JP5268175B2 - 迅速に細胞の生存テストを実行するための方法及び構成物 - Google Patents
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Description
尚、本出願は、2006年1月12日に出願した米国仮特許出願第60/758,362号の優先権の利益を主張するものである。
本発明の好適な実施形態の説明が以下になされる。本発明の特定の実施形態は、単に説明を目的に挙げられるものであり、何ら本発明を限定するものではない。最初に本発明は広く説明され、全体的な説明がなされる。その後、いくつかの特徴について、より詳細な説明がなされる。本発明の構成及び方法の特徴並びに他の詳細は、請求の範囲にて更に記載されている。
他の特徴として、本発明は、生存細胞の存在或いは不存在を検知することに関する。この検知には、インピーダンス検知が用いられ、ストレス因子に対する細胞のストレス応答をモニタする。
更に他の特徴として、本発明は、選択された濃度の生物学的に活性を有する物からなるストレス因子に対する細胞の感受性及び生物学的に活性を有する物の選択された濃度における細胞のストレスレベルを判定する方法を提供する。この方法は、インピーダンス検知を用い、この判定を実行する。
生存細胞集団の成長は、細胞集団を構成する1若しくはそれ以上の細胞の増殖により決定される。この成長の間、細胞は、利用可能な栄養素を用いて、ATPやNADPH及びホスホエノールピルビン酸塩(PEP)の形態で、多くのエネルギを蓄積し、また、生物学的巨大分子(例えば、DNA、 RNA、タンパク質、脂質及び糖質など)を合成する。例えば、バクテリアの場合、これら要素全てが引き続き利用され、二分裂として知られるプロセスによって、2つの新たな娘細胞を作り出す。培養条件が好適に維持されると、両方の新たな細胞がこのサイクルを繰り返す。このことは常に増殖の間生じ、対数増殖と呼ばれる。
化学的な生物活性物及び生物学的な生物活性物の非限定的な一例が、本発明の一実施形態で用いられているが、これらには、治療剤及び薬剤が含まれる。例えば、抗菌剤、抗生物質、トロンビン阻害剤、抗血栓薬、血栓溶解剤、線維素溶解薬、血管痙攣阻害剤、カルシウムチャンネル遮断薬、血管拡張剤、降圧薬、表面糖タンパク質レセプタの阻害剤、抗血小板薬、抗有糸分裂薬、微小管阻害剤、分泌型抗体剤、アクチン阻害剤、リモデリング阻害剤、アンチセンスヌクレオチド、抗代謝物、抗増殖剤(抗血管形成剤など)、抗癌用化学療法薬、抗炎症ステロイド或いは非ステロイド系の抗炎症薬、免疫抑制剤、ホルモン、成長ホルモン抑制因子、成長因子、ドーパミン作動薬、放射線治療薬、ペプチド、タンパク質、酵素、細胞外マトリックス成分、ACE阻害剤、フリーラジカル捕捉剤、キレート剤、酸化防止剤、抗ポリメラーゼ剤、抗ウィルス薬、光線力学療法薬及び遺伝子治療薬を挙げることができる。
ストレス応答は一般的なものであり、任意の一細胞或いは微生物に特有のものではないことは重要である。したがって、本明細書に開示される手法は、全ての原核生物細胞又は真核性細胞に適用可能である。本明細書に開示される方法は特に、病原体の存在或いは不存在並びにある濃度の生物活性物(例えば、抗生物質)に対する病原体の感受性を判定するのに有用である。
本発明の一実施形態に係る方法に用いられるのに好適な培地は、細胞の生存に関与しない培地及びストレス応答を測定するのに十分な期間細胞の生存を支える培地から選択される。培地の選択は、細胞種並びに実行しようとするテストの性質によって定められる。好適な培地の例として、市販されている培養培地、水性培養液、ゲル及び寒天を主体とする培地を挙げることができる。好適な実施形態において、培地は導電性を有する。
環境的或いは工業的なサンプルの例として、水サンプル、化粧品サンプル、食品サンプル、薬剤サンプル或いはこれらに類するものの細胞の懸濁液を挙げることができる。
細胞増殖をモニタするための電気的インピーダンスの測定の使用方法は、非常に確立されたものである。この手法に用いる市販のシステムは、一般的には、導電率、キャパシタンス或いは全インピーダンス(抵抗要素及び反応要素の両方)を測定する。またこのシステムは、検知するのに十分な増殖を必要とする形状を用いる。バクテリアの場合には、これらシステムを用いての検知に必要とされる一般的な増殖閾値は、100万(106)CFU/ml或いはそれ以上である。バクテリアが、特に、低増殖種であるならば、高い滴定量を得るために、十分に時間を割かなければならない。
