DE3643108A1 - Verfahren und vorrichtung zum messen immunologischer reaktionen mittels phasenmodulierten lichtes - Google Patents
Verfahren und vorrichtung zum messen immunologischer reaktionen mittels phasenmodulierten lichtesInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum
Messen immunologischer Antigen/Antikörper-Reaktionen mit Hilfe
von Phaseninformationen polarisierten Lichtes, welches durch in
der Reaktionsflüssigkeit suspendierte feine Teilchen gestreut
wird.
Die immunologische Analyse wurde entwickelt, um Immun-Substanzen,
Hormone, Medikamente und andere Komponenten, wie Immun-Regulatoren,
welche in geringen Mengen in lebenden Körpern vorhanden
sind, mittels spezifischer immunologischer Reaktionen zu
vermessen. Die immunologische Analyse kann grob in zwei Gruppen
eingeteilt werden: Bei der markierenden immunologischen Analyse
werden Enzyme und Isotope als Indikatoren benutzt, während bei
der nicht-markierenden immunologischen Analyse die Antigen/Antikörper-
Komplexe direkt gemessen werden.
Bei der erstgenannten markierenden immunologischen Analyse sind
insbesondere bekannt die Radio-Immuno-Analyse (RIA), die Enzym-
Immuno-Analyse (EIA) und die Fluoro-Immuno-Analyse (FIA). Diese
Analysemethoden haben den Vorteil hoher Empfindlichkeit, sind
aber mit dem Nachteil behaftet, daß die Handhabung der Isotope
sowie der verbrauchten Flüssigkeit schwierig ist. Auch sind die
Meßzeiten sehr lang und die für die Markierung erforderlichen
Substanzen teuer, so daß die Analysekosten pro Probe verhältnismäßig
groß sind.
Bei der vorstehend genannten nicht-markierenden immunologischen
Analyse sind insbesondere die Immuno-Elektrophorese, die Immuno-
Diffusion und die Sedimentation bekannt. Diese Verfahren
sind recht einfach, haben jedoch nicht die erforderliche
Empfindlichkeit, Meßgenauigkeit und Reproduzierbarkeit, um für
präzise Messungen geeignet zu sein.
In der Zeitschrift "Immuno Chemistry", Vol. 12, Nr. 4 (1975),
S. 349 bis 351, wird eine immunologische Analyse vorgeschlagen,
bei der Antigene oder Antikörper, die auf den Oberflächen feiner
Teilchen gebunden sind, mit Antikörpern bzw. Antigenen reagieren,
die in einer Prüfflüssigkeit vorliegen, und eine mittlere
Diffusionskonstante wird gemessen, welche ein Maß für die
Brown'sche Molekularbewegung der aus agglutinierten Partikeln
zusammengesetzten Aggregate ist. Die mittlere Diffusionskonstante
wird aus der Änderung der spektralen Breite von Laser-
Licht ermittelt, welches in der Lösung der Teilchen gestreut
wird. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß kein Reagens benutzt
werden muß. Da aber die Aufweitung des Spektrums aufgrund
des Doppler-Effektes entsprechend der Brown'schen Bewegung der
Aggregate mittels einer Spektrometers gemessen wird, handelt es
sich um eine sehr große und teure Vorrichtung. Wird das
Spektrometer mechanisch betrieben, so können sich Fehler einschleichen
und die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Messung
läßt zu wünschen übrig. Die bei diesen bekannten Verfahren
vorgesehene Messung der mittleren Diffusionskonstante aufgrund
der spektralen Breite ermöglicht auch nur eine begrenzte Information
über die Antigen/Antikörper-Reaktionen.
In der DE-OS 35 25 719 der Anmelderin ist ein Verfahren zum
Messen einer Antigen/Antikörper-Reaktion beschrieben, bei dem
die Schwankungen der Lichtintensitäten von an den Teilchen gestreutem
Licht gemessen werden.
