DE2905433C2

DE2905433C2 - Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern

Info

Publication number: DE2905433C2
Application number: DE2905433A
Authority: DE
Inventors: Shinichiro Tokyo Matsumoto; Shiro Tokyo Morita; Masanobu Yamato Kanagawa Sawai; Tadamitsu Sagamihara Kanagawa Sudo
Original assignee: Mitsubishi Chemical Industries Ltd Tokyo; Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1978-02-16
Filing date: 1979-02-13
Publication date: 1986-05-28
Also published as: GB1598532A; FR2417770A2; JPS54109494A; FR2417770B2; DE2905433A1; US4313929A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern gemäß Oberbegriff des Patentanspruchs.

In den letzten Jahren besteht auf dem Gebiet der Medizin ein anhaltendes Bedürfnis dafür. Antigene und Antikörper quantitativ zu bestimmen.

Die DE-OS 27 36805 beschreibt bereits ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, welches darin besteht, einen Antikörper oder ein Antigen an unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als Ι,όμιη zu fixieren, um die unlöslichen Trägerteilchen zu sensibilisieren, den auf dem Trägermaterial vorliegenden Antikörper und/oder das auf dem Trägermaterial vorliegende Antigen mit einem entsprechenden Antigen oder Antikörper oder einer Mischung davon in einem flüssigen Medium umzusetzen und die Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μιη, die um einen Faktor von mindestens 1,5 langer ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, zu bestrahlen, um die Extinktion der Rea!:iionsmischung zu messen.

Aus der GB-PS 869483 sind weiterhin ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Antikörpern in einer Flüssigkeit bekannt, mit denen das durch die Reaktionsmischung der Antigene mit den Antikörpern gestreute Licht gemessen wird.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, ein einfaches und präzises Verfahren anzugeben, mit dem es gelingt, Antigene und Antikörper quantitativ zu bestimmen.

Diese Aufgabe wird nun durch das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Patentanspruch gelöst.

Das erfindungsgemäß angewandte Licht besitzt eine Wellenlänge im Bereich von 0,8 bis 2,4 μηι, das in den nahen Infrarotbereich oder einen Teil des sich unmittelbar daran anschließenden sichtbaren Bereiches fallt. Von dem Licht aus dem oben angegebenen Wellenlängenbereich ist besonders bevorzugt das Licht des nahen Infrarotbereichs mit einer Wellenlänge im Bereich von 1,0 bis 1,8 μιη.

Es hat sich nunmehr gezeigt, daß, wenn man ein Antigen und/oder einen Antikörper, das bzw. der in einer Probe vorliegt, mit dem entsprechenden Antikörper und/oder Antigen, der bzw. das auf Mikroteilchen aus einem unlöslichen Trägermaterial mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μίτι, der vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 1 μσι und noch bevorzugter im Bereich von 0,2 bis 0,8 μιη liegt, umsetzt, um eine Agglutination der Mikroteilchen zu bewirken, und die erhaltene Reaktionsmischung mit Licht aus dem oben angegebenen nahen Infrarotbereich bestrahlt, dessen Wellenlänge um einen Faktor von mindestens 1,5 und noch bevorzugter von mindestens 2 langer ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteiichen, die Intensität des durch die oder von der Reaktionsmischung gestreuten Lichtes in guter Abhängigkeit mit dem Fortschreiten der durch die Antigen-Antikörper-Reaktion verursachten Agglutination zunimmt. Somit ist es erfindungsgemäß wesentlich, die Wellenlänge des angewandten Lichtes und den durchschnittlichen Durchmesser der Trägerteilchen in geeigneter Weise derart auszuwählen, daß eine bestimmte Korrelation zwischen der Konzentration eines bestimmten Antigens oder Antikörpers oder einer Mischung davon (einschließlich des daraus gebildeten Reaktionsprodukts) in einer Probenlösung und der Intensität des durch die Reaktionsmischung gestreuten Lichtes erreicht wird.