定められた一定の実験或いは単純な調整以上のことを必要とせずに、当業者は、本発明の実施形態にしたがって、ストレス応答を測定するキャパシタンスだけでなく、電気的な測定値のすべての表現形式(例えば、インピーダンス)を利用することができる。更には、電場の印加は様々な手法(任意の電圧及び/又は電流の組み合わせを利用)を用いて実行することが可能である。誘電体は、完全に非理想的な特性表現を含むことを意味し、インピーダンスの反応要素を制限するものではない。
(i)第1の標準値
第1の標準値は、第1の参照サンプルのインピーダンス応答を示すものである。第1の参照サンプルは、ストレス因子を備える培地又はストレス因子を備えない培地である。尚、第1の参照サンプルには、細胞は含まれない。
(ii)第2の標準値
第2の標準値は、第2の参照サンプルの初期インピーダンス応答を表すものである。尚、第2の参照サンプルは細胞と培地からなる。参照サンプル内の細胞は、テストサンプル内の細胞と同一種であり、且つ、同一濃度である。当該参照サンプルには、ストレス因子は含まれていない。上記段階(e)にて決定されたテストサンプルの初期インピーダンス応答のレベルと、第1の標準値及び/又は第2の標準値に基づいて、第1のインピーダンス応答分布の値が求められる。
熱衝撃を受けた後のバクテリアの代謝が、熱衝撃を受けていないバクテリアの細胞のそれとは有意に異なるものであることは知られている。この実施例において、ストレスからの回復期間の間におけるストレスを受けたバクテリア細胞からの初期インピーダンス応答の測定の能力が示される。第1に熱衝撃を受けていない大腸菌からの初期インピーダンス応答が測定された。ルリア・ベルタニ寒天(LBA: Luria-Bertani Agar)(Becton Dickinson Microbiology System社製(メリーランド州スパークス))上で一晩かけて形成された単一のコロニが滅菌ループを用いて回収され、TSB内で再懸濁された。1ミリリットル当たり約1,000コロニ形成ユニット(103CFU/ml)まで適切に希釈した後、この希釈液が一のインピーダンスカセットチャンバに直接的に導入された。尚、隣接するチャンバは、TSBのみで充填されている。カセットが、熱制御下にある分析器(摂氏37度(37℃)に保持)に挿入された。その後、完全インピーダンスベクトルが記録された。ここで示すデータにおいて、初期インピーダンス信号のキャパシタンス成分が分析された。インピーダンスベクトルの他の表示を分析することによっても、同様の効果が観察できる。
図3は、初期インピーダンス応答分布をグラフ表示したものであり、摂氏37度(37℃)におけるTSB中のストレスを与えられていない大腸菌(上側の曲線)と熱衝撃を受けた大腸菌(下側の曲線)に対するものである。
初期滴定量は、ストレスを与えられていない細胞に対して、5.6×103CFU/mlであり、熱ストレスをかけられた細胞に対して4.4×103CFU/mlであった。予測されたものと同様であるが、一般的な約1.5時間から2.0時間の遅延期遅れの後、ストレスを与えられていないバクテリアは増殖を開始し、対応してインピーダンス応答の値が増加している。一方で、熱衝撃を受けたバクテリアのインピーダンス応答は、反対の傾向を示す。特に、インピーダンス応答の瞬時且つ一定の減少が観察され、この減少は、データ取得開始から5時間続いた。したがって、第2のインピーダンス応答値の測定によって、ストレス下における、細胞の増殖(即ち、細胞分裂)の不存在を見出すことができる。尚、第2のインピーダンス応答値とは、2つの測定の統計学的不確実性を超えた量だけ第1の初期測定において記録された値より小さな応答値をいう。この実施例において、明確な初期応答値が30分以内に高い統計学的信頼度を以って認識可能である。このテストに要した経過時間は、この細胞種の集団倍加時間と同等の時間の範囲である。これら細胞が、ストレスによって引き起こされた細胞分裂停止状態にあるということを考慮に入れると、このことは、本発明の測定に必要とされる時間で、増殖の不存在を明らかにするという役割を担っていることを意味する。
