CH640353A5 - Verfahren zur bestimmung von antigenen und antikoerpern. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern durch Fixieren des Antikörpers oder des Antigens an unlöslichen Trägerteilchen mit geringen Teilchendurchmessern, wodurch die unlöslichen Trägerteilchen sensibilisiert werden, Umsetzen der sensibilisierten Trägerteilchen mit einem entsprechenden Antigen, Antikörper oder einer Mischung davon und Bestrahlen der Reaktionsmischung mit Strahlung einer spezifischen Wellenlänge zur Messung der durchgelassenen Strahlung an zwei oder mehreren Zeitpunkten und Ermitteln der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung während einer gegebenen Zeitdauer.

Es besteht ein ständiges Bedürfnis für ein Verfahren und eine Vorrichtung zur schnellen und genauen qualitativen und quantitativen Bestimmung von biologisch aktiven Substanzen, beispielsweise von Antigenen und Antikörpern, die in extrem geringen Konzentrationen vorliegen. Es besteht weiterhin ein starkes Bedürfnis dafür, die Anwesenheit von Arzneimittelwirkstoffen in Körperflüssigkeiten festzustellen. Weiterhin ist es für die medizinische Diagnose häufig wichtig, über die Anwesenheit von verschiedenen Substanzen Bescheid zu wissen, die auf natürlichem Wege von dem Körper synthetisiert werden oder die in den Körper eingebracht worden sind.

Bislang ist es bereits bekannt, Antikörper oder Antigene halbquantitativ dadurch nachzuweisen, dass man Latexteilchen, an die man einen Antikörper oder ein Antigen fixiert hat, mit einem entsprechenden Antigen oder Antikörper auf einer Glasplatte umzusetzen und visuell den Agglutinationszustand zu beobachten.

In den letzten Jahren ist in den nachstehend angegebenen Veröffentlichungen vorgeschlagen worden, Antigene und Antikörper unter Verwendung der oben erwähnten Latexteilchen quantitativ zu bestimmen, indem man den entsprechenden Antikörper oder das entsprechende Antigen auf den Latexteilchen fixiert, um den Latex zu sensibilisieren, den auf dem Trägermaterial vorliegenden Antikörper oder das auf dem Trägermaterial vorliegende Antigen mit dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper umsetzt, um die Latexteilchen zu agglutinieren oder zusammenzuballen, und die Geschwindigkeit der Abnahme der Trübung der überstehenden Flüssigkeit des Latex' mit Hilfe von sichtbarem Licht zu messen, um das Antigen oder den Antikörper unter Ausnützung des Agglutinationsphänomens des als Reagens verwendeten Latex zu bestimmen: a) Croatica Chemica Acta, 42 (1970) 457 bis 466 und b) European Journal of Biochemistry, Vol. 20, Nr. 4 (1971) 558 bis 560.

Da die Methode des obigen Vorschlags die Messung der Geschwindigkeit der Trübungsabnahme dazu benützt, das Antigen oder den Antikörper zu bestimmen, ist es erforderlich, einen mit dem Antikörper oder dem Antigen sensibilisierten Latex mit extrem geringer Konzentration, die beispielsweise im Bereich von 0,007 bis 0,028% liegt, zu verwenden, die Reaktion des Latex' mit dem Antigen oder dem Antikörper in einem stationären Zustand durchzuführen, irgendwelche Verunreinigungen, die die Trübung der Probe beeinträchtigen könnten, zu entfernen und ähnliche Massnahmen zu ergreifen. Als Ergebnis davon ist die oben erwähnte Methode nachteilig dadurch, dass die Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion unvermeidbar vermindert wird, dass sowohl die Präzision als auch die Reproduzierbarkeit der Messmethode für die Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern ungenügend sind und dass die Abtrennung von Verunreinigungen häufig extrem komplizierte Massnahmen erforderlich macht. Demzufolge ist es schwierig, die obige Methode zur Bestimmung von Antigenen, wie Fibrinogen (Fg), Humanchoriongonadotropin (hCG) oder ähnliche Materialien zu bestimmen, da komplizierte Massnahmen zur Herstellung des notwendigen Reagens' erforderlich sind und es schwierig ist, eine reproduzierbare Agglutinationsreaktion der Substanz zu erreichen, wenn sie in Blut oder Urin enthalten ist, das bzw. der verschiedene andere Substanzen enthält, die die Reaktion beeinträchtigen können.

In c) Immunochemistry, Vol. 12 (1975) 349 bis 351 ist bereits vorgeschlagen worden, Antikörper oder Antigen quantitativ dadurch zu bestimmen, dass man die oben erwähnten

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agglutinierten Latexteilchen mit einem Laserstrahl bestrahlt und die Änderung der Breite der Spektrallinien des gestreuten Lichtes des Laserstrahls misst, um die mittlere Diffusionskonstante (D) zu bestimmen, die einen Hinweis auf die Brownsche Bewegung der agglutinierten Teilchen gibt, die ihrerseits umgekehrt proportional ist der Grösse der agglutinierten Teilchen. Da bei dieser Methode der Antikörper- oder Antigen-sensibilisierte Latex in extrem niedriger Konzentration die beispielsweise lediglich 0,001% beträgt, verwendet wird, wird die Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion vermindert, so dass sowohl die Präzision als auch die Reproduzierbarkeit dieser Methode zu wünschen übrig lassen. Weiterhin besitzt diese Methode den Nachteil, dass komplizierte Berechnungen unter Anwendung von Spektrumanalysemethoden erforderlich sind, was komplizierte Massnahmen notwendig macht, und dass irgendwelche in der Probe vorhandenen Verunreinigungen vor der Messung entfernt werden müssen. Aus diesem Grund hat sich auch diese Methode in der Praxis nicht durchsetzen können.

Die obige Literaturstelle c beschreibt ferner, dass die Bestimmung mit Hilfe der in der Literaturstelle a angegebenen Trübungsmessmethode extrem ungenaue Ergebnisse liefert (siehe Fig. 2 auf Seite 350 dieser Veröffentlichung).

Das Ergebnis von früheren Untersuchungen der Inhaberin im Hinblick auf Verfahren und Vorrichtungen zur schnellen Bestimmung von Antigenen und/oder Antikörpern in Proben mit hoher Präzision und guter Reproduzierbarkeit ist Gegenstand der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 24015/1978 der Inhaberin (nachfolgend als «ältere Anmeldung» bezeichnet).

Gegenstand dieser älteren Anmeldung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, das darin besteht, einen Antikörper oder ein Antigen, der bzw. das dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper entspricht, auf unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 (im zu fixieren, den auf dem Trägermaterial vorliegenden Antikörper und/oder das auf dem Trägermaterial vorliegende Antigen mit dem zu bestimmenden Antigen, dem zu bestimmenden Antikörper oder der zu bestimmenden Mischung davon umzusetzen und die Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereiche von 0,6 bis 2,4 um, die um einen Faktor von mindestens 1,5 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, zu bestrahlen, um die Extinktion der Reaktionsmischung zu bestimmen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, das in der genannten älteren Anmeldung angegebene frühere Verfahren weiter zu verbessern und eine reproduzierbare, schnelle Bestimmung von Antigenen und Antikörpern mit höherer Präzision zu ermöglichen.

Es hat sich gezeigt, dass diese Aufgabe dadurch gelöst werden kann, dass man die offenbare Geschwindigkeit einer Antigen-Antikörper-Reaktion über die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung für Licht mit einer Wellenlänge in dem oben angesprochenen nahen Infrarotbereich misst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und/oder Antikörpern, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Antigen, einen Antikörper oder eine Mischung davon in einem flüssigen Medium mit dem entsprechenden Antikörper und/oder Antigen, der bzw. das auf unlösliche Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 um vorliegt, wodurch die Trägerteilchen sensibilisiert werden, umsetzt, die Reaktionsmischung mit Strahlung mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 (im bestrahlt, um das durchgelassene Licht an zwei oder mehreren Zeitpunkten während des Ablaufs der Reaktion zu messen, und anschliessend die Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung während einer gegebenen Zeitdauer ermittelt.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann besonders zweckmässig mit Hilfe einer Vorrichtung durchgeführt werden, welche a) unlösliche Trägerteilchen für den Antikörper oder das Antigen, der bzw. das dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper entspricht, welche Trägerteilchen einen durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 (im aufweisen;

b) eine Absorptionszelle mit einer Dicke von 0,5 bis 10 mm zur Aufnahme der Reaktionsmischung aus einem Antikörper oder Antigen, der bzw. das auf dem unlöslichen Trägermaterial vorliegt, und dem zu bestimmenden Antigen, Antikörper oder der Mischung davon in einem flüssigen Medium;

c) eine Bestrahlungseinrichtung zum Bestrahlen mit Licht mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 (im ;

d) eine Einrichtung zum Messen der Intensität des Lichts mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 (im, mit dem die Reaktionsmischung in der Absorptionszelle bestrahlt worden ist und das von der Reaktionsmischung durchgelassen worden ist; und e) eine Einrichtung zur Ermittlung oder Errechnung der Änderung der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung bei der in der Stufe d gemessenen Wellenlänge in Abhängigkeit von der Reaktionszeit, welche Ermittlungseinrichtung in Abhängigkeit von der Messeinrichtung betrieben wird, umfasst.

Die Erfindung sei nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert.

In der Zeichnung zeigen

Fig. 1 das Absorptionsspektrum von Wasser, das unter Verwendung von Strahlung mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 (im in einer Absorptionszelle mit einer Dicke von 1 mm aufgenommen wurde;

Fig. 2 anhand einer Kurve die Änderung der Extinktion in Abhängigkeit von dem Teilchendurchmesser eines Polystyrollatex' ;

Fig. 3 anhand einer Kurve die zeitliche Änderung der Extinktion für Strahlung einer Wellenlänge von 950 nm, die während des Ablaufs der Reaktion aufgezeichnet wurde, welche Reaktion dadurch verursacht wird, dass man Standardfi-brinogenlösungen unterschiedlicher Konzentrationen zu einer Mischung von Polystyrollatices mit durchschnittlichen Teilchendurchmessern von 0,091 und 0,220 (im, die mit Anti-(humanfibrinogen)-Antikörpern sensibilisiert worden sind, zugibt;

Fig. 4 anhand einer Kurve die Beziehung zwischen der aus der Fig. 3 ermittelten Zunahme der Extinktion und der Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung;

Fig. 5a anhand einer Kurve die Änderung der prozentualen Absorption in Abhängigkeit von der Zeit bei einer maximalen Emissionswellenlänge von 940 nm, die während des Ablaufs der Reaktion aufgezeichnet worden ist, welche reak-tion dadurch ausgelöst worden ist, dass man Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen zu einem mit Antihumanchoriongonadotro-pin sensibilisiertem Latexreagens zugibt;

Fig. 5b eine von der Fig. 5a abgeleitete Kurve, bei der die prozentuale Absorption in die Extinktion umgewandelt worden ist;

Fig. 6a eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption, die aus der Fig. 5a entnommen worden ist, und der Konzentration der eingesetzten Standard-Humanchoriongonadotro-

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Fig. 6b eine Kurve, die die Beziehung zwischen der aus der Fig. 5b gewonnenen Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion und der Konzentration der Standard-Humancho-riongonadotropin-Lösungen wiedergibt ;

