DE3643108C2

DE3643108C2 -

Info

Publication number: DE3643108C2
Application number: DE3643108A
Authority: DE
Inventors: Toshimitsu Prof. Machida Tokio/Tokyo Jp Musha
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1985-12-20
Filing date: 1986-12-17
Publication date: 1988-11-17
Also published as: JPS62145165A; DE3643108A1; JPH0580980B2; US4799796A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen immunologischer Antigen/Antikörper-Reaktionen mit Hilfe von Phaseninformationen polarisierten Lichtes, welches durch in der Reaktionsflüssigkeit suspendierte feine Teilchen gestreut wird.

Die immunologische Analyse wurde entwickelt, um Immun-Substanzen, Hormone, Medikamente und andere Komponenten, wie Immun-Regulatoren, welche in geringen Mengen in lebenden Körpern vorhanden sind, mittels spezifischer immunologischer Reaktionen zu vermessen. Die immunologische Analyse kann grob in zwei Gruppen eingeteilt werden: Bei der markierenden immunologischen Analyse werden Enzyme und Isotope als Indikatoren benutzt, während bei der nicht-markierenden immunologischen Analyse die Antigen/ Antikörper-Komplexe direkt gemessen werden.

Bei der erstgenannten markierenden immunologischen Analyse sind insbesondere bekannt die Radio-Immuno-Analyse (RIA), die Enzym- Immuno-Analyse (EIA) und die Fluoro-Immuno-Analyse (FIA). Diese Analysemethoden haben den Vorteil hoher Empfindlichkeit, sind aber mit dem Nachteil behaftet, daß die Handhabung der Isotope sowie der verbrauchten Flüssigkeit schwierig ist. Auch sind die Meßzeiten sehr lang und die für die Markierung erforderlichen Substanzen teuer, so daß die Analysekosten pro Probe verhältnismäßig groß sind.

Bei der vorstehend genannten nicht-markierenden immunologischen Analyse sind insbesondere die Immuno-Elektrophorese, die Immuno- Diffusion und die Sedimentation bekannt. Diese Verfahren sind recht einfach, haben jedoch nicht die erforderliche Empfindlichkeit, Meßgenauigkeit und Reproduzierbarkeit, um für präzise Messungen geeignet zu sein.

In der Zeitschrift "Immuno Chemistry", Vol. 12, Nr. 4 (1975), S. 349 bis 351, wird eine immunologische Analyse vorgeschlagen, bei der Antigene oder Antikörper, die auf den Oberflächen feiner Teilchen gebunden sind, mit Antikörpern bzw. Antigenen reagieren, die in einer Prüfflüssigkeit vorliegen, und eine mittlere Diffusionskonstante wird gemessen, welche ein Maß für die Brown'sche Molekularbewegung der aus agglutinierten Partikeln zusammengesetzten Aggregate ist. Die mittlere Diffusionskonstante wird aus der Änderung der spektralen Breite von Laser- Licht ermittelt, welches in der Lösung der Teilchen gestreut wird. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß kein Reagenz benutzt werden muß. Da aber die Aufweitung des Spektrums aufgrund des Doppler-Effektes entsprechend der Brown'schen Bewegung der Aggregate mittels eines Spektrometers gemessen wird, handelt es sich um eine sehr große und teure Vorrichtung. Wird das Spektrometer mechanisch betrieben, so können sich Fehler einschleichen und die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Messung läßt zu wünschen übrig. Die bei diesen bekannten Verfahren vorgesehene Messung der mittleren Diffusionskonstante aufgrund der spektralen Breite ermöglicht auch nur eine begrenzte Information über die Antigen/Antikörper-Reaktionen.

In der DE-OS 35 25 719 der Anmelderin ist ein Verfahren zum Messen einer Antigen/Antikörper-Reaktion beschrieben, bei dem die Schwankungen der Lichtintensitäten von an den Teilchen gestreutem Licht gemessen werden.