本明細書に開示される方法は、細胞の存在或いは不存在を迅速に検知する方法である。この検知は、細胞が存在する場合には、細胞のストレス応答をモニタし、細胞が不存在或いは死滅している場合には、ストレス応答の不存在をモニタするものである。この方法は、(a)電圧及び/又は電流を好適にモニタ可能な条件下で、電場をテストサンプルに印加する段階を備える。テストサンプルは、細胞と培地からなる。更にこの方法は、(b)電圧及び/又は電流をモニタする段階を備える。この方法は更に、(c)ストレス因子がテストサンプルに影響を与えることを可能とする段階を備える。ストレス因子は、電場印加の前、電場印加と略同時、電場印加の後に与えられるストレス因子から選択される。この方法は、(d)特定の時間点或いは連続する一式の時間点にわたって、テストサンプルの初期インピーダンス応答を測定する段階を備える。テストサンプルの初期インピーダンスは、遷移期間におけるテストサンプルのインピーダンス変化である。尚、遷移期間は、電場印加をしたのと略同時点におけるテストサンプルの最初のインピーダンス測定から、ストレス応答或いは非増殖状態を指し示すテストサンプルのインピーダンスが後に測定されるまでの期間である。本発明の方法は、(e)各時間点におけるテストサンプルの初期インピーダンス応答のレベルを評価する段階を備える。各時間点におけるテストサンプルの初期インピーダンス応答のレベルは、細胞のストレス応答のレベルを指し示す。したがって、細胞が存在する場合には、ストレス因子に対する細胞のストレス応答をモニタすることが可能であり、細胞がテストサンプル中に存在しない場合や死滅している場合にはストレス応答の不存在がモニタされる。したがって、テストサンプル中の細胞の存在或いは不存在を迅速に検知可能である。この方法が、以下の説明のように、更に改良される。
サンプル中の細胞の迅速且つ特定の検知を説明する。データは、リンゴジュース中の大腸菌を捕捉し、検知することを示している。一連の実験において、故意に汚染させたリンゴジュース中の大腸菌の検知結果を比較した。尚、大腸菌の増殖及びストレス応答は直接的にモニタされた。図4は、実験手順の概略図である。10 ml体積の滅菌リンゴジュースに、約103CFU/mlの大腸菌O157:H7が混ぜられた(図4参照)。磁気ビード(Dynal Biotech社製(ノルウェー オスロ)が、大腸菌上の株に特異的な抗体で予めコーティング処理を施され、添加された(図4B参照)。
大腸菌(120 CFU/mlの混入量)の初期8時間の間、インピーダンス応答は記録された。この大腸菌は、混入されたリンゴジュースから回収されたものである。図8はインピーダンス応答を示す。測定の初期120分は、拡大して、同図に挿入され、拡大、再プロットされている。負の勾配を示す応答が、最初の30分間観察される。これは、より明確な増加信号が発生する前である。この負の信号は、「新たな培地」によるストレスを受け、生存しているが分裂をしていない細胞の生物学的作用と解釈することができる。典型的な微生物学において、バクテリアのこの増殖期間は、遅滞期或いは、新たな培養環境にバクテリアが適用するのに要する時間と呼ばれる。微生物の遅滞期は、非常に複雑であり、未だ完全に当該現象の理解がなされているわけではない。以下に2つの事実を述べる。
(1)ストレスを受けた細胞からのインピーダンス応答は、遅滞期におけるストレスを受けていない細胞からのインピーダンス応答と同様であること。
(2)最適な増殖環境に戻されたストレスを受けた細胞は、一層長い遅滞期を見せること。
本発明の感度に関する追加的な実施例を示す。
尿とTSB培地懸濁液の1:1V/V混合物中の145 CFU/mlの大腸菌接種材料が、一のチャンバ中でモニタされた。これとともに他のチャンバで、培地と尿の混合物がモニタされた。インピーダンス分布は、インピーダンス信号のそれぞれ2つの容量成分の算出された比であり、この分布は、図9に示される。また、図9には陰性対照(尿/培地のみを両チャンバに入れたもの)が示されている。図9は、バクテリア懸濁液中の遅滞期並びにその後の増殖を特徴付ける。
他の実施形態において、本発明は、選択された濃度の生物活性物に対する細胞の感受性に対する予測結果並びに生物活性物の選択された濃度における細胞のストレスの大きさを決定する方法を提供する。この方法は、(a)(i)特定の時間点或いは連続する一式の時間点にわたって、テストサンプルの初期インピーダンス応答を測定する段階を備える。テストサンプルは、細胞、培地並びに選択された濃度の生物活性物を備える。この方法は、更に、参照サンプルのインピーダンス応答を測定する段階を備える。参照サンプルは、培地と選択された濃度の生物活性物からなり、参照サンプルは、細胞を含むものではない。本発明の方法は、(ii)各時間点での第1のインピーダンス応答処理分布を決定する段階を備える。第1のインピーダンス応答処理分布は、各時間点における、段階(a)(i)で決定されたテストサンプルの初期インピーダンス応答と参照サンプルのインピーダンス応答の数学的比較である。本発明の方法は、(iii)必要に応じて、複数の選択された濃度の生物活性物に対して、段階(a)(i)と(a)(ii)を繰り返し、既知の生物活性物の異なる選択濃度それぞれについて、対応する第1のインピーダンス応答処理分布を得る段階を備える。