Fig. 7 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption bei 950 nm wiedergibt, welch letztere bei der Reaktion eines mit Antihumanchoriongonadotropin sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 |im mit Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentration ermittelt worden ist;

Fig. 8 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Fibri-nogenkonzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption bei 950 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Antifibrinogen sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,312 |i,m mit Standard-Fibrinogenlösungen unterschiedlicher Konzentrationen unterschiedlicher Konzentration ermittelt worden ist;

Fig. 9 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption für polychromatische Strahlung mit Wellenlängen von 800 bis 1100 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Antihumanchoriongonadotropin sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 (im mit den Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist;

Fig. 10 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption für Licht mit einer Wellenlänge der maximalen Emission von 940 nm wiedergibt, die mit Hilfe eines Integrators bei der Umsetzung eines mit Anti-Humanchoriongonadotropin sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 jim mit Standard-Humanchorion-gonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist;

Fig. 11 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 950 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Anti-Humanchoriongonadotropin sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 (im mit Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist;

Fig. 12 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Fibri-nogen-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 900 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Antifibrinogen sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 [im und Standard-Fibrinogenlösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist;

Fig. 13 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 1100 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Antihumanchoriongonadotropin sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 1,09 (im und Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist;

Fig. 14 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Fibri-nogen-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 1650 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Antifibrinogen sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 um und Standard-Fibrinogenlösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist; und

Fig. 15 ein schematisches Diagramm, das den Grundaufbau einer Ausführungsform der erwähnten Vorrichtung wiedergibt, in der

1 für einen Monochromator;

2 für einen halbdurchlässigen Spiegel ;

3 für eine Blende;

4 für einen Kompensationsdetektor;

5 für eine Absorptionszelle;

6 für einen Probendetektor;

7 für einen Verstärker;

8 für eine Aufzeichnungsvorrichtung und

9 für einen Integrator stehen.

Mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann eine extrem geringe Menge eines Antigens und/oder eines Antikörpers, die in der Praxis bislang nur mit Hilfe der Radioimmunoassay-Methode (RIA) bestimmt werden konnte, schneller und sicherer und mit einer Präzision nachgewiesen werden, die gleich oder grösser ist als die Präzision der Radioimmunoassay-Methode (Radioimmuntest).

Mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens ist es weiterhin möglich, nicht nur multivalente Antigene, sondern auch unvollständige Antigene, beispielsweise Haptene, mit hoher Präzision zu bestimmen, wobei die Antigene und/oder die Antikörper nicht nur über ihre Agglutinationsreaktion, sondern auch über ihre Agglutinations-Inhibierung nachgewiesen werden können.

Der oben erwähnte Ausdruck «Reaktionsmischung»

steht, wie aus der obigen Beschreibung hervorgeht, nicht für eine Mischung, indem die Antigen-Antikörper-Reaktion bereits vollständig abgelaufen ist, sondern für eine Mischung, in der die Reaktion abläuft. Somit misst die erfindungsge-mässe Bestimmung die scheinbare oder offenbare Reaktionsgeschwindigkeit einer solchen Mischung, in der eine Antigen-Antikörper-Reaktion abläuft, und zwar über die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung für Licht des oben angesprochenen nahen Infrarotbereiches oder eines Bereiches des sichtbaren Lichtes, der sich an den nahen Infrarotbereich anschliesst.

Wie bereits erwähnt, besitzt das herkömmliche Verfahren, gemäss dem der Grad der Agglutination; die sich bei dem Kontakt eines ein Antigen oder einen Antikörper oder eine Mischung davon enthaltenden Probe mit Latexteilchen, auf denen der entsprechende Antikörper und/oder das entsprechende Antigen vorliegt bzw. fixiert ist (welche Latexteilchen nachstehend auch als «sensibilisierte Teilchen» oder «sensibilisierter Latex» bezeichnet werden) ergibt, über die Geschwindigkeit der Abnahme der Trübung der überstehenden Flüssigkeit des Latex bestimmt wird, verschiedene Nachteile, wie eine geringe Genauigkeit und eine schlechte Reproduzierbarkeit, da die Reaktion in stationärem Zustand unter Verwendung eines extrem stark verdünnten Latex' durchgeführt werden muss. Weiterhin ist es bei diesem vorbekannten Verfahren erforderlich, zunächst jegliche Verunreinigungen, die die Trübung beeinträchtigen könnten, aus der Probe zu entfernen. Im Gegensatz zu dem oben angesprochenen vorbekannten Verfahren ist es erwünscht, die Reaktion eines Antigens oder eines Antikörpers in einer Probe in einem sensibilisierte Altex in einem bewegten Zustand, vorzugsweise unter Rühren, durchzuführen, und die Reaktion bei hohen Konzentrationen zu bewirken.

Wenn ein Antigen oder ein Antikörper, das bzw. der in einer Probe vorliegt, in Gegenwart mindestens eines flüssigen Mediums mit einem unlöslichen Träger, dessen Teilchen einen durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6

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(im aufweisen, der mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen sensibilisiert worden ist (sensibilisierter Träger), umgesetzt wird, verläuft die Agglutination des sensibilisierten Latex' zumindest im Anfangszustand der Antigen-Antikör-per-Reaktion und insbesondere in einem relativ frühen Zeitpunkt dieser Reaktion, in dem Masse, in dem die Reaktion abläuft. Wenn die Reaktionsmischung dann mit Strahlung einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von etwa 0,6 bis 2,4 (im bestrahlt oder belichtet wird, nimmt die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung mit fortschreitender Agglutination zu. Somit kann die Strahlung, mit der die Reaktionsmischung erfindungsgemäss bestrahlt wird, irgendeine Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 |im aufweisen, vorausgesetzt, dass die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung in diesem Wellenlängenbereich während des Fortschreitens der Antigen-Antikörper-Reaktion zunimmt. Mit Hilfe vorausgehender Experimente ist es ohne weiteres möglich, für ein bestimmtes Antigen oder einen bestimmten Antikörper, das bzw. der in einer Probe vorliegt, und für einen bestimmten sensibilisierten Träger ein Licht einer Wellenlänge oder Wellenlängen auszuwählen, die in diesem geeigneten Wellenlängenbereich liegen.

Die erfindungsgemäss angewandte Strahlung kann entweder monochromatische oder polychromatische Strahlung sein, die eine geeignete Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 um aufweist.

Wie es aus den nachstehend angegebenen Beispielen hervorgeht, ist es möglich, ein relativ schmalbandiges polychromatisches Licht mit einer Halbwertsbreite von 35 nm oder 55 nm sowie ein polychromatisches Licht mit einem relativ weiten Wellenlängenbereich anzuwenden, wie das Licht einer Wolframlampe, aus dem Strahlen mit einer Wellenlänge von nicht mehr als etwa 800 nm (0,8 um) ausgeblendet worden sind.

Die verwendete Strahlung kann im wesentlichen aus Strahlen mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 [im bestehen oder auch Strahlen mit Wellenlängen ausserhalb dieses Bereiches umfassen. Im letzteren Fall sollte die Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption nur für Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 (im erfolgen.

Vorzugsweise besitzt das erfindungsgemäss angewandte monochromatische oder polychromatische Licht eine Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,8 bis 1,4 (im.

Wie bereits erwähnt, kann die zum Bestrahlen verwendete Strahlung spektrale Komponenten enthalten, die eine Wellenlänge besitzen, die von den Wellenlängen des oben angegebenen Bereiches verschieden sind, vorausgesetzt, dass es sich bei der Strahlung um polychromatisches Licht handelt. Wie bereits erwähnt, ist es wesentlich, wenn die zur Bestrahlung verwendete Strahlung polychromatische Strahlung umfasst, die Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption lediglich mit jenen Komponenten der polychromatischen Strahlung zu bewirken, deren Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 (im liegen, und die Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption einer Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung in Abhängigkeit von der Zeit anzugeben.

Wenn somit die zur Bestrahlung herangezogene Strahlung im wesentlichen aus diesen polychromatischen Strahlen besteht, kann das Messen der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung ohne jegliche Behandlung durchgeführt werden. Wenn die für die Bestrahlung verwendete Quelle jedoch eine Strahlung emittiert, die spektrale Komponenten enthält, die von den oben erwähnten polychromatischen Strahlung verschieden ist, kann die Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption wie folgt durchgeführt werden :

1. Das von der Lichtquelle emittierte Licht wird zunächst durch ein Filter oder einen Monochromator geführt, wonach lediglich der ausgewählte Bereich des Lichts, das im wesentlichen aus den oben definierten polychromatischen Lichtstrahlen besteht, dazu verwendet wird, die Reaktionsmischung zu bestrahlen und die Extinktion oder die prozentuale Absorption zu messen;

2. das von der Lichtquelle abgegebene Licht wird direkt als bestrahlendes Licht auf die Reaktionsmischung gerichtet, wonach das von der Reaktionsmischung durchgelassene Licht durch ein Filter oder einen Monochromator geführt wird und der ausgewählte Bereich des durchgelassenen Lichtes, der im wesentlichen aus den oben definierten polychromatischen Lichtstrahlen besteht, dazu herangezogen wird, die Extinktion oder die prozentuale Absorption zu messen; oder

3. das von der Lichtquelle emittierte Licht wird direkt für das Bestrahlen der Reaktionsmischung verwendet, worauf ein spezieller Lichtdetektor, der im wesentlichen nur auf die oben erwähnten polychromatischen Lichtstrahlen anspricht, verwendet wird, so dass lediglich der Bereich des durchgelassenen Lichtes, der im wesentlichen aus diesen polychromatischen Lichtstrahlen besteht, zur Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption verwendet wird.

Somit kann das bestrahlende Licht spektrale Komponenten, die von den oben erwähnten polychromatischen Lichtstrahlen verschieden sind, enthalten, oder es ist, mit anderen Worten, möglich, Licht zu verwenden, das spektrale Komponenten enthält, deren Wellenlänge ausserhalb des Bereiches von 0,6 bis 2,4 um liegt. Jedoch tragen diese spektralen Komponenten mit einer Wellenlänge ausserhalb eines Bereiches von 0,6 bis 2,4 (im nicht zu der Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption bei dem erfindungsgemässen Verfahren bei und können sogar in gewissenn Fällen eine nachteilige Wirkung, wie beispielsweise eine chemische Veränderung der Reaktionsmischung, eine Steigerung der Temperatur, unerwartete Lumineszenzphänomene und dergleichen verursachen. Im allgemeinen ist es daher unerwünscht, dass das für die Bestrahlung verwendete Licht eine erhebliche Menge solcher spektralen Komponenten enthält, deren Wellenlänge ausserhalb eines Bereiches von 0,6 bis 2,4 (im liegt, und zwar insbesondere ultraviolettes Licht und sichtbares Licht mit einer Wellenlänge, die kürzer ist als die des blauen Lichtes. Vorzugsweise ist das für die Bestrahlung verwendete Licht im wesentlichen frei von Lichtstrahlen einer Wellenlänge von weniger als 0,6 (im und vorzugsweise von weniger als 0,8 (im. Da andererseits Lichtstrahlen mit einer Wellenlänge von mehr als 2,4 (im eine Temperatursteigerung der Reaktionsmischung verursachen können, ist es erwünscht, dass das für die Bestrahlung verwendete Licht keine signifikante Menge Lichts dieser längeren Wellenlängen enthält und vorzugsweise im wesentlichen frei ist von Komponenten solcher längeren Wellenlängen.