Anschließend hat die Anmelderin eine Weiterentwicklung dieses Analyseverfahrens vorgeschlagen (DE-OS 36 39 352), bei dem linear polarisiertes Licht nach dem Durchtritt durch einen Polarisator auf die Reaktionsflüssigkeit gerichtet wird und das durch Teilchen gestreute Licht mittels eines Analysators nachgewiesen wird, dessen Polarisationsebene senkrecht zu der des Polarisators steht. Bei diesem Verfahren wird ausgenutzt, daß bei der Streuung von linear polarisiertem Licht durch die Teilchen die Polarisationseigenschaften des gestreuten Lichtes sehr empfindlich von der Antigen/Antikörper-Reaktion abhängen.

Aber auch dieses Verfahren ist verbesserungsfähig. Soll die Meßempfindlichkeit durch Erhöhung der Konzentration der Teilchen verbessert werden, treten Vielfachstreuungen auf, weshalb das gestreute Licht auch Polarisationskomponenten enthält, die senkrecht zur Polarisationsebene des einfallenden, linear polarisierten Lichtstrahles stehen, obwohl die Antigen/Antikörper- Reaktion noch nicht in der Zelle stattgefunden hat, so daß die Empfindlichkeit insgesamt gesenkt wird und die immunologische Reaktion nicht genau vermessen werden kann.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen von immunologischen Reaktionen bereitzustellen, bei dem bzw. der die Meßempfindlichkeit erhöht werden kann, ohne daß die Meßgenauigkeit und Meßzuverlässigkeit beeinträchtigt werden, wobei die Messung schnell, automatisch und ohne teure Reagenzien oder teure Spektrometer durchgeführt werden kann.

Ein Verfahren und eine Vorrichtung, die diese Aufgabe lösen, sind mit Ausgestaltungen in den Patentansprüchen gekennzeichnet.

Wenn linear polarisiertes Licht auf die eine Reaktionsflüssigkeit enthaltende Zelle fällt, wird das Licht durch die in der Reaktionsflüssigkeit vorhandenen feinen Teilchen gestreut und der Polarisationszustand des gestreuten Lichtes hängt ab vom Agglutinationszustand der Teilchen. Nicht agglutinierte Teilchen haben im wesentlichen eine runde Form (kugelförmig), wes halb das durch die runden Teilchen nach vorne gestreute Licht in der gleichen Polarisationsebene linear polarisiert ist wie das einfallende, linear polarisierte Licht, solange der Durchmesser d des Teilchens hinreichend klein gegenüber der Wellenlänge λ (d«g ) ist. Erfolgt eine Antigen/Antikörper-Reaktion und binden sich die Teilchen aneinander, so haben die agglutinierten Teilchen nicht mehr Kugelform und weisen optische Anisotropie auf. Deshalb weist das durch diese agglutinierten Teilchen gestreute Licht Polarisationskomponenten auf, die nicht in der Polarisationsebene des einfallenden Lichtes liegen und auch die Phase des gestreuten Lichtes schwankt nicht. Wird deshalb angenommen, daß nur eine einzige Vorwärtsstreuung auftritt, d. h. das einfallende Licht wird nur ein einziges Mal gestreut, so kann nur das durch die agglutinierten Teilchen gestreute Licht selektiv dadurch nachgewiesen werden, daß das gestreute Licht über einen Analysator empfangen wird, desse Polarisationsebene von der des einfallenden Lichtes verschieden ist. In diesem Falle ändert sich das Ausgangssignal eines Photodetektors entsprechend dem Agglutinationszustand der Teilchen, d. h. das Ausmaß der Antigen/Antikörper-Reaktion geht in das Ausgangssignal ein, so daß die immunologische Reaktion durch eine Verarbeitung des Ausgangssignals des Photodetektors vermessen werden kann.