本発明の方法は、(b)(i)特定の時間点或いは連続する一式の時間点にわたって、第2のテストサンプルの初期インピーダンス応答を測定する段階を備える。第2のテストサンプルは、細胞と培地からなる。第2のテストサンプルには、生物活性物は含まれない。本発明の方法は、参照サンプルのインピーダンス応答を測定する段階を備える。この参照サンプルは培地からなるとともに細胞を含まない。本発明は、第1のインピーダンス応答未処理分布を算出する段階を備える。第1のインピーダンス応答未処理分布は、各時間点において、段階(b)(i)で決定された第2のテストサンプルの初期インピーダンス応答と、段階(b)(i)で決定された第2の参照サンプルのインピーダンス応答の数学的比較である。
本発明の方法は、(c)生物活性物の各選択された濃度に対して、正規化インピーダンス応答値NIRを決定する段階を備える。NIRは、アルゴリズムにより決定される数値である。アルゴリズムは、段階(a)(ii)及び/又は段階(a)(iii)で得られた第1のインピーダンス応答処理分布値を段階(b)(ii)で得られた第1のインピーダンス応答未処理分布値を間連づける。これにより、第1のインピーダンス応答未処理分布値が、NIRに組み込まれる。決定されたNIR値は、生物活性物の選択された濃度における細胞のストレスのレベルの定量化された測定値となる。
迅速な薬剤感受性テストの非限定的な例を以下に説明する。
上述の如く、感染したサンプルの培養に現在多くの時間を費やしている。なぜなら、生物学的構成要素の観察可能な増殖を発生させることには時間がかかるからである。このことは、迅速な薬剤抵抗性のテストにとって主要な障害である。増殖に依存する代わりに、上記されたインピーダンスを主体とする方法は当該障害を克服し、培養可能且つ製造可能であって、迅速には培養することができない生組織の薬剤への感受性を決定することができる。この方法は、抗菌性化合物への暴露時間の間与えられるストレスに対応する微小組織の初期インピーダンス応答をモニタすることにより行なわれる。遅い増殖性を有するバクテリア(ウシ結核菌BCG(M.bovis))をイソニアジド(INH)(Sigma-Aldrich社製 ミズーリ州セントルイス)に暴露し、感受性及び抵抗性株のインピーダンスデータをとり、この結果を本発明の説明に用いる。
これら曲線の各点は、異なる測定時間において細胞、培地、薬剤の懸濁液のキャパシタンス信号を培地と薬剤の混合物のキャパシタンス信号で除算した値である。これらデータが比として構成されているので、対照(コントロール)測定は、自動的に組み込まれるものとなり、実験背景からの影響は最小限化される。全体として、インピーダンス応答分布の勾配は、薬剤濃度が増加するにつれて低減する。増殖を比較すると、一層有意なストレス応答並びに対応する細胞生存率の低下が分かる。この傾向は、対応する平板法による計数によっても確認された。尚、この平板法は、各実験の終わりに実行された。
薬剤に対する感受性は、単一点の増殖の多数の試験或いは拡散勾配を介しての多数の薬剤希釈測定から、薬剤に対する感受性に関する情報が得られる。本明細書に説明される方法は、時間にわたって多数の測定からこの同一の情報を抽出するが、単一の薬剤濃度を用いる。図11にプロットされるデータは、薬剤濃度とインピーダンスから生ずるパラメータとの間の一対一の関係を示す。使用された実際の薬剤濃度に対してプロットされた測定された時系列データから生じたこのパラメータを計算することにより、薬剤に対する細胞の感受性を示す対応するストレスレベルを表すことができる。このことは、異なる細胞及び薬剤に対するアルゴリズム及びデータベース編集により達成される。
(実施例5:血中の微生物の検知)
複合試料マトリックス中で、効果的な方法を説明するために、ヒト濃縮血小板(PC)が異なる種のバクテリアに混ぜられ、BioSense社製のインピーダンス基板を用いて検知処理が行われた。複合試料を用いての作業には、追加的な考慮が必要とされる。例えば、血液の場合、血小板、残存する白血球細胞(WBC)及び赤血球細胞(RBC)が代謝活動をし、酸素及び/又はグルコースを消費する。これらは、バクテリアのストレス応答のインピーダンス測定に影響を与えることとなる。したがって、これらの細胞の存在は、最小限化される必要があり、これにより、感度の高い測定を保証可能となる。加えて、血液及び/又は他の細胞に埋設された細胞或いは、これら細胞の表面に付着したバクテリアは、遊離される必要がある。これにより、全てのバクテリアが検知され、誤った芳しくない結果を生じないことを保証できる。