Für die Bestrahlung bei dem erfindungsgemässen Verfahren besonders gut geeignetes Licht besteht somit vorzugsweise überwiegend aus polychromatischen Lichtstrahlen mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 (im und vorzugsweise im Bereich von 0,8 bis 1,4 (im oder es besteht im wesentlichen aus monochromatischen Lichtstrahlen mit einer Wellenlänge in den genannten Bereichen.

Der hierin verwendete Ausdruck «polychromatisches Licht» steht für irgendein zusammengesetztes Licht, das aus einer Vielzahl von im wesentlichen monochromatischen Lichtstrahlen oder einem kontinuierlichen Spektrum oder einer Kombination davon besteht. Vorzugsweise besitzt das polychromatische Licht einen Wellenlängenbereich von 0,6 bis 2,4 [im und vorzugsweise von 0,8 bis 1,4 (im. Die Halbwertsbreite oder der Wellenlängenbereich des polychromatischen Lichtes ist nicht kritisch, wenngleich es im allgemeinen

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bevorzugt ist, dass das polychromatische Licht eine Halbwertsbreite oder einen Wellenlängenbereich von mindestens 0,03 [im und vorzugsweise von mindestens 0,05 [im aufweist.

Zur Bestrahlung kann man irgendeine Lichtquelle verwenden, die das oben beschriebene, für die Bestrahlung geeignete Licht zu emittieren vermag. Beispiele für solche Lichtquellen sind Wolframlampen, Xenonlampen, Halogenlampen, Nernstlampen, Nichromheizdrähte, lichtemittierende Dioden (LED)-und dergleichen. Von diesen Lichtquellen sind die Wolframlampen, die Halogenlampen, die Xenonlampen und die Nernstlampen, die ein kontinuierliches Spektrum innerhalb des sichtbaren und des Infrarotbereiches abgeben, geeignete Lichtquellen, da man aus dem von diesen Lichtquellen emittierten Licht ohne weiteres ein für die Bestrahlung geeignetes Licht mit einem relativ breiten Wellenlängenbereich, der im wesentlichen frei ist von Strahlen mit einer Wellenlänge von weniger als beispielsweise 0,8 um, gewinnen kann, indem man das von diesen Lichtquellen emittierte Licht lediglich durch ein Tiefpassfilter führt. Die lichtemittierenden Dioden, beispielsweise die lichtemittierenden Ga/As-Dioden, besitzen eine maximale Emissionswellenlänge bei etwa 0,95 Um bei einer Halbwertsbreite von etwa 50 nm und stellen daher besonders geeignete Lichtquellen dar, da das emittierte Licht direkt, ohne dass es durch ein Filter oder einen Monochromator geführt werden müsste, als für die Bestrahlung geeignetes polychromatisches Licht eingesetzt werden kann. Wenn es erwünscht ist, unter Verwendung dieser Lichtquellen monochromatisches Licht zu erhalten, kann man das eingestrahlte oder durchgelassene Licht durch ein Filter oder einen Monochromator führen.

Bislang ist die Methode der Spektrumanalyse unter Verwendung von Lichtstrahlen im Infrarotbereich mit einer Wellenlänge von mindestens 2,5 Jim oder Lichtstrahlen im ultravioletten Bereich mit einer Wellenlänge von nicht mehr als 0,4 [im als Methode zur Untersuchung der Molekülstruktur und von Moleküleigenschaften bekannt. Das Licht des nahen Infrarots oder des sich daran anschliessenden sichtbaren Bereiches mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 [im, das erfindungsgemäss angewandt wird und das der Einfachheit halber im folgenden als «Licht des nahen Infrarotbereiches» bezeichnet wird, ist bislang nur begrenzt angewandt worden und hat nur geringes Interesse gefunden.

Es wurde nunmehr gefunden, dass das oben erwähnte Licht des nahen Infrarotbereiches erfindungsgemäss besonders geeignet ist, da es sehr gut durch wässrige Medien, wie Wasser, wässrige Lösungen und dergleichen, die im allgemeinen die Grundmedien von Antigene oder Antikörper enthaltenden Proben darstellen, wie Wasser, Sera, Urin, Salzlösungen, usw. sowie die Grundmedien der oben erwähnten Lati-ces, hindurchdringt, wobei insbesondere das Licht des nahen Infrarotbereiches mit Wellenlängen von 0,8 bis 1,4 [im und von 1,53 bis 1,88 [im von den wässrigen Medien nur in geringem Ausmass absorbiert wird.

Man kann zwar irgendeinen unlöslichen Träger, der Teilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 [im umfasst, verwenden. Die unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von mehr als 1,6 [im sind für die erfindungsgemässe Bestimmung ungünstig, da es schwierig ist, einen solche Teilchen enthaltenden Latex stabil zu halten. Vorzugsweise b.esitzen die unlöslichen Trägerteilchen einen durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 1,0 [im, bevorzugter im Bereich von 0,2 bis 0,8 um und am bevorzugtesten im Bereich von 0,2 bis 0,6 [im.

Also wird ein Antigen oder ein Antikörper, das bzw. der in der Regel in einer Probe vorliegt, in Gegenwart mindestens eines flüssigen Mediums mit unlöslichen Trägerteilchen, die einen durchschnittlichen Durchmesser innerhalb des oben angegebenen Bereiches aufweisen und die mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen sensibilisiert worden sind (sensibilisierter Träger) umgesetzt, wobei die Reaktionsmischung mit dem oben erwähnten Licht mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 [im bestrahlt wird, nachdem die Reaktion gestartet worden ist. In diesen Fällen besteht eine sehr gute Korrelation zwischen der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder prozentualen Absorption der Reaktionsmischung für das oben erwähnte Licht und der scheinbaren Reaktionsgeschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion, insbesondere in einem frühen oder mittleren Stadium der Reaktion, wobei die scheinbare Reaktionsgeschwindigkeit ihrerseits mit der Konzentration des Antigens oder des Antikörpers in der Probe in Beziehung steht. Auf der Grundlage dieser Prinzipien ist es daher möglich, die Konzentration des Antigens oder des Antikörpers in der Probe zu bestimmen.

Der hierin verwendete Ausdruck «prozentuale Absorption» kann durch die folgende Gleichung 1

S = IoT~ 1 x 100 (%) (1)

lo wiedergegeben werden, in der S für die prozentuale Absorption, Io für die Intensität des durchgelassenen Lichtes, wenn die Zelle das gleiche System wie die zu messende Reaktionsmischung, mit dem Unterschied, dass das System frei ist von dem Antigen und/oder dem Antikörper, enthält, und I für die Intensität des durchgelassenen Lichtes, wenn die Zelle die Reaktionsmischung enthält, stehen.

Wie aus der obigen Definition ersichtlich ist, kann die prozentuale Absorption auch anders herum als der Prozentsatz des durch die Reaktionsmischung nicht hindurchgegangenen Lichtes oder den Prozentsatz des absorbierten Lichtes bezeichnet werden.

Die oben definierte prozentuale Absorption steht in Korrelation zu dem Extinktionswert A, den man beispielsweise mit Hilfe eines Spektrophotometers, wie er für die Infrarot-spektrometrie verwendet wird, bestimmen kann, so dass man diese prozentuale Absorption der Einfachheit halber auch über die Extinktion ausdrücken kann. In der Infrarotspektro-metrie ist die Extinktion A durch die folgende Gleichung 2 definiert:

A = log y (2)

worin Io und I die für die Gleichung 1 angegebenen Bedeutungen besitzen.

Somit ist es möglich, Antigene und Antikörper zu bestimmen, indem man entweder die durch die Gleichung 1 definierte prozentuale Absorption oder die durch die Gleichung 2 definierte Extinktion heranzieht, wobei unabhängig von dem angewandten Parameter die erhaltenen Daten innerhalb eines vernünftigen, verlässlichen Bereiches übereinstimmen, vorausgesetzt, dass die Messungen sorgfältig durchgeführt werden.

Es wird ein Antigen oder ein Antikörper oder eine Mischung davon mit dem oben erwähnten sensibilisierten Träger in einem flüssigen Medium unter vorbestimmten, im wesentlichen festen bzw. festgelegten Bedingungen umgesetzt und es wird die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung pro Zeiteinheit zu einem im wesentlichen festgelegten Zeitpunkt nach Beginn der Reaktion ermittelt, wodurch das Antigen oder der Antikörper quantitativ bestimmt werden kann. Nachdem die Umsetzung der Reaktionsteilnehmer, das heisst des sensibilisierten Latex' und des Antigens, des Antikörpers

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oder einer Mischung davon (oder eines Reaktionsprodukts davon) in Gang gebracht worden ist, erfolgen die Messungen zur Bestimmung der oben angesprochenen Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit, vorzugsweise zu dem frühest möglichen Zeitpunkt, zu dem die Antigen-Antikörper-Reaktion in der Reaktionsmischung einen stationären, d.h. gleichmässigen oder stetigen, Zustand erreicht hat. In dieser Weise können bei der Messung genauere und reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden.

Zu diesem Zweck wird der sensibilisierte Latex mit der das Antigen oder den Antikörper enthaltenden Testflüssigkeit in Kontakt gebracht und vorzugsweise unter Rühren damit vermischt, worauf die Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung nicht augenblicklich, jedoch baldmöglichst, beispielsweise 2 bis 3 Sekunden und vorzugsweise etwa 5 Sekunden nach Vermischen der Reaktionsteilnehmer erfolgen sollte.

Nachdem die Reaktion des sensibilisierten Latex' mit dem in der Testflüssigkeit enthaltenen Antigen oder Antikörper in Gang gebracht worden ist, erreicht die in der Reaktionsmischung ablaufende Antigen-Antikörper-Reaktion bald einen stationären Zustand oder den Zustand eines dynamischen Gleichgewichts. In diesem Zustand, insbesondere in einem frühen Stadium, wenn die Reaktion einen stationären Zustand erreicht hat, nimmt die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung praktisch gleichmässig oder stetig zu. Daher ist es bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens von Vorteil, zuvor mit Hilfe eines vorausgehenden Experiments einen Zustand oder einen Zeitraum in dem Reaktionsablauf auszuwählen, in dem eine stetige Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption einer bestimmten Reaktionsmischung erfolgt, und anschliessend innerhalb des ausgewählten Stadiums das Antigen oder den Antikörper in einer Testflüssigkeit zu bestimmen, die das Antigen, den Antikörper oder eine Mischung davon in unbekannter Konzentration enthält.

Es versteht sich, dass bei der Durchführung der Messung die Reaktion des sensibilisierten Latex' mit der Testflüssigkeit mit Vorteil unter vorbestimmten, im wesentlichen festgelegten Bedingungen durchgeführt wird.

Es ist von Vorteil, den sensibilisierten Träger mit einem Antigen oder einem Antikörper in einer Testflüssigkeit unter im wesentlichen festgelegten Bedingungen umzusetzen und dann die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung in einem solchen Stadium zu bestimmen, in dem die Extinktion oder die prozentuale Absorption erstmals nach Beginn der Reaktion eine annähernd stetige Zunahme zeigt, wodurch es möglich wird, die quantitative Bestimmung der Antigene und Antikörper mit höherer Präzision in kürzerer Zeit zu bewirken.