Es ist aber erforderlich, zur Erhöhung der Meßempfindlichkeit die Konzentration der Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit zu erhöhen. Das Licht wird dann aber mehrfach durch die Teilchen gestreut. Bei einer derartigen Mehrfachstreuung kann die Phase des gestreuten Lichtes nach Zufallsgesetzen schwanken, auch wenn die Teilchen kugelförmig sind und das Licht nach vorne gestreut wird, d. h. wenn keine Agglutinationsreaktion erfolgt. Somit fällt auch dann, wenn das gestreute Licht durch einen Analysator beobachtet wird, mehrfach von nicht-agglutinierten Teilchen gestreutes Licht auf den Photodetektor. Deshalb läßt sich die Messung nicht mit der gewünschten Genauigkeit ausführen.

Die Erfindung macht sich die Erkenntnis zunutze, daß die Phase des durch nicht-agglutinierte Teilchen mehrfach in Vorwärtsrichtung gestreuten Lichtes nach Zufallsgesetzen schwankt. Gemäß der Erfindung wird deshalb ein Teil des einfallenden Lichtes abgetrennt und bezüglich seiner Phase moduliert und das phasenmodulierte Licht wird zusammen mit dem gestreuten, aus der Meßzelle stammenden Licht auf den Photodetektor gelenkt. Das Ausgangssignal des Photodetektors wird entsprechend der Winkelfrequenz der Phasenmodulation des phasenmodulierten Lichtes verarbeitet. Auf diese Weise ist es möglich, selektiv diejenige Lichtkomponente nachzuweisen, die durch die agglutinierten Teilchen nur ein einziges Mal gestreut wurde. Die Phase dieser Lichtkomponente ist kohärent mit der des einfallenden Lichtes.

Der elektrische Feldvektor E des auf eine Empfangsfläche des Photodetektors fallenden Lichtes kann wie folgt beschrieben werden:

E = E₁ cos [ω t + Φ₁] + E₂ cos [ω t + Φ₂(t)] + E₃ cos [ω t + a cos ω₀t + Φ₃] (1)

In dieser Gleichung (1) gedeutet E₁ cos (ω t + Φ₁) die Intensität des elektrischen Feldes des durch agglutinierte Teilchen ein einziges Mal gestreuten Lichtes und Φ₁ die Phasenkonstante. Der zweite Term E₂ cos (l t + Φ₂(t)) bedeutet die Intensität des elektrischen Feldvektors des durch nicht-agglutinierte Teilchen mehrfach gestreuten Lichtes und Φ₂(t) bezeichnet die zufällige Phasenkonstante. Der dritte Term E₃ cos (ω t + a cos ω₀t + Φ₃) bezeichnet die Intensität des elektrischen Feldes des einfallenden Lichtes, welches durch den Term a cos ω₀t phasenmoduliert ist, wobei ω₀ die Winkelfrequenz der Phasenmodulation ist. Φ₁ bezeichnet eine Phasenkonstante, die im allgemeinen verschieden von Φ₃ ist.

Ganz allgemein kann das Ausgangssignal des Photodetektors wie folgt dargestellt werden:

In der vorstehenden Gleichung (2) hat nur der fünfte Term eine Komponente, die mit der Winkelfrequenz n ω₀ variiert (n ist eine natürliche Zahl), da sowohl der vierte als auch der sechste Term Zufallskomponenten cos Φ₂(t) und sin Φ₂(t) aufweisen, so daß die Mittelwerte zu Null werden. Der fünfte Term kann mittels einer Bessel-Funktion wie folgt geschrieben werden:

In der vorstehenden Gleichung (3) kann die Amplitude derjenigen Komponente, die mit der Winkelfrequenz (2n-1)ω₀ variiert, wie folgt ausgedrückt werden:

E₁E₃ sin (Φ₁ - Φ₃)J _2n-1 (a) (4)

Fernerhin kann die Amplitude derjenigen Komponente, die mit der Winkelfrequenz 2n ω₀ variiert, wie folgt ausgedrückt werden:

E₁E₃ cos (Φ₁ - Φ₃)J _2n (a) (5)