(i)異なる種からの異なる代謝応答
(ii)バクテリア細胞数の変動
(iii)本研究で用いられたストレス因子に対する異なる感受性(影響の受けやすさ)
(iv)異なる信号ゲインを生ずるカセット間の機械的ばらつき
本発明は、特に好適な実施形態を参照して示され且つ説明されてきたが、当業者が、添付の請求の範囲で定められる本発明の技術的範囲から逸脱することなしに、形式や詳細部分の様々な変更を施すことは可能である。
Claims (25)
- ストレス因子に対する培地中に懸濁された細胞のストレス応答を迅速にモニタし、ストレス応答の大きさを判定する方法であって、
(a)電圧及び/又は電流をモニタするのに好適な条件の下、培地中に懸濁された細胞を備えるテストサンプル、又は懸濁された培養マイクロビーズ上に細胞を備えるテストサンプルに電場を与える段階と、
(b)前記電圧及び/又は前記電流をモニタする段階と、
(c)前記ストレス因子が前記テストサンプルに衝撃を与えることを可能とする段階を備え、前記ストレス因子は、電場を与える前に供給されるストレス因子、電場を与えるのと略同時に供給されるストレス因子及び電場を与えた後に供給されるストレス因子から選択され、
(d)前記方法は更に、前記テストサンプルの初期インピーダンス応答をモニタする段階を備え、前記テストサンプルの初期インピーダンス応答は、電場印加と略同時点の第1のインピーダンス測定からこの後測定される前記測定サンプルのインピーダンスがストレス応答或いは非成長を示す時点までの遷移期間における前記テストサンプルのインピーダンス変化であり、これにより、前記細胞の前記ストレス因子に対するストレス応答がモニタされ、
(e)前記方法は更に、前記テストサンプルの初期インピーダンス応答のレベルを判定する段階を備え、
前記テストサンプルの初期インピーダンス応答のレベルが、前記細胞のストレス応答の大きさを指し示し、これにより、前記ストレス因子に対する前記細胞の前記ストレス応答の大きさが判定されることを特徴とする方法。 - 前記段階(e)において判定される前記テストサンプルの初期インピーダンス応答のレベルを、
(i)ストレス因子を含む培地或いはストレス因子を含まない培地からなる第1の参照サンプルのインピーダンス応答を表す第1の標準値、
(ii)細胞と培地からなる第2の参照サンプルの初期インピーダンス応答を表す第2の標準値
と数学的に比較する段階を更に備え、
前記第1の参照サンプルは、前記細胞を含まず、
前記第2の参照サンプル内の細胞は、前記テストサンプル内の細胞と同一種且つ同濃度であり、
前記第2の参照サンプルは、前記ストレス因子を含まず、
前記方法は更に、前記テストサンプルの第1のインピーダンス応答分布に対する値を決定する段階を備え、
該第1のインピーダンス応答分布に対する値が、前記段階(e)で判定される前記テストサンプルの初期インピーダンス応答と前記第1の標準値及び/又は第2の標準値との数学的比較に基づくことを特徴とする請求項1記載の方法。 - 前記細胞が、原核生物細胞と真核性細胞から選択されることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記細胞に供給される前記ストレス因子が、既知の生物学的活性物への前記細胞の接触であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記既知の生物学的活性物が、薬学的に活性を有する物質、抗癌剤、生体毒素、ウィルス、ストレスを作り出すことが可能な他の物質並びにこれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 細胞が存在している場合のストレス応答或いは細胞が不存在或いは死滅している場合のストレス応答の不存在をモニタすることにより、前記細胞の存在或いは不存在を迅速に検知する方法であって、
(a)電圧及び/又は電流をモニタするのに好適な条件の下、培地中に懸濁された細胞を備えるテストサンプル、又は懸濁された培養マイクロビーズ上に細胞を備えるテストサンプルに電場を与える段階と、
(b)前記電圧及び/又は前記電流をモニタする段階と、
(c)前記ストレス因子が前記テストサンプルに衝撃を与えることを可能とする段階を備え、前記ストレス因子は、電場を与える前に供給されるストレス因子、電場を与えるのと略同時に供給されるストレス因子及び電場を与えた後に供給されるストレス因子から選択され、
