der Antikörper in

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der Probe möglichst aktiv mit den sensibilisierten Trägerteilchen reagieren kann. Weiterhin kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Reaktion zwischen der das Antigen oder den Antikörper enthaltenden Probe und den sensibilisierten Trägerteilchen unter nichtruhenden Bedingungen durchgeführt werden. Für diesen Zweck ist es von Vorteil, die Reaktion unter Bewegen der Reaktionsmischung durchzuführen, was beispielsweise durch Rühren oder Schütteln erreicht wird.

Die erfindungsgemäße Antigen-Antikörper-Reaktion wird in einem flüssigen Medium, vorzugsweise in Wasser oder einer Mischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Aceton etc. durchgeführt.

Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man eine ein Antigen oder einen Antikörper enthaltende Probenlösung, die verdünnt oder konzentriert

20 sein kann, mit einer Suspension unlöslicher Trägerteilchen, auf denen der entsprechende Antikörper oder das entsprechende Antigen vorliegt, umsetzen, um hierdurch die Agglutination der Teilchen zu bewirken. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Proben-

lösung, die den zu bestimmenden Antikörper oder das zu

bestimmende Antigen enthält, zunächst mit dem entsprechenden Antigen oder Antikörper umgesetzt, wonach die erhaltene Reaktionsmischung mit einer Suspension unlöslicher Trägerteilchen, auf denen der entsprechende Antikörper

oder das entsprechende Antigen vorliegt, umgesetzt wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die in dieser Weise erhaltene Reaktionsmischung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge zu einem oder mehreren Zeltpunkten nach Beginn der Reaktion belichtet und es wird die

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Intensität des von der oder durch die Reaktionsmiscnung gestreuten Lichtes zur Bestimmung des Antigens oder des Antikörpers in der Probe gemessen.

5 Die Erfindung sei im folgenden anhand der beigefügten , Zeichnungen näher erläutert.

In den Äeichnusgen zeigen^

Fig. 1 eine Kurve, die die änderung der Intensi- *° tat des gestreuten Lichtes in Abhängigkeit

von der Zeit wiedergibt, wenn man die Reaktionsmischung aus einer Standarä-Fibrinogen-Lösung mit einer Konzentration von 2,0 7xg/ml und einer Mischung von Poiystyroilatices mit durchschnittlichen Teiichendurcnmessern von O,091 und 0,220 pm, die mit Antifibrinogen-Antikörpern sensibilisiert worden sind, mit Licht mit einer Wellenlänge tos A: ί,Ο μΐίι _t Bi 1,1 pm und C: 1,25 pm bestrahlt;

Fig 2 eine der in der Flg. 1 dargestellten Kurve ähnliche Kurve, die unter Verwendung einer Standard-Fibrinogen-Lösung mit einer Konzentration von O,S pg/ml aufgezeichnet wurde;

Fig. 3 eine Kurve, die die Änderung der Intensität des gestreuten Lichtes in Abhängigkeit von der Zeit wiedergibt/ wenn man Reak-

30 tionsmischungen von Standard-Fibrinogen-

Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen und einem Antifibrinogen-sensibilisierten Latex {anti-Fg-sensitized latex) mit Licht mit einer Wellenlänge von 1 ,25 μπι be-

35 strahlt;

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- ίο -

Fig. 4 eine Kurve., die die aus den Daten der Fig. 3 ermittelte Beziehung zwischen der Geschwindigkeit der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes und-der Konzentration der

Standard-Fibrinogen-Lösung wiedergibt;

Fig. 5 eine Eichkurve,, die die Beziehung

zwischen der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes zwei Minuten nach Beginn der Reaktion und der Fibrinogen-Konzentration wiedergibt, die durch Belichten der Reaktiöns-

mischung von Standard—Fibrinogen-

15

Losungen unterschiedlicher Konzentrationen und einem Antifibrinogensensibilisierten Latex mit LiGht mit einer Wellenlänge von 1,25 jam ermittelt wurde; und
Fig. 6 eine Eichkurve, die die Beziehung

zwischen der Zeit, die für einen Anstieg der Intensität des gestreuten Lichtes um 1O% erforderlich ist _t und

der Fibrinogen-Konzentration wieder-

25

gibt, die durch Bestrahlen einer

Reaktionsmischung aus Standard-Fibrinogen-Losungen unterschiedlicher Konzentrationen omd Einern Antifibrinogen-sensibilisierten Latex mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,25 iim ermittelt worden ist*

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In der Praxis kann das erfindungsgemäße Verfahren gemäß einer der nachstehenden Verfahrensweisen durchgeführt werden:

A) Aus einer Standardprobe, die eine bekannte Menge
eines Antigens und/oder eines Antikörpers enthält, bereitet man durch Verdünnen der ursprünglichen
Standardprobe unter Anwendung verschiedener Verdünnungsfaktoren eine Reihe von verdünnten Standardproben. Jede der verdünnten und der unverdünnten
Standardproben wird mit unlöslichen Trägerteilchen umgesetzt, die mit einer definierten Menge des
entsprechenden Antikörpers oder Antigens sensibilisiert worden sind. Die Reaktion wird während einer

gegebenen Zeitdauer (beispielsweise von wenigen

1 ζ

Minuten bis zu 2 Stunden) unter vorbestimmten Bedingungen, beispielsweise bei Raumtemperatur, fortgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt wird die Intensität
des durch die Reaktionsmischung gestreuten Lichtes gemessen. Aus den in dieser Weise erhaltenen Zahlenwerten wird eine Eichkurve A ermittelt, die die
Beziehung zwischen der Menge (der Konzentration) des Antigens oder des Antikörpers in der Standardlösung und der Intensität des gestreuten Lichtes für die
besondere Kombination aus dem Antigen und/oder dem Antikörper und den sensibilisierten Trägerteilchen wiedergibt. Anschließend wird eine unbekannte Probe unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen, wie sie für die Ermittlung der Eichkurve A angewandt
wurden, mit den gleichen sensibilisierten Trägerteilchen umgesetzt. Nachdem die gleiche Reaktionszeit abgelaufen ist, wird die Intensität des durch die Reaktionsmischung gestreuten Lichtes gemessen und mit der Eichkurve A verglichen, wodurch die Menge (oder die Konzentration) des Antigens und/oder des Antikörpers in der unbekannten Probe festgestellt werden kann.

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B) Es ist weiterhin möglich, eine andere Art von Eichkurve B zu ermitteln, die die Beziehung zwischen der Reaktionszeit (die sich von einigen Sekunden bis 10 Minuten bei Raumtemperatur erstrecken kann), die dafür erforderlich ist, daß die Intensität des gestreuten Lichtes einen bestimmten Wert erreicht, und der Menge (oder der Konzentration) des Antigens oder des Antikörpers in der Standardprobe wiedergibt. Dann wird in ähnlicher Weise unter den gleichen Bedingungen, wie sie für die Ermittlung der Eichkurve angewandt wurden,eine unbekannte Probe mit den gleichen sensxbilisierten Trägerteilchen umgesetzt. Die Bestimmung der Menge oder der Konzentration des Antigens und/oder des Antikörpers in der unbekannten Probe kann dadurch erreicht werden, daß man die Zeit mißt, die dazu erforderlich ist, daß die Intensität des von der Reaktionsmischung gestreuten Lichtes den gleichen Wert erreicht, und diese Zeit mit der Eichkurve B vergleicht.

C) Eine Standardprobe, die eine bekannte Menge eines Antigens und/oder eines Antikörpers enthält, wird zur Bildung einer Reihe von verdünnten Standardproben unter Anwendung verschiedener Verdünnungsfaktoren verdünnt. Jede dieser verdünnten und unverdünnten Proben wird unter vorbestimmten Bedingungen mit unlöslichen Trägerteilchen, die mit einer definierten Menge des entsprechenden Antikörpers oder Antigens sensibilisiert worden sind, umgesetzt, worauf die Intensität des gestreuten Lichtes an zwei oder mehreren Zeitpunkten in einem solchen Stadium gemessen wir<J, in dem die Reaktion der Mischung stetig verläuft und die Intensität des von der Reaktionsmischung gestreuten Lichtes kurz nach Beginn der Reaktion erstmals annähernd

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stetig zunimmt (das heißt mindestens 2 bis 3 Sekunden und vorzugsweise mindestens 5 Sekunden nach Beginn der Reaktion). Aus den in dieser Weise erhaltenen Zahlenwerten ermittelt man die Eichkurve C₁ die die Beziehung zwischen der

Menge (oder der Konzentration) des Antigens oder des Antikörpers in der Probe und der Geschwindigkeit der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes pro Zeiteinheit wiedergibt _Ψ für die besondere Kombination aus dem Antigen und/oder dem

Antikörper und den sensibilisierten Trägerteilchen. Anschließend wird eine unbekannt Probe unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen, wie sie für die Ermittlung der Eichkurve C angewandt wurden, mit den gleichen sensibilisierten