Werden demnach nur diejenigen Komponenten des Ausgangssignals selektiv nachgewiesen, die Winkelfrequenzen ω₀, 2ω₀, 3l₀, 4ω₀ . . ., d. h. m ω₀ (m ist eine natürliche Zahl) aufweisen, so ist es möglich, dasjenige Licht zu messen, das durch die agglutinierten Teilchen nur ein einziges Mal gestreut wurde. Aufgrund der Charakteristik der Bessel-Funktion ist es möglich, mit den Werten m=1 und a=2 das maximale Ausgangssignal zu erzielen.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher beschrieben. Es zeigt bzw. zeigen:

Fig. 1 eine schematische Ansicht einer Vorrichtung zum Vermessen einer immunologischen Reaktion; und

Fig. 2A und 2B perspektivische Ansichten des bei der Vorrichtung gemäß Fig. 1 benutzten Phasenmodulators.

Fig. 1 zeigt schematisch eine Vorrichtung zum Vermessen einer immunologischen Reaktion. Bei diesem Ausführungsbeispiel dient als Lichtquelle zur Erzeugung kohärenten Lichtes ein He/Ne-Gaslaser 1, der einen Laserstrahl der Wellenlänge 632,8 nm emittiert. Die kohärentes Licht erzeugende Lichtquelle kann aber auch durch einen Festkörper-Laser, wie einen Halbleiterlaser, realisiert sein. Der Laserstrahl 2 aus der Lichtquelle 1 passiert den Polarisator 3, der aus einem Glan-Thompson-Prisma geformt sein kann, und wird sodann durch einen halbdurchlässigen Spiegel 4 in die beiden Lichtstrahlen 5 und 6 aufgeteilt. Der Lichtstrahl 5 wird durch die Sammellinse 7 konzentriert und auf die Zelle 8 gerichtet. Die Zelle 8 besteht aus durchsichtigem Quarz.

In der Zelle 8 (Reaktionszelle) befindet sich eine Antigen/ Antikörper-Reaktionsflüssigkeit 9, die eine Mischung aus einer Pufferlösung, in welcher feine kugelförmige Teilchen, wie Polystyren- Latex-Teilchen, suspendiert sind, und einer Probe aus Antigenen oder Antikörpern ist, welche vermessen werden sollen. Auf die äußeren Flächen der Teilchen sind Antikörper oder Antigene gebunden, wie z. B. Immuno-Globulin G (IgG), welches spezifisch mit dem Antigen oder Antikörper in der Probe reagiert. In der Zelle 8 findet deshalb die Antigen/Antikörper-Reaktion statt und es entstehen Anziehungskräfte zwischen den Teilchen. Die Teilchen agglutinieren deshalb miteinander, um Aggregate zu bilden, weshalb die Polarisationseigenschaften des gestreuten Lichtes entsprechend der Form und Größe der Aggregate variieren.

Das von den Teilchen in der Zelle 8 gestreute Licht passiert einen Kollimator aus einem Paar von Schlitzen 10 a, 10 b, einem halbdurchlässigen Spiegel 11 und einem Analysator 12, und fällt dann auf einen Photodetektor 13, für den ein Photoelektronen- Vervielfacher vorgesehen ist, der eine sehr hohe Empfindlichkeit aufweist. Der Analysator 12 hat eine Polarisationsebene, die zu der des Polarisators 3 senkrecht steht. Beim gezeigten Ausführungsbeispiel empfängt der Photodetektor 13 dasjenige Licht, welches aus der Zelle in der gleichen Richtung gestreut wird, in welcher der einfallende Lichtstrahl 5 eintrifft.