Es ist weiterhin von Vorteil, den sensibilisierten Latex unter im wesentlichen festgelegten Bedingungen mit einem Antigen oder einem Antikörper in einer Testflüssigkeit umzusetzen, dann die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung an zwei oder mehreren Zeitpunkten zu messen und zu speichern und ausgehend von den gespeicherten Werten der Extinktion oder der prozentualen Absorption die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit zu ermitteln bzw. zu errechnen.

Die Bestimmung von Antigenen und Antikörpern kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: Zunächst wird ein unlöslicher, fester Träger (Latex) mit Teilchen eines bestimmten durchschnittlichen Durchmessers mit einem bestimmten Antikörper oder Antigen, der bzw. das dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper entspricht, sensibilisiert. Andererseits wird unter Verwendung des gleichen Antigens oder Antikörpers (oder einer Mischung davon) das, der bzw. die in der tatsächlich zu bestimmenden Probenlösung enthalten ist, eine Reihe von Standardprobenlösungen hergestellt, die das Antigen oder den Antikörper in unterschiedlichen bekannten Konzentrationen in einem flüssigen Medium enthalten, das genau dem der tatsächlichen Probenlösung entspricht oder mit diesem annähernd identisch ist.

Anschliessend werden der sensibilisierte Latex und eine der in dieser Weise gebildeten Standardprobenlösungen vermischt, worauf die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung während der ablaufenden Anti-gen-Antikörper-Reaktion gemessen wird, nachdem das Fortschreiten dieser Reaktion einen stationären Zustand erreicht hat.

Beispielsweise sind in Fig. 3 (Beispiel 1) und Fig. 5a und 5b (Beispiel 2) der Zeichnungen die Veränderungen (die Zunahme) der Extinktion oder der prozentualen Absorption einiger Reaktionsmischungen gegen die Zeit aufgetragen, wobei die Zeit (in Minuten) auf der Abszisse und die Extinktion (im Fall der Fig. 3 und 5b) oder die prozentuale Absorption (im Fall der Fig. 5a) auf der Ordinate aufgetragen sind. Von diesen Kurven zeigen die in der Fig. 3 dargestellten Kurven A, B, C und D die tatsächlichen Aufzeichnungen des für die Bestimmung der Extinktion verwendeten Spektrophoto-meters, die die Änderung (die Zunahme) der Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit erkennen lassen.

Aus diesen Kurven A, B, C und D ist ersichtlich, dass wenn man einen sensibilisierten Träger und eine Standardprobenlösung umsetzt, relativ kurz nach Beginn der Reaktion ein stationärer Zustand im Ablauf der Antigen-Antikörper-Reaktion erreicht wird und dass insbesondere der Anfangsbereich dieses Zustandes eine annähernd stetige Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung erkennen lässt.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird im Fall jeder Standardprobenlösung die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung pro Zeiteinheit mit Vorteil in einem derart frühen Stadium oder Zeitraum bestimmt, in dem die Extinktion oder die prozentuale Absorption annähernd stetig mit der Zeit zunimmt.

Die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption kann beispielsweise für die in der Fig. 3 dargestellten Kurven A, B, C und D ermittelt werden, indem man die Geschwindigkeit der Zunahme der Fläche zwischen der Kurve und der Grundlinie (Abszisse) während einer festgelegten Zeitdauer (beispielsweise einer Minute) in einem relativ linearen Abschnitt der Kurve ermittelt. Alternativ kann man eine gerade Linie durch die Kurven in dem relativ linearen Abschnitt ziehen, wie es in der Fig. 3 mit A', B', C' oder D' angegeben ist, und für jede gerade Linie A', B', C' und D' den Tangens des Neigungswinkels 0 bestimmten.

Anschliessend wird beispielsweise die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit, die man mit jeder Probenlösung ermittelt hat (in logarithmischem Massstab) auf der Ordinate gegen beispielsweise die Konzentration des Antigens oder des Antikörpers in der Standardprobenlösung (in logarithmischem Massstab) auf der Abszisse aufgetragen. In dieser Weise erhält man eine Kurve (das heisst eine Eichkurve), wie sie beispielsweise in den Fig. 4, 6a oder 6b angegeben ist. Wie aus diesen Kurven zu ersehen ist, weisen die Eichkurven darauf hin, dass eine lineare Beziehung zwischen der Konzentration des Antigens oder des Antikörpes in der Standardprobenlösung und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung pro Zeiteinheit besteht.

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Somit ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren die quantitative Bestimmung von Antigenen und Antikörpern in Proben oder Testflüssigkeiten bzw. Testfluiden, indem man zunächst in der oben beschriebenen Weise eine Eichkurve für das zu bestimmende besondere Antigen oder den zu bestimmenden besonderen Antikörper ermittelt, die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit in der oben beschriebenen Weise unter Verwendung einer Probe oder eine Testflüssigkeit, die das Antigen oder den Antikörper in unbekannter Konzentration enthält, bestimmt und die in dieser Weise erhaltenen Werte mit der Eichkurve vergleicht.

In dieser Weise ist es möglich, die Konzentration des Antigens oder des Antikörpers in einer Testflüssigkeit mit extrem hoher Präzision in kurzer Zeit zu messen, wie es auch durch die folgenden Beispiele belegt wird.

Bei dem Verfahren der oben angesprochenen veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 24015/1978 wird die Reaktionsmischung mit Licht bestrahlt, dessen Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 (im liegt und dessen Wellenlänge um einen Faktor von mindestens 1,5 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der unlöslichen Trägerteilchen. Nach der Lehre der vorliegenden Erfindung kann jedoch, wie es aus den obigen Ausführungen hervorgeht,

Licht einer beliebigen Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 Lim verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Wellenlänge des Lichtes derart ausgewählt ist, dass beim Bestrahlen der Reaktionsmischung mit dem Licht sich eine Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption feststellen lässt. Demzufolge ist das verwendete Licht nicht länger auf Licht mit einer Wellenlänge beschränkt, das einen Faktor von mindestens 1,5 grösser ist als der durchschnittliche Durchmesser der unlöslichen Trägerteilchen. In der Tat kann das erfindungsgemässe Verfahren, wie aus den Beispielen 9 und 8 hervorgeht, mit Licht einer Wellenlänge durchgeführt werden, die etwa gleich ist dem durchschnittlichen Durchmesser der Trägerteilchen (Latexteilchen) oder mit Licht mit einer Wellenlänge, die um einen Faktor um etwa 1,1 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen.

Jedoch ist es von Vorteil, Licht zu verwenden, dessen Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 (im liegen und um einen Faktor von mindestens 1,1, vorzugsweise von mindestens 1,5 länger sind als der durchschnittliche Durchmesser der unlöslichen Trägerteilchen, da durch die Anwendung von Licht solcher Wellenlängen die genaue Bestimmung der Antigene und Antikörper leichter erreicht werden kann.

Beispielsweise ist in der Fig. 1 durch Auftragen der Wellenlänge des Lichtes auf der Abszisse und der prozentualen Transmission des Lichtes auf der Ordinate das prozentuale Transmissionsspektrum einer Wasserschicht mit einer Dicke von 1 mm in einem Wellenlängenbereich von 0,6 bis 2,4 (im dargestellt. Aus der Fig. 1 ist zu ersehen, dass das Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 1,4 (im praktisch ohne merkliche Absorption durch Wasser, das das für Latices und Proben weitgehendst verwendete Grundmedium darstellt, hindurchdringt und dass Licht mit einer Wellenlänge von 1,53 bis 1,88 [im ebenfalls im wesentlichen durch Wasser hindurchdringt, so dass man Licht mit einer Wellenlänge in diesem Bereich bei dem erfindungsgemässen Verfahren anwenden kann. Es ist weiterhin aus der Fig. 1 ersichtlich, dass Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 2,1 bis 2,35 (im für Wasser eine Transmission im Bereich von 20% zeigt, so dass man Licht einer solchen Wellenlänge auch in Kombination mit einem hochempfindlichen Photometer anwenden kann, wenngleich dies nicht bevorzugt ist.

Die Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen der Extinktion eines Polystyrollatex' (mit einem Feststoffgehalt von 1 Gew.-%), die auf der Ordinate aufgetragen ist, und der Wellenlänge des Lichtes, die in um auf der Abszisse aufgetragen ist, wenn man die Bestimmung in einer Absorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm durchführt. Die in der Fig. 2 dargestellte Kurve A gibt die Änderung der Extinktion eines Polystyrollatex' wieder, dessen durchschnittlicher Teilchendurchmesser 0,481 (im beträgt, während die Kurve B die Extinktion eines Polystyrollatex' zeigt, dessen durchschnittlicher Teilchendurchmesser 0,804 lim beträgt. Zur Bestimmung der Extinktion wurde der Latex aus Gründen der Vereinfachung der Messung verdünnt, wonach die Extinktion des Latex' durch Multiplizieren des tatsächlich gemessenen Wertes der Extinktion mit dem Verdünnungsfaktor errechnet wurde.

Aus der Fig. 2 ist zu ersehen, dass die Extinktion des Latex' bei einer Wellenlänge von weniger als 0,6 (im derart gross ist, dass es schwierig ist, die Änderung der Lichttransmission einer Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung unter Verwendung von Licht einer solchen Wellenlänge zu messen. Wenn man jedoch Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 0,8 (im und insbesondere von mindestens 1 um anwendet, so ist die Extinktion des Latex' als solchem relativ gering, so dass Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 0,8 (im und vorzugsweise mindestens 1 um für die oben erwähnte Messung der Lichttransmission geeignet ist.

Vergleicht man die in der Fig. 2 dargestellte Kurve A mit der dort gezeigten Kurve B, so ist festzustellen, dass die Extinktion des Latex' mit zunehmendem durchschnittlichem Durchmesser der Polystyrollatexteilchen zunimmt. Daraus ist ersichtlich, dass Latexteilchen mit einem extrem grossen durchschnittlichen Durchmesser erfindungsgemäss nicht geeignet sind. Es hat sich ferner gezeigt, dass die erfindungsgemäss geeigneten unlöslichen Trägerteilchen einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von nicht mehr als 1,6 (im besitzen müssen und dass Latexteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,1 bis 1 [im und insbesondere von 0,2 bis 0,8 (im bevorzugt sind.

Somit kann man die Menge oder die Konzentration eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer Probe bestimmen, indem man den entsprechenden Antikörper und/oder das entsprechende Antigen auf unlöslichen Trägerteilchen (oder einem Latex) mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser innerhalb des oben angegebenen Bereiches unter Bildung eines sensibilisierten Latex' abscheidet oder fixiert, den Latex mit dem in der Probe vorhandenen Antigen und/oder Antikörper umsetzt und die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung mit Licht mit Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 (im und vorzugsweise im Bereich von 0,8 bis 1,4 (im bestimmt.

Die geeigneten unlöslichen Trägerteilchen schliessen Mikroteilchen organischer Polymerer, die im wesentlichen in dem für die erfindungsgemässe Messung verwendeten flüssigen Medium unlöslich sind und einen durchschnittlichen Durchmesser innerhalb des oben angegebenen Bereiches aufweisen, ein, beispielsweise Latices von organischen Polymeren, wie Polystyrol und Styrol-Butadien-Copolymere, die man durch Emulsionspolymerisation erhält; dispergierte Kokkenbakterien, wie Staphylokokken und Streptokokken, Bacillus prodigiosus, Rickettsia, Zellmembranfragmente usw., sowie Mikroteilchen von anorganischen Oxiden, wie Siliciumdi-oxid, Siliciumdioxid-Aluminiumoxid und Aluminiumoxid und feinpulverisierte Mineralien, Metalle und dergleichen.

