DE2905435A1 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von antigenen und antikoerpern - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern durch Fixieren des Antikörpers oder des Antigens an unlösliehen Trägerteilchen mit geringen Teilchendurchmessern, wodurch die unlöslichen Trägerteilchen sensibilisiert werden, Umsetzen der sensibilisierten Trägerteilchen mit einem entsprechenden Antigen, Antikörper oder einer Mischung davon und Bestrahlen der Reaktions-5 mischung mit Licht einer spezifischen Wellenlänge zur Messung des durchgelassenen Lichts an zwei oder mehreren Zeitpunkten und Ermitteln der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung während einer gegebenen Zeitdauer, sowie

20 eine für dieses Verfahren geeignete Vorrichtung.

Es besteht ein ständiges Bedürfnis für ein Verfahren und eine Vorrichtung zur schnellen und genauen qualitativen und quantitativen Bestimmung von biologisch

aktiven Substanzen, beispielsweise von Antigenen und Antikörpern, die in extrem geringen Konzentrationen vorliegen. Es besteht weiterhin ein starkes Bedürfnis dafür, die Anwesenheit von Arzneimittelwirkstoffen in Körperflüssigkeiten festzustellen. Weiterhin ist es für die medizinische Diagnose häufig wichtig, über die Anwesenheit von verschiedenen Substanzen Bescheid zu wissen, die auf natürlichem Wege von dem Körper synthetisiert werden oder die in den Körper eingebracht worden sind.

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Bislang ist es bereits bekannt, Antikörper oder Antigene halbquantitativ dadurch nachzuweisen, daß man Latexteilchen, an die man einen Antikörper oder ein Antigen fixiert hat, mit einem entsprechenden Antigen oder Antikörper auf einer Glasplatte umzusetzen und visuell den Agglutinationszustand zu beobachten.

In den letzten Jahren ist in den nachstehend angegebenen Veröffentlichungen vorgeschlagen worden, Antigene und Antikörper unter Verwendung der oben erwähnten Latexteilchen quantitativ zu bestimmen, indem man den entsprechenden Antikörper oder das entsprechende Antigen auf den Latexteilchen fixiert, um den Latex zu sensibilisieren, den auf dem Trägermaterial vorliegenden Antikörper oder das auf dem Trägermaterial vorliegende Antigen mit dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper umsetzt, um die Latexteilchen zu agglutinieren oder zusammenzuballen, und die Geschwindigkeit der Abnahme der Trübung der überstehenden Flüssigkeit des Latex¹ mit Hilfe von sichtbarem Licht zu messen, um das Antigen oder den Antikörper unter Ausnützung des Agglutinationsphänomens des als Reagens verwendeten Latex zu be- stimmen:

A) CROATICA CHEMICA ACTA, 42 (1970) 457 bis 466 und

B) European Journal of Biochemistry, Vol. 20, Nr. 4 (1971) 558 bis 560.

Da die Methode des obigen Vorschlags die Messung der Geschwindigkeit der Trübungsabnahme dazu benützt, das Antigen oder den Antikörper zu bestimmen, ist es erforderlich, einen mit dem Antikörper oder dem Antigen sensibilisierten Latex mit extrem geringer Konzentration, die beispielsweise im Bereich von 0,007 bis 0,028% liegt, zu verwenden, die Reaktion des Latex*

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mit dem Antigen oder dem Antikörper in einem stationären Zustand durchzuführen, irgendwelche Verunreinigungen, die die Trübung der Probe beeinträchtigen könnten, zu entfernen und ähnliche Maßnahmen zu ergreifen. Als Ergebnis davon ist die oben erwähnte Methode nachteilig dadurch, daß die Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion unvermeidbar vermindert wird, daß sowohl die Präzision als auch die Reproduzierbarkeit der Meßmethode für die Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern ungenügend sind und daß die Abtrennung von" Verunreinigungen häufig extrem komplizierte Maßnehmen erforderlich macht. Demzufolge ist es schwierig, die obige Methode zur Bestimmung von Antigenen, wie Fibrinogen (Fg), Humanchoriongonadotropin (hCG) oder ähnliche Materialien zu bestimmen, da komplizierte Maßnahmen zur Herstellung des notwendigen Reagens' erforderlich sind und es schwierig ist, eine reproduzierbare Agglutinationsreaktion der Substanz zu erreichen, wenn sie in Blut oder Urin enthalten ist, das bzw. der verschiedene andere

20 Substanzen enthält, die die Reaktion beeinträchtigen können·

In

C) Immunochemistry ,Vol. 12 (1975) 349 bis 351

ist bereits vorgeschlagen worden. Antikörper oder Antigen quantitativ dadurch zu bestimmen, daß man die oben erwähnten agglutinierten Latexteilchen mit einem Laserstrahl bestrahlt und die Änderung der Breite der Spektrallinien des gestreuten Lichtes des Laserstrahls mißt, um die mittlere Diffusionskonstante (D) zu bestimmen, die einen Hinweis auf die Brown¹sehe Bewegung der agglutinierten Teilchen gibt, die ihrerseits umgekehrt proportional ist der Größe der agglutinierten Teilchen. Da bei dieser Methode der Antikörper- oder Antigensensibilisierte Latex in extrem niedriger Konzentration die beispielsweise lediglich 0,001% beträgt, verwendet

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wird, wird die Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion vermindert, so daß sowohl die Präzision als auch die Reproduzierbarkeit dieser Methode zu wünschen übrig lassen. Weiterhin besitzt diese Methode den Nach-5 teil, daß komplizierte Berechnungen unter Anwendung von Spektrumanalysemethoden erforderlich sind, was komplizierte Maßnahmen notwendig macht, und daß irgendwelche in der Probe vorhandenen Verunreinigungen vor der Messung entfernt werden müssen. Aus diesem Grund 10 hat sich auch diese Methode in der Praxis nicht durchsetzen können.

Die obige Literaturstelle C beschreibt ferner, daß die Bestimmung mit Hilfe der in der Literaturstelle A angegebenen Trübungsmeßmethode extrem ungenaue Ergebnisse liefert (siehe Fig. 2 auf Seite 350 dieser Veröffentlichung) .

Das Ergebnis von früheren Untersuchungen der Anmelderin 20 im Hinblick auf Verfahren und Vorrichtungen zur schnellen Bestimmung von Antigenen und/oder Antikörpern in Proben mit hoher Präzision und guter Reproduzierbarkeit ist Gegenstand der älteren Patentanmeldung ρ 27 3 6 805.4 (japanische Patentanmeldung Nr. 97158/76) der Anmelderin 25 (nachfolgend als "älteren Anmeldung" bezeichnet).

Gegenstand dieser älteren Anmeldung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, das darin besteht, einen Antikörper oder ein Antigen, der bzw. das dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper entspricht, auf unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μπι zu fixieren, den auf dem Trägermaterial vorliegenden Antkörper und/oder das auf dem Trägermaterial vorliegende Antigen mit dem zu bestimmenden Antigen,

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dem zu bestimmenden Antikörper oder der zu bestimmenden Mischung davon umzusetzen und die Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μΐη, die um einen Faktor von mindestens 1 ,5 langer ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, zu bestrahlen, um die Extinktion der Reaktionsmischung zu bestimmen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, die in der genannten älteren Anmeldung angegebene frühere Erfindung weiter zu verbessern und eine reproduzierbare, schnelle Bestimmung von Antigenen und Antikörpern mit höherer Präzision zu ermöglichen.

Es hat sich gezeigt, daß diese Aufgabe dadurch gelöst werden kann, daß man die offenbare Geschwindigkeit einer Antigen-Antikörper-Reaktion über die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung für Licht mit einer

20 Wellenlänge in dem oben angesprochenen nahen Infrarotbereich mißt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur genauen, schnellen Bestimmung von Antigenen und Anti-

körpern, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Antigen, einen Antikörper oder eine Mischung davon in einem flüssigen Medium mit dem entsprechenden Antikörper und/oder Antigen, das auf unlösliche Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 um vorliegt, wodurch die Trägerteilchen sensibilisiert werden, umsetzt, die Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μΐη bestrahlt, um das durchgelassene Licht an zwei oder mehreren Zeitpunkten während des 5 Ablaufs der Reaktion zu messen, und anschließend die Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption

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der Reaktionsmischung während einer gegebenen Zeitdauer ermittelt bzw. errechnet.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, die gekennzeichnet ist durch

a) unlösliche Trägerteilchen für den Antikörper oder das Antigen, der bzw. das dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper entspricht, welche Trägerteilchen

10 einen durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μη aufweisen;

b) eine Absorptionszelle mit einer Dicke von 0,5 bis 10 mm zur Aufnahme der Reaktionsmischung aus einem Antikörper oder Antigen, der bzw. das auf dem unlösliehen Trägermaterial vorliegt, und dem zu bestimmenden Antigen, Antikörper oder der Mischung davon in einem flüssigen Medium;

c) eine Bestrahlungseinrichtung zum Bestrahlen mit Licht mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich

20 von 0,6 bis 2,4 μΐη;

d) eine Einrichtung zum Messen der Intensität des Lichts mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μΐη, mit dem die Reaktionsmischung in der Absorptionszelle bestrahlt worden ist und das

25 von der Reaktionsmischung durchgelassen worden ist; und

e) eine Einrichtung zur Ermittlung oder Errechnung der Änderung der Extinktion oder der prozentualen
Absorption der Reaktionsmischung bei der in der

Stufe d gemessenen Wellenlänge in Abhängigkeit von der Reaktionszeit, welche Ermittlungseinrichtung in Abhängigkeit von der Meßeinrichtung betrieben wird.

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Die Erfindung sei nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert.

In der Zeichnung zeigen

Fig. 1 das Absorptionsspektrum von Wasser, das unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von O₇ 6 bis 2,4 μΐη in einer Absorptionszelle mit einer Dicke von 1 mm

aufgenommen wurde; 10

Fig. 2 anhand einer Kurve die Änderung der Extinktion

in Abhängigkeit von dem Teilchendurchmesser eines Polystyrollatex¹;

Fig. 3 anhand einer Kurve die zeitliche Änderung der Extinktion für Licht einer Wellenlänge von 950 nm, die während des Ablaufs der Reaktion aufgezeichnet wurde, welche Reaktion dadurch verursacht wird, daß man Standardfibrinogenlösungen unterschiedlicher Konzentrationen zu einer Mischung von Polystyrol-

latices mit durchschnittlichen Teilchendurchmessern von 0,091 und 0,220 μπι, die mit Anti-(humanfibrinogen)-Antikörpern sensibilisiert worden sind, zugibt;

Fig. 4 anhand einer Kurve die Beziehung zwischen der

aus der Fig. 3 ermittelten Zunahme der Extinktion und der Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung;

Fig. 5a

anhand einer Kurve die Änderung der prozentualen

Absorption in Abhängigkeit von der Zeit bei einer maximalen Emissionswellenlänge von 940 nm, die während des "Ablaufs der Reaktion aufgezeichnet worden ist, welche Reaktion dadurch ausgelöst worden ist, daß man Standard-Humanchor iongonadotropin-Lösungen unterschied-

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licher Konzentrationen zu einem mit Antihumanchoriongonadotropin sensibilisiertem Latexreagens zugibtj

Fig. 5b eine von der Fig. 5a abgeleitete Kurve, bei der die prozentuale Absorption in die

Extinktion umgewandelt worden ist;

Fig. 6a eine Kurve, die die Beziehung zwischen der

Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption, die aus der Fig. 5a entnommen worden ist, und der Konzentration der eingesetzten Standard-Humanehöriongonadotropin-Lösungen wiedergibt;

Fig. 6b eine Kurve, die die Beziehung zwischen der aus der Fig. 5b gewonnenen Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion und der Konzentration der Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen wiedergibt;

Fig. 7 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und

der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption bei 950 nm wiedergibt, welch letztere bei der Reaktion eines mit Antihumanchoriongonadotropin sensibilisierten 2 5 Latexreagens' mit einem durchschnittlichen

Teilchendurchmesser von 0,220 μπι mit Standard-Humanchor iongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentration ermittelt worden ist;

Fig. 8 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der

Fibrinogenkonzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption bei 950 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Antifibrinogen sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen

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Teilchendurchmesser von 0,312 μΐη mit Standard-Fibrinogenlösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist; Fig. 9 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und

der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption für polychromatisches Licht mit Wellenlängen von 800 bis 1100 mn wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Antihumanchorxongonadotropxn sensibili-

sierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 μπι mit den Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen

15 ermittelt worden ist;

Fig. 10 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption für Licht mit einer Wellenlänge der maximalen Emission von 940 nm wiedergibt, die mit Hilfe eines Integrators bei der Umsetzung eines mit Anti-Humanchoriongonadotropin sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teil-

chendurchmesser von 0,220 μπι mit Standard-

Humanchoriongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist;

Fig. 11 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konz entration und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 950 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Anti-Humanchoriongonadotropin sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser

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von 0,220 μΐη mit Standard-Humanehoriongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist;

Fig. 12 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der

Fibrinogen-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 900 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Antifibrinogen sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 μπι und Standard-Fibrinogenlösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist;

Fig. 13 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 1100 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Antihumanchoriongonadotropin sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 1,09 μια und Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist;

Fig. 14 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Fibrinogen-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 1650 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Antifibrinogen sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 μπ\ und Standard-

Fibrinogenlösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist; und

Fig. 15 ein schematisches Diagramm, das den Grundaubau einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung wiedergibt, in der

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1 für einen Monochromator;

2 für einen halbdurchlässigen Spiegel;

3 für eine Blende;

4 für einen Kompensationsdetektor; 5 5 für eine Absorptionszelle;

6 für einen Probendetektor;

7 für einen Verstärker;

8 für eine Aufzeichnungsvorrichtung und

9 für einen Integrator 10 stehen.