Anschließend hat die Anmelderin eine Weiterentwicklung dieses
Analyseverfahrens vorgeschlagen (DE-OS 36 39 352), bei dem
linear polarisiertes Licht nach dem Durchtritt durch einen
Polarisator auf die Reaktionsflüssigkeit gerichtet wird und das
durch Teilchen gestreute Licht mittels eines Analysators nachgewiesen
wird, dessen Polarisationsebene senkrecht zu der des
Polarisators steht. Bei diesem Verfahren wird ausgenutzt, daß
bei der Streuung von linear polarisiertem Licht durch die Teilchen
die Polarisationseigenschaften des gestreuten Lichtes sehr
empfindlich von der Antigen/Antikörper-Reaktion abhängen.
Aber auch dieses Verfahren ist verbesserungsfähig. Soll die
Meßempfindlichkeit durch Erhöhung der Konzentration der Teilchen
verbessert werden, treten Vielfachstreuungen auf, weshalb
das gestreute Licht auch Polarisationskomponenten enthält, die
senkrecht zur Polarisationsebene des einfallenden, linear polarisierten
Lichtstrahles stehen, obwohl die Antigen/Antikörper-
Reaktion noch nicht in der Zelle stattgefunden hat, so daß die
Empfindlichkeit insgesamt gesenkt wird und die immunologische
Reaktion nicht genau vermessen werden kann.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und
eine Vorrichtung zum Messen von immunologischen Reaktionen
bereitzustellen, bei dem bzw. der die Meßempfindlichkeit erhöht
werden kann, ohne daß die Meßgenauigkeit und Meßzuverlässigkeit
beeinträchtigt werden, wobei die Messung schnell, automatisch
und ohne teure Reagenzien oder teure Spektrometer durchgeführt
werden kann.
Ein Verfahren und eine Vorrichtung, die diese Aufgabe lösen,
sind mit Ausgestaltungen in den Patentansprüchen gekennzeichnet.
Wenn linear polarisiertes Licht auf die eine Reaktionsflüssigkeit
enthaltende Zelle fällt, wird das Licht durch die in der
Reaktionsflüssigkeit vorhandenen feinen Teilchen gestreut und
der Polarisationszustand des gestreuten Lichtes hängt ab vom
Agglutinationszustand der Teilchen. Nicht agglutinierte Teilchen
haben im wesentlichen eine runde Form (kugelförmig), weshalb
das durch die runden Teilchen nach vorne gestreute Licht
in der gleichen Polarisationsebene linear polarisiert ist wie
das einfallende, linear polarisierte Licht, solange der Durchmesser
d des Teilchens hinreichend klein gegenüber der Wellenlänge
λ (d«λ) ist. Erfolgt eine Antigen/Antikörper-Reaktion und
binden sich die Teilchen aneinander, so haben die agglutinierten
Teilchen nicht mehr Kugelform und weisen optische Anisotropie
auf. Deshalb weist das durch diese agglutinierten Teilchen
gestreute Licht Polarisationskomponenten auf, die nicht in der
Polarisationsebene des einfallenden Lichtes liegen und auch die
Phase des gestreuten Lichtes schwankt nicht. Wird deshalb angenommen,
daß nur eine einzige Vorwärtsstreuung auftritt, d. h.
das einfallende Licht wird nur ein einziges Mal gestreut, so
kann nur das durch die agglutinierten Teilchen gestreute Licht
selektiv dadurch nachgewiesen werden, daß das gestreute Licht
über einen Analysator empfangen wird, dessen Polarisationsebene
von der des einfallenden Lichtes verschieden ist. In diesem
Falle ändert sich das Ausgangssignal eines Photodetektors entsprechend
dem Agglutinationszustand der Teilchen, d. h. das Ausmaß
der Antigen/Antikörper-Reaktion geht in das Ausgangssignal
ein, so daß die immunologische Reaktion durch eine Verarbeitung
des Ausgangssignals des Photodetektors vermessen werden kann.
Es ist aber erforderlich, zur Erhöhung der Meßempfindlichkeit
die Konzentration der Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit zu
erhöhen. Das Licht wird dann aber mehrfach durch die Teilchen
gestreut. Bei einer derartigen Mehrfachstreuung kann die Phase
des gestreuten Lichtes nach Zufallsgrenzen schwanken, auch
wenn die Teilchen kugelförmig sind und das Licht nach vorne
gestreut wird, d. h. wenn keine Agglutinationsreaktion erfolgt.