(d)前記方法は更に、一の特定の時間点又は連続する時間点の組にわたって前記テストサンプルの初期インピーダンス応答を測定する段階を備え、前記テストサンプルの初期インピーダンス応答は、電場印加と略同時点の第1のインピーダンス測定からこの後測定される前記測定サンプルのインピーダンスがストレス応答或いは非増殖を示す時点までの遷移期間における前記テストサンプルのインピーダンス変化であり、
(e)前記方法は更に、各時間点における前記テストサンプルの初期インピーダンス応答のレベルを評価する段階を備え、各時間点における前記テストサンプルの初期インピーダンスのレベルが、前記細胞のストレス応答のレベルを指し示し、これにより、前記テストサンプル中に前記細胞が存在するならば、前記ストレス因子に対する前記細胞のストレス応答をモニタし、或いは、前記細胞が前記テストサンプルに存在しない或いは死滅しているならば、前記ストレス応答の不存在をモニタし、前記テストサンプル中の前記細胞の存在或いは不存在を迅速に検知することを特徴とする方法。 - 前記テストサンプル中に前記細胞が存在するか否かを確認する段階を更に備え、該確認する段階が、
(i)前記ストレス因子を備える培地或いは前記ストレス因子を備えない培地からなる第1の参照サンプルのインピーダンス応答を測定する段階を備え、前記第1の参照サンプルは、細胞を含まず、及び/又は、
(ii)前記確認する段階が、前記細胞と前記培地からなる第2の参照サンプルの初期インピーダンス応答を測定する段階を備え、前記第2の参照サンプルの前記細胞が、前記テストサンプル中の細胞と同濃度であり、前記第2の参照サンプルはストレス因子を含まず、前記第2の参照サンプルの初期インピーダンス応答は、電場印加と略同時点の前記第2の参照サンプルに対する第1のインピーダンス測定からこの後測定される前記測定サンプルのインピーダンスがストレス応答或いは非増殖を示す時点までの遷移期間における前記第2の参照サンプルのインピーダンス変化であり、
(iii)前記確認する段階が、前記段階(d)にて得られた前記テストサンプルの前記初期インピーダンス応答を前記第1の参照サンプルのインピーダンス応答及び/又は前記第2の参照サンプルの初期インピーダンス応答と比較する段階と、
(iv)前記段階(iii)の比較を評価し、これにより、前記テストサンプル中の前記細胞の存在或いは不存在を確認することを特徴とする請求項6記載の方法。 - 前記細胞が、原核生物細胞と真核性細胞から選択されることを特徴とする請求項6記載の方法。
- 前記細胞が真核性細胞であり、
該真核性細胞は、原生生物、菌類、非形質転換ヒト細胞、非形質転換動物細胞、形質転換ヒト細胞及び形質転換動物細胞から選択され、
前記真核性細胞は、接着依存性であるとともに前記テストサンプルの培地が更に、懸濁された培養マイクロビーズを備え、該マイクロビーズは、細胞外マトリックスのコーティングを備え、該細胞外マトリックスが、前記真核性細胞を接着可能であることを特徴とする請求項8記載の方法。 - 前記細胞が、原核生物細胞又は真核性細胞であり、
前記テストサンプルの培地及び前記参照サンプルの培地が更に、懸濁されたビーズを備え、
該ビーズは、特定のレセプタのコーティングを備え、
前記特定のレセプタが、前記原核生物細胞又は真核性細胞を接着可能であることを特徴とする請求項8記載の方法。 - 前記レセプタが、生物学的に活性な成分を備え、
該活性成分が、免疫反応から生ずる成分、核酸から生ずる成分及び特定の細胞を見極めるために使用可能な他の化合物から生ずる成分から選択されることを特徴とする請求項10記載の方法。 - 前記細胞に供給される前記ストレス因子が、既知の生物学的活性物への前記細胞の接触であることを特徴とする請求項6記載の方法。
- 前記既知の生物学的活性物が、薬学的に活性を有する物、抗癌剤、生体毒素、ウィルス、ストレスを作り出すことが可能な他の物質並びにこれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項12記載の方法。
- 生物学的に活性を有する物及び前記生物学的に活性を有する物の選択された濃度における細胞のストレスレベルに対する細胞の感受性の予測結果を決定する方法であり、
前記細胞の感受性のレベルは予め既知であり、又は、前以って知られていないものであり、前記方法は、
(a)(i)一の特定の時間点又は連続する時間点の組にわたってテストサンプルの初期インピーダンス応答を測定する段階を備え、前記テストサンプルは、培地中に懸濁された細胞或いは懸濁された培養マイクロビーズ上の細胞、及び選択された濃度の前記生物学的に活性を有する物からなり、前記方法は更に、培地と前記選択された濃度の生物学的に活性を有する物からなる参照サンプルのインピーダンス応答を測定する段階を備え、前記参照サンプルは、前記細胞を含まず、