Der durch den halbdurchlässigen Spiegel 4 abgetrennte Lichtstrahl 6 wird an einem Spiegel 14 reflektiert und passiert ein Halbwellenlängenplättchen 15, so daß seine Polarisationsebene um 90° gedreht wird und derjenigen des Analysators 12 entspricht. Das aus dem Halbwellenlängenplättchen 15 austretende Licht fällt auf einen Phasenmodulator 16 und wird mit einem Modulationssignal phasenmoduliert, dessen Winkelfrequenz ω₀ vom Oszillator 17 bereitgestellt wird, so daß das linear polarisierte Licht eine Phase aufweist, die gemäß der Formel cos (ω t + a cos ω₀t + Φ₃) variiert. Das auf diese Weise phasenmodulierte Licht fällt auf den Photodetektor 13, nachdem es vom Spiegel 18 und vom halbdurchlässigen Spiegel 11 reflektiert wurde und den Analysator 12 passiert hat.

Ein Ausgangssignal des Photodetektors 13 wird in den Synchron detektor 19 eingegeben, der einen Synchron-Nachweis in bezug auf das Referenzsignal der Frequenz ω₀/2 erzeugt, welches vom Oszillator 17 bereitgestellt wird. Ein Ausgangssignal des Synchron- Detektors 19 wird in die Anzeigeeinrichtung 20 eingegeben und dort angezeigt. Beim gezeigten Ausführungsbeispiel wird das Ausgangssignal des Photodetektors 13 synchron gemäß der Frequenz ω₀/2 nachgewiesen. Die Frequenz ω₀/2 kann so gesetzt werden, daß sie etwa 2 KHz größer ist als die Doppler-Frequenz. Der Modulationsindex a des Phasenmodulators 16 wird vorzugsweise so bestimmt, daß die Gleichungen (4) und (5) maximale Werte annehmen, so daß die höchste Empfindlichkeit erreicht wird. Dies bedeutet, daß a=2 ist.

Wie vorstehend erläutert ist, hängt das Ausgangssignal des Synchron- Detektors 19 allein von demjenigen Licht ab, das durch die agglutinierten Teilchen ein einziges Mal gestreut wurde, weshalb dieses Signal auch ein Maß für die Konzentration der Antigene oder Antikörper in der Probe ist. Mittels einer zuvor aufgenommenen Eichkurve unter Verwendung von Standardproben mit bekannten Konzentrationen ist es deshalb möglich, die unbekannten Konzentrationen einer Probe mittels des Ausgangssignals des Synchron-Detektors 10 zu messen. Wie sich ferner aus den Gleichungen (4) und (5) ergibt, kann das Ausgangssignal des Photodetektors 13 durch das Produkt aus E₁ und E₃ repräsentiert werden und es ist möglich, das Ausgangssignal des Synchron- Detektors durch Erhöhung von E₃ zu verstärken. Da der Einfluß einer Mehrfachstreuung durch nicht-agglutinierte Teilchen vermieden ist, ist es möglich, die Messung mit hoher Empfindlichkeit dadurch zu erhöhen, daß die Anzahl der Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit erhöht wird.

Die Fig. 2A und 2B zeigen zwei Ausführungsbeispiele für einen in einer Vorrichtung gemäß Fig. 1 zu verwendenden Phasenmodulator 16. Der Phasenmodulator 16 benutzt den Pockels-Effekt, wonach die Phase eines durch einen Kristall gehenden Licht strahles dadurch moduliert werden kann, daß ein elektrisches Feld an den Kristall angelegt wird. Beim Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 2A ist ein Paar von Elektroden 22 a und 22 b auf gegenüberliegenden Seiten des durch den optischen Kristall 21 gehenden Lichtstrahles angeordnet und es wird ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden mittels des Oszillators 17 erzeugt, dessen Winkelfrequenz ω₀ ist. Beim Ausführungsbeispiel gemäß 2B ist ein Paar von lichtdurchlässigen Elektroden 23 a und 23 b auf den Eingangs- bzw. Ausgangsflächen des optischen Kristalles 21 angeordnet und das elektrisches Feld wird zwischen diesen Elektroden erzeugt.