Wenn ein Lichtstrahl auf einen halbtransparenten Körper fällt, wird ein Teil des Lichtes gestreut, während ein Teil des Lichtes absorbiert und ein Teil des Lichtes durchgelassen werden. Wenn I₀ für die Intensität des einfallenden Lichtstrahls, /_s für die Intensität des gestreuten Lichtes, /,, für die Intensität des absorbierten Lichtes und /, für die Intensität des durchgelassenen Lichtes stehen, so besteht folgende Beziehung:

Da bei dem erfindungsgemäß angewandten System die Absorption des Lichtes weitgehend vernachlässigt werden kann, kann die Gleichung 1 wie folgt geschrieben werden:

/„ =

Wenn der einfallende Lichtstrahl auf Mikroteilchen fallt, die in einer transparenten Flüssigkeit suspendiert sind, wie es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Fall ist, wird das Licht in sämtliche Raumrichtungen gestreut. Der Teil des gestreuten Lichtes, der nach vorne gestreut wird, das heißt in der Richtung des einfallenden Lichtes gestreut wird, vereinigt sich mit dem tatsächlich durchgelassenen Licht und ergibt damit das scheinbar durchgelassene Licht. Die Intensität dieses scheinbar durchgelassenen Lichtes variiert mit dem Fortschreiten der Antigen-Antikörper-Reaktion, wie es genauer in der oben angesprochenen DE-OS der Anmelderin beschrieben ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun die Messung der restlichen Komponenten des gesamten gestreuten Lichtes ausschließlich der Komponente, die parallel zu dem einfallenden Lichtstrahl gestreut wird (wobei die Intensität dieser parallelen Komponente als/"bezeichnet wird) das heißt mit anderen Worten des Lichtes, das in eine andere Richtung als die des einfallenden Lichtstrahles gestreut wird (wobei die Intensität dieses Lichtes mit I'_s bezeichnet wird). Natürlich gilt hierbei die folgende Gleichung:

Erfindungsgemäß geeignete unlösliche Trägerteiichen schließen Mikroteilchen aus organischen Polymeren, die im wesentlichen in den für die erfindungsgemäße Messung verwendeten flüssigen Medium unlöslich sind u.id

die einen durchschnittlichen Durchmesser innerhalb des oben angegebenen Bereiches aufweisen, beispielsweise Latices von organischen Polymeren, wie Polystyrol und Styrol-Butadien-Copoiymere, die man durch Emulsionspolymerisation erhält; dispergierte Kokkenbakterien, wie Staphylokokken und Streptokokken, Bacillus prodieiosus, Rickettsia, Zellmembranfragmente etc.; sowie Vllkroteilchen von anorganischen Oxiden, wie Siliciumdioxid, Si!^;ciumdioxid-Aluminiumoxid und Aluminiumoxid, und feinpulverisierte Mineralien. Metalle und dergleichen ein.

Erfindungsgemäß wird ein Antikörper oder ein Antigen, der mit dem Antigen und/oder dem Antikörper in der zu bestimmenden Probe reagiert, an den oben erwähnten unlöslichen Trägerteilchen, beispielsweise Latexleilchen, fixiert (um das Trägermaterial zu sensibiüsieren). Für diesen Zweck kann man den Antikörper oder das Antigen physikalisch und/ode. chemisch an dem Träger adsorbieren oder fixieren.

Antikörper bestehen aus Proteinen, während Antigene aus einem Vertreter einer Reihe von Substanzen bestehen, die beispielsweise Proleine, Polypeptide. Steroide, Polysaccharide. Lipide. Pollen, Staub und dergleichen einschließen. Es wurde bereits eine Reihe von Methoden vorgeschlagen, um diese Antikörper oder Anligene und insbesondere Antikörper auf unlöslichen Trägerteilchen festzulegen oder zu fixieren.