Somit fällt auch dann, wenn das gestreute Licht durch einen
Analysator beobachtet wird, mehrfach von nicht-agglutinierten
Teilchen gestreutes Licht auf den Photodetektor. Deshalb läßt
sich die Messung nicht mit der gewünschten Genauigkeit ausführen.
Die Erfindung macht sich die Erkenntnis zunutze, daß die Phase
des durch nicht-agglutinierte Teilchen mehrfach in Vorwärtsrichtung
gestreuten Lichtes nach Zufallsgesetzen schwankt.
Gemäß der Erfindung wird deshalb ein Teil des einfallenden
Lichtes abgetrennt und bezüglich seiner Phase moduliert und das
phasenmodulierte Licht wird zusammen mit dem gestreuten, aus
der Meßzelle stammenden Licht auf den Photodetektor gelenkt.
Das Ausgangssignal des Photodetektors wird entsprechend der
Winkelfrequenz der Phasenmodulation des phasenmodulierten
Lichtes verarbeitet. Auf diese Weise ist es möglich, selektiv
diejenige Lichtkomponente nachzuweisen, die durch die agglutinierten
Teilchen nur ein einziges Mal gestreut wurde. Die Phase
dieser Lichtkomponente ist kohärent mit der des einfallenden
Lichtes.
Der elektrische Feldvektor E des auf eine Empfangsfläche des
Photodetektors fallenden Lichtes kann wie folgt beschrieben
werden:
E = E 1cos[ω t+Φ 1]+E 2cos [ω t+Φ 2(t-)]+E 3cos[ω t+ acosω 0 t+Φ 3] (1)
In dieser Gleichung (1) bedeutet E 1cos(l t+Φ 1) die Intensität
des elektrischen Feldes des durch agglutinierte Teilchen ein
einziges Mal gestreuten Lichtes und Φ 1 die Phasenkonstante. Der
zweite Term E 2cos(ω t+Φ 2(t)) bedeutet die Intensität des elektrischen
Feldvektors des durch nicht-agglutinierte Teilchen
mehrfach gestreuten Lichtes und Φ 2(t) bezeichnet die zufällige
Phasenkonstante. Der dritte Term E 3cos(ω t+ acosl 0 t+Φ-3) bezeichnet
die Intensität des eletrischen Feldes des einfallenden
Lichtes, welches durch den Term acosl 0 t phasenmoduliert ist,
wobei ω 0 die Winkelfrequenz der Phasenmodulation ist. Φ 1 bezeichnet
eine Phasenkonstante, die im allgemeinen verschieden
von Φ 3 ist.
Ganz allgemein kann das Ausgangssignal E 2 des Photodetektors
wie folgt dargestellt werden:
In der vorstehenden Gleichung (2) hat nur der fünfte Term eine
Komponente, die mit der Winkelfrequenz n ω 0 variiert (n ist eine
natürliche Zahl), da sowohl die vierte als auch der sechste
Term Zufallskomponenten cosΦ 2(t) und sinΦ 2(t) aufweisen, so
daß die Mittelwerte zu Null werden. Der fünfte Term kann
mittels einer Bessel-Funktion wie folgt beschrieben werden:
In der vorstehenden Gleichung (3) kann die Amplitude derjenigen
Komponente, die mit der Winkelfrequenz (2n-1)ω 0 variiert, wie
folgt ausgedrückt werden:
E 1 E 3sin(Φ 1-Φ 3)J 2n-1(a) (4)
Fernerhin kann die Amplitude derjenigen Komponente, die mit der
Winkelfrequenz 2n ω 0 variiert, wie folgt ausgedrückt werden:
E 1 E 3cos(Φ 1-Φ 3)J 2n (a) (5)
Werden demnach nur diejenigen Komponenten des Ausgangssignals
selektiv nachgewiesen, die Winkelfrequenzen ω 0, 2ω 0, 3ω 0, 4ω 0
. . ., d. h. m ω 0 (m ist eine natürliche Zahl) aufweisen, so ist es
möglich, dasjenige Licht zu messen, das durch die agglutinierten
Teilchen nur ein einziges Mal gestreut wurde. Aufgrund
der Charakteristik der Bessel-Funktion ist es möglich,
mit den Werten m = 1 und a = 2 das maximale Ausgangssignal zu erzielen.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher beschrieben.