Mit Hilfe des Verfahrens und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann eine extrem geringe Menge eines Antigens und/oder eines Antikörpers, die in der Praxis bislang nur mit Hilfe der Radioimmunoassay-Methode (RIA) bestimmt werden konnte, schneller und sicherer und mit einer Präzision nachgewiesen werden, die gleich oder größer ist als die Präzision der Radioimmunoassay-Methode (Radioimmuntest).

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es weiterhin möglich, nicht nur multivalente Antigene, sondern auch unvollständige Antigene, beispielsweise Haptene, mit hoher Präzision zu bestimmen, wobei die Antigene und/oder die Antkörper nicht nur über ihre Agglutinationsreaktion, sondern auch über ihre Agglutinations-Inhibierung nachgewiesen werden können.

Wie bereits erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, das darin besteht, ein Antigen oder einen Antikörper oder eine Mischung davon in einem flüssigen Medium mit dem entsprechenden Antikörper und/oder

35 Antigen, der bzw. das auf unlöslichen Trägerteilchen

mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr

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als 1 ,6 μΐη vorliegt oder an diesen fixiert ist, so
daß die Trägerteilchen sensibilisiert sind,umzusetzen, die Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μΐη zu bestrahlen oder zu belichten, um das von der Reaktionsmischung durchgelassene Licht an zwei oder mehreren
Zeitpunkten im Verlaufe der Reaktion zu messen, und
dann die Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung während einer gegebenen Zeitdauer zu ermitteln bzw. zu errechnen.

Der oben erwähnte Ausdruck "Reaktionsmischung" steht, wie aus der obigen Beschreibung hervorgeht, nicht für eine Reaktionsmischung, indem die Antigen-Antikörper-Reaktion bereits vollständig abgelaufen ist, sondern

für eine Reaktionsmischung,in der die Reaktion abläuft. Somit ist die erfindungsgemäße Bestimmung dadurch gekennzeichnet, daß sie die scheinbare oder offenbare Reaktionsgeschwindigkeit einer solchen Reaktions-

20 mischung, in der eine Antigen-Antikörper-Reaktion abläuft, mißt, und zwar über die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung für Licht des oben angesprochenen nahen Infrarotbereiches oder eines Bereiches des sieht-

25 baren Lichtes, der sich an den nahen Infrarotbereich anschließt.

Wie bereits erwähnt, besitzt das herkömmliche Verfahren, gemäß dem der Grad der Agglutination, die sich bei dem

30 Kontakt eines ein Antigen oder einen Antikörper oder eine Mischung davon enthaltenden Probe mit Latexteilchen, auf denen der entsprechende Antikörper und/oder das entsprechende Antigen vorliegt bzw. fixiert ist (welche Latexteilchen nachstehend auch als "sensibili-

35 sierte Teilchen" oder "sensibilisierter Latex" bezeichnet werden) ergibt, über die Geschwindigkeit der

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Abnahme der Trübung der überstehenden Flüssigkeit des Latex bestimmt wird, verschiedene Nachteile, wie eine geringe Genauigkeit und eine schlechte Reproduzierbarkeit, da die Reaktion in stationärem Zustand unter Verwendung eines extrem stark verdünnten Latex¹ durchgeführt werden muß. Weiterhin ist es bei diesem vorbekannten Verfahren erforderlich, zunächst jegliche Verunreinigungen, die die Trübung beeinträchtigen könnten, aus der Probe zu entfernen. Im Gegensatz zu dem

10 oben angesprochenen vorbekannten Verfahren ist es

erfindungsgemäß erwünscht, die Reaktion eines Antigens oder eines Antikörpers in einer Probe in einem sensibilisierten Latex in einem bewegten Zustand, vorzugsweise unter Rühren, durchzuführen, und die Reaktion

15 bei hohen Konzentrationen zu bewirken.

Wenn ein Antigen oder ein Antikörper, das bzw. der in einer Probe vorliegt, in Gegenwart mindestens eines flüssigen Mediums mit einem unlöslichen Träger, dessen Teilchen einen durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μΐη aufweisen, der mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen sensibilisiert worden ist (sensibilisierter Träger), umgesetzt wird, verläuft die Agglutination des sensibilisierten Latex¹ zumindest im Anfangszustand der Antigen-Antikörper-Reaktion und insbesondere in einem relativ frühen Zeitpunkt dieser Reaktion, in dem Maße, in dem die Reaktion abläuft. Wenn die Reaktionsmischung dann mit Licht einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von etwa 0,6 bis 2,4 μΐη bestrahlt oder belichtet wird, nimmt die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung mit fortschreitender Agglutination zu. Somit kann das Licht, mit dem die Reaktionsmischung erfindungsgemäß belichtet wird, irgendeine Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μΐη aufweisen, vorausgesetzt,

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daß die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung in diesem Wellenlängenbereich während des Fortschreitens der Antigen-Antikörper-Reaktion zunimmt. Mit Hilfe vorausgehender Experimente 5 ist es ohne weiteres möglich, für ein bestimmtes Antigen oder einen bestimmten Antikörper, das bzw. der in einer Probe vorliegt, und für einen bestimmten sensibilisierten Träger ein Licht einer Wellenlänge oder Wellenlängen auszuwählen, die in diesem geeigneten 10 Wellenlängenbereich liegen.

Das erfindungsgemäß angewandte Licht kann entweder monochromatisches oder polychromatisches Licht sein, das eine geeignete Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι aufweist.

Wie es aus den nachstehend angegebenen Beispielen hervorgeht, ist es erfindungsgemäß möglich, ein relativ schmalbandiges polychromatisches Licht mit einer HaIb-20 wertsbreite von 35 nm oder 55 nm sowie ein polychromatisches Licht mit einem relativ weiten Wellenlängenbereich anzuwenden, wie das Licht einer Wolframlampe, aus dem Strahlen mit einer Wellenlänge von nicht mehr als etwa 800 nm (0,8 μπι) ausgeblendet worden sind.

Das erfindungsgemäß verwendete Licht kann im wesentlichen aus Strahlen mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι bestehen oder kann auch Strahlen mit Wellenlängen außerhalb dieses Bereiches umfassen. Im letzteren Fall sollte die Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption unter Verwendung von Licht mit Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι erfolgen.

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Vorzugsweise besitzt das erfindungsgemäß angewandte monochromatische oder polychromatische Licht eine Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,8 bis 1 , 4 μΐη.

Wie bereits erwähnt, kann das erfindungsgemäß zum Bestrahlen verwendete Licht spektrale Komponenten enthalten, die eine Wellenlänge besitzen, die von den Wellenlängen des oben angegebenen Bereiches verschieden sind, vorausgesetzt, daß es sich bei dem Licht um polychromatisches Licht handelt. Wie bereits erwähnt, ist es wesentlich, wenn das zur Bestrahlung verwendete Licht polychromatisches Licht umfaßt, die Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption lediglich mit jenen Komponenten des polychromatischen Lichts, das für die Bestrahlung herangezogen worden ist, zu bewirken, deren Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι liegen, und die Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption einer Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung in Abhängigkeit von der Zeit anzugeben.

Wenn somit das zur Bestrahlung herangezogene Licht im wesentlichen aus diesen polychromatischen Lichtstrahlen besteht, kann das Messen der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung ohne jegliche Behandlung durchgeführt werden. Wenn die für die Bestrahlung verwendete Lichtquelle jedoch Licht emittiert, das spektrale Komponenten enthält, die von den oben erwähnten polychromatischen Lichtstrahlen verschieden ist, kann die Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption wie folgt durchgeführt werden:

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1. Das von der Lichtquelle emittierte Licht wird zunächst durch ein Filter oder einen Monochromator geführt, wonach lediglich der ausgewählte Bereich des Lichts, das im wesentlichen aus den oben definierten polychromatischen Lichtstrahlen besteht, dazu verwendet wird, die Reaktionsmischung zu bestrahlen und die Extinktion oder die prozentale Absorption zu messen;

2. das von der Lichtquelle abgegebene Licht wird direkt als bestrahlendes Licht auf die Reaktionsmischung gerichtet, wonach das von der Reaktionsmischung durchgelassene Licht durch ein Filter oder einen Monochromator geführt wird und der ausgewählte Bereich des durchgelassenen Lichtes, der im wesentlichen aus den oben definierten polychromatischen Lichtstrahlen besteht, dazu herangezogen wird, die Extinktion oder die prozentuale Absorption zu messen; oder

3. das von der Lichtquelle emittierte Licht wird direkt für das Bestrahlen der Reaktionsmischung verwendet, worauf ein spezieller Lichtdetektor, der im wesentliehen nur auf die oben erwähnten polychromatischen Lichtstrahlen anspricht, verwendet wird, so daß lediglich der Bereich des durchgelassenen Lichtes, der im wesentlichen aus diesen polychromatischen Lichtstrahlen besteht, zur Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption verwendet wird.

Somit kann das bestrahlende Licht spektrale Komponenten, die von den oben erwähnten polychromatischen Lichtstrahlen verschieden sind, enthalten, oder es ist, mit anderen Worten möglich, Licht zu verwenden, das spektrale Komponenten enthält, deren Wellenlänge außerhalb des Bereiches von 0,6 bis 2,4 μπι liegt. Jedoch tragen diese spektralen Komponenten mit einer Wellenlänge außerhalb eines Bereiches von 0,6 bis 2,4 μπι nicht wesentlich zu der Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorp-

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tion bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bei und können sogar in gewissen Fällen eine nachteilige Wirkung, wie beispielsweise eine chemische Veränderung der Reaktionsmischung, eine Steigerung der Temperatur, unerwartete Luminesζenzphänomene und dergleichen verursachen. Im allgemeinen ist es daher unerwünscht, daß das für die Bestrahlung verwendete Licht eine erhebliche Menge solcher spektralen Komponenten enthält, deren Wellenlänge außerhalb eines Bereiches von 0,6 bis 2,4 μπι liegt, und zwar insbesondere ultraviolettes Licht und sichtbares Licht mit einer Wellenlänge, die kürzer ist als die des blauen Lichtes. Vorzugsweise ist das für die Bestrahlung verwendete Licht im wesentlichen frei von Lichtstrahlen einer Wellenlänge von weniger als 0,6 μΐΐι und vorzugsweise von weniger als 0,8 μπι. Da andererseits Lichtstrahlen mit einer Wellenlänge von mehr als 2,4 μπι eine Temperatur steigerung der Reaktionsmischung verursachen können, ist es erwünscht, daß das für die Bestrahlung verwendete Licht keine signifikante Menge Lichts dieser längeren Wellenlängen enthält und vorzugsweise im wesentlichen frei ist von Komponenten solcher längeren Wellenlängen.

Für die Bestrahlung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders gut geeignetes Licht besteht somit vorzugsweise überwiegend aus polychromatischen Lichtstrahlen mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μΐη und vorzugsweise im Bereich von 0,8 bis 1,4 μπι oder es besteht im wesentlichen aus monochromatischen Lichtstrahlen mit einer Wellenlänge in den genannten Bereichen.

Der hierin verwendete Ausdruck "polychromatisches Licht" steht für irgendein zusammengesetztes Licht, das aus einer Vielzahl von im wesentlichen monochromatischen Lichtstrahlen oder einem kontinuierlichen Spektrum oder

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einer Kombination davon besteht. Vorzugsweise besitzt das polychromatische Licht einen Wellenlängenberexch von 0,6 bis 2,4 μπι und vorzugsweise von 0,8 bis 1,4 μΐη. Die Halbwertsbreite oder der Wellenlängenberexch des polychromatischen Lichtes ist nicht kritisch wenngleich es im allgemeinen bevorzugt ist, daß das polychromatische Licht eine Halbwertsbreite oder einen Wellenlängenberexch von mindestens 0,03 μπι und vorzugsweise von mindestens 0,05 μπι aufweist.