Trägerteilchen umgesetzt, worauf die Geschwindigkeit der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes pro Zeiteinheit in im wesentlichen gleicher Weise festgestellt wird.. Durch Vergleichen des in dieser Weise erhaltenen Wertes mit

der Eichkurve C ist es möglich, die Menge oder die Konzentration des Antigens und/oder des Antikörpers in der unbekannten Probe festzustellen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man die Intensität des gestreuten Lichtes mit einer integrierenden Kugel (integrating sphere), wie sie für die spektroskopische Analyse üblicher emulgierbarer Proben eingesetzt wird, deren Fläche der inneren Oberfläche schwarz gestrichen ist, den der auf die Probenzelle gerichtete einfallende und davon <lurchgelassene Lichtstrahl direkt erreicht, messen. Alternativ kann man die Messung des gestreuten Lichts mit Hilfe einer üblichen Vorrichtung zur Bestimmung der Lichtstreuung bewirken.

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Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

1. Herstellung eines mit Antifibrinogen-Antikörpern

sensibilisierten Latexreagens¹ {Antifibrinogen-Latexreagens {Anti-Fg-Latexreagens)

2u 10 ml einer Lösung von Antihumanfibrinogen-Antikörpern (Anti-(humanfibrinogen-Fg-antikörpern)) in einem Glycinpuffer, die 2 mg/ml Fibrinogen enthält, gibt man 0,5 ml eines Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von O₇OSU ji.m (mit einem Feststoffgehalt von 10 Gew.-%₇ der von der Firma Dow Chemical Company erhältlich ist) und O,5 ml eines weiteren Polystyrollatex mit einem durchschnittliehen Teilchendurchmesser von 0,220 μπι {mit gleichem Feststoff gehalt und gleicher Herkunft). Man rührt die Mischung während 30 Minuten bei Raumtemperatur, erwärmt dann auf 40°C und rührt während weiterer 30 Minuten bei dieser Temperatur. Nachdem man die Reaktionsmischung unter Kühlen auf 2 bis 4⁰C während 50 Minuten bei 12000 min zentrifugiert hat, dekantiert man den Niederschlag ab und suspendiert die isolierten Latex-

teilchen, die mit dem Antifibrinogen-Antikörper sensi-

bilisiert sind, in einer 0,2 gew.-%igen Lösung von Rinderserumalbumin unter Bildung eines Antifibrinogensensibilisierten Latexreagens', das 0,5 Gew.-% der sensi-, bilisierten Latexteilchen enthält*

2. Umsetzung des Antifibrinogen-sensibilisierten Latex' mit Fibrinogen-Antigen

"Zu 0,2 ml des gemäß Abschnitt 1 bereiteten Antif ibrinogen-sensibilisierten Latexreagens¹ gibt man 0,2 ml einer

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Standard-Fibrinogen-Lösung mit einer Konzentration von 2 μg/ml in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, und mischt gut durch. Die erhaltene Mischung überführt man in eine Zelle mit einer Dicke von 2 mm, einer Breite von 10 mm und einer Länge von 40 mm und bestrahlt sie mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,0, 1,1 bzw. 1,25 μτα. Während der Bestrahlung mißt man die Änderung der Intensität des gestreuten Lichtes in Abhängigkeit von der Zeit mit einem Spektrophotometer (Hitachi 340), der mit einer Probenhalterung (Hitachi 340-0702) einer integrierenden Kugel und einem PbS-Detektor ausgerüstet ist. Anstelle des weißen Vergleichskartons ordnet man in dem Bereich der Kugel, die der Probenzelle gegenüberliegt, ein mit schwarzer Farbe beschichtetes Filterpapier an. Die Vergleichszelle (die eine Dicke von 2 mm aufweist) enthält ein gleiches Volumen der Mischung aus dem sensibilisierten Latexreagens und der isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin

20 enthält (welche Mischung nachfolgend als "Blindprobe" bezeichnet wird), wobei in dem Bereich gegenüber der Vergleichszelle der weiße Vergleichskarton belassen wurde.

25 Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. 1 der Zeichnungen dargestellt. Die auf der Ordinate der Fig. 1 aufgetragene Intensität des gestreuten Lichtes steht für das Verhältnis I_/I_ in Prozent, wobei

S O

I für die mit der oben beschriebenen Vorrichtung gemessene Intensität des gestreuten Lichtes, wenn beide Zellen, nämlich die Probenzelle und die Vergleichszelle, die Blindprobe enthalten, und I für die gemesse-

ne Intensität stehen, wenn die Probenzelle die tatsächliche, Fibrinogen-Antigen enthaltende Reaktions-35 mischung enthält.