Es zeigt bzw. zeigen:
Fig. 1 eine schematische Ansicht einer Vorrichtung zum Vermessen
einer immunologischen Reaktion; und
Fig. 2A und 2B perspektivische Ansichten des bei der Vorrichtung
gemäß Fig. 1 benutzten Phasenmodulators.
Fig. 1 zeigt schematisch eine Vorrichtung zum Vermessen einer
immunologischen Reaktion. Bei diesem Ausführungsbeispiel dient
als Lichtquelle zur Erzeugung kohärenten Lichtes ein He/Ne-Gaslaser
1, der einen Laserstrahl der Wellenlänge 632,8 nm emittiert.
Die kohärentes Licht erzeugende Lichtquelle kann aber
auch durch einen Festkörper-Laser, wie einen Halbleiterlaser,
realisiert sein. Der Laserstrahl 2 aus der Lichtquelle 1 passiert
den Polarisator 3, der aus einem Glan-Thompson-Prisma
geformt sein kann, und wird sodann durch einen halbdurchlässigen
Spiegel 4 in die beiden Lichtstrahlen 5 und 6 aufgeteilt.
Der Lichtstrahl 5 wird durch die Sammellinse 7 konzentriert und
auf die Zelle 8 gerichtet. Die Zelle 8 besteht aus durchsichtigem
Quarz.
In der Zelle 8 (Reaktionszelle) befindet sich eine Antigen/Antikörper-
Reaktionsflüssigkeit 9, die eine Mischung aus einer
Pufferlösung, in welcher feine kugelförmige Teilchen, wie Polystyren-
Latex-Teilchen, suspendiert sind, und einer Probe aus
Antigenen oder Antikörpern ist, welche vermessen werden sollen.
Auf die äußeren Flächen der Teilchen sind Antikörper oder Antigene
gebunden, wie z. B. Immuno-Globulin G (IgG), welches spezifisch
mit dem Antigen oder Antikörper in der Probe reagiert. In
der Zelle 8 findet deshalb die Antigen/Antikörper-Reaktion
statt und es entstehen Anziehungskräfte zwischen den Teilchen.
Die Teilchen agglutinieren deshalb miteinander, um Aggregate zu
bilden, weshalb die Polarisationseigenschaften des gestreuten
Lichtes entsprechend der Form und Größe der Aggregate variieren.
Das von den Teilchen in der Zelle 8 gestreute Licht passiert
einen Kollimator aus einem Paar von Schlitzen 10 a, 10 b, einem
halbdurchlässigen Spiegel 11 und einem Analysator 12, und fällt
dann auf einen Photodetektor 13, für den ein Photoelektronen-
Vervielfacher vorgesehen ist, der eine sehr hohe Empfindlichkeit
aufweist. Der Analysator 12 hat eine Polarisationsebene,
die zu der des Polarisators 3 senkrecht steht. Beim gezeigten
Ausführungsbeispiel empfängt der Photodetektor 13 dasjenige
Licht, welches aus der Zelle in der gleichen Richtung gestreut
wird, in welcher der einfallende Lichtstrahl 5 eintrifft.
Der durch den halbdurchlässigen Spiegel 4 abgetrennte Lichtstrahl
6 wird an einem Spiegel 14 reflektiert und passiert ein
Halbwellenlängenplättchen 15, so daß seine Polarisationsebene
um 90° gedreht wird und derjenigen des Analysators 12 entspricht.
Das aus dem Halbwellenlängenplättchen 15 austretende
Licht fällt auf einen Phasenmodulator 16 und wird mit einem
Modulationsspiegel phasenmoduliert, dessen Winkelfrequenz ω 0 vom
Oszillator 17 bereitgestellt wird, so daß das linear polarisierte
Licht eine Phase aufweist, die gemäß der Formel
cos(ω t+acosω 0 t+Φ 3) variiert. Das auf diese Weise phasenmodulierte
Licht fällt auf den Photodetektor 13, nachdem es vom
Spiegel 18 und vom halbdurchlässigen Spiegel 11 reflektiert
wurde und den Analysator 12 passiert hat.