Wenn ein unvollständiges Antigen, insbesondere ein Hapten. auf unlöslichen Trägennaterialien fixiert werden soll, ist es vorteilhaft, die Trägermaterialien chemisch zu modifizieren, beispielsweise mit Hilfe eines Kupplungsmittel, und anschließend das Antigen chemisch an das modifizierte Trägermaterial zu binden.

Erfindungsgemäß kann man die unlöslichen Trägcrleilclien (beispielsweise die Latexteilchen), die mil einem J5 Antikörper oder einem Antigen scnsibilisicrt worden sind (welche Teilchen nachstehend als »sensibilisierte Trägelteilchen« bezeichnet werden) in Form einer Suspension verwenden, die diese Teilchen in einer relativ hohen Konzentration von mindestens 0.05 Gevv.-%. vorziiiisweise von 0.1 bis 1 Gew.-% und noch bevorzugter von 0.2 bis 0.6 Gew.-% enthält, um solche Bedingungen zu schaffen, daß das Antigen oder der Antikörper in der Probe möglichst aktiv mit den sensibilisierten Trägerleilchen reagieren kann. Weiterhin kann bei dem erfindimgsiiemüßcn Verfahren die Reaktion zwischen der das Antigen oder den Antikörper enthaltenden Probe und den sensibilisierten Trägerteilchen unter nichtruhcndcn Bedingungen durchgeführt werden. Für diesen Zweck ist es von Vorteil, die Reaktion unter Bewegen der Reaktionsmischung durchzuführen, was beispielsweise durch Rühren oder Schütteln erreicht wird.

Die erfindungsgemäße Anligen-Aniikörptr-Reaktion wird in einem flüssigen Medium, vorzugsweise in Wasser oder einer Mischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Methanol. Äthanol. Aceton etc. durchgeführt.

Gemäß einer Ausführungsfonn des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man eine ein Antigen oder einen Antikörper enthaltende Probenlösung, die verdünnt oder konzentriert sein kann, mit einer Suspension unlöslicher Trügerteilchen, auf denen der entsprechende Antikörper oder das entsprechende Antigen vorliegt, umsetzen, um hierdurch die Agglutination der Teilchen zu bewirken. Gemäß einer weiteren Ausführungsfonn der Erfindung t>5 wird eine Probenlösung, die den zu bestimmenden Antikörper oder das zu bestimmende Antigen enthält, zunächst mit dem entsprechenden Antigen oder Antikörper umgesetzt, wonach die erhaltene Reaktionsmischung mit einer Suspension unlöslicher Trägerteilchen, auf denen der entsprechende Antikörper oder das entsprechende Antigen vorliegt, umgesetzt wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die in dieser Weise erhaltene Reaktionsmischung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge zu einem oder mehreren Zeitpunkten nach Beginn der Reaktion belichtet und es wird die Intensität des von der oder durch die Reaktionsmischung gestreuten Lichtes zur Bestimmung des Antigens oder des Antikörpers in der Probe gemessen.

Die Erfindung sei im folgenden anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 eine Kurve, die die Änderung der Intensität des gestreuten Lichtes in Abhängigkeit von der Zeit wiedergibt, wenn man die Reaktionsmischung aus einer Standard-Fibrinogen-Lösung mit einer Konzentration von 2.OiIgZm] und einer Mischung vor? Polyslyroilaiices mit durchschnittlichen Teilchendurchmessern von 0.091 und 0.220 μιτί. die mit Antifibrinogen-Antikörpern sensibilisiert worden sind, mit Licht mit einer Wellenlänge von A: 1.0μηι, B: 1,1 μιη und C: 1.25 μΐη bestrahlt;

Fig. 2 eine der in der Fig. 1 dargestellten Kurve ähnliche Kurve, die unter Verwendung einer Standard-Fibnnogen-Lösung mit einer Konzentration von 0,5ng/ml aufgezeichnet wurde;

Fig. 3 eine Kurve, die die Änderung der Intensität des gestreuten Lichtes in Abhängigkeit von der Zeit wiedergibt, wenn man Reaktionsmischungen von Standard-Fibrinogen-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen und einem Antifibrinogen-sensibiüsierten Latex (anti-Fg-sensitized latex) mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,25μιη bestrahlt;