Bei den vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispielen sind u. a. folgende Abwandlungen möglich. Statt des Immuno-Globulins G (IgG) kann zur Prüfung des Antigens auch eine andere Substanz, wie Immuno-Globulin A (IgA), IgM, IgD, IgE, Australia- Antigen oder Insulin verwendet werden, welche eine Agglutination während der Antigen/Antikörper-Reaktion verursachen. Beim vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiel sind die Antikörper auf der Teilchenoberfläche gebunden und es wird das in der Probe enthaltene Antigen vermessen, es ist aber offensichtlich auch möglich, Antikörper in der Probe zu vermessen, wobei Antigene auf den Teilchen gebunden sind. Statt der Polystyren-Latex- Teilchen können auch andere organische Teilchen und inorganische Teilchen, wie Glaskügelchen, verwendet werden. Bei den beschriebenen Ausführungsbeispielen sind die Teilchen bereits vor der Reaktion in der Prüfflüssigkeit vorhanden, es ist jedoch auch möglich, Partikelsubstanzen zu verwenden, die während der Antigen/Antikörper-Reaktion erzeugt werden. Wird beispielsweise menschliches Villus gonadotropin (HCG) als Antigen und nichtmenschliches Villus gonadotropin (Anti-HCG) als Antikörper verwendet, dann können die durch die Antigen/Antikörper- Reaktion erzeugten Antigen-Antikörper-Komplexe als Partikel verwendet werden. Auch kann das Antigen selbst als Partikel- Substanz eingesetzt werden. Als Beispiel für eine derartige Antigen/Antikörper-Reaktion sei die Reaktion von Candida- Albicans genannt, wobei letztgenanntes als Antigen und Anti-Candida-Albicans als Antikörper benutzt werden. Auch können Blut-Korpuskel, Zellen und Mikroorganismen als Partikel (Teilchen) verwendet werden.

Beim in Fig. 1 gezeigten Ausführungsbeispiel wird die Messung an einer stehenden Reaktionsflüssigkeit ausgeführt und die zu untersuchenden Proben werden nacheinander in die Zelle eingegeben, es ist aber auch möglich, ein strömendes System zu verwenden, bei dem Antigen/Antikörper-Reaktionen in einer Flüssigkeit ablaufen, die kontinuierlich durch die Zelle strömt.

Bei den beschriebenen Ausführungsbeispielen wird die Lichtquelle durch einen kohärentes Licht ausstrahlenden Laser realisiert, es ist jedoch auch möglich, Lichtquellen zu verwenden, die nicht-kohärentes Licht ausstrahlen. Auch kann anders als linear polarisiertes Licht verwendet werden, wie zirkular oder elliptisch polarisiertes Licht.

Bei dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wird durch den Synchron detektor die Signalkomponente des Ausgangssignals des Photodetektors gemessen, die eine mit der Winkelfrequenz ω₀ modulierte Phase aufweist. Es ist aber auch möglich, gleichzeitig Frequenzkomponenten nachzuweisen mit den Frequenzen ω₀/2π und 2ω₀/2π, wobei zwei Synchrondetektoren eingesetzt werden, in welche Referenzsignale der Frequenzen l₀/2π bzw. 2ω₀/2π eingegeben werden. Auch kann jede gewünschte Frequenzkomponente dadurch abgeleitet werden, daß Filter mit Durchlaß-Bändern eingesetzt werden, deren Mittelfrequenzen jeweils ω₀/2π, 2ω₀/2π . . . oder m ω₀/2π betragen. In diesen Fällen ist es vorteilhaft, ein Kombinationsfilter mit einer Vielzahl von Durchlaßbändern zu verwenden, die jeweils Mittenfrequenzen der Werte ω₀/2π, 2ω₀/2π . . . und m l₀/2π aufweisen.

Beim oben beschriebenen Ausführungsbeispiel wird der Analysator vor dem Photodetektor angeordnet, um zu verhindern, daß einmal von nicht-agglutinierten Teilchen gestreutes Licht und derjenige Teil des einfallenden Lichtes, der nicht durch die Teilchen reflektiert wird, auf den Photodetektor fallen. Es ist aber nicht unbedingt erforderlich, daß das phasenmodulierte Licht über den Analysator auf den Photodetektor fällt, weshalb der Analysator auch z. B. vor dem halbdurchlässigen Spiegel 11 angeordnet werden kann. Dann fällt das phasenmodulierte Licht direkt auf den Photodetektor. In diesem Fall muß die Einstellung des optischen Phasenmodulators nicht notwendig streng sein. Auch in diesem Falle kann aber das Halbwellenlängenplättchen 15 mit Vorteil im Referenzlichtstrahl angeordnet werden.