Es wird ein Antikörper oder ein Antigen, das mit dem in der Probe zu bestimmenden Antigen und/oder Antikörper reagiert, an den oben erwähnten unlöslichen Trägerteilchen, beispielsweise Latexteilchen, fixiert (um das Trägermaterial zu sensibilisieren). Zu diesem Zweck kann der Antikörper oder das Antigen physikalisch und/oder chemisch an dem Träger adsorbiert werden.

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Bei den Antikörpern handelt es sich vorzugsweise um Proteine, während die Antigene aus einem Vertreter einer Gruppe von verschiedenartigen Substanzen bestehen, die beispielsweise Proteine, Polypeptide, Steroide, Polysaccharide, Lipide, Pollen, Staub und dergleichen einschliesst. Es wurde bereits eine Reihe von Verfahren beschrieben, um diese Antikörper oder Antigene und insbesondere Antikörper auf unlöslichen Trägerteilchen abzuscheiden oder zu fixieren.

Um ein unvollständiges Antigen, insbesondere ein Hapten, an unlöslichen Trägermaterialien zu fixieren, ist es von Vorteil, die Trägermaterialien chemisch zu modifizieren, beispielsweise mit Hilfe eines Kupplungsmittels, und anschliessend das Antigen chemisch an das modifizierte Trägermaterial zu binden. Wenn der verwendete unlösliche Träger ein Latex einer hochmolekularen Substanz ist, die funktionelle Gruppen, wie Sulfogruppen, Aminogruppen oder Carboxyl-gruppen oder davon abgeleitete reaktive Gruppen aufweist, ist es auch möglich, den Antikörper und/oder das Antigen an einem solchen Latex chemisch zu adsorbieren.

Von den erfindungsgemäss geeigneten flüssigen Medien ist Wasser am bevorzugtesten, wenngleich man auch eine Mischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel verwenden kann. Beispiele für geeignete mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel sind Alkohole, wie Methanol, Äthanol usw., Ketone, wie Aceton, und dergleichen.

Im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren, bei denen die Trübung bestimmt oder die mittlere Diffusionskonstante mit Hilfe eines Laserstrahles gemessen wird, ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren Bedingungen, bei denen die mit einem Antikörper oder einem Antigen sensibilisierten unlöslichen Trägerteilchen in möglichst aktiver Weise mit dem entsprechenden Antigen und/oder Antikörper reagieren können.

Zu diesem Zweck kann man erfindungsgemäss die unlöslichen Trägerteilchen, beispielsweise die Latexteilchen, die mit einem Antikörper oder einem Antigen sensibilisiert worden sind (und die hierin auch als «sensibilisierte Trägerteilchen» bezeichnet werden) in Form einer Suspension verwenden, die eine Konzentration von nicht weniger als 0,05 Gew.-% und vorzugsweise eine Konzentration im Bereich von 0,1 bis 1 Gew.-% und noch bevorzugter im Bereich von 0,2 bis 0,6 Gew.-% aufweist.

Wenn die Konzentration der sensibilisierten Trägerteilchen zu hoch ist, wird die Durchlässigkeit der Suspension derart vermindert, dass die Messung der Extinktion erschwert wird. Innerhalb des Konzentrationsbereiches, in dem die Messung der Extinktion möglich ist, sind jedoch höhere Konzentrationen der sensibilisierten Trägerteilchen in der Suspension bevorzugt, da es hierdurch möglich wird, die Empfindlichkeit der quantitativen Bestimmung der Antigene und Antikörper zu steigern.

Im Gegensatz zu den herkömmlichen Methoden werden die sensibilisierten Trägerteilchen und die das Antigen und/ oder den Antikörper enthaltende Probe nicht unter Stehenlassen umgesetzt. Zu diesem Zweck kann man die Reaktion mit Vorteil unter Bewegung der Reaktionsmischung durchführen. Da die Reaktion im allgemeinen in einer dünnen oder schmalen Zelle durchgeführt wird, erreicht man das Bewegen der Reaktionsmischung bequemerweise zum Beispiel dadurch, dass man einen Stab vertikal oder transversal durch die Zelle bewegt. Natürlich kann man die sensibilisierten Trägerteilchen und die Probe ausserhalb der Zelle unter vorbestimmten Bedingungen während einer gewissen Zeitdauer umsetzen und anschliessend die Reaktionsmischung zur Bestimmung der Extinktion oder der prozentualen Absorption in die Zelle einbringen. Um die Reaktionsbedingungen jedoch reproduzierbar zu machen, insbesondere im Hinblick auf die Reaktionszeit, kann man die sensibilisierten Trägerteilchen und die Probe unter vorbestimmter Bewegung direkt in einer Zelle, die in ein Spektrophotometer eingebracht ist, umsetzen, wodurch eine genauere Bestimmung der Extinktion oder der prozuentualen Absorption möglich wird.

Somit ermöglicht die Erfindung nicht nur die Bestimmung der Konzentration eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer Probe, was bislang visuell in halbquantitativer Weise möglich war, sondern gestattet auch die Bestimmung eines Antigens und/oder eines Antikörpers in Spurenmengen, wie es bislang nur jnit Hilfe des Radioimmuntests (Radioim-munoassay, RIA) möglich war, und dies mit einer Präzision, die vergleichbar ist mit der bei dem Radioimmunoassay erreichten.

Wie bereits erwähnt, zeichnet sich die vorliegende Erfindung dadurch aus, dass die sensibilisierten Trägerteilchen mit einer möglichst hohen Konzentration mit einer Probe in Kontakt gebracht und mit ihr umgesetzt werden.

Zur erfindundungsgemässen Bestimmung der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung ist eine Zelle mit einer Dicke von beispielsweise 0,5 bis 10 mm und vorzugsweise von 1 bis 5 mm geeignet.

Wenn das erfindungsgemässe Verfahren zu einer empfindlichen Bestimmung von Spurenmengen eines Antigens oder eines Antikörpers, die bislang nach der Radioimmuno-assay-Methode bestimmt wurden, angewandt werden soll, ist es besonders vorteilhaft:

a) Ein Antigen oder einen Antikörper mit einer möglichst hohen Gleichgewichtskonzentration zu verwenden,

b) Latexteilchen, die insbesondere einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,2 bis 0,8 (im aufweisen, zu verwenden, deren Teilchengrössenverteilung möglichst eng ist, und c) die Extinktion oder die prozentuale Absorption von Licht mit einer Wellenlänge von 0,8 bis 1,4 (im zu bestimmen.

Die Erfindung wurde oben bezüglich der Bestimmung eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer Probe beschrieben, die darauf beruht, dass man das in der Probe enthaltene Antigen und/oder den in der Probe enthaltenen Antikörper mit sensibilisierten Trägerteilchen agglutiniert (das heisst ein LA-System anwendet). Das erfindungsgemässe Verfahren ist auch bei einer Probe anwendbar, bei der die inhibierende Wirkung gegen die oben erwähnte Agglutination das Prinzip der Messung ist (das heisst, dass man ein LI-System anwendet).

Unvollständige Antigene, beispielsweise Haptene, kann man dadurch bestimmen, dass man das erfindungsgemässe Verfahren auf das Ll-System anwendet. In diesem Fall kann man beispielsweise ein Antigen auf den unlöslichen Trägerteilchen, wie sie erfindungsgemäss angewandt werden, fixieren, die in dieser Weise sensibilisierten Trägerteilchen nach einer kompetitiven Reaktion mit einer gegebenen Menge eines Antikörpers, der mit einem Antigen einer vorbestimmten Konzentration (beispielsweise einer Standardantigenlösung) umgesetzt worden ist, reagieren lassen, und dann die Extinktion oder die prozentuale Absorption der gebildeten Reaktionsmischung pro Zeiteinheit bestimmen. Diese Massnahmen werden bei unterschiedlichen Konzentrationen der Standard-Antigenlösung wiederholt, um eine Eichkurve zu ermitteln. Anschliessend setzt man eine unbekannte Probe mit dem gleichen Antikörper einer bestimmten Konzentration um, wonach man die erhaltene Reaktionsmischung mit dem sensibilisierten Trägermaterial zur Reaktion bringt. Diese Reaktionen sollten unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen durchgeführt werden, wie sie für die Ermittlung der Eichkurve angewandt wurden. Dann bestimmt man die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit der endgültigen Reaktionsmischung mit den sensibilisierten Trägerteilchen und ver5

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gleicht sie mit der Eichkurve, um in dieser Weise die Menge (Konzentration) des Antigens in der unbekannten Probe zu ermitteln.

Nach der Verfahrensweise der oben erwähnten LI-Methode kann man auch einen Antikörper in einer unbekannten Probe bestimmen, indem man einen bestimmten Antikörper auf den unlöslichen Trägerteilchen fixiert. Weiterhin ist es gewünschtenfalls möglich, gleichzeitig ein Antigen und einen Antikörper unterschiedlicher Art auf den unlöslichen Trägerteilchen zu fixieren und dann ein Antigen und einen Antikörper in einer unbekannten Probe zu bestimmen.

Somit gelingt erfindungsgemäss die quantitative Bestimmung einer grossen Vielzahl von Antigenen und/oder Antikörpern, beispielsweise

1. die Blutuntersuchung von Patienten oder Blutspendern, was für Notmassnahmen unerlässlich ist; beispielsweise kann man die Blutgruppensubstanzen, das Au- oder das HB-Antigen oder andere Verunreinigungen im Blut oder Fibrin-Fibrinogen-Abbauprodukte (FDP) bestimmen, was sich in jüngster Zeit als nützlich erwiesen hat bei der Überwachung der Genesung von Patienten, denen eine Niere transplantiert worden ist oder die an Nierenversagen leiden;

2. die Bestimmung von Humanchoriongonadotropin (hCG), das eine wichtige Rolle spielt bei der Schwangerschaftsdiagnose oder bei der Überwachung der Genesung von Chorionepitheliomen ;

3. die Bestimmung von Humanchoriongonadotropin oder von Östrolglucuronid, das ein Stoffwechselprodukt des Folli-kelhormons darstellt, im Urin, welche Bestimmung für die Überwachung der Schwangerschaft von Bedeutung ist;

4. die Bestimmung von Oxytocin im Blut, von welcher Substanz man annimmt, dass sie Uteruskontraktionen verursacht;

5. die Bestimmung bestimmter Nebennierenrindenhor-mone, wie Corticoiden und Aldosteron oder von adrenocorti-cotropen Hormonen (ACTH):

6. die Bestimmung des Insulins bei Diabetikern oder die Bestimmung des Follikel-anregenden Hormons, des luteinisierenden Hormons, von Östrogenen, des Gelbkörperhormons (corpus luteum hormone) usw. ;

7. die Bestimmung von Gastrin oder Sekretin, bei dem es sich um ein Magen-Darm-Hormon handelt; und

8. der Nachweis und die Bestimmung von Antikörpern in Körperflüssigkeiten von Patienten, die an Allergien, Syphilis, hämolytischer Streptokokzidiose, Röteln, Autoimmunkrankheiten, wie Kallagenose, und anderen Infektionskrankheiten und dergleichen leiden.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann natürlich auch zur qualitativen oder halbquantitativen Bestimmung dieser Antigene und/oder Antikörper angewandt werden.