(ii)前記方法は、前記各時間点において、第1のインピーダンス応答処理分布を決定する段階を備え、該第1のインピーダンス応答処理分布は、前記段階(a)(i)にて決定されるテストサンプルの初期インピーダンス応答と、前記段階(a)(i)の各時間点で決定される参照サンプルのインピーダンス応答の数学的比較であり、
(iii)前記方法は、必要に応じて、前記生物学的に活性を有する物の選択された濃度について、前記段階(a)(i)と前記段階(a)(ii)を繰り返し、前記既知の生物学的に活性を有する物の異なる選択濃度それぞれに対する前記第1のインピーダンス応答処理分布を求め、
(b)(i)前記方法は更に、前記特定の時間点或いは連続する時間点の組にわたって第2のテストサンプルの初期インピーダンス応答を測定する段階を備え、前記第2のテストサンプルは前記細胞と前記培地からなり、前記第2のテストサンプルは前記生物学的に活性を有する物を含まず、前記方法は更に、培地からなる参照サンプルのインピーダンス応答を測定する段階を備え、前記参照サンプルは細胞を含まず、
(ii)前記方法は、第1のインピーダンス応答未処理分布を算出する段階を備え、該第1のインピーダンス応答未処理分布は、前記段階(b)(i)にて決定される第2のテストサンプルの初期インピーダンス応答と各時間点において前記段階(b)(i)にて決定される参照サンプルのインピーダンス応答の数学的比較であり、
(c)前記生物学的に活性を有する物の各選択濃度に対して、正規化インピーダンス応答値NIRを決定し、該NIRが、前記段階(a)(ii)及び/又は段階(a)(iii)で得られる第1のインピーダンス応答処理分布値を前記段階(b)(ii)で得られる前記第1のインピーダンス応答未処理分布値に関連付けるアルゴリズムにより決定される数値であり、前記第1のインピーダンス応答未処理分布値が前記NIRに組み込まれ、前記決定されたNIR値が、前記生物学的に活性を有する物の選択された濃度における前記細胞のストレスのレベルの定量測度であることを特徴とする方法。 - 前記段階(a)(i)で決定されるテストサンプルの初期インピーダンスと各時間点において前記段階(a)(i)にて決定される前記参照サンプルのインピーダンス応答の前記段階(a)(ii)にて行われる数学的比較が、
前記段階(a)(i)にて決定される前記テストサンプルのインピーダンス応答と各時間点において前記段階(a)(i)にて決定される参照サンプルのインピーダンス応答の比と、
前記段階(a)(i)にて決定される前記テストサンプルのインピーダンス応答と各時間点において前記段階(a)(i)にて決定される前記参照サンプルのインピーダンス応答との間の差異から選択されることを特徴とする請求項14記載の方法。 - 前記NIRを決定されるために用いられるアルゴリズムが、前記第1のインピーダンス応答処理分布値と前記第1のインピーダンス応答未処理分布値間の数学的比率或いは差の絶対値から選択されることを特徴とする請求項14記載の方法。
- 前記細胞が、前記生物学的に活性を有する物に対する感受性が前以って知られたものであり、
第2の細胞を用いて、前記段階(a)、(b)及び(c)を繰り返す段階を更に備え、
前記第2の細胞は、前記生物学的に活性を有する物に対する感受性が未知のものであるとともに前記生物学的に活性を有する物に対する感受性が前以って知られた前記細胞と同一種であり、これにより、前記生物学的に活性を有する物に対して未知の感受性を有する細胞の正規化インピーダンス応答値NIRUNKが決定され、
前記方法は、前記選択された濃度における前記生物学的に活性を有する物に対する未知の感受性を有する細胞のNIRUNK値と前記生物学的に活性を有する物に対しての前以って知られた株を有する細胞の選択された濃度におけるNIR値を比較する段階を備え、
前記選択された濃度におけるNIRUNK値が前記生物学的に活性を有する物に対しての感受性が前以って知られた細胞の選択された濃度におけるNIR値よりも大きい場合には、前記生物学的に活性を有する物に対する感受性が未知の細胞が、選択された濃度において、前記生物学的に活性を有する物に対する感受性が前以って知られた細胞よりも影響を受けにくいと予測されることを特徴とする請求項14記載の方法。 - 前記細胞が既知の株を有する細胞或いは前記生物学的に活性を有する物に対して感受性を有すると判明した細胞であり、