Ein Ausgangssignal des Photodetektors 13 wird in den Synchrondetektor
19 eingegeben, der einen Synchron-Nachweis in bezug
auf das Referenzsignal der Frequenz ω 0/2 erzeugt, welches vom
Oszillator 17 bereitgestellt wird. Ein Ausgangssignal des Synchron-
Detektors 19 wird in die Anzeigeeinrichtung 20 eingegeben
und dort angezeigt. Beim gezeigten Ausführungsbeispiel wird das
Ausgangssignal des Photodetektors 13 synchron gemäß der Frequenz
ω 0/2 nachgewiesen. Die Frequenz ω 0/2 kann so gesetzt
werden, daß sie etwa 2 KHz größer ist als die Doppler-Frequenz.
Der Modulationsindex a des Phasenmodulators 16 wird vorzugsweise
so bestimmt, daß die Gleichungen (4) und (5) maximale
Werte annehmen, so daß die höchste Empfindlichkeit erreicht
wird. Dies bedeutet, daß a = 2 ist.
Wie vorstehend erläutert ist, hängt das Ausgangssignal des Synchron-
Detektors 19 allein von demjenigen Licht ab, das durch
die agglutinierten Teilchen ein einziges Mal gestreut wurde,
weshalb dieses Signal auch ein Maß für die Konzentration der
Antigene oder Antikörper in der Probe ist. Mittels einer zuvor
aufgenommenen Eichkurve unter Verwendung von Standardproben mit
bekannten Konzentrationen ist es deshalb möglich, die unbekannten
Konzentrationen einer Probe mittels des Ausgangssignals des
Synchron-Detektors 10 zu messen. Wie sich ferner aus den Gleichungen
(4) und (5) ergibt, kann das Ausgangssignal des Photodetektors
13 durch das Produkt aus E 1 und E 3 repräsentiert
werden und es ist möglich, das Ausgangssignal des Synchron-Detektors
durch Erhöhung von E 3 zu verstärken. Da der Einfluß
einer Mehrfachstreuung durch nicht-agglutinierte Teilchen vermieden
ist, ist es möglich, die Messung mit hoher Empfindlichkeit
dadurch zu erhöhen, daß die Anzahl der Teilchen in der
Reaktionsflüssigkeit erhöht wird.
Die Fig. 2A und 2B zeigen zwei Ausführungsbeispiele für einen
in einer Vorrichtung gemäß Fig. 1 zu verwendenden Phasenmodulator
16. Der Phasenmodulator 16 benutzt den Pockels-Effekt,
wonach die Phase eines durch einen Kristall gehenden Lichtstrahles
dadurch moduliert werden kann, daß ein elektrisches
Feld an den Kristall angelegt wird. Beim Ausführungsbeispiel
gemäß Fig. 2A ist ein Paar von Elektroden 22 a und 22 b auf
gegenüberliegenden Seiten des durch den optischen Kristall 21
gehenden Lichtstrahles angeordnet und es wird ein elektrisches
Feld zwischen den Elektroden mittels des Oszillators 17 erzeugt,
dessen Winkelfrequenz ω 0 ist. Beim Ausführungsbeispiel
gemäß 2B ist ein Paar von lichtdurchlässigen Elektroden 23 a und
23 b auf den Eingangs- bzw. Ausgangsflächen des optischen Kristalles
21 angeordnet und das elektrische Feld wird zwischen
diesen Elektroden erzeugt.