In der Fig. 15 ist der Grundaufbau einer Vorrichtung dargestellt. Wie aus dieser Fig. 15 zu ersehen ist, umfasst die Vorrichtung einen Monochromator 1 aus einer Lichtquelle und einem Filter oder einem Prisma, einen halbdurchlässigen Spiegel 2 zum Abteilen des Vergleichslichtstrahls, der durch eine Blende 3 einem Kompensationsdetektor 4 zugeführt wird, in dem der Vergleichslichtstrahl in ein elektrisches Signal umgewandelt wird, und dazu dient, die Änderung der Intensität des Lichtes der Lichtquelle festzustellen. Andererseits wird die die Antigen-Antikörper-Reaktipnsmischung enthaltende Zelle 5 mit dem durch den halbdurchlässigen Spiegel 2 hindurchtretenden Licht belichtet, und es wird die Intensität des durch die Probe geführten Lichtes mit dem Probendetektor 6 gemessen und in ein elektrisches Signal umgewandelt. Das durch den Probendetektor 6 gebildete elektrische Signal wird mit dem des Kompensationsdetektors 4 kombiniert und dann einem Verstärker 7 zugeführt. Die Gesamtänderung der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung, die bezüglich der Änderung der prozentualen Absorption als Folge einer Schwankung der Lichtintensität der Lichtquelle kompensiert worden ist, wird mit Hilfe der Aufzeichnungseinrichtung 8 aufgezeichnet. Alternativ kann man die Gesamtänderung der prozentualen Absorption elektrisch in die Extinktion umwandeln und mit Hilfe der Aufzeichnungseinrichtung 8 aufzeichnen.

Andererseits kann man gewünschtenfalls auch das von dem Verstärker 7 abgegebene elektrische Signal mit einem Integrator 9 während einer gegebenen Zeitdauer integrieren und dann das Integral mit der Aufzeichnungseinrichtung 8 aufzeichnen.

Über die mit der Aufzeichnungseinrichtung aufgezeichnete Änderung der Extinktion oder der prozentualen Absorption mit der Zeit ist es möglich, die Geschwindigkeit der Änderung (der Zunahme) der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit zu ermitteln, wodurch es möglich wird, das Antigen oder den Antikörper zu bestimmen.

Wie bereits erwähnt, ist die Absorptionszelle 5 vorzugsweise mit einer Rühreinrichtung versehen.

Als Lichtquelle für den Monochromator 1 kann man eine übliche Wolframlampe verwenden. Das von dieser Lichtquelle emittierte Licht wird durch ein Filter oder Prisma gefiltert. Beispielsweise kann man ein Interferenzfilter, das eine Wellenlänge von 1200 ± 50 nm ergibt, als Filter, oder man kann Prismen aus Glas oder Quarz verwenden.

Wie bereits erwähnt, kann man auch eine lichtemittierende Diode, wie beispielsweise eine lichtemittierende Gal-liumarsenid-Diode mit einer Halbwertsbreite von 0,05 [im und einer Spitzenemissionswellenlänge von 0,94 um oder dergleichen als Lichtquelle verwenden.

Die Absorptionszelle 5 kann aus transparentem Glas oder synthetischem Harz (beispielsweise einem Acrylharz) bestehen und einen schachtelartigen Aufbau mit rechteckigem Querschnitt besitzen. Die Dicke der Zelle kann im Bereich von 0,5 bis 10 mm und vorzugsweise im Bereich von 1 bis 5 mm liegen. Mit Vorteil besitzen die lichtdurchlässigen Fenster der Zelle für Licht mit Wellenlängen von 0,6 bis 2,4 Jim eine Transmission von mindestens 30% und vorzugsweise von mehr als 80%. Als Detektoren 4 und 6 kann man mit Vorteil Bleisulfid-Photoleiterelemente oder Silicium-Photodioden verwenden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

1. Herstellung eines mit Antifibrinogen-Antikörpern sensibilisierten Latexreagens' (Antifibrinogen-Latexreagens, Anti-Fg-Latexreagens, Antifibrinogen-sensibilisiertes Latexreagens)

Zu 10 ml einer Lösung von Anti-humanfibrinogen (Fg)-Antikörpern (mit einer Konzentration von 2 mg/ml) in einem Glycinpuffer gibt man 1 ml eines Polystyrollatex' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,091 (im (der einen Feststoffgehalt von 10 Gew.-% aufweist und von der Firma Dow Chemical Company erhältlich ist) und 0,5 ml eines weiteren Polystyrollatex' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 um (dito), rührt die Mischung während 30 Minuten bei Raumtemperatur, erwärmt auf 40 °C und rührt während weiterer 30 Minuten bei dieser Temperatur und zentrifugiert dann unter Kühlen auf 2 bis 4°C während 50 Minuten (bei 12000 min-1). Den Niederschlag trennt man durch Dekantieren ab und suspendiert die erhaltenen Latexteilchen, die mit dem Antifibrinogen-Antikörper sensibilisiert sind, in einer Rinderserumalbuminlösung (mit einer Konzentration von 0,2 Gew.-%) unter Bildung eines Antifibri-nogen-sensibilisierten Latexreagens', das die sensibilisierten Latexteilchen in einer Konzentration von 1 Gew.-% enthält.

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2. Aufnahme einer Eichkurve

Man beschickt ein kleines Reagensglas mit 0,1 ml des in der Stufe 1 erhaltenen Antifibrinogen-Latexreagens', gibt 0,1 ml einer Glycinpufferlösung (mit einem pH-Wert von 9,6) und anschliessend 0,2 ml einer Standard-Fibrinogen-Lösung 5 mit einer in der nachstehenden Tabelle I angegebenen Konzentration, in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,2 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, zu und mischt durch Schütteln während 5 Sekunden bei Raumtemperatur gut durch. Anschliessend wird die Mischung sofort in eine 10 Acrylharzzelle mit einer Dicke von 2 mm überführt, die mit einem L-förmigen Rührstab, der auf und ab bewegt werden kann, ausgerüstet ist, und ermittelt die Extinktion der Reaktionsmischung in Abhängigkeit von der Zeit, währenddem man die Reaktionsmischung mit 160 Hüben pro Minute rührt. 15 Man bestimmt die Extinktion mit Hilfe eines Spektrophoto-meters (Hitachi 340) bei einer Wellenlänge von 950 nm, wobei man das Photometer auf «Extinktion» einstellt. Das Licht der für die Messung herangezogenen Wellenlänge besitzt eine Schlitzbreite oder Halbwertsbreite von etwa 3 nm. 20

Die in dieser Weise von dem Spektrophotometer aufgezeichnete Kurve der Änderung der Extinktion mit der Zeit ist in der Fig. 3 dargestellt, in der die Kurven A, B, C und D Fibrinogen-Konzentrationen von 0,0156,0,0313,0,0625 bzw. 0,125 |ig/ml entsprechen. Auf diesen Kurven wurde dann 25 eine gerade Linie längs des geraden Abschnitts einer jeden Kurve in einem möglichst frühen Stadium nach Beginn der Aufzeichnung gezogen, und es wurde die Neigung der geraden Linie berechnet. Die in dieser Weise erhaltenen Werte sind in der nachstehenden Tabelle I in der mit «Geschwindig- 30 keit» bezeichneten Spalte angegeben, in der die Geschwindigkeit der Änderung der Extinktion als «Extinktion/min» angegeben ist. Die in dieser Weise erhaltenen Geraden sind in der Fig. 3 als die Geraden A', B', C' und D' dargestellt. Die Korrelation zwischen der Antigenkonzentration und der in dieser 35 Weise erhaltenen Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion als Folge der Agglutination des Latex' erfolgt graphisch, wodurch man die in der Fig. 4 dargestellte Eichkurve erhält.

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Tabelle I

Konzentration der Geschwindigkeit der Zunahme der

Standard-Fibrinogen-Lösung Extinktion bei 950 nm (jig/ml) (Extinktion/min)

0,0156

0,0008

0,0313

0,00264

0,0625

0,00480

0,125

0,0103

0,250

0,0256

0,500

0,0566

1,00

0,152

2,00

0,300

4,00

0,514

3. Bestimmung von Fibrinogen in unbekannten Proben

Man entnimmt einem Patienten eine Probe Blut oder Urin und trennt im Fall der Blutprobe Serum in üblicher Weise ab. Dann vermischt man einen aliquoten Anteil von 0,2 ml der unverdünnten oder verdünnten Probe (unter Anwendung des in der nachstehenden Tabelle II angegebenen Verdünnungsfaktors) mit 0,1 ml des gemäss Abschnitt 1 bereiteten Antifibrinogen-Latexreagens und 0,1 ml einer Glycinpufferlösung (pH 9,6) ind er Weise, wie es in Abschnitt 2 angegeben ist, worauf man die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion in gleicher Weise, wie in Abschnitt 2 beschrieben, ermittelt. Dann liest man auf der gemäss Abschnitt 2 erstellten Eichkurve die Fibrinogen-Konzentration, die dem in dieser Weise ermittelten Wert der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion entspricht, ab. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengestellt

Zu Vergleichszwecken sind in der Tabelle II auch die Werte aufgeführt, die man mit Hilfe des üblichen Radioimmuntests (RIA-Methode) (S.M. Ratky et al., Brit. J. Haema-tol. 30 (1975) 145 bis 149) und der üblichen Objektträgermethode (Fujimaki, Tamura und Takahashi, Rinsho Kagaku, Japan (Clinical Science), 12 (1976) 507 und Fujimaki, Ike-matsu, Takeuchi und Kato, Rinsho Byori (Japanese Journal of Clinical Pathology), 21 (1973) ermittelt hat.

Tabelle II

Patient Unbekannte Probe Nr. Mate- Verdün-

rial nungs-

faktor

Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion (Extinktion/min x 102)

Fibrinogenkonzentration in der unbekannten Probe (|i.g/ml)

Erfindungs- RIA-Methode gemässes Verfahren

Objektträgermethode

1

Urin x 16

3,7

5,28

4,892

8,0

2

Urin x 1

3,25

0,30

0,282

0,5

3

Urin x 1

0,087

0,015

0,020

<0,5

4

Urin x 1

<0,05

<0,01

0,006

0,5

5

Urin x 1

0,365

0,049

0,052

0,5

6

Urin x 1

0,088

0,015

0,011

0,5

7

Urin x 1

0,330

0,045

0,023

0,5

8

Urin x 1

<0,05

<0,01

0,006

0,5

9

Urin x 1

0,332

0,045

0,072

0,5

10

Serum x 10

0,671

0,810

0.789

1,0

11

Serum x 10

0,665

0,805

0,850

1,0

12

Serum x 10

1,32

1,42

1,335

1,25

13

Serum x 10

0,698

0,84

0,870

1,0

Beispiel 2

1. Herstellung eines mit Antihumanchoriongonadotropin-Antikörpern sensibilisierten Latexreagens' (Anti-hCG-Latex-reagens, Antihumanchoriongonadotropin-sensibilisiertes Latexreagens)

Nach der in Abschnitt 1 von Beispiel I beschriebenen od Weise bereitet man ein Antihumanchoriongonadotropin-sensibilisiertes Latexreagens, mit dem Unterschied, dass man anstelle des Anti-(humanfibrinogen)-Antikörpers einen Anti-(humanchoriongonadotropin)-Antikörper (Anti-hCG)-ver-

640 353

wendet, anstelle der Mischung aus gleichen Volumina von Polystyrollatices mit durchschnittlichen Teilchendurchmessern von 0,091 bzw. 0,220 (im einen monodispersen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 (im einsetzt und die Konzentration der Latexteilchen in dem fertigen Reagens auf 0,25% einstellt.