Wie sich aus der vorstehenden Beschreibung ergibt, wird gemäß der Erfindung das linear polarisierte Licht in zwei Strahlen aufgeteilt und einer der Strahlen fällt auf die Reaktionsflüssigkeit, während der andere Strahl mit der Frequenz ω₀ phasenmoduliert wird. Der phasenmodulierte Lichtstrahl und von in der Reaktionsflüssigkeit vorhandenen Teilchen gestreutes Licht werden gemeinsam auf einen Photodetektor gerichtet und das Ausgangssignal des Photodetektors wird entsprechend der Modulationsfrequenz ω₀ synchron nachgewiesen. Auf diese Weise kann der störende Einfluß von Streulicht, das von nicht-agglutinierten Teilchen mehrfach gestreut wurde, vermieden oder zumindest wesentlich gesenkt werden. Die Messung ist deshalb genau und zuverlässig und die Meßempfindlichkeit kann wesentlich dadurch gesteigert werden, daß die Konzentration der Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit erhöht wird.

Claims

1. Verfahren zum Messen einer immunologischen Reaktion, bei dem ein polarisierter Lichtstrahl in erste und zweite polarisierte Lichtstrahlen (5, 6) aufgeteilt wird, und der erste polarisierte Lichtstrahl (5) auf die Reaktionsflüssigkeit gerichtet wird, die feine Teilchen enthält, welche durch zumindest eine der drei folgenden Möglichkeiten gebildet sind:

a) Antigene und Antikörper;
b) Antigene oder Antikörper und Teilchen, an welche die Antikörper oder Antigene gebunden sind, oder
c) Antigene oder Antikörper und Blutteilchen, Zellen oder Mikroorganismen,

dadurch gekennzeichnet, daß

- der zweite polarisierte Lichtstrahl (6) mit einer vorgegebenen Winkelfrequenz phasenmoduliert wird, um einen phasenmodulierten Lichtstrahl zu erzeugen;
- der phasenmodulierte Lichtstrahl und von den Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit gestreutes Licht, das Polarisationskomponenten aufweist, die nicht in der Polarisationsebene des ersten polarisierten Lichtstrahles liegen, werden in einen Photodetektor (13) eingegeben, um ein Ausgangssignal zu erzeugen; und
- das Ausgangssignal des Photodetektors wird entsprechend der Winkelfrequenz der Phasenmodulation ausgewertet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein linear polarisierter Lichtstrahl verwendet wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest dasjenige Licht, welches durch die Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit gestreut wird, über einen Analysator (12) auf den Photodetektor (13) auftrifft, wobei die Polarisations ebene des Analysators senkrecht zur Polarisationsebene des linear polarisierten Lichtes steht.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Polarisationsebene des phasenmodulierten Lichtstrahls in bezug auf die Polarisationsebene des zweiten polarisierten Lichtstrahls um 90° gedreht wird und daß der phasenmodulierte Lichtstrahl nach Passieren des Analysators auf den Photodetektor auftrifft.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite polarisierte Lichtstrahl nach Passieren eines Halbwellenlängenplättchens auf den Phasenmodulator trifft.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangssignal des Photodetektors (13) durch einen Synchron-Detektor (19) verarbeitet wird, in welchen ein Referenzsignal der Frequenz m ω₀/2π eingegeben wird, wobei ω₀ die Winkelfrequenz der Phasenmodulation und m eine natürliche Zahl sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß m=1 ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite polarisierte Lichtstrahl derart phasenmoduliert wird, daß der Modulationsindex a gleich 2 ist.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangssignal des Photodetektors in ein Filter eingegeben wird, das zumindest ein Durchlaß-Band aufweist mit der Mittenfrequenz m ω₀/2π, wobei l₀ die Winkelfrequenz der Phasen modulation und m eine natürliche Zahl sind.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen aus Polystyren-Latex bestehen.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen durch die Antigen/Antikörper-Reaktion gebildet werden.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß solches Licht in den Photodetektor (13) eingegeben wird, welches in derjenigen Richtung gestreut wird, in welcher der erste polarisierte Lichtstrahl auf die Reaktionsflüssigkeit auftrifft.