Bei den vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispielen sind
u. a. folgende Abwandlungen möglich. Statt des Immuno-Globulins
G (IgG) kann zur Prüfung des Antigens auch eine andere Substanz,
wie Immuno-Globulin A (IgA), IgM, IgD, IgE, Australia-
Antigen oder Insurin verwendet werden, welche eine Agglutination
während der Antigen/Antikörper-Reaktion verursachen. Beim
vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiel sind die Antikörper
auf der Teilchenoberfläche gebunden und es wird das in der
Probe enthaltene Antigen vermessen, es ist aber offensichtlich
auch möglich, Antikörper in der Probe zu vermessen, wobei Antigene
auf den Teilchen gebunden sind. Statt der Polystyren-Latex-
Teilchen können auch andere organische Teilchen und inorganische
Teilchen, wie Glaskügelchen, verwendet werden. Bei den
beschriebenen Ausführungsbeispielen sind die Teilchen bereits
vor der Reaktion in der Prüfflüssigkeit vorhanden, es ist jedoch
auch möglich, Partikelsubstanzen zu verwenden, die während
der Antigen/Antikörper-Reaktion erzeugt werden. Wird beispielsweise
menschliches Villus gonadotropin (HCG) als Antigen und
nichtmenschliches Villus gonadotropin (Anti-HCG) als Antikörper
verwendet, dann können die durch die Antigen/Antikörper-
Reaktion erzeugten Antigen-Antikörper-Komplexe als Partikel
verwendet werden. Auch kann das Antigen selbst als Partikel-
Substanz eingesetzt werden. Als Beispiel für eine derartige
Antigen/Antikörper-Reaktion sei die Reaktion von Candida-
Albicans genannt werden, wobei letztgenannte als Antigen und
Anti-Candida-Albicans als Antikörper benutzt werden. Auch
können Blut- Korpuskel, Zellen und Mikroorganismen als Partikel
(Teilchen) verwendet werden.
Beim in Fig. 1 gezeigten Ausführungsbeispiel wird die Messung
an einer stehenden Reaktionsflüssigkeit ausgeführt und die zu
untersuchenden Proben werden nacheinander in die Zelle eingegeben,
es ist aber auch möglich, ein strömendes System zu verwenden,
bei dem Antigen/Antikörper-Reaktionen in einer Flüssigkeit
ablaufen, die kontinuierlich durch die Zelle strömt.
Bei den beschriebenen Ausführungsbeispielen wird die Lichtquelle
durch einen kohärentes Licht ausstrahlenden Laser realisiert,
es ist jedoch auch möglich, Lichtquellen zu verwenden,
die nicht-kohärentes Licht ausstrahlen. Auch kann anders als
linear polarisiertes Licht verwendet werden, wie zirkular oder
elliptisch polarisiertes Licht.
Bei dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wird durch den Synchrondetektor
die Signalkomponente des Ausgangssignals des
Photodetektors gemessen, die eine mit der Winkelfrequenz ω 0
modulierte Phase aufweist. Es ist aber auch möglich, gleichzeitig
Frequenzkomponenten nachzuweisen mit den Frequenzen ω 0/2π
und 2l 0/2π, wobei zwei Snychrondetektoren eingesetzt werden,
in welche Referenzsignale der Frequenzen ω 0/2π bzw. 2ω 0/2π
eingegeben werden. Auch kann jede gewünschte Frequenzkomponente
dadurch abgeleitet werden, daß Filter mit Durchlaß-Bändern eingesetzt
werden, deren Mittelfrequenzen jeweils ω 0/2π, 2ω 0/2π
. . . oder m ω 0/2π betragen. In diesen Fällen ist es vorteilhaft,
ein Kombinationsfilter mit einer Vielzahl von Durchlaßbändern
zu verwenden, die jeweils Mittenfrequenzen der Werte ω 0/2π,
2ω 0/2π . . . und m ω 0/2π aufweisen.
Beim oben beschriebenen Ausführungsbeispiel wird der Analysator
vor dem Photodetektor angeordnet, um zu verhindern, daß einmal
von nicht-agglutinierten Teilchen gestreutes Licht und derjenige
Teil des einfallenden Lichtes, der nicht durch die Teilchen
reflektiert wird, auf den Photodetektor fallen. Es ist aber
nicht unbedingt erforderlich, daß das phasenmodulierte Licht
über den Analysator auf den Photodetektor fällt, weshalb der
Analysator auch z. B. vor dem halbdurchlässigen Spiegel 11 angeordnet
werden kann. Dann fällt das phasenmodulierte Licht
direkt auf den Photodetektor. In diesem Fall muß die Einstellung
des optischen Phasenmodulators nicht notwendig streng
sein. Auch in diesem Falle kann aber das Halbwellenlängenplättchen
15 mit Vorteil im Referenzlichtstrahl angeordnet werden.