Zur Bestrahlung kann man irgendeine Lichtquelle verwenden, die das oben beschriebene, für die Bestrahlung geeignete Licht zu emittieren vermag. Beispiele für solche Lichtquellen sind Wolframlampen, Xenonlampen, Halogenlampen, Nernstlampen, Nichromheizdrähte, lichtemittierende Dioden (LED) und dergleichen. Von diesen Lichtquellen sind die Wolframlampen, die Halogenlampen, die Xenonlampen und die Nernstlampen, die ein kontinuierliches Spektrum innerhalb des sichtbaren und des Infrarotbereiches abgeben, geeignete Lichtquellen, da man aus dem von diesen Lichtquellen emittierten Licht ohne weiteres ein für die Bestrahlung geeignetes Licht mit einem relativ breiten Wellenlängenberexch, der im wesentlichen frei ist von Strahlen mit einer Wellenlänge von weniger als beispielsweise 0,8 μπι, gewinnen kann, indem man das von diesen Lichtquellen emittierte Licht lediglich durch ein Tiefpaßfilter führt. Die lichtemittierenden Dioden, beispielsweise die lichtemittierenden Ga/As-Dioden, besitzen eine maximale Emissions-

30 wellenlänge bei etwa 0,95 μπι bei einer Halbwertsbreite von etwa 50 ran und stellen daher besonders geeignete
Lichtquellen dar, da das emittierte Licht direkt ohne
daß es durch ein Filter oder einen Monochromator geführt werden müßte, als für die Bestrahlung geeignetes

35 polychromatisches Licht eingesetzt werden kann. Wenn es erwünscht ist, unter Verwendung dieser Lichtquellen

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monochromatisches Licht zu erhalten, kann man das eingestrahlte oder durchgelassene Licht durch ein Filter oder einen Monochromator führen.

5 Bislang ist die Methode der Spektrumanalyse unter

Verwendung von Lichtstrahlen im Infrarotbereich mit einer Wellenlänge von mindestens 2,5 μπι oder Lichtstrahlen im ultravioletten Bereich mit einer Wellenlänge von nicht mehr als 0,4 μπι als Methode zur Untersuchung der Molekülstruktur und von Moleküleigenschaften bekannt. Das Licht des nahen Infrarots oder des sich daran anschließenden sichtbaren Bereiches mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι, das erfindungsgemäß angewandt wird und das der Einfachheit halber im folgenden als "Licht des nahen Infrarotbereiches" bezeichnet wird, ist bislang nur begrenzt angewandt worden und hat nur geringes Interesse gefunden .

Es wurde nunmehr gefunden, daß das oben erwähnte Licht des nahen Infrarotbereiches erfindungsgemäß besonders geeignet ist, da es sehr gut durch wäßrige Medien, wie Wasser, wäßrige Lösungen und dergleichen, die im allgemeinen die Grundmedien von Antigene oder Antikörper enthaltenden Proben darstellen, wie Wasser, Sera, Urin, Salzlösungen, etc. sowie die Grundmedien der oben erwähnten Latices, hindurchdringt, wobei insbesondere das Licht des nahen Infrarotbereiches mit Wellenlängen von 0,8 bis 1,4 μΐη und von 1,53 bis 1,88 μπι von den wäßrigen Medien nur in geringem Ausmaß absorbiert wird.

Erfindungsgemäß kann man irgendeinen unlöslichen Träger, der Teilchen mit einem durchschnittlichen Durch-5 messer von nicht mehr als 1,6 μπι umfaßt, verwenden.

Die unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnitt-

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lichen Durchmesser von mehr als 1,6 μπι sind für die erfindungsgemäße Bestimmung ungünstig, da es schwierig ist, einen solche Teilchen enthaltenden Latex stabil zu halten. Vorzugsweise besitzen die unlöslichen Trägerteilchen einen durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 1,0 μπι, bevorzugter im Bereich von 0,2 bis 0,8 μπι und am bevorzugtesten im Bereich von 0,2 bis 0,6 μπι.

Erfindungsgemäß wird ein Antigen oder ein Antikörper, das bzw. der in einer Probe vorliegt, in Gegenwart mindestens eines flüssigen Mediums mit unlöslichen Trägerteilchen, die einen durchschnittlichen Durchmesser innerhalb des oben angegebenen Bereiches aufweisen und

15 die mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen

sensibilisiert worden sind (sensibilisierter Träger) umgesetzt, wobei die Reaktionsmischung mit dem oben erwähnten Licht mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι bestrahlt wird, nachdem die Reaktion gestartet worden ist. In diesen Fällen besteht eine sehr gute Korrelation zwischen der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder prozentualen Absorption der Reaktionsmischung für das oben erwähnte Licht und der scheinbaren Reaktionsgeschwindigkeit der

25 Antigen-Antikörper-Reaktion, insbesondere in einem frühen oder mittleren Stadium der Reaktion, wobei die scheinbare Reaktionsgeschwindigkeit ihrerseits mit der Konzentration des Antigens oder des Antikörpers in der Probe in Beziehung steht. Auf der Grundlage dieser

30 Prinzipien ist es daher möglich, die Konzentration des Antigens oder des Antikörpers in der Probe zu bestimmen.

Der hierin verwendet Ausdruck "prozentuale Absorption" 35 kann durch die folgende Gleichung 1

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Mitsubishi Chemical £I>-83

I - I
S = -2j χ 100 (%) (1)

5 wiedergegeben werden, in der

S für die prozentuale Absorption, I für die Intensität des durchgelassenen Lichtes, wenn die Zelle das gleiche System wie die zu messende Reaktionsmischung, mit dem Unterschied, daß das System frei ist von dem Antigen und/oder dem Antikörper, enthält, und I für die Intensität des durchgelassenen Lichtes, wenn die Zelle die Reaktionsmischung enthält, stehen.

Wie aus der obigen Definition ersichtlich ist, kann die prozentuale Absorption auch anders herum als der Prozentsatz des durch die Reaktionsmischung nicht hindurchgegangenen Lichtes oder den Prozentsatz des absorbierten Lichtes bezeichnet werden.

Die oben definierte prozentuale Absorption steht in Korrelation zu dem Extinktionswert A, den man beispielsweise mit Hilfe eines Spektrophotometers, wie er für die Infrarotspektrometrie verwendet wird, bestimmen kann, so daß man diese prozentuale Absorption der Einfachheit halber auch über die Extinktion ausdrücken kann. In der Infrarotspektrometrie ist die Extinktion A durch die folgende Gleichung 2 definiert:

A - log -~ (2)

worin I und I die für die Gleichung T angegebenen Bedeutungen besitzen.

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Mitsubishi Chemical FD-83

Somit ist es erfindungsgemäß möglich, Antigene und Antikörper zu bestimmen, indem man entweder die durch die Gleichung 1 definierte prozentuale Absorption oder die durch die Gleichung 2 definierte Extinktion heranzieht, wobei unabhängig von dem angewandten Parameter die erhaltenen Daten innerhalb eines vernünftigen, verläßlichen Bereiches übereinstimmen, vorausgesetzt, daß die Messungen sorgfältig durchgeführt werden.

10 Erfindungsgemäß wird ein Antigen oder ein Antikörper

oder eine Mischung davon mit dem oben erwähnten sensibilisierten Träger in einem flüssigen Medium unter vorbestimmten, im wesentlichen festen bzw. festgelegten Bedingungen umgesetzt und es wird die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorpttion der Reaktionsmischung pro Zeiteinheit zu einem im wesentlichen festgelegten Zeitpunkt nach Beginn der Reaktion ermittelt, wodurch das Antigen oder der Antikörper quantitativ bestimmt werden kann. Nach der Umsetzung der Reaktionsteilnehmer, das heißt des sensibilisierten Latex'und des Antigens, des Antikörpers oder einer Mischung davon (oder eines Reaktionsprodukts davon) in Gang gebracht worden ist, erfolgen die Messungen zur Bestimmung der oben angesprochenen Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit vorzugsweise zu dem frühest möglichen Zeitpunkt, zu dem die Antigen-Antikörper-Reaktion in der Reaktionsmischung einen stationären bzw. gleichmäßigen oder stetigen Zustand erreicht hat.

30 In dieser Weise können bei der Messung genauere und reproduzierbarere Ergebnisse erhalten werden.

Zu diesem Zweck wird der sensibilisierte Latex mit der das Antigen oder den Antikörper enthaltenden Testflüssigkeit in Kontakt gebracht und vorzugsweise unter Rühren

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Mitsubishi Chemical FD-83

damit vermischt, worauf die Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung nicht augenblicklich, jedoch baldmöglichst, beispielsweise 2 bis 3 Sekunden und vorzugsweise etwa 5 Sekunden nach Vermischen der Reaktionsteilnehmer erfolgen sollte.

Nachdem die Reaktion des sensibilisierten Latex' mit dem in der Testflüssigkeit enthaltenen Antigen oder Antikörper in Gang gebracht worden ist, erreicht die in der Reaktionsmischung ablaufende Antigen-Antikörper-Reaktion bald einen stationären Zustand oder den Zustand eines dynamischen Gleichgewichts. In diesem Zustand, insbesondere in einem frühen Stadium, wenn die Reaktion

15 einen stationären Zustand erreicht hat, nimmt die

Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung praktisch gleichmäßig oder stetig zu. Daher ist es bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens von Vorteil, zuvor mit Hilfe eines vorausgehenden Experiments einen Zustand oder einen Zeitraum in dem Reaktionsablauf auszuwählen, in dem eine stetige Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption einer bestimmten Reaktionsmischung erfolgt, und anschließend innerhalb des ausgewählten Stadiums das Antigen oder den Antikörper in einer Testflüssigkeit zu bestimmen, die das Antigen, den Antikörper oder eine Mischung davon in unbekannter Konzentration enthält.

Es versteht sich, daß bei der Durchführung der Messung die Reaktion des sensibilisierten Latex' mit der Testflüssigkeit unter vorbestimmten, im wesentlichen festgelegten Bedingungen durchgeführt wird.

Erfindungsgemäß ist es von Vorteil, den sensibilisierten Träger mit einem Antigen oder einem Antikörper in einer

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Mitsubishi Chemical FD-33

Testflüssigkeit unter im wesentlichen festgelegten Bedingungen umzusetzen und dann die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung in einem solchen Stadium zu bestimmen, in dem die Extinktion oder die prozentuale Absorption erstmals nach Beginn der Reaktion eine annähernd stetige Zunahme zeigt, wodurch es möglich wird, die quantitative Bestimmung der Antigene und Antikörper mit höherer Präzision in kürzerer Zeit zu bewirken.

Erfindungsgemäß ist es weiterhin von Vorteil, den sensibilisierten Latex unter im wesentlichen festgelegten Bedingungen mit einem Antigen oder einem Antikörper in einer Testflüssigkeit unzusetzen, dann die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung an zwei oder mehreren Zeitpunkten zu messen und zu speichern und ausgehend von den gespeicherten Werten der Extinktion oder der prozentualen Absorption die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen

20 Absorption pro Zeiteinheit zu ermitteln bzw. zu errechnen.

Die erfindungsgemäße Bestimmung von Antigenen und Antikörpern kann beispielsweise wie folgt durchgeführt

25 werden:

Zunächst wird ein unlöslicher, fester Träger (Latex) mit Teilchen eines bestimmten durchschnittlichen Durchmessers mit einem bestimmten Antikörper oder Antigen, der bzw. das dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper entspricht, sensibilisiert. Andererseits wird unter Verwendung des gleichen Antigens oder Antikörpers (oder einer Mischung davon) das, der bzw. die in der tatsächlich zu bestimmenden Probenlösung enthalten ist, eine Reihe von Standardprobenlösungen hergestellt, die das Antigen oder den Antikörper in unterschiedlichen bekannten Konzentrationen in einem flüssigen Medium enthalten,

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Mitsubishi Chemical FD-83

das genau dem der tatsächlichen Probenlösung entspricht oder mit diesem annähernd identisch ist.

Anschließend werden der sensibilisierte Latex und eine der in dieser "Weise gebildeten Standardprobenlösungen vermischt, worauf die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung während der ablaufenden Antigen-Antikörper-Reaktion gemessen wird, nachdem das Fortschreiten dieser Reaktion einen stationären Zustand erreicht hat.

Beispielsweise sind in Fig. 3 (Beispiel 1) und Fig. 5a und 5b (Beispiel 2) der Zeichnungen die Veränderungen (die Zunahme) der Extinktion oder der prozentualen Absorption einiger Reaktionsmischungen gegen die Zeit aufgetragen, wobei die Zeit (in Minuten) auf der Abszisse und die Extinktion (im Fall der Fig. 3 und 5b) oder die prozentuale Absorption (im Fall der Fig. 5a) auf der Ordinate aufgetragen sind. Von diesen Kurven zeigen die in der Fig. 3 dargestellten Kurven A, B, C und D die tatsächlichen Aufzeichnungen des für die Bestimmung der Extinktion verwendeten Spektrophotometers, die die Änderung (die Zunahme) der Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit erkennen lassen.

Aus diesen Kurven A, B, C und D ist ersichtlich,daß wenn man einen sensibilisierten Träger und eine Standardprobenlösung umsetzt, relativ kurz nach Beginn der Reaktion ein stationärer Zustand im Ablauf der Antigen-Antikörper-Reaktion erreicht wird und daß insbesondere der Anfangsbereich dieses Zustandes eine annähernd stetige Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung erkennen läßt.

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Mitsubishi Chemcial FD-83

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im Fall jeder Standardprobenlösung die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung pro Zeiteinheit mit Vorteil in einem derart frühen Stadium oder Zeitraum bestimmt, in dem die Extinktion oder die prozentuale Absorption annähernd stetig mit der Zeit zunimmt.