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Man wiederholt die oben beschriebene Verfahrensweise unter Verwendung einer anderen Standard-Fibrinogen-Lösung mit einer Konzentration, von 0,5 μg/πιl und erhält die in der Fig. 2 dargestellten Ergebnisse. 5

In den Fig. 1 und 2 stehen die Kurven A, B und C für die Ergebnisse, die man bei Wellenlängen von 1,0, 1,1 bzw. 1,25 μπι erhält. Aus den Fig. 1 und 2 ist ersichtlich, daß man günstige Ergebnisse erzielt, wenn man einfallendes Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 1 μπι, vorzugsweise mindestens 1 ,2 μΐη zur Messung der Intensität des gestreuten Lichtes verwendet, und daß die Intensität des gestreuten Lichtes in Abhängigkeit von der Konzentration des Antigens variiert.

Beispiel 2

1. Ermittlung der Eichkurve

Zu O,2 ml eines Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens', das in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise bereitet worden ist, gibt man jeweils 0,2 ml der Standard-Fibrinogen-Lösungen (in der in Beispiel 1 beschriebenen isotonischen Natriumchloridlösung) mit __ den in der nachstehenden Tabelle I angegebenen Konzentrationen und mischt gut durch.

Anschließend mißt man die Intensität des gestreuten Lichtes bei einer Wellenlänge von 1,25 μΐπ nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 und zeichnet die Änderung der Intensität des gestreuten Lichtes in Abhängigkeit von der Zeit kontinuierlich auf. Dxe hierbei aufgezeichneten Kurven sind in der Fig. 3 dargestellt, wobei die Kurven Ä_f B, C, D, E und F Fibrinogen-Konzentrationen _a5 von a_e06Z5* σ,250, 0_t5Q0, 1_P0G> 2,OO bzw. 4»OO pg/ittl

entsprechen und wobei die auf der Ordinate aufgetragene

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Einheit identisch der in Beispiel 1 beschriebenen ist. Auf jeder Kurve zieht man links ihres annähernd geraden Abschnittes, der in dem frühesten Stadium nach Beginn der Reaktion auftritt, eine Gerade. Aus dem Anstieg der in dieser Weise gebildeten Geraden ermittelt man die Geschwindigkeit der Änderung (der Zunahme) der Intensität des gestreuten Lichtes pro Zeiteinheit und trägt diesen Wert auf der Ordinate gegen die auf der Abszisse aufgetragene Konzentration des Antigens auf. In dieser Weise erhält man die in der Fig. 4 dargestellte Eichkurve.

Tabelle I 15

20

Fibrinogen-Konzentration ^g/ml)	Geschwindigkeit der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes (%/min)
O,0625	0,12
0,250	O, 29
0,50	0,51
1,00	0,87
2,00	1,29
4,00	1,57

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Man kann die Fibrinogenmenge in unbekannten Proben mit Hilfe der in der obigen Weise ermittelten Eichkurve wie folgt bestimmen:

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2. Bestimmung von Fibrinogen in unbekannten Proben

Man entnimmt einem Patienten Blut oder Urin, wobei man dann, wenn es sich bei der Probe um eine Blutprobe _ handelt, das Serum in üblicher Weise abtrennt. Erforderlichenfalls wird die Probe dann um den in der nachstehenden Tabelle II angegebenen Faktor verdünnt. Unter Anwendung der in dem obigen Abschnitt 1 angegebenen Verfahrensweise vermischt man 0,2 ml der unverdünnten oder verdünnten Probe mit 0,2 ml des gemäß Abschnitt 1 von Beispiel 1 bereiteten Antifibrinogen-Latexreagens und bestrahlt die erhaltene Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,25 μπι, um die Geschwindigkeit der Zunahme der Intensität des

.- gestreuten Lichtes zu messen. Dann liest man auf der gemäß Abschnitt 1 ermittelten Eichkurve den der beobachteten Geschwindigkeit der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes entsprechenden Wert der Fibrinogen-Konzentration ab. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse -. sind in der Tabelle II zusammengestellt.

Zu Vergleichszwecken enthält die Tabelle II auch die Zahlenwerte, die man mit Hilfe des üblichen Radioimmuntests (RIA-Methode) (S.M.Ratkey et al, Brit.J.Haematol.

30 (1975) 145 bis 149) und der üblichen Objektträgermethode (Fujimaki, Tamura und Takahashi, Rinsho Kagaku (Clinical Science) Japan, 12 (1976) 507 und Fujimaki, Ikematsu, Takeuchi und Kato, Rinsho Byori (Japanese Journal of Clinical Pathology, 21 (1973) S73) ermittelt hat.