Fig. 4 eine Kurve, die die aus den Daten der Fig. 3 ermittelte Beziehung zwischen der Geschwindigkeit der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes und der Konzentration der Standard-Fibrinogen-Lösung wiedergibt;

Fig. 5 eine Eichkurve, die die Beziehung zwischen der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes zwei Minuten nach Beginn der Reaktion und der Fibrinogen-Konzentration wiedergibt, die durch Belichten der Reaklionsmischung von Standard-Fibrinogen-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen und einem Antifibrinogen-sensibilisierten Latex mil Licht mit einer Wellenlänge von 1.25 μιη ermittelt wurde; und

Fig. 6 eine Eichkurve, die die Beziehung zwischen der Zeit, die für einen Anstieg der Intensität des gestreuten Lichtes um 10% erforderlich ist. und der Fibrinogen-Konzentration wiedergibt, die durch Bestrahlen einer Reaktionsmischung aus Standard-Fibrinogen-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen und einem Antifibrinogen-sensibilisierten Lalex mit Licht mit einer Wellenlänge von 1.25 μιη ermittelt worden ist.

In der Praxis kann das erfindungsgemäße Verfahren gemäß einer der nachstehenden Verfahrensweisen durchgeführt werden:

A) Aus einer Standardprobe, die eine bekannte Menge eines Antigens und/oder eines Antikörpers enthält, bereitet man durch Verdünnen der ursprünglichen Standardprobe unter Anwendung verschiedener Verdünnungsfaktoren eine Reihe von verdünnten Standardproben. Jede der verdünnten und der unverdünnten Standardproben wird mit unlöslichen Trägerteilchen umgesetzt, die mit einer definierten Menge des entsprechenden Antikörpers oder Antigens sensibilisiert worden sind. Die Reaktion wird

während einer gegebenen Zeitdauer (beispielsweise von wenigen Minuten bis zu 2 Stunden) unter vorbestimmten Bedingungen, beispielsweise bei Raumtemperatur, fortgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt wird die Intensität des durch die Reaktionsmischung gestreuten Lichtes gemessen. Aus den in dieser Weise erhaltenen Zahlenwerten wird eine Eichkurve A ermittelt, die die Beziehung zwischen der Menge (der Konzentration) des Antigens oder des Antikörpers in der Standardlösung und der Intensität des gestreuten Lichtes für die besondere Kombination aus dem Antigen und oder dem Antikörper und den sensibilisierten Trägerteilchen wiedergibt. Anschließend wird eine unbekannte Probe unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen, wie sie iür die Eniiilliuiig der Eichkurve A angewandt wurden, mit den gleichen sensibilisierten Trägerteilchen umgesetzt. Nachdem die gleiche Reaktionszeit abgelaufen ist. wird die Intensität des durch die Reaktionsmischung gestreuten Lichtes gemessen und mit der Eichkurve A verglichen. wodurch die Menge (oder die Konzentration) des Antigens undoder des Antikörpers in der unbekannten Probe fesi«estellt werden kann.

B) Es ist weiterhin möglich, eine andere Art von Eichkurve B zu ermitteln, die die Beziehung zwischen der Reaktionszeit (die sich von einigen Sekunden bis 10 Minuten bei Raumtemperatur erstrecken kann), die dafür erforderlich ist. daß die Intensität des gestreuten Lichtes einen bestimmten Wert erreicht, und der Menge (oder der Konzentration) des Antigens oder des Antikörpers in der Standardprobe wiedergibt. Dann wird in ähnlicher Weise unter den gleichen Bedingungen, wie sie für die Ermittlung der Eichkurve angewandt wurden, eine unbekannte Probe mit den gleichen sensibilisierten Trägerteilchen umgesetzt. Die Bestimmung der Menge oder der Konzentraiion des Antigens und oder des Antikörpers in der unbekannten Probe kann dadurch erreicht werden. daß man die Zeit mißt, die dazu erforderlich ist. daß die Intensität des \on der Reaktionsmischung gestreuten Lichtes den gleichen Wert erreicht, und diese Zeit mit der Eichkurve B vergleicht.