Die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption kann beispielsweise für die in der Fig. 3 dargestellten Kurven A, B, C und D ermittelt werden, indem man die Geschwindigkeit der Zunahme der Fläche zwischen der Kurve und der Grundlinie (Abszisse) während einer festgelegten Zeitdauer (beispielsweise einer Minute) in einem relativ linearen Abschnitt der Kurve ermittelt. Alternativ kann man eine gerade Linie durch die Kurven in dem relativ linearen Abschnitt ziehen, wie es in der Fig. 3 mit A¹, B¹, C oder D¹ angegeben ist, und für jede gerade Linie A¹, B¹, C und D¹ den Tangens des Neigungswinkels θ bestimmten.

Anschließend wird beispielsweise die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit, die man mit jeder Probenlösung ermittelt hat (in logarithmischem Maßstab) auf der Ordinate gegen beispielsweise die Konzentration .des Antigens oder des Antikörpers in der Standardprobenlösung (in logarithmischem Maßstab) auf der Abszisse aufgetragen. In dieser Weise erhält man eine Kurve (das heißt eine

30 Eichkurve), wie sie beispielsweise in den Fig. 4, 6a

oder 6b angegeben ist. Wie aus diesen Kurven zu ersehen ist, weisen die Eichkurven darauf hin, daß eine annähernd lineare Beziehung zwischen der Konzentration des Antigens oder des Antikörpers in der Standardprobenlösung und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung pro

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" ³⁷ " 2305435

Zeiteinheit besteht.

Somit ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die quantitative Bestimmung von Antigenen und Antikörpern in Proben oder Testflüssigkeiten bzw. Testfluiden, indem man zunächst in der oben beschriebenen Weise eine Eichkurve für das zu bestimmende besondere Antigen oder den zu bestimmenden besonderen Antikörper ermittelt, die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit in der oben beschriebenen Weise unter Verwendung einer Probe oder einer Testflüssigkeit, die das Antigen oder den Antikörper in unbekannter Konzentration enthält, bestimmt und die in dieser Weise erhaltenen Werte mit

15 der Eichkurve vergleicht.

In dieser Weise ist es möglich, die Konzentration des Antigens oder des Antikörpers in einer Testflüssigkeit mit extrem hoher Präzision in kurzer Zeit zu messen, wie es auch durch die folgenden Beispiele belegt wird.

Bei dem Verfahren der oben angesprochenen älteren Patentanmeldung ρ 27 36 805.4 (japanische Patentanmeldung Nr. 97158/76) wird die Reaktionsmischung mit Licht bestrahlt, dessen Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι liegt und dessen Wellenlänge um einen Faktor von mindestens 1,5 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der unlöslichen Trägerteilchen. Nach der Lehre der vorliegenden Erfindung kann jedoch, wie es aus den obigen Ausführungen hervorgeht, Licht einer beliebigen Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Wellenlänge des Lichtes derart ausgewählt ist, daß beim Bestrahlen der Reaktionsmischung mit dem Licht sich eine Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption feststellen läßt. Demzufolge ist das verwendete Licht

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nicht länger auf Licht mit einer Wellenlänge beschränkt, das einen Faktor von mindestens 1,5 größer ist als der durchschnittliche Durchmesser der unlöslichen Trägerteilchen. In der Tat kann das erfindungsgemäße Verfahren, wie aus den Beispielen 9 und 8 hervorgeht, mit Licht , einer Wellenlänge durchgeführt werden, die etwa gleich ist dem durchschnittlichen Durchmesser der Trägerteilchen (Latexteilchen) oder mit Licht mit einer Wellenlänge, die um einen Faktor um etwa 1,1 langer ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen.

Jedoch ist es erfindungsgemäß von Vorteil, Licht zu verwenden, dessen Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μΐη liegen und um einen Faktor von mindestens 1,1,

15 vorzugsweise von mindestens 1,5 länger sind als der durchschnittliche Durchmesser der unlöslichen Trägerteilchen, da durch die Anwendung von Licht solcher Wellenlängen die genaue Bestimmung der Antigene und Antikörper leichter erreicht werden kann.

Beispielsweise ist in der Fig. 1 durch Auftragen der Wellenlänge des Lichtes auf der Abszisse und der prozentualen Transmission des Lichtes auf der Ordinate das prozentuale Transmissionsspektrum einer Wasserschicht mit einer Dicke von 1 mm in einem Wellenlängenbereich von 0,6 bis 2,4 μπι dargestellt. Aus der Fig. 1 ist zu ersehen, daß das Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 1,4 μπι praktisch ohne merkliche Absorption durch Wasser, das das für Latices und Proben weitgehendst verwendete Grundmedium darstellt, hindurchdringt und daß Licht mit einer Wellenlänge von 1,53 bis 1,88 μΐη ebenfalls im wesentlichen durch Wasser hindurchdringt, so daß man Licht mit einer Wellenlänge in diesem Bereich bei dem erfindungsgemäßen Ver-

35 fahren anwenden kann . Es ist weiterhin aus der Fig. 1

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ersichtlich/ daß Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 2,1 bis 2,3 5 μπι für Wasser eine Transmission im Bereich von 20% zeigt, so daß man Licht einer solchen Wellenlänge auch in Kombination mit einem hochempfindliehen Photometer anwenden kann, wenngleich dies nicht bevorzugt ist.

Die Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen der Extinktion eines Polystyrollatex¹(mit einem Feststoffgehalt von

1 Gew.-%), die auf der Ordinate aufgetragen ist, und der Wellenlänge des Lichtes, die in μΐη auf der Abszisse aufgetragen ist, wenn man die Bestimmung in einer Absorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm durchführt. Die in der Fig. 2 dargestellte Kurve A gibt die Änderung der Extinktion eines Polystyrollatex'wieder, dessen durchschnittlicher Teilchendurchmesser 0,481 μΐη beträgt, während die Kurve B die Extinktion eines Polystyrollatex* zeigt, dessen durchschnittlicher Teilchendurchmesser 0,804 μΐη beträgt. Zur Bestimmung der Extinktion wurde der Latex aus Gründen der Vereinfachung der Messung verdünnt, wonach die Extinktion des Latex' durch Multiplizieren des tatsächlich gemessenen Wertes der Extinktion mit dem Verdünnungsfaktor errechnet wurde.

25 Aus der Fig. 2 ist zu ersehen, daß die Extinktion des

Latex'bei einer Wellenlänge von weniger als 0,6 μπι derart groß ist, daß es schwierig ist, die Änderung der Lichttransmission einer Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung unter Verwendung von Licht einer solchen Wellenlänge zu messen. Wenn man jedoch Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 0,8 μια und insbesondere von mindestens 1 μπι anwendet, so ist die Extinktion des Latex'als solchem relativ gering, so daß Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 0,8 μΐη und vorzugsweise mindestens 1 μπι für Jie oben erwähnte Messung der Lichttransmission geeignet ist.

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Mitsubishi Chemical FP-8?

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Vergleicht man die in der Fig. 2 dargestellte Kurve A mit der dort gezeigten Kurve B, so ist festzustellen, daß die Extinktion des Latex' mit zunehmendem durchschnittlichem Durchmesser der Polystyrollatexteilchen zunimmt. Daraus ist ersichtlich, daß Latexteilchen mit einem extrem großen durchschnittlichen Durchmesser erfindungsgemäß nicht geeignet sind. Es hat sich ferner gezeigt, daß die erfindungsgemäß geeigneten unlöslichen Trägerteilchen einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von nicht mehr als 1,6 μΐη besitzen müssen und daß Latexteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,1 bis 1 μΐη und insbesondere von 0,2 bis 0,8 μπι bevorzugt sind.

Somit kann man erfindungsgemäß die Menge oder die Konzentration eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer Probe bestimmen, indem man den entsprechenden Antikörper und/oder das entsprechende Antigen auf unlöslichen Trägerteilchen (oder einem Latex) mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser innerhalb des oben angegebenen Bereiches unter Bildung eines sensibilisierten Latex' abscheidet oder fixiert, den Latex mit dem in der Probe vorhandenen Antigen und/oder Antikörper umsetzt und die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung mit Licht mit Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι und vorzugsweise im Bereich von 0,8 bis 1,4 μπι bestimmt.

Die erfindungsgemäß geeigneten unlöslichen Trägerteil-30 chen schließen Mikroteilchen organischer Polymerer, die im wesentlichen in dem für die erfindungsgemäße Messung verwendeten flüssigen Medium unlöslich sind und einen
durchschnittlichen Durchmesser innerhalb des oben angegebenen Bereiches aufweisen, ein, beispielsweise Latices

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Mitsubishi Chemical FC -8 Z

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von organischen Polymeren, wie Polystyrol und Styrol-Butadien-Copolymere, die man durch Emulsionspolymerisation erhält; dispergierte Kokkenbakterien, wie Staphylokokken und Streptokokken, Bacillus prodigiosus, Rickettsia, Zellmembranfragmente etc., sowie Mikroteilchen von anorganischen Oxiden, wie Siliciumdioxid, Siliciumdioxid-Aluminiumoxid und Aluminiumoxid und feinpulverisierte Mineralien, Metalle und dergleichen.

Erfindungsgemäß wird ein Antikörper oder ein Antigen, das mit dem in der Probe zu bestimmenden Antigen und/oder Antikörper.reagiert, an den oben erwähnten unlöslichen Trägerteilchen, beispielsweise Latexteilchen, fixiert (um das Trägermaterial zu sensibilisieren). Zu diesem Zweck kann der Antikörper oder das Antigen physikalisch und/oder chemisch an dem Träger adsorbiert werden.

Bei den Antikörpern handelt es sich um Proteine, während die Antigene aus einem Vertreter einer Gruppe von verschiedenartigen Substanzen bestehen, die beispielsweise Proteine, Polypeptide, Steroide, Polysaccharide, Lipide, Pollen, Staub und dergleichen einschließt. Es wurde bereits eine Reihe von Verfahren beschrieben, um diese Antikörper oder Antigene und insbesondere Antikörper auf unlöslichen Trägerteilchen abzuscheiden oder zu fixieren.

Um ein unvollständiges Antigen, insbesondere ein Hapten, an unlöslichen Trägermaterialien zu fixieren, ist es von Vorteil, die Trägermaterialien chemisch zu modifizieren, beispielsweise mit Hilfe eines Kupplungsmittels, und anschließend das Antigen chemisch an das modifizierte Trägermaterial zu binden. Wenn der verwendete unlösliche Träger ein Latex einer hochmolekularen Substanz ist, die funktionelle Gruppen, wie

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Sulfogruppen, Aminogruppen oder Carboxylgruppen oder davon abgeleitete reaktive Gruppen aufweist, ist es auch möglich, den Antikörper und/oder das Antigen an einem solchen Latex chemisch zu adsorbieren. 5

Von den erfindungsgemäß geeigneten flüssigen Medien ist Wasser am bevorzugtesten, wenngleich man auch eine Mischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel verwenden kann. Beispiele für geeignete mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel sind Alkohole, wie Methanol, Äthanol etc., Ketone, wie Aceton, und dergleichen.

Im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren, bei denen die Trübung bestimmt oder die mittlere Diffusionskonstante mit Hilfe eines Laserstrahles gemessen wird, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren Bedingungen, bei denen die mit einem Antikörper oder einem Antigen sensibilisierten unlöslichen Trägerteilchen in mögliehst aktiver Weise mit dem entsprechenden Antigen und/oder Antikörper reagieren können.

Zu diesem Zweck kann man erfindungsgemäß die unlöslichen Trägerteilchen, beispielsweise die Latexteilchen, die

mit einem Antikörper oder einem Antigen sensibilisiert worden sind (und die hierin auch als "sensibilisierte Trägerteilchen" bezeichnet werden) in Form einer Suspension verwenden, die eine Konzentration von nicht weniger als 0,05 Gew.-% und vorzugsweise eine Konzentration im Bereich von 0,1 bis 1 Gew.-% und noch bevorzugter im Bereich von 0,2 bis 0,6 Gew.-% aufweist.

Wenn die Konzentration der sensibilisierten Trägerteilchen zu hoch ist, wie es aus der Fig. 2 hervorgeht, wird die Durchlässigkeit der Suspension derart vermindert, daß die erfindungsgemäße Messung der Extinktion

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erschwert wird. Innerhalb des Konzentrationsbereiches, in dem die Messung der Extinktion möglich ist, sind jedoch höhere Konzentrationen der sensibilisierten Trägerteilchen in der Suspension bevorzugt, da es hierdurch möglich wird, die Empfindlichkeit der quantitativen Bestimmung der Antigene und Antikörper zu steigern.

Erfindungsgemäß und im Gegensatzu zu den herkömmlichen

10 Methoden werden die sensibilisierten Trägerteilchen

und die das Antigen und/oder den Antikörper enthaltende Probe unter nicht-stationären Bedingungen, das heißt nicht unter Stehenlassen, umgesetzt. Zu diesem Zweck kann man die Reaktion mit Vorteil unter Bewegung der Reaktionsmischung durchführen. Da die Reaktion im allgemeinen in einer dünnen oder schmalen Zelle durchgeführt wird, erreicht man das Bewegen der Reaktionsmischung bequemerweise zum Beispiel dadurch, daß man einen Stab vertikal oder transversal durch die Zelle bewegt. Natürlich kann man die sensibilisierten Trägerteilchen und die Probe außerhalb der Zelle unter vorbestimmten Bedingungen während einer gewissen Zeitdauer umsetzen und anschließend die Reaktionsmischung zur Bestimmung der Extinktion oder der prozentualen Absorption in die Zelle einbringen. Um die Reaktionsbedingungen jedoch reproduzierbar zu machen, insbesondere im Hinblick auf die Reaktionszeit, kann man die sensibilisierten Trägerteilchen und die Probe unter vorbestimmten, nicht-ruhenden Bedingungen direkt in einer Zelle, die in ein Spektrophotometer eingebracht ist, umsetzen, wodurch eine genauere Bestimmung der Extinktion oder der prozentualen Absorption möglich wird.