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	1	Unbekannte Probe	Verdunnungs-	Tabelle 11	Fibrinogen-Kbnzentratjxjn	RlÄ-^ethode	in der	I	Objekt träger methode
Patient;		Material	faktor	Geschwindigkeit	unbekannten Probe ^g/ml)	5,021 0,337 1,230	8,0 0,5 1,25
Nr.			χ 16 χ 1 χ 10	der Zunahme der	erfindungs gemäßes Verfahren
	Urin Il Serum.	Intensität des gestreuten Lichts (%/min)	4,96 0,27 1,20
0,37 0,34 0,185

CQ , Z

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Beispiel 3

Zu 0,2 ml eines nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 bereiteten Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens' gibt man jeweils 0,2 ml der Standard-Fibrinogen-Lösungen mit den in der nachstehenden Tabelle III angegebenen Konzentrationen, die nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 hergestellt würden, und mischt gut durch. Die erhaltene Mischung wird dann in die bei Beispiel 1 verwendete Probenzelle überführt und mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,25 μπι bestrahlt. Unter Verwendung einer Stoppuhr wird die Intensität des gestreuten Lichtes 2 Minuten nach Einbringen der Reaktionsmischung in die Zelle gemessen. Die nach 2 Minuten gemessene Intensität (I_) des gestreuten Lichtes wird auf der

Grundlage von I in die Zunahme ( Δ,} der Intensität umgerechnet, das heißt die Intensität des gestreuten Lichtes, die man beim Messen der in Beispiel 1 verwendeten Blindpröbe errechnet, wobei diese Zunahme Δ durch die folgende Gleichung wiedergegeben werden kann:

Δ = (Ι_β/Ι_η - 1) x 100

5 O

Die bei verschiedenen Konzentrationen der Standard-Fibrinogen-Lösung erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengestellt. Aus den in der Tabelle III angegebenen Zahlenwerten kann die in der Fig. 5 dargestellte Eichkurve ermittelt werden, die die Beziehung zwischen der Konzentration des Antigens (Fibrinogen) und der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes nach einer gegebenen Zeitdauer wiedergibt, unter Verwendung dieser Eichkurve ist es möglich, die Fibrxnogen-Konzentration in unbekannten Proben zu

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- 21 Tabelle III

Fibrinogen-Konzentration Zunahme der Intensität

des gestreuten Lichtes nach 2 Minuten (%}

0,0625	0/4
0,250	2/2
O,5O	4,0
1,00	7,2
2,00	11,6
4,00	12,6
Beispiel 4

15

Zu 0,2 ml des gemäß Beispiel 1 bereiteten Äntifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens¹ gibt man jeweils
0,2 ml der Standard-Fibrinogen-Lösungen, deren Konzentration in der nachstehenden Tabelle IV angegeben ^ ist und die in der in Beispiel 1 angegebenen Weise

hergestellt worden sind und mischt gut durch» Man überführt die erhaltene Mischung in die Probenzelle/ die in Beispiel 1 verwendet wurde, und bestrahlt sie mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,25 μπι. Unmittelbar danach beginnt man, die Intensität des gestreuten
Lichtes zu messen und ermittelt die Zeit, die dazu erforderlich ist, daß die Zunahme <Δ) der Intensität
des gestreuten Lichtes, wie sie in Beispiel 3 definiert ist, einen Wert von 1O% erreicht/ wozu man die Zeit mit Hilfe einer Stoppuhr von Beginn der Reaktion an mißt. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle IV und der Fig. 6 wiedergegeben. Unter Verwendung der in der Fig. 6 dargestellten Kurve ist es möglich, die Fibrinogen-Konzentration in unbekannten Proben zu bestimmen.

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- 22 Tabelle IV

Fibrinogen-Konzentration	Zeit bis zum Erreichen
^g/ml)	einer Zunahme der Inten
	sität des gestreuten
	Lichtes um 10% (min)
O₇ 250	1 ,020
0,500	500
1,00	340
2,00	200
4,00	160

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ι ^Λ ·♦ Leerseif e

Claims

PATENTANSPRUCH

Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antigen oder einen Antikörper oder ein Gemisch davon in einem flüssigen Medium mit dem entsprechenden Antikörper und/oder Antigen, der bzw. das auf unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μΐη vorliegt, umsetzt., die erhaltene Reaktionsmischung mit Licht mit einer

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ORIGINAL INSPECTED

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Wellenlänge im Bereich von 0,8 bis 2,4 μΐη an einem oder mehreren Zeitpunkten nach Beginn der Reaktion bestrahlt und die Intensität des durch die Reaktionsmischung gestreuten Lichtes mißt.

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