Wie sich aus der vorstehenden Beschreibung ergibt, wird gemäß
der Erfindung das linear polarisierte Licht in zwei Strahlen
aufgeteilt und einer der Strahlen fällt auf die Reaktionsflüssigkeit,
während der andere Strahl mit der Frequenz ω 0 phasenmoduliert
wird. Der phasenmodulierte Lichtstrahl und von in der
Reaktionsflüssigkeit vorhandenen Teilchen gestreutes Licht werden
gemeinsam auf einen Photodetektor gerichtet und das Ausgangssignal
des Photodetektors wird entsprechend der Modulationsfrequenz
ω 0 synchron nachgewiesen. Auf diese Weise kann
der störende Einfluß von Streulicht, das von nicht-agglutinierten
Teilchen mehrfach gestreut wurde, vermieden oder zumindest
wesentlich gesenkt werden. Die Messung ist deshalb genau und
zuverlässig und die Meßempfindlichkeit kann wesentlich dadurch
gesteigert werden, daß die Konzentration der Teilchen in der
Reaktionsflüssigkeit erhöht wird.
Claims (24)
1. Verfahren zum Messen einer immunologischen Reaktion,
gekennzeichnet durch folgende Schritte:
gekennzeichnet durch folgende Schritte:
- - ein polarisierter Lichtstrahl wird in erste und zweite polarisierte Lichtstrahlen (5, 6) aufgeteilt;
- - der erste polarisierte Lichtstrahl (5) wird auf die Reaktionsflüssigkeit gerichtet, die zumindest Antigene und Antikörper enthält;
- - der zweite polarisierte Lichtstrahl (6) wird mit einer vorgegebenen Winkelfrequenz phasenmoduliert, um einen phasenmodulierten Lichtstrahl zu erzeugen;
- - der phasenmodulierte Lichtstrahl und von Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit gestreutes Licht, das Polarisationskomponenten aufweist, die nicht in der Polarisationsebene des ersten polarisierten Lichtstrahles liegen, werden in einen Photodetektor (13) eingegeben, um ein Ausgangssignal zu erzeugen; und
- - das Ausgangssignal des Photodetektors wird entsprechend der Winkelfrequenz der Phasenmodulation ausgewertet.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein linear polarisierter Lichtstrahl verwendet wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß zumindest dasjenige Licht, welches durch die Teilchen in
der Reaktionsflüssigkeit gestreut wird, über einen Analysator
(12) auf den Photodetektor (13) auftrifft, wobei die Polarisationsebene
des Analysators senkrecht zur Polarisationsebene des
linear polarisierten Lichtes steht.
4. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Polarisationsebene des phasenmodulierten Lichtstrahls
in bezug auf die Polarisationsebene des zweiten polarisierten
Lichtstrahls um 90° gedreht wird und daß der phasenmodulierte
Lichtstrahl nach Passieren des Analysators auf den Photodetektor
auftrifft.
5. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß der zweite polarisierte Lichtstrahl nach Passieren eines
Halbwellenlängenplättchens auf den Phasenmodulator trifft.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Ausgangssignal des Photodetektors (13) durch einen
Synchron-Detektor (19) verarbeitet wird, in welchen ein Referenzsignal
der Frequenz m ω 0/2π eingegeben wird, wobei ω 0 die
Winkelfrequenz der Phasenmodulation und m eine natürliche Zahl
sind.
7. Verfahren nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß m = 1 ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß der zweite polarisierte Lichtstrahl derart phasenmoduliert
wird, daß der Modulationsindex a gleich 2 ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Ausgangssignal des Photodetektors in ein Filter eingegeben
wird, das zumindest ein Durchlaß-Band aufweist mit der
Mittelfrequenz m ω 0/2π, wobei ω 0 die Winkelfrequenz der Phasenmodulation
und m eine natürliche Zahl sind.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit vor der Messung in
die Reaktionsflüssigkeit eingegeben werden und daß Antigene
oder Antikörper auf diesen Teilchen gebunden sind.