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Mit pub j .shi Chemical FD-83

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Somit ermöglicht die Erfindung nicht nur die Bestimmung der Konzentration eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer Probe, was bislang visuell in halbquantitativer Weise möglich war, sondern gestattet auch die Bestimmung eines Antigens und/oder eines Antikörpers in Spurenmengen, wie es bislang nur mit Hilfe des Radioimmuntests (Radioimmunoassay, RIA) möglich war, und dies mit einer Präzision, die vergleichbar ist mit der bei dem Radioimmunoassay erreichten.

Wie bereits erwähnt, zeichnet sich die vorliegende Erfindung dadurch aus, daß die sensibilisierten Trägerteilchen mit einer möglichst hohen Konzentration mit einer Probe in Kontakt gebracht und mit ihr umgesetzt werden.

Zur erfindungsgemäßen Bestimmung der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung ist eine Zelle mit einer Dicke von beispielsweise 0,5 bis 10 mm und vorzugsweise von 1 bis 5 mm geeignet.

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren zu einer empfindlichen Bestimmung von Spurenmengen eines Antigens oder eines Antikörpers, die bislang nach der Radioimmunoassay-Methode bestimmt wurden, angewandt werden soll, ist es besonders vorteilhaft:

a) Ein Antigen oder einen Antikörper mit einer möglichst hohen Gleichgewichtskonzentration zu verwenden,

b) Latexteilchen, die.insbesondere einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,2 bis 0,8 μπι aufweisen, zu verwenden, der Teilchengrößenverteilung möglichst eng ist, und

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c) die Extinktion oder die prozentuale Absorption mit Licht mit einer Wellenlänge von 0,8 bis 1,4 μπι zu bestimmen.

Die Erfindung wurde oben bezüglich der Bestimmung eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer Probe beschrieben, die darauf beruht, daß man das in der Probe enthaltene Antigen und/oder den in der Probe enthaltenen Antikörper mit sensibilisierten Träger-' teilchen agglutiniert (das heißt ein LÄ-System anwendet) . Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch zur Bestimmung einer Probe geeignet, bei der die inhibierende Wirkung gegen die oben erwähnte Agglutination das Prinzip der Messung ist (das heißt, daß man ein

15 LI-Systern anwendet).

Unvollständige Antigene, beispielsweise Haptene, kann man dadurch bestimmen, daß man das erfindungsgemäße Verfahren auf das LI-System anwendet. In diesem Fall kann man beispielsweise ein Antigen auf den unlöslichen Trägerteilchen, wie sie erfindungsgemäß angewandt werden, fixieren, die in dieser Weise sensibiiisierten Trägerteilchen nach einer kompetitiven Reaktion mit einer gegebenen Menge eines Antikörpers, der mit einem Antigen einer vorbestimmten Konzentration (beispielsweise einer Standardantxgenlösung) umgesetzt worden ist, reagieren lassen, und dann die Extinktion oder die prozentuale Absorption der gebildeten Reaktionsmischung pro Zeiteinheit bestimmen. Diese Maßnahmen werden bei unterschiedlichen Konzentrationen der Standard-Antigenlösung wiederholt, um eine Eichkurve zu ermitteln. Anschließend setzt man eine unbekannte Probe mit dem gleichen Antikörper einer bestimmten Konzentration um, wonach man die erhaltene Reaktionsmischung mit dem sensibilisierten Trägermaterial zur

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Reaktion bringt. Diese Reaktionen sollten unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen durchgeführt werden, wie sie für die Ermittlung der Eichkurve angewandt wurden. Dann bestimmt man die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit der endgültigen Reaktionsmischung mit den sensibilisierten Trägerteilchen und vergleicht sie mit der Eichkurve, um in dieser Weise die Menge (Konzentration) des Antigens in der unbekannten Probe zu ermitteln.

Nach der Verfahrensweise der oben erwähnten LI-Methode kann man auch einen Antikörper in einer unbekannten Probe bestimmen, indem man einen bestimmten Antikörper

15 auf den unlöslichen Trägerteilchen fixiert. Weiterhin ist es gewünschtenfalls möglich, gleichzeitig ein Antigen und einen Antikörper unterschiedlicher Art auf den unlöslichen Trägerteilchen zu fixieren und dann ein Antigen und einen Antikörper in einer unbekannten

Probe zu bestimmen.

Somit gelingt erfindungsgemäß die quantitative Bestimmung einer großen Vielzahl von Antigenen und/oder Antikörpern, beispielsweise

1..) die Blutuntersuchung von Patienten oder Blutspendern, was für Notmaßnahmen unerläßlich ist; beispielsweise kann man die Blutgruppensubstanzen, das Au- oder das HB-Antigen oder andere Verunreinigungen im Blut oder Fibrin/Fibrinogen-Abbauprodukte (FDP) bestimmen, was sich in jüngster Zeit als nützlich erwiesen hat bei der Überwachung der Genesung von Patienten, denen eine Niere transplantiert worden ist oder die an Nierenversagen leiden;

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Mitsubishi Chemical FD-83

2.) die Bestimmung von Humanchoriongonadotropin

(hCG), das eine wichtige Rolle spielt bei der Schwangerschaftsdiagnose oder bei der Überwachung der Genesung von Chorionepitheliomen;

3.) die Bestimmung von Humanchoriongonadotropin oder von östrolglucuronid, das ein Stoffwechselprodukt des Follikelhormons darstellt, im Urin, welche Bestimmung für die Überwachung der

Schwangerschaft von Bedeutung ist; 10

4.) die Bestimmung von Oxytocin im Blut, von welcher Substanz man annimmt, daß sie Uteruskontraktionen verursacht;

5.) die Bestimmung bestimmter Nebennierenrinden-15 hormone, wie Corticoiden und Aldosteron oder von

adrenocorticotropen Hormonen (ACTH):

6.) die Bestimmung des Insulins bei Diabetikern oder die Bestimmung des Follikel-anregenden Hormons, des luteinisierenden Hormons, von östrogenen, des Gelbkörperhormons (corpus luteum hormone) etc.;

7.) die Bestimmung von Gastrin oder Sekretin, bei dem es sich um ein Magen-Darm-Hormon handelt;

8.) der Nachweis und die Bestimmung von Antikörpern in Körperflüssigkeiten von Patienten, die an Allergien, Syphilis, hämolytischer Streptokokzidiose, Röteln, Autoimmunkrankheiten, wie

Kollagenose, und anderen Infektionskrankheiten

und dergleichen leiden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann natürlich auch zur qualitativen oder halbquantitativen Bestimmung dieser Antigene und/oder Antikörper angewandt werden.

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Mitsubishi Chemical PD -93

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Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angewandt werden kann und die gekennzeichnet ist durch

a) unlösliche Trägerteilchen für den Antikörper oder das Antigen, welche Trägerteilchen einen durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1 , 6 μΐη aufweisen;

b) eine Absorptionszelle mit einer Dicke von 0,5

bis 10 mm zur Aufnahme einer Reaktionsmischung, die man durch Umsetzen des auf den unlöslichen Trägerteilchen vorliegenden Antikörpers oder Antigens mit einem entsprechenden Antigen und/oder Antikörper in einem flüssigen Medium erhält;

c) eine Bestrahlungseinrichtung zum Bestrahlen mit Licht mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι;

d) eine Einrichtung zum Messen der Intensität des Lichtes mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μΐη, mit dem die Reaktionsmischung in der Absorptionszelle bestrahlt worden ist und das von der Reaktionsmischung durchgelas—

sen worden ist; und

e) eine Einrichtung zur Ermittlung der Änderung der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung bei der in der Stufe d) gemessenen Wellenlänge in Abhängigkeit von der Reaktionszeit, welche Ermittlungseinrichtung in Abhängigkeit von der Meßeinrichtung betrieben wird.

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Die erfindungsgemäße Vorrichtung unterscheidet sich von den herkömmlichen photometrischen Vorrichtungen durch die in den Merkmalen a, c, d und e beschriebenen strukturellen Merkmale.
5

In der Fig. 15 ist der Grundaufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt. Wie aus dieser Fig. 15 zu ersehen ist, umfaßt die Vorrichtung einen Monochromator 1 aus einer Lichtquelle und einem Filter oder einem Prisma, einen halbdurchlässigen Spiegel 2 zum Abteilen des Vergleichslichtstrahls, der durch eine Blende 3 einem Kompensationsdetektor 4 zugeführt wird, in dem der Vergleichslichtstrahl in ein elektrisches Signal umgewandelt wird, und dazu dient, die Änderung der Intensität des Lichtes der Lichtquelle festzustellen. Andererseits wird die die Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung enthaltende Zelle 5 mit dem durch den halbdurchlässigen Spiegel 2 hindurchtretenden Licht belichtet und es wird die Intensität des durch die Probe geführten Lichtes mit dem Probendetektor 6 gemessen und in ein elektrisches Signal umgewandelt. Das durch den Probendetektor 6 gebildete elektrische Signal wird mit dem des Kompensationsdetektors 4 kombiniert und dann einem Verstärker 7 zugeführt. Die Gesamtänderung der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung, die bezüglich der Änderung der prozentualen Absorption als Folge einer Schwankung der Lichtintensität der Lichtquelle kompensiert worden ist, wird mit Hilfe der Aufzeichnungseinrichtung 8 aufgezeichnet.

Alternativ kann man die Gesamtänderung der prozentualen Absorption elektrisch in die Extinktion umwandeln und mit Hilfe der Aufzeichnungseinrichtung 8 aufzeichnen.

Andererseits kann man gewünschtenfalls auch das von dem Verstärker 7 abgegebene elektrische Signal mit einem

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Mitsubishi Chemical FD-33

_ so - 29Ü5435

Integrator 9 während einer gegebenen Zeitdauer integrieren und dann das Integral mit der Aufzeichnungseinrichtung 8 aufzeichnen.

5 Über die mit der Aufzeichnungseinrichtung aufgezeichnete Änderung der Extinktion oder der prozentualen Absorption mit der Zeit ist es möglich, die Geschwindigkeit der Änderung (der Zunahme) der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit z-u ermit-1O teln, wodurch es möglich wird, erfindungsgemäß das Antigen oder den Antikörper zu bestimmen.

Wie bereits erwähnt, ist die Absorptionszelle 5 vorzugsweise mit einer Rühreinrichtung versehen.

Als Lichtquelle für den Monochromator 1 kann man eine übliche Wolframlampe verwenden. Das von dieser Lichtquelle emittierte Licht wird durch ein Filter oder Prisma gefiltert oder monochromatisiert, so daß man die Zelle mit Licht mit Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μΐη und vorzugsweise im Bereich von 0,8 bis 1,4 μΐη bestrahlt. Zu diesem Zweck wird das Filter oder das Prisma aus jenen Materialien ausgewählt, die dazu geeignet sind, in wirksamer Weise Licht der oben angegebenen Wellenlänge auszufiltern oder zu monochromatisieren. Beispielsweise kann man ein Interferenzfilter, das eine Wellenlänge von 1200-50 nm ergibt, als Filter, oder man kann Prismen aus Glas oder Quarz verwenden.

Wie bereits erwähnt, kann man auch eine lichtemittierende Diode, wie beispielsweise eine lichtemittierende Galliumarsenid-Diode mit einer Halbwertsbreite von 0,05 μΐη und einer Spitzenemissionswellenlänge von 0,94 μΐη oder dergleichen als Lichtquelle verwenden.

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Die Absorptionsζelle 5 kann aus transparentem Glas oder synthetischem Harz (beispielsweise einem Acrylharz) bestehen und einen schachtelartigen Aufbau mit rechteckigem Querschnitt besitzen. Die Dicke der Zelle kann im Bereich von 0,5 bis 10 mm und vorzugsweise im Bereich" von 1 bis 5 mm liegen. Mit Vorteil besitzen die lichtdurchlässigen Fenster der Zelle für Licht mit Wellenlängen von 0,6 bis 2,4 μπι eine Transmission von mindestens 30% und vorzugsweise von mehr als 80%. Als Detektoren 4 und 6 kann man irgendwelche Einrichtungen verwenden, die die Intensität des aufgefangenen Lichtes in ein elektrisches Signal umwandeln können, dessen Signalstärke der Intensität des Lichtes proportional ist. Beispielsweise kann man mit Vorteil Bleisulfid-Photoleiterelemente oder Silicium-Photodioden verwenden.

Die durch die Detektoren gebildeten elektrischen Signale können in üblicher Weise mit dem Verstärker 7 verstärkt und mit der Aufzeichnungseinrichtung 8 aufgezeichnet werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
25

Beispiel 1

1. Herstellung eines mit Antifibrinogen-AntiJfcörpern sensibilisierten Latexreagens¹ (Antifibrinogen-Latexreagens, Anti-Fg-Latexreagens_r Antifibrinogen-sensibilisiertes Latexreagens).