前記方法は、前記特定の時間点或いは前記連続する時間点の組に対して、時間の関数として、前記生物学的に活性を有する物の異なる選択濃度それぞれに対する前記第1のインピーダンス応答処理分布と前記細胞と前記培地からなる第2のテストサンプルの第1のインピーダンス応答未処理分布をプロットする段階を備え、前記第2のテストサンプルは前記生物学的に活性を有する物を含まず、これにより、選択濃度並びに未処理細胞に対する曲線群が得られ、
前記方法は、選択された時間点における各曲線の平均勾配を算出する段階と、
前記選択された時間点での各曲線の平均勾配の値を前記第1のインピーダンス応答未処理分布の曲線勾配の値で除算する或いは前記選択された時間点における各曲線の前記平均勾配の前記値を前記第1のインピーダンス応答未処理分布曲線の勾配の値で修正することにより各第1のインピーダンス応答処理分布に対する正規化された勾配値を得る段階と、
前記生物学的に活性を有する物の対応する濃度の関数として、各第1のインピーダンス応答処理分布の正規化された勾配をプロットし、細胞に対する生物学的に活性を有する物の有効濃度を予測するために用いる変化曲線の正規化率を得る段階と、
未知の細胞株に対する正規化された勾配値を決定する段階を備え、
前記未知の細胞株に対する前記正規化された勾配値が、前記生物学的に活性を有する物に対する感受性が知られている細胞株の変化曲線の正規化率より上であるならば、他の方法により決定されるように、前記未知の細胞株が、前記生物学的に活性を有する物に対して、耐性を有すると判断することを特徴とする請求項14記載の方法。 - 前記細胞が、原核生物細胞と真核性細胞から選択されることを特徴とする請求項14記載の方法。
- 前記細胞が真核性細胞であり、
該真核性細胞は、原生生物、菌類、非形質転換ヒト細胞、非形質転換動物細胞、形質転換ヒト細胞及び形質転換動物細胞から選択され、
前記真核性細胞は、接着依存性であるとともに前記テストサンプルの培地が更に、懸濁された培養マイクロビーズを備え、該マイクロビーズは、細胞外マトリックスのコーティングを備え、該細胞外マトリックスが、前記真核性細胞を接着可能であることを特徴とする請求項19記載の方法。 - 前記細胞が、原核生物細胞又は真核性細胞であり、
前記テストサンプルの培地及び前記参照サンプルの培地が更に、懸濁されたビーズを備え、
該ビーズは、特定のレセプタのコーティングを備え、
前記特定のレセプタが、前記原核生物細胞又は真核性細胞を接着可能であることを特徴とする請求項19記載の方法。 - 前記レセプタが、生物学的に活性な成分を備え、
該活性成分が、免疫反応から生ずる成分、核酸から生ずる成分及び特定の細胞を見極めるために使用可能な他の化合物から生ずる成分から選択されることを特徴とする請求項21記載の方法。 - 請求項6に記載の方法にしたがって、培地のテストサンプル内に細胞が存在するか否かを迅速に検知するキットであって、
前記テストサンプル内に前記細胞が存在するならば、ストレス応答を前記細胞に生じさせることが前以って知られている少なくとも1つのストレス因子と、
請求項6に記載の方法にしたがって、前記テストサンプル内に前記細胞が存在するか否かを検知するために前記キットの部品を使用するための一式の説明書を備えることを特徴とするキット。 - 請求項14に記載の方法にしたがってテストサンプル内の生存細胞の有無を判定するキットであって、
(a)テストサンプルとストレス因子の懸濁液をテスト用に準備するための培地と、
(b)請求項14の方法にしたがって、前記テストサンプルの初期インピーダンス応答のレベルと、細胞の生存に対する予測結果と前記生物学的に活性を有する物の前記選択された濃度における前記細胞のストレスレベルを判定するために前記キットの部品を使用するための一式の説明書を備えることを特徴とするキット。 - 生物学的に活性を有する物の選択された濃度における細胞の感受性と前記生物学的に活性を有する物の選択された濃度における前記細胞のストレスレベルに対する予測結果を請求項14に記載の方法にしたがって判定するためのキットであって、
(a)前記細胞のテストサンプルの懸濁液と前記生物学的に活性を有する物の各濃度の懸濁液をテスト用に準備するための培地と、
(b)請求項14に記載の方法にしたがって、各濃度の前記生物学的に活性を有する物に対する前記細胞の前記テストサンプルの前記初期インピーダンス応答のレベル、選択された濃度の前記生物学的に活性を有する物に対する前記細胞の感受性に対する予測結果及び前記生物学的に活性を有する物の前記選択された濃度における前記細胞のストレスレベルを決定するために前記キットの部品を使用するための一式の説明書を備えることを特徴とするキット。
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