C) Eine Standardprobe. die eine bekannte Menge eines Antigens und oder e>nes Antikörpers enthält, wird /in Bildung einer i\"ihe von \erdünnten Standardproben unter Anwendung verschiedener Verdünnungsfaktoren verdünnt. Jede dieser verdünnten und un\ erdünnten Proben wird unter vorbestimmten Bedingungen mit unlöslichen Trägerteilchen, die mit einer delinierten Menge des entsprechenden Antikörpers oder Antigens sensibiiisiert worden sind, umgesetzt, worauf die intensität des gestreuten Lichtes an zwei oder mehreren Zeitpunkten in einem solchen Stadium gemessen wird, in dem die Reaktion der Mischung sieiig \erläuft und die Intensität des von der Reaktionsmischung gestreuten Lichtes kurz nach Beginn der Reaktion erstmals annähernd stetig zunirrimi (das heißt mindestens 2 bis 3 Sekunden und '.orzugs'Aeise mindestens 5 Sekunden nach Beginn der Reaktion). Aus den in dieser Weise erhaltenen Zahlenwerten ermittelt mim die Eichkurve C die die Beziehung zwischen der Menge (oder der Konzentration) des Antigens oder des Antikörpers in der Probe und der Geschwindigkeit der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes pro Zeiteinheit wiedergibt, für die besondere Kombination aus dem Antigen und, oder dem Antikörper und den sensibilisierten Trägerteüchen. Anschließend wird eine unbekannte Probe unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen, wie sie für die Ermittlung der Eichkurve C angewandt wurden, mit den gleichen sensibilisierten Trägerteilchen umgesetzt, worauf die Geschwindigkeit der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes pro Zeiteinheit in im wesentlichen gleicher Weise festgestellt wird. Durch Vergleichen des in dieser Weise erhaltenen Wertes mit der Eichkurve C ist es möglich, die Menge oder die Konzentration des Antigens und/ oder des Antikörpers in der unbekannten Probe festzustellen.

Elei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man die Intensität des gestreuten Lichtes mit einer integrierenden Kugel (integrating sphere), wie sie für die spektroskopische Analyse üblicher emulgierbarer Proben eingesetzt wird, deren Fläche der inneren Oberfläche in einem Bereich schwarz gestrichen ist. den der auf die Probenzelle gerichtete einfallende und davon durchgelassene Lichtstrahl direkt erreicht, messen. Alternativ kann man die Messung des gestreuten Lichts mit Hilfe einer üblichen Vorrichtung zur Bestimmung der Lichtstreuung bewirken.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

1. Herstellung eines mit Antifibrinogen-Antikörpern
sensibilisierten Latexreagens(Antifibrinogen-Latexreagens (Anti-Fg-Latexreagens)

2'u 10 ml einer Lösung von Antihumanfibrinogen-Antikörpern (Anti-ihurnanfibrinogcn-Fg-untikörpern)) in einem Glycinpuffer. die 2 mg/m! Fibrinogen enthält, gibt man 0.5 ml eines Polystyrolliitex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,091 μΐη (mit einem Feststoffgehalt von 10Gew.-%. der von der Firma Dow Chemical Company erhältlich ist) und 0.5 ml eines weiteren Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0.220 μιη (mit gleichem Feststoffgehalt und gleicher Herkunft). Man rührt die Mischung während 30 Minuten bei Raumtemperatur, erwärmt dann auf 40°C und rührt während weiterer 30 Minuten bei dieser Temperatur. Nachdem man die Reaktionsmischung unter Kühlen auf2 bis 4° C während 50 Minuten bei 12000 min"' zentrifugiert hat. dekantiert man den Niederschlag ab und suspendiert die isolierten Latexteilchen, die mit dem Antifibrinogen-Antikörper sensibiiisiert sind, in einer 0.2gew.-%igen Lösung von Rinderserumalbumin unter Bildung eines Antifibrinogen-sensibiiisici ici'i Lutcxrcägcns, uüs u,~> ocw.- /» ucr sensibilisierten Latexteilchen enthält.