Zu 10 ml einer Lösung von Anti-humanfibrinogen (Fg)-Antikörpern(mit einer Konzentration von 2 mg/ml) in einem Glycinpuffer gibt man 1 ml eines Polystyrollatex¹ mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,091 μπι (der einen Feststoffgehalt von

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10 Gew.-% aufweist und von der Firma Dow Chemical Company erhältlich ist) und 0,5 ml eines weiteren Polystyrollatex' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 μΐη (dito), rührt die Mischung während 30 Minuten bei Raumtemperatur, erwärmt auf 40⁰C und rührt während weiterer 30 Minuten bei dieser Temperatur und zentrifugiert dann unter Kühlen auf 2 bis 4°c während 50 Minuten (bei 12 000 min ). Den Niederschlag trennt man durch Dekantieren ab und suspendiert die erhaltenen Latexteilchen, die mit dem Antifibrinogen-Antikörper sensibilisiert sind, in einer Rinderserumalbuminlösung (mit. einer Konzentration von 0,2 Gew.-%) unter Bildung eines Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens¹, das die sensibilisierten Latexteilchen in einer Konzentration von 1 Gew.-% enthält.

2. Aufnahme einer Eichkurve

Man beschickt ein kleines Reagensglas mit 0,1 ml des in der Stufe 1 erhaltenen Antifibrinogen-Latexreagens', gibt 0,1 ml einer Glycinpuff er lösung (mit einem pH-Wert von 9,6) und anschließend 0,2 ml einer Standard-Fibrinogen- Lösung mit einer in der nachstehenden Tabelle I angegebenen Konzentration,

in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die O,2 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, zu und mischt durch Schütteln während 5 Sekunden bei Raumtemperatur gut durch. Anschließend wird die Mischung sofort in eine Acrylharzzelle mit einer Dicke von 2 mm überführt, die mit einem L-förmigen Rührstab, der auf und ab bewegt werden kann, ausgerüstet ist, und ermittelt die Extinktion der Reaktionsmischung in Abhängigkeit von der Zeit, währenddem man die Reaktionsmischung mit 160 Hüben pro Minute rührt. Man bestimmt

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die Extinktion mit Hilfe eines Spektrophotometers (Hitachi 340) bei einer Wellenlänge von 950 nm, wobei man das Photometer auf "Extinktion" einstellt. Das Licht der für die Messung herangezogenen Wellenlänge besitzt eine Schlitzbreite oder Halbwertsbreite von etwa 3 nm.

Die in dieser Weise von dem Spektrophotometer aufgezeichnete Kurve der Änderung der Extinktion mit der Zeit ist in der Fig. 3 dargestellt, in der die Kurven A, B, C und D Fibrinogen-Konzentrationen von 0,0156, 0,0313, 0,0625 bzw. 0,125 μg/ml entsprechen. . Auf diesen Kurven wurde dann eine gerade Linie längs des geraden Abschnitts einer jeden Kurve in einem möglichst frühen Stadium nach Beginn der Aufzeichnung gezogen und es wurde die Neigung der geraden Linie berechnet. Die in dieser Weise erhaltenen Werte sind in der nachstehenden Tabelle I in der mit "Geschwindigkeit" bezeichneten Spalte angegeben, in der die

20 Geschwindigkeit der Änderung der Extinktion als

"Extinktion/min" angegeben ist. Die in dieser Weise erhaltenen Geraden sind in der Fig. 3 als die Geraden A', B¹, C und D¹ dargestellt. Die Korrelation zwischen der Antigenkonzentration und der in dieser Weise erhaltenen Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion als Folge der Agglutination des Latex' erfolgt graphisch, wodurch man die in der Fig. 4 dargestellte Eichkurve erhält.

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- 54 -

Tabelle I

Konzentration der Standard-Fibrinogen- Lösung ^g/ml)	Geschwindigkeit der Zunahme der Extink tion bei 950 nm (Extinktion/min)
0,0156	O,0008
0,0313	0,00264
0,0625	0,00480
0,125	0,0103
0,250	0,0256
0,500	0,0566
1,00	0,152
2,00	0,300
4,00	0,514

3. Bestimmung von Fibrinogen in unbekannten Proben

Man entnimmt einem Patienten eine Probe Blut oder Urin

und trennt im Fall der Blutprobe Serum in üblicher Weise ab. Dann vermischt man einen aliquoten Anteil von 0,2 ml der unverdünnten oder verdünnten Probe (unter Anwendung des in der nachstehenden Tabelle II ange-

gebenen Verdünnungsfaktors) mit 0,1 ml des gemäß Abschnitt 1 bereiteten Antifibrinogen-Latexreagens und 0,1 ml einer Glycinpufferlösung (pH 9,6) in der Weise, wie es in Abschnitt 2 angegeben ist, worauf man die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion in gleicher Weise, wie in Abschnitt 2 beschrieben, ermittelt. Dann liest man auf der gemäß Abschnitt 2 erstellten Eichkurve die Fibrinogen-Konzentration, die dem in dieser Weise ermittelten Wert der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion entspricht, ab. Die hierbei erhaltenen

35 Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengestellt.

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Zu Vergleichszwecken sind in der Tabelle II auch die Werte aufgeführt, die man mit Hilfe des üblichen Radioimmuntests (RIA-Methode) (S.M.Ratky et al. , Brit.J.Haematol. 30 (1975) 145 bis 149) und der üblichen Objektträgermethode (Fujimaki, Tamura und Takahashi, Rinsho Kagaku, Japan (Clinical Science), 12 (1976) 507 und Fujimaki, Ikematsu, Takeuchi und Kato, Rinsho Byori (Japanese Journal of Clinical Pathology), 21 (1973) 973) ermittelt hat.

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Tabelle II

CD CO 00

Patient	Unbekannte Probe	Verdün nungs- faktor	Geschwindigkeit	Fibrinogenkon2entration in der unbekannten	lUÄ-Methode	Ob j ektträger- methode	0,052	Il
Nr.	Material	χ 16	der Zunahme der Extinktion (Extinktion/min χ 102)	Probe ^/!til-	4,892	I 8,0	0,011 j	11
1	Urin	χ 1	3,7	Erf indungs- gemäßes Ver fahren	0,282	0,5	0,023	II
2	π	χ 1	3,25	5,28	0,020	<0,5	0,006	1,0
3	π	χ 1	0,087	0,30	0,006	II	0,072	1,0
4	ti	χ 1	<0,05	0,015	0,789	1,25
5	H	χ 1	0,365	< 0,01	0,850	1,0
6	Il	χ 1	0,088	0,049	1,335
7	Il	χ 1	0,330	0,015	0,870
8	η	χ 1	<0,05	0,045
9	π	χ 10	0,332	< 0,01
10	Serum	χ 10	0,671	0,045
11	Il	χ 10	0,665	0,810
12	Il	χ 10	1,32	0,805
13	Il	0,698	1,42
0,84

IQ O Ul

Ö H-I ft co cn

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Beispiel 2

1. Herstellung eines mit Antihumanchoriongonadotropin-Antikörpern sensibilisierten Latexreagens'(Anti- hCG-

Latexreagens, Antihumanchoriongonadotropin-sensibilisiertes Latexreagens)
Nach der in Abschnitt 1 von Beispiel 1 beschriebenen Weise bereitet man ein Antihumanchoriongonadotropinsensibilisiertes Latexreagens, mit dem Unterschied, daß man anstelle des Anti-(humanfibrinogen)-Antikörpers

10 einen Anti-Chumanchorxongonadotropin)-Antikörper

(Anti-hCG)-verwendet, anstelle der Mischung aus gleichen Volumina von Polystyrollatices mit durchschnittlichen Teilchendurchmessern von 0,091 bzw. 0,220 μπι einen monodispersen Polystyrollatex mit einem durchschnittliehen Teilchendurchmesser von 0,220 μΐη einsetzt und die Konzentration der Latexteilchen in dem fertigen Reagens auf 0,25% einstellt.

2. Aufnahme der Eichkurve

In einem kleinen Reagensglas vermischt man durch heftiges Schütteln während 5 Sekunden 0,15 ml des in dem obigen Abschnitt gebildeten Anti-hCG-Latexreagens' und 0,15 ml einer Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung, der in der in der nachstehenden Tabelle III

angegebenen Konzentration in einer isotonischen

Natriumchloridlösung, die 0,2 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält. Unmittelbar anschließend überführt man die Mischung in eine Acrylharzzelle mit einer Dicke von 4 mm, die mit einem kompakten Rührer mit einem Rührflügeldurchmesser von 2,4 mm ausgerüstet ist, wonach man die Änderung der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung in Abhängigkeit von der Zeit mißt, währenddem man die Mischung bei 1200 min rührt. Die Bestimmung der prozentualen Absorption erfolgt unter Verwendung einer Licht emittierenden Ga/As-Diode

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(Monsanto Company, Modell ME-7124, Spitzenemissionswellenlänge: 940 nm, Halbwertsbreite: 50 nm) als Lichtquelle. Das von der Lichtquelle emittierte Licht wird direkt auf die Zelle gerichtet, worauf man das durchgelassene Licht mit Hilfe einer Silicium-

Photozelle (Hamamatsu TV, Modell S 874-8K) mißt. Das Ausgangssignal der Photozelle wird verstärkt und es wird die Änderung der prozentualen Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit mit Hilfe eines Schreibers

10 aufgezeichnet. Die in dieser Weise erhaltene Kurve

ist in der Fig. 5a dargestellt. Auf dieser Kurve wird dann eine gerade Linie längs des annähernd geraden Abschnittes der Kurve in einem möglichst frühen Stadium nach Beginn der Aufzeichnung gezeichnet, wo-

15 rauf man die Steigung der Geraden berechnet. Die in

dieser Weise erhaltenen Werte sind in der nachstehenden Tabelle III in der mit "Geschwindigkeit" bezeichneten Spalte angegeben, in der die Geschwindigkeit der Änderung der prozentualen Absorption in %/min angegeben ist. Diese Bestimmung erfolgt für jede Konzentration doppelt, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu überprüfen. Aus den in der Tabelle III angegebenen Zahlenwerten wird die in der Fig. 6a dargestellte Eichkurve erstellt, indem man graphisch die Korrelation zwischen der Konzentration des Antigens und der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption als Folge der Agglutination des Latex' ermittelt. In der Fig. 6a sind die Werte auf beiden Achsen in logarithmischem Maßstab angegeben.

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Tabelle III

Konzentration der Standard-hCG-Lösung (internat iona1e	Geschwindigkeit der Änderung der prozentualen Absorption bei 940 nm (%/min)	2.Messung	Mittel
Einheiten/ml)	1.Messung	1,78	1,81
0,078	1,84	3,18	3,15
0,156	3,12	5,50	5,50
0,312	5,50	9,40	9,51
0,625	9,62	14,8	14,85
1,25	14,9

Die Fig. 5b zeigt die Kurven, die man erhält, wenn man die in der Fig. 5a dargestellten Kurven, die tatsächlich von dem Schreiber aufgezeichnet wurden, in die Extinktion umwandelt. Mit Hilfe der in der Fig.. 5b dargestellten Kurven wird die Geschwindigkeit der Änderung der

2o Extinktion in gleicher Weise ermittelt, wozu man den

ungefähr geraden Abschnitt einer jeden Extinktionskurve in einem möglichst frühen Stadium nach Beginn der Reaktion verwendet. Die Fig. 6b zeigt anhand einer Kurve die Beziehung zwischen der in dieser Weise ermittelten Geschwindigkeit der Änderung der Extinktion und der Konzentration der Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung. Die in dem nachstehenden Abschnitt 3 beschriebene Bestimmung unbekannter Proben könnte auch mit Hilfe der Fig. 6b erfolgen.

3. Bestimmung von Humanchoriongonadotropin in unbekannten Proben

Man entnimmt einem Patienten eine Probe Blut oder Urin, wobei man im Fall einer Blutprobe Serum in üblicher Weise isoliert. Die Probe wird dann in der in der nach-

3C9S33/0S93

Mitsubishi Chemical PD-8 3

stehenden Tabelle IV angegebenen Weise verdünnt. In gleicher Weise, wie es in dem obigen Abschnitt 2 angegeben ist, werden dann 0,15 ml der verdünnten Probe mit 0,15 ml des in dem Abschnitt 1 bereiteten Anti-hCG-Latexreagens umgesetzt und es wird die Änderung der prozentualen Absorption in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt, um die Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption zu ermitteln. Der in dieser Weise erhaltene Wert wird mit der Eichkurve ver-

10 glichen und es wird von der Eichkurve die diesem Wert
der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen
Absorption entsprechende Konzentration des Humanchoriongonadotropins abgelesen. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV zusam-

15 mengestellt, die zu Vergleichszwecken auch die Zahlenwerte enthält, die man an der gleichen Probe mit Hilfe der Radioimmunoassay-Methode ermittelt hat (Radioimmunoassay Method, K.Okumura, J.of Jap. Endocrinologic Soc. 52 (1976) 105).