2. Aufnahme der Eichkurve

In einem kleinen Reagensglas vermischt man durch heftiges Schütteln während 5 Sekunden 0,15 ml des in dem obigen Abschnitt gebildeten Anti-hCG-Latexreagens' und 0,15 ml einer Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung, der in der in der nachstehenden Tabelle III angegebenen Konzentration in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,2 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält. Unmittelbar anschliessend überführt man die Mischung in eine Acrylharzzelle mit einer Dicke von 4 mm, die mit einem kompakten Rührer mit einem Rührflügeldurchmesser von 2,4 mm ausgerüstet ist, wonach man die Änderung der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung in Abhängigkeit von der Zeit misst, währenddem man die Mischung bei 1200 min-1 rührt. Die Bestimmung der prozentualen Absorption erfolgt unter Verwendung einer Licht emittierenden Ga/As-Diode (Monsanto Company, Modell ME-7124, Spitzenemissionswellenlänge: 940 nm, Halbwertsbreite: 50 nm) als Lichtquelle. Das von der Lichtquelle emittierte Licht wird direkt auf die Zelle gerichtet, worauf man das durchgelassene Licht mit Hilfe einer Sili-cium-Photozelle (Hamamatsu TV, Modell S 874-8K) misst. Das Ausgangssignal der Photozelle wird verstärkt, und es wird die Änderung der prozentualen Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit mit Hilfe eines Schreibers aufgezeichnet. Die in dieser Weise erhaltene Kurve ist in der Fig. 5a dargestellt. Auf dieser Kurve wird dann eine gerade Linie längs des annähernd geraden Abschnittes der Kurve in einem möglichst frühen Stadium nach Beginn der Aufzeichnung gezeichnet, worauf man die Steigung der Geraden berechnet. Die in dieser Weise erhaltenen Werte sind in der nachstehenden Tabelle III in der mit «Geschwindigkeit» bezeichneten Spalte angegeben, in der die Geschwindigkeit der Änderung der prozentualen Absorption in %/min angegeben ist. Diese Bestimmung erfolgt für jede Konzentration doppelt, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu überprüfen. Aus den in der Tabelle III angegebenen Zahlenwerten wird die in der Fig.6a dargestellte Eichkurve erstellt, indem man graphisch die Korrelation zwischen der Konzentration des Antigens und der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption als Folge der Agglutination des Latex' ermittelt. In der Fig. 6a sind die Werte auf beiden Achsen in logarithmischem Massstab angegeben.

12

Tabelle III

Konzentration der Geschwindigkeit der Änderung

Standard-hCG-Lösung der prozentualen Absorption bei

(internationale Einheiten/ml) 940 nm (%/min) 5 1. Messung 2. Messung Mittel

0,078

1,78

1,81

1,81

0,156

3,12

3,18

3,15

0,312

5,50

5,50

5,50

0,625

9,62

9,40

9,51

1,25

14,90

14,80

14,85

Die Fig. 5b zeigt die Kurven, die man erhält, wenn man 15 die in der Fig.5a dargestelltenn Kurven, die tatsächlich von dem Schreiber aufgezeichnet wurden, in die Extinktion umwandelt. Mit Hilfe der in der Fig. 5b dargestellten Kurven wird die Geschwindigkeit der Änderung der Extinktion in gleicher Weise ermittelt, wozu man den ungefähr geraden so Abschnitt einer jeden Extinktionskurve in einem möglichst frühen Stadium nach Beginn der Reaktion verwendet. Die Fig. 6b zeigt anhand einer Kurve die Beziehung zwischen der in dieser Weise ermittelten Geschwindigkeit der Änderung der Extinktion und der Konzentration der Standard-Human-25 choriongonadotropin-Lösung. Die in dem nachstehenden Abschnitt 3 beschriebene Bestimmung unbekannter Proben könnte auch mit Hilfe der Fig. 6b erfolgen.

3. Bestimmung von Humanchoriongonadotropin in unbe-30 kannten Proben

Man entnimmt einem Patienten eine Probe Blut oder Urin, wobei man im Fall einer Blutprobe Serum in üblicher Weise isoliert. Die Probe wird dann in der in der nachstehenden Tabelle IV angegebenen Weise verdünnt. In gleicher 35 Weise, wie es in dem obigen Abschnitt 2 angegeben ist, werden dann 0,15 ml der verdünnten Probe mit 0,15 ml des in dem Abschnitt 1 bereiteten Anti-hCG-Latexreagens umgesetzt, und es wird die Änderung der prozentualen Absorption in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt, um die Geschwindig-40 keit der Zunahme der prozentualen Absorption zu ermitteln. Der in dieser Weise erhaltene Wert wird mit der Eichkurve verglichen, und es wird von der Eichkurve die diesem Wert der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption entsprechende Konzentration des Humanchoriongona-45 dotropins abgelesen. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV zusammengestellt, die zu Vergleichszwecken auch die Zahlenwerte enthält, die man an der gleichen Probe mit Hilfe der Radioimmunoassay-Methode ermittelt hat (Radioimmunoassay Method, K. Oku-50 mura, J. of Jap. Endocrinologie Soc. 532 (1976) 105).

13

640 353

Tabelle IV Bestimmung einer unbekannten Probe

Probe Nr.

Art der Probe

Name des Patienten (Geschlecht)

Diagnose

Verdünnung- Geschwin-sfaktor digkeit (%/min)

Humanchoriongonadotropin-Konzentration in der unbekannten Probe (1 U/ml)* erfindungsgemässes RIA-Verfahren Methode

1

Urin

H.M. (w)

Schwangerschaft (10. Woche)

X

100

9,2

60

65,16

2

Urin

K.O. (w)

Traubenmole (8. Woche)

X

1000

10,2

690

682,9

3

Urin

R.H. (w)

Nach Entfernen der

X

1

7,8

0,45

0,484

Traubenmole

4

Urin

G.M. (m)

Rechtes Testiculom

X

1

3,8

0,20

0,182

5

Urin

T.I. (w)

Teilabort (4. Woche)

X

1

3,5

0,18

0,194

6

Serum

T.Y. (w)

Traubenmole

X

1

1,7

0,075

0,0741

7

Serum

E.S. (m)

Testiculom

X

10

9,6

6,4

6,17

8

Serum

S.K. (w)

Traubenmole

X

1

7,7

0,48

0,544

9

Serum

H.N. (m)

Bösartiges Thymom

X

1

10,0

0,69

0,673

10

Serum

R.W. (w)

Schwangerschaft (6. Woche)

X

100

13,2

95

100,3

* IU/ml = internationale Einheiten/ml

Beispiel 3 25

Man setzt einen aliquoten Anteil von 0,1 ml eines gemäss Abschnitt 1 von Beispiel 2 bereiteten Antihumanchoriongo-nadotropin-Antikörper-sensibilisierten Latexreagens' mit einem Latexgehalt von 0,33% mit 0,1 ml einer Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung in der in Abschnitt 2 30 von Beispiel 1 beschriebenen Weise um und zeichnet die Änderung der prozentualen Absorption auf. Die Bestimmung der prozentualen Absorption erfolgt unter Anwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Vorrichtung, mit dem Unterschied,

dass man für die Bestrahlung ein monochromatisches Licht 35 mit einer Wellenlänge von 950 nm und einer Schlitzbreite von 30 nm (was einer mechanischen Schlitzbreite von 0,36 mm entspricht) verwendet, die man mit Hilfe eines Prismenspek-trophotometers (Hitachi Modell EPU-2) als Lichtquelle bildet und wobei man eine Zelle mit einer Dicke von 3 mm einsetzt, 40 Aus dem geraden Abschnitt der aufgezeichneten Kurve, die die Änderung der prozentualen Absorption in Abhängigkeit von der Zeit wiedergibt, ermittelt man die Geschwindigkeit der Änderung der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit und trägt diese auf der Ordinate gegen die Konzentration der 45 Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung auf der Abszisse auf doppelt-logarithmischem Papier auf und erhält in dieser Weise die in der Fig. 7 dargestellte Eichkurve. Unter Verwendung dieser Eichkurve kann man die Humanchorion-gonadotropin-Konzentration unbekannter Proben bestim- 50 men.

Beispiel 4

Nach der in Abschnitt 1 von Beispiel 1 beschriebenen Weise bereitet man ein Antifibrinogen-Latexreagens mit 55 einem Latexgehalt von 0,50%, mit dem Unterschied, dass man die Mischung aus gleichen Volumina eines Polystyrollatex' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,091 (im und einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 (xm durch einen monodispersen Polystyrollatex mit e>o einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,312 jj,m (Dow Chemical) ersetzt.

Dann vermischt man in einem kleinen Reagensglas 0,2 ml des Latexreagens' und 0,2 ml einer Standard-Fibrinogen-Lösung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise durch «s Schütteln während 5 Sekunden. Unmittelbar anschliessend überführt man die Reaktionsmischung in eine Zelle mit einer Dicke von 2 mm und zeichnet die Änderung der prozentualen

Absorption auf, währenddem man die Mischung mit Hilfe eines auf und ab bewegten Rührstabes nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise bewegt. Die Bestimmung der prozentualen Absorption erfolgt in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise, mit dem Unterschied der andersartigen Rühreinrichtung. Die in dieser Weise erhaltenen Zahlenwerte werden dann nach der in Beispiel 3 angegebenen Weise aufgearbeitet, wobei man die Korrelationswerte zwischen der Konzentration der Standard-Fibrinogen-Lösung und der Geschwindigkeit der Änderung der prozentualen Absorption erhält, die in der nachstehenden Tabelle V angegeben sind, aus denen man die in der Fig. 8 dargestellte Eichkurve erstellt. Unter Verwendung dieser Eichkurve kann die Fibrinogenmenge in unbekannten Proben bestimmt werden.

Tabelle V

Konzentration der Standard-Fibrinogen-Lösung

(Hg/ml)

Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption (%/min)

15,6

1,03

31,3

2,48

62,5

4,95

125

7,70

250

15,15

500

30,0

1000

48,5

Beispiel 5

Unter Anwendung des in Beispiel 3 verwendeten Antihu-manchoriongonadotropin-Latexreagens' bestimmt man die Änderung der prozentualen Absorption. Die für diese Messung verwendete Vorrichtung entspricht der in Beispiel 3 beschriebenen, mit dem Unterschied, dass man die Lichtquelle durch eine Kombination aus einer üblichen Wolframlampe (12 V, 8 W) und einem optischen Filter (Ditric Optics, D 800) ersetzt und die Zelle mit Licht bestrahlt, das keine Spektralkomponente mit einer Wellenlänge von -weniger als 800 nm enthält. Die in dieser Weise erhaltenen Zahlenwerte werden nach den in Beispiel 3 beschriebenen Weise aufgearbeitet, wodurch man die in der nachstehenden Tabelle VI angegebenen Ergebnisse erhält, die die Korrelation zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und der

640 353

14

Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption wiedergeben. Die Ergebnisse sind graphisch in der in der Fig. 9 dargestellten Eichkurve wiedergegeben, mit der die Humanchoriongonadotropin-Menge in unbekannten Proben nach der in Beispiel 2 angegebenen Weise bestimmt werden können.