13. Vorrichtung zum Messen einer Antigen/Antikörper-Reaktion mittels eines polarisierten Lichtstrahles, welcher in einen ersten und einen zweiten polarisierten Lichtstrahl (5, 6) aufgeteilt ist, wobei der erste polarisierte Lichtstrahl (5) auf die Reaktionsflüssigkeit gerichtet ist, die feine Teilchen enthält, welche durch eine der drei folgenden Möglichkeiten gebildet sind:

gekennzeichnet durch

- einen Phasenmodulator (16) zum Phasenmodulieren des zweiten polarisierten Lichtstrahls mit einer vorgegebenen Winkelfrequenz ω₀ der Phasenmodulation, um einen phasenmodulierten Lichtstrahl zu erzeugen;
- einen Analysator (12), dessen Polarisation von derjenigen des polarisierten Lichtstrahles verschieden ist;
- eine Einrichtung (10 a, 10 b) zum Lenken des von den Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit gestreuten Lichtes auf den Analysator (12);
- einen Phasendetektor (13) zum Empfangen von aus dem Analysator austretendem Licht sowie des genannten phasenmodulierten Lichtstrahles, um ein Ausgangssignal zu erzeugen; und
- eine Signalverarbeitungseinrichtung (19) zum Verarbeiten des Ausgangssignals des Photodetektors (13) unter Berücksichtigung der genannten Winkelfrequenz der Phasenmodulation, um die Antigen/Antikörper-Reaktion in der Reaktionsflüssigkeit zu messen.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Lichtquelle ein Laser vorgesehen ist, der einen kohärenten Laserstrahl erzeugt und daß ein Polarisator (3) vorgesehen ist, um diesen kohärenten Laserstrahl linear zu polarisieren.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Polarisationsebene des Polarisators (3) senkrecht zur Polarisationsebene des Analysators (12) steht.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einrichtung (11) zum Zusammenführen des von den Teilchen gestreuten Lichtes und des phasenmodulierten Lichtstrahles vorgesehen ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Vereinigungseinrichtung (11) zwischen der Zelle (8) und dem Analysator (12) angeordnet ist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einrichtung (18) vorgesehen ist, um die Polarisationsebene des zweiten polarisierten Lichtstrahles (6) um 90° zu drehen.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13-18, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Verarbeiten des Signals einen Synchron- Detektor (19) aufweist, um das Ausgangssignal des Photodetektors (13) synchron mit einem Referenzsignal zu messen, welches die Frequenz m ω₀/2π aufweist, wobei m eine natürliche Zahl ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein Oszillator (17) vorgesehen ist, um das Referenzsignal zu erzeugen, wobei ein Ausgangssignal des Oszillators in den Phasenmodulator (16) eingegeben wird, um die Phasenmodulation durchzuführen.

21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13-20, dadurch gekennzeichnet, daß als Phasenmodulator (16) ein optischer Kristall (21) vorgesehen ist, in dem ein optischer Weg definiert ist und an dem ein Paar von Elektroden (22 a, 22 b; 23 a, 23 b) angeordnet sind.

22. Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden (22 a, 22 b) beiderseits des Lichtweges angeordnet sind.

23. Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden (23 a, 23 b) aus lichtdurchlässigem Material gefertigt sind und am Eingang bzw. am Ausgang des optischen Weges im Kristall angeordnet sind.