2. Umsetzung des Antifibrinogen-sensibilisierten Latex mit Fibrinogen-Antigen

Zu 0.2 ml des gemäß Abschnitt 1 bereiteten Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens gibt man 0.2 ml einer Standard-Fibrinogen-Lösung mit einer Konzentration von 2 Mg/ml in einer isotonischen Natriumchloridlösung. dieO.l Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, und mischt gut durch. Die erhaltene Mischung überfuhrt man in eine Zelle mit einer Dicke von 2 mm. einer Breite von 10 mm und einer Länge von 40 mm und bestrahlt sie mit Licht mit einer Wellenlänge von 1.0. 1.1 bzw. 1.25Mm. Während der Bestrahlung mißt man die Änderung der Intensität des gestreuten Lichtes in Abhängigkeit von der Zeit mit einem Spektropholometer (Hitachi 340). der mit ei-

ner Probenhalterung (Hitachi 340-0702) einer integrierenden Kugel und einem PbS-Detektor ausgerüstet ist. Anstelle des weißen Vergleichskartons ordnet man in dem Bereich der Kugel, die der Probenzelle gegenüberliegt, ein mit schwarzer Farbe beschichtetes Filterpapier an. Die Vergleichszelle (die eine Dicke von 2 mm aufweist) enthält ein gleiches Volumen der Mischung aus dem sensibilisierten Latexreagens und der isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält (welche Mischung nachfolgend als ίο »Blindprobe« bezeichnet wird), wobei in dem Bereich gegenüber der Vergleichszeüe der weiße Vergleichskarton belassen wurde.

Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der F i g. 1 der Zeichnungen dargestellt. Die auf der Ordinate der Fig. 1 aufgetragene Intensität des gestreuten Lichtes steht für das Verhältnis IJl_a in Prozent, wobei J₀ für die mit der oben beschriebenen Vorrichtung gemessene Intensität des gestreuten Lichtes, wenn beide Zellen, nämlich die Probenzelle und die Vergleichszelle, die Blindprobe enthalten, und I_s für die gemessene Intensität stehen, wenn die Probenzelle die tatsächliche, Fibrinogen-Antigen enthallende Reaktionsmischung enthält.

Man wiederholt die oben beschriebene Verfahrensweise unter Verwendung einer anderen Standard-Fibrinogen-Lösung mit einer Konzentration von 0^g/ml und erhält die in der Fig. 2 dargestellten Ergebnisse.

In den Fig. 1 und 2 stehen die Kurven A, B und C für die Ergebnisse, die man bei Wellenlängen von 1,0, 1,1 bzw. 1,25 μπι erhält. Aus den Fig. 1 und 2 ist ersichtlich, daß man günstige Ergebnisse erzielt, wenn man einfallendes Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 1 μίτι, vorzugsweise mindestens 1,2 μΐη zur Messung der Intensität des gestreuten Lichtes verwendet, und daß die Intensität des gestreuten Lichtes in Abhängigkeit von der Konzentration des Antigens variiert.

Beispiel 2
1. Ermittlung der Eichkurve

40

Zu 0,2 ml eines Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens, das in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise bereitet worden ist, gibt man jeweils 0,2 ml der Standard-Fibrinogen-Lösungen (in der in Beispiel 1 beschriebenen isotonischen Natriumchloridlösung) mit den in der nachstehenden Tabelle I angegebenen Konzentrationen und mischt gut durch.