Tabelle IV

Bestimmung einer unbekannten Probe

Probe Art d. Nr. Probe	Name des Patienten (Geschlecht)	Diagnose	Verdünnungs- faktor	Geschwin digkeit (%/min)	Humanchoriongonadotropin- Konzentration in der unbe kannten Probe (Iü/ml)*	RIA- Methode
1 Urin	H.M. (w)	Schwangerschaft (10.Woche)	χ 100	9,2	erfindungs gemäßes Verfahren	65,16
2	K.O. (w)	Traubenmole (8.Woche)	x 1000	10,2	60	682,9
3	R. H. (w)	Nach Entfernen der Traubenmole	χ 1	7,8	690	0,484
4	G.M. (m)	Rechtes Testi- culom	χ 1	3,8	0,45	0,182
5	T. I. (W)	Teilabort (4.Woche)	χ 1	3,5	0,20	0,194
6 Serum	T. Y. (w)	Traubenmole	χ 1	1,7	0,18	Ö,O741
7	E. S. (m)	Testiculcm	χ 10	9,6	0,075	6,17
8	S.K. (w)	Traubenmole	χ 1	7,7	6,4	0,544
9	H.N. (m)	Bösartiges Thynon	χ 1	10,0	0,48	0,673
10	R.W. (w)	Schwangerschaft (6. Woche)	χ 100	13,2	0,69	100,3
95

* Iü/ml - internationale Einheiten/ml

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Beispiel 3

Man setzt einen aliquoten Anteil von 0,1 ml eines gemäß Abschnitt 1 von Beispiel 2 bereiteten Antihumanchoriongonadotropin-Antikörper-sensibilisierten Latexreagens¹ mit einem Latexgehalt von 0,33% mit 0,1 ml einer Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung in der in Abschnitt 2 von Beispiel 1 beschriebenen Weise um und zeichnet die Änderung der prozentualen Absorption auf. Die Bestimmung der prozentualen Absorption erfolgt unter Anwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Vorrichtung, mit dem Unterschied, daß man für die Bestrahlung ein monochromatisches Licht mit einer Wellenlänge von 950 nm und einer Schlitzbreite von 30 nm (was einer mechanischen Schlitzbreite von 0,36 mm entspricht) verwendet, die man mit Hilfe eines Prismenspektrophotometers (Hitachi Modell EPU-2) als Lichtquelle bildet und wobei man eine Zelle mit einer Dicke von 3 mm einsetzt. Aus dem geraden Abschnitt der aufgezeichneten Kurve, die die Änderung der prozentualen Absorption in Abhängigkeit von der Zeit wiedergibt, ermittelt man die Geschwindigkeit der Änderung der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit und trägt diese auf der Ordinate gegen die

„_ Konzentration der Standard-Humanchoriongonadotropin-25

Lösung auf der Abszisse auf doppelt-logarithmischem Papier auf und erhält in dieser Weise die in der Fig. dargestellte Eichkurve. Unter Verwendung dieser Eichkurve kann man die Humanchoriongonadotropin-Konzentration unbekannter Proben bestimmen.

Beispiel 4

Nach der in Abschnitt 1 von Beispiel 1 beschriebenen Weise bereitet man ein Antifibrinogen-Latexreagens mit einem Latexgehalt von O,50%, mit dem Unterschied,

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daß man die Mischung aus gleichen Volumina eines Polystyrollatex' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,091 μπι und einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 μπι durch einen monodispersen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,312 μπι (Dow Chemical) ersetzt.

Dann vermischt man in einem kleinen Reagensglas

0,2 ml des Latexreagens¹ und 0,2 ml einer Standard-Fibrinogen-Lösung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise durch Schütteln während 5 Sekunden. Unmittelbar anschließend überführt man die Reaktionsmischung in eine Zelle mit einer Dicke von 2 mm und zeichnet die Änderung der prozentualen Absorption auf, währenddem man die Mischung mit Hilfe eines auf und ab bewegten RührStabes nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise bewegt. Die Bestimmung der prozentualen Absorption erfolgt in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise, mit dem Unterschied der andersartigen Rühreinrichtung. Die in dieser Weise erhaltenen Zahlenwerte werden dann nach der in Beispiel 3 angegebenen Weise aufgearbeitet, wobei man die Korrelationswerte zwischen der Konzentration der Standard-Fibrinogen-Lösung und der Geschwindigkeit der Änderung der prozentualen Absorption erhält, die in der nachstehenden Tabelle V angegeben sind, aus denen man die in der Fig. 8 dargestellte Eichkurve erstellt. Unter Verwendung dieser Eichkurve kann die Fibrinogen-

30 menge in unbekannten Proben bestimmt werden.

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Tabelle V

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Konzentration der Standard-Fibrinogen- Lösung ^g/ml)	Geschwindigkeit der Zunahme der prozen tualen Absorption (%/min)
15,6	1 ,03
31,3	2,48
62,5	4,95
125	7,70
250	15,15
500	30,0
1000	48,5

Beispiel 5

Unter Anwendung des in Beispiel 3 verwendeten Antihumanchoriongonadotropin-Latexreagens' bestimmt man die Änderung der prozentualen Absorption. Die für diese Messung verwendete Vorrichtung entspricht der in Beispiel 3 beschriebenen, mit dem Unterschied, daß man die

„_ Lichtquelle durch eine Kombination aus einer üblichen Wolframlampe (12 V, 8 W) und einem optischen Filter (Ditric Optics, D 800) ersetzt und die Zelle mit Licht bestrahlt, das keine Spektralkomponente mit einer Wellenlänge von weniger als 800 nm enthält. Die in dieser

_ Weiser erhaltenen Zahlenwerte werden nach der in Beispiel 3 beschriebenen Weise aufgearbeitet, wodurch man die in der nachstehenden Tabelle VI angegebenen Ergebnisse erhält, die die Korrelation zwischen der Humanchor iongonadotropin-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption wiedergeben. Die Ergebnisse sind graphisch in der in der

SM*Q

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Fig. 9 dargestellten Eichkurve wiedergegeben, mit der die Humanchoriongonadotropin-Menge in unbekannten Proben nach der in Beispiel 2 angegebenen Weise bestimmt werden können.

Tabelle VI

Konzentration der Geschwindigkeit

Standard-Human- der Änderung der

choriongonadotropin- prozentualen Ab-

Lösung (Iü/ml)* sorption (%/min)

0,125	0,40
0,25	0,70
0,5	1,3
1,0	2,1
2,0	3,3
4,0	6,0

* IU/ml = internationale Einheiten/ml

Beispiel 6

Man ersetzt ein nach der Verfahrensweise von Beispiel 2 hergestelltes Anti-(humanchoriongonadotropin)-Antikörper-sensibilisiertes Latexreagens (Antihumanchoriongonadotropin-Latexreagens) mit einer Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung der in der nachstehenden Tabelle VII angegebenen Konzentration um. Dann bestimmt man die Änderung der prozentualen Absorption unter Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Lichtquelle und des dort angegebenen Detektors, mit dem Unterschied, daß man zwischen dem Detektor und der Aufzeichnungseinrichtung einen Integrator zwischen-

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schaltet. Die Integration erfolgt zusammen mit dem Rühren, wobei eine Integration der prozentualen Absorption während Perioden von 9 Sekunden, zwischen denen Pausen von 1 Sekunde liegen, vorgenommen wird. Die Geschwindigkeit der Änderung wird aus den Integralen der fünften und siebten Periode von 9 Sekunden ermittelt. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VII zusammengestellt.

	Tabelle	VII	(b)	- (a)
Konzentration	Integral (a)	Integral (b)
der Standard-	der fünften	der siebten
Humanchorion-	Periode von	Periode von
gonadotropin-	9 Sekunden	9 Sekunden
Lösung (Iü/ml) *	(Schreiber	(Schreiber
	ablesung)	ablesung)	1	,0
0,0625	0,5	1,5	2	,0
0,125	14,5	16,5	4	,5
0,25	22,5	27,0	8	,0
0,50	39	47	20
1,0	70	90	45
2,0	96	141

* Iü/ml = internationale Einheiten/ml

Die in der obigen Tabelle angegebenen Zahlenwerte sind in der Fig. 10 graphisch dargestellt. Unter Verwendung der in der Fig. 10 angegebenen Kurve als Eichkurve kann die Humanchoriongonadotropin-Konzentration unbekannter Proben in der oben beschriebenen Weise ermittelt werden.

Mitsubishi Chemical FD-83

Beispiel 7

Nach der in Beispiel 2, Abschnitt 1, beschriebenen Weise bereitet man ein Antihumanchoriongonadotropinj. sensibilisiertes Latexreagens, mit dem Unterschied,

daß man die Konzentration der Latexteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,220 μΐη in dem fertigen sensibilisierten Latexreagens auf 1,0 Gew.-% einstellt.

Die anschließende Umsetzung und Messung erfolgt nach

der Verfahrensweise und unter Verwendung der Vorrichtung, die in Abschnitt 2 von Beispiel 1 beschrieben sind, mit dem Unterschied, daß man die Standard-

.,. Fibrinogen-Lösungen durch Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen, die in der nachstehenden Tabelle VIII angegeben sind, ersetzt. Aus den in dieser Weise erhaltenen Daten erstellt man die in der Fig. 11 dargestellte Eichkurve, die die

„ Beziehung zwischen der Antigenkonzentration und der

Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion wiedergibt. Unter Verwendung dieser Eichkurve kann die Humanchoriongonadotropin-Konzentration in unbekannten Proben nach der Verfahrensweise von Beispiel 2 bestimmt werden.

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Mitsubishi Chemical WD-8

Tabelle VIII

Konzentration der Standard-Humanchor iongonado tropin-Lösung (IU/ml)*

Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei
950 nm {Extinktion/min χ 10 )·

0,078 0,0086

0,156 0,016

0,313 0,0278

0,625 0,075

1,25 0,197

2,5 0,480

*IU/ml = internationale Einheiten/ml

Beispiel 8

Nach der Verfahrensweise von Beispiel 1, Abschnitt 1, bereitet man ein mit Antifibrinogen-Antikörpern sensibilisiertes Latexreagens (Antifibrinögen-Latexreagens) (Latexteilchengehalt: 1 Gew.-%), mit dem Unterschied, daß man einen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 μΐη (Dow Chemical, Feststoffgehalt =10 Gew.-%) verwendet.

In einem kleinen Reagensglas vermischt man durch Schütteln während 5 Sekunden 0,1 ml des in dieser Weise erhaltenen Antif ibrinögen-Latexreagens', 0,1 ml einer Glycinpufferlösung (mit einem pH-Wert von 9,6) und 0,2 ml einer Standard-Fibrinogen-Lösung, die Fibrinogen in den in der nachstehenden Tabelle IX abgegebenen Konzentrationen in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, enthalten. Anschließend bestimmt man die Änderung der Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit mit der in Ab-

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Mitsubishi Chemical FD-S3

schnitt 2 von Beispiel 1 beschriebenen Vorrichtung bei einer Wellenlänge von 900 nm (Schlitzbreite: etwa 3 nm). Man ermittelt die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion als Folge der Agglutination des Latex' in der in Abschnitt 2 von Beispiel 1 beschriebenen Weise (welche Werte in -der nachstehenden Tabelle IX angegeben sind) und ermittelt die Korrelation dieser Werte mit der Antigenkonzentration der Standardlösung graphisch, wodurch man die in der Fig. 12 dargestellte Eichkurve erhält.

Aus diesen Zahlenwerten ist ersichtlich, daß selbst dann, wenn die Wellenlänge, bei der die Extinktion gemessen wird, um einen Faktor von lediglich 1,13 länger ist als der durchschnittliche Teilchendurchmesser des Latex', eine zufriedenstellende Korrelation zur Bestimmung der Antigenkonzentration erreicht wird und dies bei Konzentrationen des Antigens in Standardlösungen von nicht mehr als 1 μg/ml.

Tabelle IX

Konzentration der Standard-Fibrinogen- Lö sung (μg/ml)	Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 900 nm (Extinktion/ min)
0,0625	0,0008
0,125	0,0034
0,250	0,0090
0,500	0,0148
1 ,00	0,0276
4,00	0,0296

9098 3 3/0803

Mitsu£>ism cneraicai FD-83

- 7O -

Beispiel 9

Man bereitet nach der in Beispiel 2 angegebenen Verfahrensweise, jedoch mit dem Unterschied, daß man den "Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 μπι durch einen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 1,091 μκι (Dow Chemical, Peststoffgehalt = 10 Gew.-%) ersetzt, ein Antihumanchoriongonadotropin-Latexreagens, das 0,3 Gew.-% Latexteilchen enthält.

Man beschickt ein kleines Reagensglas mit einem aliquoten Anteil von 0,2 ml des in dieser Weise bereiteten Antihumanchoriongonadotropin-Latexreagens' und gibt 0,2 ml einer Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung der in der nachstehenden Tabelle X angegebenen Konzentration in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, zu. Anschliessend zeichnet man die Änderung der Extinktion der Reaktionsmischung in Abhängigkeit von der Zeit unter Anwendung der Verfahrensweise und der Vorrichtung von Abschnitt 2 des Beispiels 1 auf, mit dem Unterschied, daß man eine Wellenlänge von 1100 nm (Schlitzbreite: etwa 3 nm) anstelle einer Wellenlänge von 950 nm einstellt. Auf der Grundlage der in dieser Weise aufgezeichneten Änderung der Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit ermittelt man die in der Fig. 13 dargestellte Eichkurve nach der Verfahrensweise von Beispiel 1, Abschnitt 2.