Tabelle VI

Konzentration der Standard-Humanchoriongona-dotropin-Lösung (IU/ml)*

Geschwindigkeit der Änderung der prozentualen Absorption (%/min)

0,125

0,40

0,25

0,70

0,5

1,3

1,0

2,1

2,0

3,3

4,0

6,0

* IU/ml = internationale Einheiten/ml Beispiel 6

Man ersetzt ein nach der Verfahrensweise von Beispiel 2 hergestelltes Anti-(humanchoriongonadotropin)-Antikörper-sensibilisiertes Latexreagens (Antihumanchoriongonadotro-pin-Latexreagens) mit einer Standard-Humanchoriongonado-tropin-Lösung der in der nachstehenden Tabelle VII angegebenen Konzentration um. Dann bestimmt man die Änderung der prozentualen Absorption unter Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Lichtquelle und des dort angegebenen Detektors, mit dem Unterschied, dass man zwischen dem Detektor und der Aufzeichnungseinrichtung einen Integrator zwischenschaltet. Die Integration erfolgt zusammen mit dem Rühren, wobei eine Integration der prozentualen Absorption während Perioden von 9 Sekunden, zwischen denen Pausen von 1 Sekunde liegen, vorgenommen wird. Die Geschwindigkeit der Änderung wird aus den Integralen der fünften und siebten Periode von 9 Sekunden ermittelt. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VII zusammengestellt.

Tabelle VII

Konzentration

Integral (a) der

Integral (b) der

(b)-(a)

der Standard-

fünften Periode siebten Periode

Irl umanchorion-

von 9 Sekunden von 9 Sekunden

gonadotropin-

(Schreiberable

(Schreiberable

Lösung (IU/ml)*

sung)

sung)

0,0625

0,5

1,5

0,5 1,5

1,0

0,125

14,5

16,5

2,0

0,25

22,5

27,0

4,5

0,50

39

47

8,0

1,0

70

90

20

2,0

96

141

45

* IU/ml = internationale Einheiten/ml

Die in der obigen Tabelle angegebenen Zahlenwerte sind in der Fig. 10 graphisch dargestellt. Unter Verwendung der in der Fig. 10 angegebenen Kurve als Eichkurve kann die Humanchoriongonadotropin-Konzentration unbekannte Proben in der oben beschriebenen Weise ermittelt werden.

Beispiel 7

Nach der in Beispiel 2, Abschnitt 1, beschriebenen Weise bereitet man ein Antihumanchoriongonadotropin-sensibili-

siertes Latexreagens, mit dem Unterschied, dass man die Konzentration der Altexteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,220 [im in dem fertigen sensibilisierten Latexreagens auf 1,0 Gew.-% einstellt.

Die anschliessende Umsetzung und Messung erfolgt nach der Verfahrensweise und unter Verwendung der Vorrichtung, die in Abschnitt 2 von Beispiel 1 beschrieben sind, mit dem Unterschied, dass man die Standard-Fibrinogen-Lösungen durch Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen, die in der nachstehenden Tabelle VIII angegeben sind, ersetzt. Aus den in dieser Weise erhaltenen Daten erstellt man die in der Fig. 11 dargestellte Eichkurve, die die Beziehung zwischen der Antigenkonzen-tration und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion wiedergibt. Unter Verwendung dieser Eichkurve kann die Humanchoriongonadotropin-Konzentration in unbekannten Proben nach der Verfahrensweise von Beispiel 2 bestimmt werden.

Tabelle VIII

Konzentration der Standard-Humanchoriongona-dotropin-Lösung (IU/ml)*

Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 950 nm (Extinktion/min x 102)

0,078

0,0086

0,156

0,016

0,313

0,0278

0,625

0,075

1,25

0,197

2,5

0,480

* IU/ml = internationale Einheiten/ml Beispiel 8

Nach der Verfahrensweise von Beispiel 1, Abschnitt 1, bereitet man ein mit Antifibrinogen-Antikörpern sensibilisiertes Latexreagens (Antifibrinogen-Latexreagens) (Latexteilchengehalt: 1 Gew.-%), mit dem Unterschied, dass man einen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 [im (Dow Chemical, Feststoffgehalt = 10 Gew.-%) verwendet.

In einem kleinen Reagensglas vermischt man durch Schütteln während 5 Sekunden 0,1 ml des in dieser Weise erhaltenen Antifibrinogen-Latexreagens', 0,1 ml einer Glycinpufferlösung (mit einem pH-Wert von 9,5) und 0,2 ml einer Standard-Fibrinogen-Lösung, die Fibrinogen in den in der nachstehenden Tabelle IX angegebenen Konzentrationen in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, enthalten. Anschliessend bestimmt man die Änderung der Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit mit der in Abschnitt 2 von Beispiel 1 beschriebenen Vorrichtung bei einer Wellenlänge von 900 nm (Schlitzbreite: etwa 3 nm). Man ermittelt die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion als Folge der Agglutination des Latex' in der in Abschnitt 2 von Beispiel 1 beschriebenen Weise (welche Werte in der nachstehenden Tabelle IX angegeben sind) und ermittelt die Korrelation dieser Werte mit der Antigenkonzentration der Standardlösung graphisch,

wodurch man die in der Fig. 12 dargestellte Eichkurve erhält.

Aus diesen Zahlenwerten ist ersichtlich, dass selbst dann, wenn die Wellenlänge, bei der die Extinktion gemessen wird, um einen Faktor von lediglich 1,13 länger ist als der durchschnittliche Teilchendurchmesser des Latex', eine zufriedenstellende Korrelation zur Bestimmung der Antigenkonzentration erreicht wird und dies bei Konzentrationen des Antigens in Standardlösungen von nicht mehr als 1 ug/ml.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

o5

Tabelle IX

Konzentration der Geschwindigkeit der Zunahme der

Standard-Fibrinogen-Lösung Extinktion bei 900 nm ([ig/ml) (Extinktion/min)

0,0625

0,0008

0,125

0,0034

0,250

0,0090

0,500

0,0148

1,00

0,0276

4,00

0,0296

Beispiel 9

Man bereitet nach der in Beispiel 2 angegebenen Verfahrensweise, jedoch mit dem Unterschied, dass man den Polystyrollatex mit einem durchschnittlichenn Teilchendurchmesser von 0,220 (im durch einen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 1,091 [im (Dow Chemical, Feststoffgehalt = 10 Gew.-%) ersetzt, ein Antihu-manchoriongonadotropin-Latexreagens, das 0,3 Gew.-% Latexteilchen enthält.

Man beschickt ein kleines Reagensglas mit einem aliquoten Anteil von 0,2 ml des in dieser Weise bereiteten Antihu-manchoriongonadotropin-Latexreagens' und gibt 0,2 ml einer Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung der in der nachstehenden Tabelle X angegebenen Konzentration in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, zu. Anschliessend zeichnet man die Änderung der Extinktion der Reaktionsmischung in Abhängigkeit von der Zeit unter Anwendung der Verfahrensweise und der Vorrichtung von Abschnitt 2 des Beispiels 1 auf, mit dem Unterschied, dass man eine Wellenlänge von 1100 nm (Schlitzbreite: etwa 3 nm) anstelle einer Wellenlänge von 950 nm einstellt. Auf der Grundlage der in dieser Weise aufgezeichneten Änderung der Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit ermittelt man die in der Fig. 13 dargestellte Eichkurve nach der Verfahrensweise von Beispiel 1, Abschnitt 2.

Aus der Fig. 13 ist ersichtlich, dass selbst dann, wenn das Verhältnis von Wellenlänge zu durchschnittlichem Teilchendurchmesser des Latex annähernd 1,0 beträgt, die erfindungsgemässe Verfahrensweise dazu geeignet ist, Humanchoriongonadotropin-Konzentrationen von nicht mehr als 1,0 internationale Einheiten/ml zu bestimmen.

640 353

Tabelle X

Konzentration der Standard-Humanchoriongona-dotropin-Lösung (internationale Einheiten/ml)

Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 1100 min (Extinktion/min)

0,0156

0,0032

0,0313

0,0072

0,0625

0,0095

0,125

0,0169

0,250

0,025

0,500

0,033

1,00

0,050

2,00

0,066

4,00

0,066

Beispiel 10

Nach der Verfahrensweise von Beispiel 8 führt man eine Reihe von Untersuchungen durch, bei denen man einen Anti-fibrinogen-sensibilisierten Latex (mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 (im) identisch dem in Beispiel 8 verwendeten und Standard-Fibrinogen-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen, die in der nachstehenden Tabelle XI angegeben sind, in isotonischer Natriumchloridlösung, die 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, verwendet. Die Bestimmung der Extinktion erfolgt bei einer Wellenlänge von 1650 nm anstelle einer Wellenlänge von 900 nm bei Anwendung einer Schlitzbreite von etwa 3 nm. Die in dieser Weise erhaltene und in der Fig. 14 dargestellte Eichkurve ist für die Bestimmung der Antigenkonzentration geeignet.

Tabelle XI

Konzentration der

Standard-Fibrinogen-Lösung

(Hg/ml)

Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 1650 nm (Extinktion/min)

0,0313

0,00128

0,0625

0,0020

0,250

0,0116

0,500

0,027

1,00

0,044

4,00

0,092

15

5

10

15

20

25

30

35

40

G

8 Blatt Zeichnungen

Claims (10)

640 353

1. Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und/oder Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Antigen und/oder einen Antikörper in einem flüssigen Medium mit dem entsprechenden Antikörper und/oder Antigen, der bzw. das auf unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 (im vorliegt, 'im die Trägerteilchen zu sensibilisieren, umsetzt, die Mischung, in welcher die Reaktion abläuft, mit einer Strahlung mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 um bestrahlt, die durchgelassene Strahlung an zwei oder mehreren Zeitpunkten während des Ablaufs der Reaktion und dann die Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung während einer gegebenen Zeitdauer ermittelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man besagte Umsetzung in dem flüssigen Medium unter vorbestimmten, im wesentlichen festen Bedingungen durchführt und die Geschwindigkeit besagter Zunahme pro Zeiteinheit zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Beginn der Reaktion ermittelt.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Geschwindigkeit besagter Zunahme pro Zeiteinheit an einem Zeitpunkt ermittelt, bei dem die Reaktion stetig abläuft.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Geschwindigkeit besagter Zunahme, kurz nachdem die Reaktion den stationären Zustand erreicht hat, ermittelt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Geschwindigkeit besagter Zunahme pro Zeiteinheit an einem solchen Zeitpunkt ermittelt, bei dem die Extinktion oder die prozentuale Absorption gleichmässig mit Ablauf der Zeit zunimmt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Geschwindigkeit besagter Zunahme pro Zeiteinheit an einem Zeitpunkt ermittelt, bei dem die Extinktion oder die prozentuale Absorption erstmals nach Beginn der Reaktion gleichmässig zunimmt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man unlösliche Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 1,0 p.m verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktionsmischung mit monochromatischer oder polychromatischer Strahlung mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 (im bestrahlt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktionsmischung mit monochromatischer oder polychromatischer Strahlung mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,8 bis 1,4 um bestrahlt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Trägerteilchen in der Reaktionsmischung in einer Konzentration im Bereich von 0,05 bis 1 Gew.-% verwendet.