Anschließend mißt man die Intensität des gestreuten Lichtes bei einer Wellenlänge von 1,25 μίτι nach der Verfahrcr.swcisc von Beispiel 1 und zeichnet die Änderung der Intensität des gestreuten Lichtes in Abhängigkeit von der Zeit kontinuierlich auf. Die hierbei aufgezeichneten Kurven sind in der Fig. 3 dargestellt, wobei die Kurven A, B, C, Z), E und FFibrinogen-Konzentrationen von 0,0625, 0,250, 0,500, 1,00, 2,00 bzw. 4,0(^g/mI entsprechen und

Tabelle II

wobei die auf der Ordinate aufgetragene Einheit identisch der in Beispiel 1 beschriebenen ist. Auf jeder Kurve zieht man links ihres annähernd geraden Abschnittes, der in dem frühesten Stadium nach Beginn der Reaktion auftritt, eine Gerade. Aus dem Anstieg der in dieser Weise gebildeten Geraden ermittelt man die Geschwindigkeit der Änderung (der Zunahme) der Intensität des gestreuten Lichtes pro Zeiteinheit und trägt diesen Wert auf der Ordinate gegen die auf der Abszisse aufgetragene Konzentration des Antigens auf. In dieser Weise erhält man die in der Fig. 4 dargestellte Eichkurve.

Tabelle I

	Geschwindigkei! der Zunahme
Fibrinogen-Konzentration	der Intensität des
(Mg/ml)	gestreuten Lichtes
	(%/min)
0,0625	0,12
0,250	0,29
0,50	0,51
1,00	0,87
2,00	1,29
4,00	1.57

Man kann die Fibrinogenmenge in unbekannten Proben mit Hilfe der in der obigen Weise ermittelten Eichkurve wie folgt bestimmen:

2. Bestimmung von Fibrinogen in unbekannten Proben

Man entnimmt einem Patienten Blut oder Urin, wobei man dann, wenn es sich bei der Probe um eine Blutprobe handelt, das Serum in üblicher Weise abtrennt. Erforderlichenfalls wird die Probe dann um den in der nachstehenden Tabelle II angegebenen Faktor verdünnt. Unter Anwendung der in dem obigen Abschnitt 1 angegebenen Verfahrensweise vermischt man 0,2 ml der unverdünnten oder verdünnten Probe mit 0,2 ml des gemäß Abschnitt 1 von Beispiel 1 bereiteten Antifibrinogen-Latexreagens und bestrahlt die erhaltene Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,25 μπι, um die Geschwindigkeit der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes zu messen. Dann liest man auf der gemäß Abschnitt 1 ermittelten Eichkurve den der beobachteten Geschwindigkeit der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes entsprechenden Wert der Fibrinogen-Konzentration ab. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle II zusammengestellt.

Zu Vergleichszwecken enthält die Tabelle II auch die

-7..i_i *_ j:_ :* ι i:ir_ J-- ;;ui:~i r»..j:~:

z^aiiicuwci ic, uic man um urne u« uuiicucii r\.auiuiiiimuntests (RIA-Methode) (S. M. Ratkey et al, Brit. J. Haematol. 30 (1975) 145 bis 149) und der üblichen Objektträgermethode (Fujimaki, Tamura und Takahashi, Rinsho Kagaku (Clinical Science) Japan, 12(1976) 507 und Fujimaki, Ikematsu, Takeuchi und Kato,

Patient

Unbekannte Probe

Material

Verdünnungsfaktor

Geschwindigkeit der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes (%/min) Fibrinogen-Konzentration in der unbekannten
Probe

erfindungs-

gemäßes

Verfahren

RIA-Methode

Objekt-

träger-

melhode

Urin
Urin
Serum

χ 16
χ 1
xlO

0,37
0,34
0.185

4,96
0,27
1.20

5,021
0,337
1.230

8,0
0,5

1.25

ίο

Rinsho Byori (Japanese Journal of Clinical Pathology, 21 (1973) 973) ermittelt hat.