Aus der Fig. 13 ist ersichtlich, daß selbst dann, wenn das Verhältnis von Wellenlänge zu durchschnittlichem Teilchendurchmesser des Latex annähernd 1,0 beträgt, die erfindungsgemäße Verfahrensweise dazu geeignet ist, Humanehöriongonadotropin-Konzentrationen von nicht mehr als 1,0 internationale Einheiten/ml zu bestimmen.

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FD-S3

Tabelle X

Konzentration der Standard-Humanchorion- gonadotropin-Lösung (internationale Ein heiten/ml)	Beispiel 10	Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion* bei 1100 min (Extinktion/ min)
0,0156	O,0O32
0,0313	0,0072
0,0625	0,0095
0,125	0,0169
0,250	0,025
0,500	0,033
1 ,00	0,050
2,00	0,066
4,00	0,066

Nach der Verfahrensweise von Beispiel 8 führt man eine Reihe von Untersuchungen durch, bei denen man einen Antifibrinogen-sensibilisierten Latex (mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 μΐη) identisch

dem in Beispiel 8 verwendeten und Standard-Fibrinogen-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen, die in der nachstehenden Tabelle XI angegeben sind, in isotonischer Natriumchloridlösung, die 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, verwendet. Die Bestimmung der Extinktion erfolgt bei einer Wellenlänge von 1650 nm anstelle einer Wellenlänge von 900 nm bei Anwendung einer Schlitzbreite von etwa 3 nm. Die in dieser Weise erhaltene und in der Fig. 14 dargestellte Eichkurve ist für die Bestimmung der Antxgenkonzentration geeignet.

909835/0803

Mitsubishi Chemical FD-ε 3

Tabelle XI

Konzentration der Standard-Fibrinogen-Lösung ^g/ml)

Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 1650 nm (Extinktion/ min)

0,0313	0,00128
0,0625	0,0020
0,250	0,0116
0,500	0,027
1 ,00	0,044
4,00	0,092

9098 3 3/0803

eerse

it

Claims (1)

1. PATENTANWÄLTE 2305435

   TER MEER-MÜLLER-STEINMEISTER

   Beim Europäischen Patentamt zugelassene Vertreter — Professional Representatives before the European Patent Ofllce Mandataires agrees pres !'Office european des brevets

   Dipl.-Ghem. Dr. N, tar Meer Dipl.-lng. H. Steinmeister

   Dipl.-lng, F. E. Müller „. ,

   Triftstrasse A₁ Siekerwall 7,

   D-8OOO MÜNCHEN 22 D-48OO BIELEFELD 1

   Case: FD-83 13. Feb. 1979

   MITSUBISHI CHEMICAL INDUSTRIES LIMITED 5-2, Marunouchi 2-chome, Chiyoda-ku, Tokyo, Japan

   Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern.

   Priorität: 14. Februar 1978, Japan, Nr. 15017-1978

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antigen oder einen Antikörper oder eine Mischung davon in einem flüssigen Medium mit dem entsprechenden Antikörper und/oder Antigen,

   909833,/ 0 8 ß 3

   ORIGINAL INSPECTED

   Mitsubishi Chemical FD-&3

   der bzw- das auf unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μη vorliegt, um die Trägerteilchen zu sensibilisieren, umsetzt.
   5 die Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge

   oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μΐη bestrahlt, ■-.τη das durchgelassene Licht an zwei oder mehreren Zeitpunkten während des Ablaufs der Reaktion zu messen; und
   dann die Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung während einer gegebenen Zeitdauer ermittelt.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen, der bzw. das auf den unlöslichen Trägerteilchen vorliegt, in dem flüssigen Medium unter vorbestimmten, im wesentlichen festen Bedingungen umsetzt und die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung pro Zeiteinheit zu etwa einem bestimmten Zeitpunkt nach Beginn der Reaktion ermittelt.

   3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen, der bzw. das auf den unlöslichen Trägerteilchen vorliegt, in dem flüssigen Medium unter vorbestimmten, im wesentlichen festen Bedingungen umsetzt und anschließend die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung pro Zeiteinheit an einem Zeitpunkt ermittelt, bei dem die Reaktion stetia abläuft.

   909833/0803

   Mitsubishi Chemical

   4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennz eichnet, daß man die Zunahmegeschwindigkeit zu einem frühen Zeitpunkt, nachdem die Reaktion den stationären Zustand erreicht hat,

   5 ermittelt.

   5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antigen oder den Antikörper in einer Testflüssigkeit mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen, der bzw. das auf den unlöslichen Trägerteilchen vorliegt, unter vorbestimmten, im wesentlichen festen Bedingungen umsetzt und anschließend die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung pro Zeiteinheit an einem solchen Zeitpunkt ermittelt, bei dem die Extinktion oder die prozentuale Absorption gleichmäßig mit Ablauf der Zeit zunimmt.

   20 6- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,

   dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antigen oder einen Antikörper in einer Testflüssigkeit mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen, der bzw. das auf den unlöslichen Trägerteilchen vorliegt, unter vorbestimmten, im wesentlichen festen Bedingungen umsetzt und die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung pro Zeiteinheit an einem Zeitpunkt ermittelt, bei dem die Extinktion oder die prozentuale Absorption erstmals nach Beginn der Reaktion gleichmäßig zunimmt.

   7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennz eiehnet, daß man ein Antigen 5 oder einen Antikörper in einer Testflüssigkeit mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen, der

   909833/08 0*'

   Mitsubishi Chemical FD-3 3

   -A-

   bzw. das auf den unlöslichen Trägerteilchen vorliegt, unter vorbestimmten, im wesentlichen festen Bedingungen umsetzt, die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung an zwei oder mehreren Zeitpunkten nach Beginn der Reaktion mißt und die Meßdaten speichert, und die gespeicherten Meßdaten dazu verwendet, die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung pro Zeiteinheit zu ermitteln.

   8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man unlösliche Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 1,0 μπι verwendet.

   9. Verfahren nach Anspruch Λ , dadurch gekennzeichnet, daß man unlösliche Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,2 bis 0,8 μπι verwendet.

   10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Trägerteilchen im wesentlichen ein feinteiliges Pulver einer organischen hochmolekularen Substanz oder einer anorganischen Substanz, die in dem flüssigen Medium im wesentlichen unlöslich ist, verwendet.

   11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als feinteiliges Pulver aus

   der organischen hochmolekularen Substanz ein feinteiliges Pulver eines synthetischen Harzes, Bakterien oder Zellmembranfragmente verwendet.

   909833/0803

   Mitsubishi Chemical FD-8.2

   12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als feinteiliges Pulver der organischen hochmolekularen Substanz Polystyrollatexteilchen verwendet.

   13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennz eichnet, daß man als feinteiliges Pulver der anorganischen Substanz mindestens einen Vertreter aus der Metalle, anorganische Oxide und Mineralien umfassenden Gruppe verwendet.

   14. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennz eichnet, daß man als feinteiliges Pulver der anorganischen Substanz

   Siliciumdioxid, Aluminiumoxid oder Siliciumdioxid-Aluminiumoxid verwendet.

   15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennz eichnet, daß man die Reaktion

   20 des Antigens oder des Antikörpers oder der

   Mischung davon mit den entsprechenden Antikörper- und/oder Antigen-sensibilisierten unlöslichen Trägerteilchen unter Bedingungen bewirkt, die den Kontakt der Trägerteilchen miteinander möglichst

   25 weitgehend beschleunigen.

   16. Verfahren nach Anspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion des Antigens oder des Antikörpers oder der Mischung davon mit den entsprechenden Antikörper- und/oder Antigen-sensibilisierten unlöslichen Trägerteilchen unter vorbestimmten, im wesentlichen festen Bedingungen durchführt, die den Kontakt der Trägerteilchen miteinander beschleunigen, währenddem man die Extinktion oder die prozentuale Absorption

   90983.1/0803

   Mitsubishi Chemical FD-83

   -fe

   Reaktionsmischung mißt.

   17. Verfahren nach den Ansprüchen 1 5 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion unter Bewegen der Reaktionsmischung durchführt.

   18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e kennz eichnet, daß man die Reaktionsmischung mit monochromatischem oder polychromatischem Licht

   mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μτη bestrahlt.

   19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e kennz eichnet, daß man die Reaktionsmischung

   mit monochromatischem oder polychromatischem Licht mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,8 bis 1,4 μπι bestrahlt.

   20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e kennzeichnet, daß man Licht mit einer Wellenlänge oder mit Wellenlängen, die um einen Faktor von mindestens 1,1 langer sind als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen und bei der bzw. denen die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung während des Ablaufs der Reaktion zunimmt, anwendet.

   21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Licht mit einer

   30 Wellenlänge oder mit Wellenlängen, die um einen Faktor von mindestens 1,5 länger sind als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen und bei der bzw. denen die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung mit ablaufender Reaktion zunimmt,

   5 anwendet.

   909833/0803

   Mitsubishi Chemical PD-83

   22. Verfahren nach Anspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß man die Trägerteilchen in der Reaktionsmischung in einer Konzentration

   im Bereich von 0,05 bis 1 Gew.-% verwendet.

   23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e kennz eichnet, daß man die Trägerteilchen in der Reaktionsmischung in einer Konzentration

   im Bereich von 0,1 bis 0,6 Gew.-% verwendet.

   24. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e kennz eichnet, daß man als flüssiges Medium Wasser oder eine Mischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungs-

   15 mittel verwendet.

   25. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch g e kennz eichnet, daß man eine Testflüssigkeit, die verdünnt oder konzentriert sein kann

   20 und ein Antigen oder einen Antikörper enthält,

   mit einer Suspension der Trägerteilchen, auf denen der entsprechende Antikörper oder das entsprechende Antigen vorliegt, umsetzt.

   26. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch g e kennz eichnet, daß man eine Testflüssigkeit, die einen zu bestimmenden Antikörper oder ein zu bestimmendes Antigen enthält, zunächst mit dem entsprechenden Antigen oder Antikörper umsetzt und die gebildete Reaktionsmischung dann mit einer Suspension der Trägerteilchen, auf denen der entsprechende Antikörper oder das entsprechende Antigen vorliegt, umsetzt.

   909833/0803

   Mitsubishi Chemical FD-3 3

   2305435

   27. Verfahren nach Anspruch !,dadurch g e kennz eichnet, daß der Antikörper oder das Antigen durch physikalische und/oder chemische Adsorption auf den unlöslichen Trägerteilchen festgelegt ist.

   28. Verfahren nach Anspruch !,dadurch g e kennz eichnet, daß der Antikörper oder das Antigen durch eine chemische Bindung mit Hilfe eines Kupplungsmittels auf den unlöslichen Trägerteilchen festgelegt ist.

   29. Vorrichtung zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, gekennzeichnet durch

   a) unlösliche Trägerteilchen für den Antikörper oder das Antigen, der bzw. das dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper entspricht, welche Trägerteilchen einen durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μΐη aufweisen?

   b) eine Absorptionszelle mit einer Dicke von 0,5 bis 10 mm zur Aufnahme der Reaktionsmischung aus dem auf dem unlöslichen Träger vorliegenden Antigen oder Antikörper und dem zu bestimmenden Antigen oder dem zu bestimmenden Antikörper oder der zu bestimmenden Mischung

   davon in einem flüssigen Medium;

   c) eine Bestrahlungseinrichtung zum Bestrahlen mit Licht mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μΐη;

   d) eine Einrichtung zum Messen der Intensität des Lichts mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι, mit dem die Reaktionsmischung in der Absorptionszelle bestrahlt worden ist und das von der Reaktionsmiehung durchgelassen worden ist; und

   909833/0803

   Mitsubishi Chemical FD-8 3

   e) eine Einrichtung zur Ermittlung der Änderung der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung bei der in Stufe d) gemessenen Wellenlänge in Abhängigkeit von der Reaktionszeit, 5 welche Ermittlungseinrichtung in Abhängigkeit von

   der Meßeinrichtung betrieben wird.

   30. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch g e kennz eichnet, daß die unlöslichen Trägerteilchen einen durchschnittlichen Durchmesser im
   Bereich von 0,1 bis 1,0 μΐη aufweisen.

   31. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch g e kennz e ichnet, daß die unlöslichen Trägerteilchen einen durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,2 bis 0,8 μπι aufweisen.

   32. Vorrichtung nach Anspruch 29,dadurch gekennzeichnet, daß die Absorptionszelle

   eine Dicke von 1 bis 5 mm aufweist.

   33. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch g e kennz eichnet, daß die das Licht durchlassenden Fenster der Zelle aus transparantem Glas oder einem transparenten synthetischen Harz bestehen, das eine Durchlässigkeit von mindestens 30% für Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis
   2,4 μπι aufweist.

   34. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch g e kennz eichnet, daß die Bestrahlungseinrichtung monochromatisches oder polychromatisches Licht mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,8 bis 1,8 μπι abgibt.

   909833/0803

   Mitsubishi Chemical FD-83

   - 10 -

   35. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennz eichnet, daß die Absorptionszelle mit einem Rührer versehen ist.

   909833/0803