11. Verfahren nach Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Teilchen aus Polystyren-Latex bestehen.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Teilchen durch die Antigene/Antikörper-Reaktion gebildet
werden.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß solches Licht in den Photodetektor (13) eingegeben wird,
welches in derjenigen Richtung gestreut wird, in welcher der
erste polarisierte Lichtstrahl auf die Reaktionsflüssigkeit
auftrifft.
14. Vorrichtung zum Messen einer Antigen/Antikörper-Reaktion
mittels polarisierten Lichtes, das auf eine Reaktionsflüssigkeit
trifft, die zumindest Antigene und Antikörper enthält, wobei
durch Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit gestreutes Licht
gemessen wird,
gekennzeichnet durch
- - eine Lichtquelle (1) zum Erzeugen eines Strahles polarisierten Lichtes;
- - eine Zelle (8) in welcher die Antigene und Antikörper enthaltende Reaktionsflüssigkeit (9) enthalten ist;
- - einen Strahlteiler (4) zum Aufteilen des polarisierten Lichtstrahles in einen ersten (5) und einen zweiten (6) polarisierten Lichtstrahl;
- - Einrichtungen (7) zum Lenken des ersten polarisierten Lichtstrahles auf die Zelle (8);
- - einen Phasenmodulator (16) zum Phasenmodulieren des zweiten polarisierten Lichtstrahls mit einer vorgegebenen Winkelfrequenz ω 0 der Phasenmodulation, um einen phasenmodulierten Lichtstrahl zu erzeugen;
- - einen Analysator (12), dessen Polarisation von derjenigen des polarisierten Lichtstrahles verschieden ist;
- - eine Einrichtung (10 a, 10 b) zum Lenken des von den Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit gestreuten Lichtes auf den Analysator (12);
- - einen Photodetektor (13) zum Empfangen von aus dem Analysator austretendem Licht sowie des genannten phasenmodulierten Lichtstrahles, um ein Ausgangssignal zu erzeugen; und
- - eine Signalverarbeitungseinrichtung (19) zum Verarbeiten des Ausgangssignals des Photodetektors (13) unter Berücksichtigung der genannten Winkelfrequenz der Phasenmodulation, um die Antigen/Antikörper-Reaktion in der Reaktionsflüssigkeit zu messen.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Lichtquelle ein Laser vorgesehen ist, der einen kohärenten
Laserstrahl erzeugt und daß ein Polarisator (3) vorgesehen
ist, um diesen kohärenten Laserstrahl linear zu polarisieren.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Polarisationsebene des Polarisators (3) senkrecht zur
Polarisationsebene des Analysators (12) steht.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine Einrichtung (11) zum Zusammenführen des von den Teilchen
gestreuten Lichtes und des phasenmodulierten Lichtstrahles
vorgesehen ist.
18. Vorrichtung nach Anspruch 17,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Vereinigungseinrichtung (11) zwischen der Zelle (8) und
dem Analysator (12) angeordnet ist.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine Einrichtung (18) vorgesehen ist, um die Polarisationsebene
des zweiten polarisierten Lichtstrahles (6) um 90° zu
drehen.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14-19,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Einrichtung zum Verarbeiten des Signals einen Synchron-
Detektor (19) aufweist, um das Ausgangssignal des Photodetektors
(13) synchron mit einem Referenzsignal zu messen, welches
die Frequenz m ω 0/2π aufweist, wobei m eine natürliche Zahl ist.
21. Vorrichtung nach Anspruch 20,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein Oszillator (17) vorgesehen ist, um das Referenzsignal
zu erzeugen, wobei ein Ausgangssignal des Oszillators in den
Phasenmodulator (16) eingegeben wird, um die Phasenmodulation
durchzuführen.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14-21,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Phasenmodulator (16) ein optischer Kristall (21) vorgesehen
ist, in dem ein optischer Weg definiert ist und an dem
ein Paar von Elektroden (22 a, 22 b; 23 a, 23 b) angeordnet sind.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Elektroden (22 a, 22 b) beiderseits des Lichtweges angeordnet
sind.
24. Vorrichtung nach Anspruch 22,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Elektroden (23 a, 23 b) aus lichtdurchlässigem Material
gefertigt sind und am Eingang bzw. am Ausgang des optischen
Weges im Kristall angeordnet sind.
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