Beispiel 3

Zu 0,2 ml eines nach der Verfahrensweise von Beispiel

1 bereiteten Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens gibt man jeweils 0,2 ml der Standard-Fibrinogen-Lösungen mit den in der nachstehenden Tabelle III angegebenen Konzentrationen, die nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 hergestellt wurden, und mischt gut durch. Die erhaltene Mischung wird dann in die bei Beispiel 1 verwendete Probenzelle überführt und mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,25 μιτι bestrahlt. Unter Verwendung einer Stoppuhr wird die Intensität des gestreuten Lichtes

2 Minuten nach Einbringen der Reaktionsmischung in die Zelle gemessen. Die nach 2 Minuten gemessene Intensität (/_s) des gestreuten Lichtes wird auf der Grundlage von I₀ in die Zunahme (Δ) der Intensität umgerechnet, das heißt die Intensität des gestreuten Lichtes, die man beim Messen der in Beispiel 1 verwendeten Blindprobe errechnet, wobei diese Zunahme Δ durch die folgende Gleichung wiedergegeben werden kann:

Δ = (/,/Z₀-l)x 100

Die bei verschiedenen Konzentrationen der Standard-Fibrinogen-Lösung erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengestellt. Aus den in der Tabelle III angegebenen Zahlenwerten kann die in

der Fig. 5 dargestellte Eichkurve ermittelt werden, die die Beziehung zwischen der Konzentration des Antigens (Fibrinogen) und der Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes nach einer gegebenen Zeitdauer wiedergibt. Unter Verwendung dieser Eichkurve ist es möglich, die Fibrinogen-Konzentration in unbekannten Proben zu bestimmen.

Beispiel 4

Zu 0,2 ml des gemäß Beispiel 1 bereiteten Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens gibt man jeweils 0,2 ml der Standard-Fibrinogen-Lösungen, deren Konzentration in der nachstehenden Tabelle IV angegeben ist und die in der in Beispiel 1 angegebenen Weise hergestellt worden sind und mischt gut durch. Man überführt die erhaltene Mischung in die Probenzelle, die in Beispiel 1 verwendet wurde, und bestrahlt sie mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,25 μην Unmittelbar danach beginnt man, die Intensität des gestreuten Lichtes zu messen und ermittelt die Zeit, die dazu erforderlich ist, daß die Zunahme (Δ) der Intensität des gestreuten Lichtes, wie sie in Beispiel 3 definiert ist, einen Wert von 10% erreicht, wozu man die Zeit mit Hilfe einer Stoppuhr von Beginn der Reaktion an mißt. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle IV und der Fig. 6 wiedergegeben. Unter Verwendung der in der Fig. 6 dargestellten Kurve ist es möglich, die Fibrinogen-Konzentration in unbekannten Proben zu bestimmen.

Tabelle III	Zunahme der Intensität des gestreuten Lichtes nach 2 Minuten (%)	Hierzu	Tabelle IV	Zeit bis zum Erreichen einer Zunahme der Intensiläl des gestreuten Lichtes um 10% (min)
Fibrinogen-Konzentration (Mg/ml)	0,4 2,2 4,0 7,2 11,6 12.6	Fibnnogen-Konzentralion (Mg/ml) 35	1,020 500 340 200 160
0,0625 0,250 0.50 1,00 2,00 4,00
	0,250 0,500 40 ¹^⁰ 2.00 4,00
	6 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern durch Umsetzen eines Antigens oder eines Antikörpers oder eines Gemisches davon in einem flüssigen Medium mit dem entsprechenden Antikörper und/oder Antigen, der bzw. das auf unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 um vorliegt, Bestrahlen der erhaltenen Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,8 bis 2,4 μΐη, die um einen Faktor von mindestens 1,5 langer ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteiichen, an einem oder mehreren Zeitpunkten nach Beginn der Reaktion und Messen des durch die Reaktionsmischung geführten Lichtes, dadurch gekennzeichnet, daß man die Intensität des durch die Reaktionsmischung gestreuten Lichtes mißt.

20