DE2724722C2

DE2724722C2 - Kinetisches Verfahren zur immunonephelometrischen Analyse einer Probe sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

Info

Publication number: DE2724722C2
Application number: DE19772724722
Authority: DE
Inventors: Robert J Orange Calif. Anderson; Robert M. Tustin Calif. Studholme
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1976-06-02
Filing date: 1977-06-01
Publication date: 1983-02-24
Also published as: SE7706338L; CA1081497A; GB1526914A; JPS6110775B2; CH621628A5; JPS5313492A; FR2353860B1; FR2353860A1; DE2724722A1; SE442148B

Description

Die Erfindung betrifft ein kinetisches Verfahren und eine Vorrichtung zur immunonephelometrischen Analyse einer Probe, d. h. zur nephelometrischen Bestimmung der Konzentration an Antikörpern oder niederschlagsbildenden Antigenen, in einer weiten Vielfalt von Proben bei gleichzeitiger Diskrimination hinsiehtlieh des Vorliegens eines Antigen- bzw. Antikörperübefschusäes bei der immunonephelomeirischen Analyse.

Bestimmte Antigene können durch ihre Reaktion mit entsprechenden Antikörpern nachgewiesen werden. Beispielsweise können polyvalente Proteinantigene mit ihren entsprechenden Antikörpern unter Bildung eines Niederschlags reagieren, derart, daß die Niederschlagsmenge entweder der Antikörperkonzentration oder der Antigenkonzentration proportional ist, je nachdem, welche von den beiden im Unterschuß vorliegt. Solche Antikörper nennt man Präzipitine und ihre Reaktionen werden als Immunopräzipitinreaktionen bezeichnet. Die Niederschlagsmenge ist, wie bereits festgestellt, bei solchen Reaktionen enweder der Antikörperkonzentration oder der Antigenkonzentration proportional, je nachdem welche Komponente im Unterschuß vorhanden ist und wie in Fig. 1 veranschaulicht Liegen beispielsweise die Antikörper im Überschuß vor, so steht die Menge des gebildeten Niederschlags in Beziehung zu der Antigenkonzentration in der Probe. Liegt andererseits ein Antigenüberschuß vor, so besteht eine Beziehung zwischen der Niederschlagsmenge und der Antikörperkonzentration. Bei der nachfolgenden Diskussion des Standes der Technik und des Hintergrunds der Erfindung wird die Antigenanalyse in Sera bei Antikörperüberschuß zugrundegelegt. Dies dient jedoch nur zur Erleichterung der Darstellung, ohne daß die Erfindung hierauf beschränkt würde.

Die Kombination von Antigen mit Antikörpern stellt eine spezifische, jedoch umkehrbare chemische Reaklion dar. Seit ihrer Entdeckung wurde die Präzipitinreaktion in weitem Umfang als qualitative oder semiquantitative Technik zur Bestimmung von Antigen- oder Antikörperknnzentrationen verwendet. Im allgemeinen geht man hierbei so vor, daß man die Reaktion vollständig ablaufen läßt und den gebildeten Niederschlag zentrifugiert oder filtriert. Unter optimalen Bedingungen verläuft die Reaktion ziemlich schnell, so daß ein vollständiger Niederschlag innerhalb einer Zeit von wenigen Minuten vorliegt. Unter mehr realistischen Bedingungen der Praxis benötigt die Bildung des Niederschlags hingegen Zeiträume von mehreren Stunden oder sogar von mehreren Tagen, je nach anderen charakteristischen Eigenschaften der betreffenden Lösungen, wie z. B. lonenstärke, Art der vorhandenen Salze und dem Vorliegen anderer hydrophober oder hvdronhiler Makromoleküle.

Läßt man die Reaktion vollständig ablaufun.so nimmt für eine gegebene Antikörpermenge die Menge des niedergeschlagenen Proteins mit der Menge dos polyvanten Antigens bis zu einem Maximalwert zu. Jenseits dieses Maximums führen größere Antigenmengen zu zunehmend geringeren Niederschlagsmengen. So hängt die Menge des gebildeten Niederschlags bei einer Antigen-Antikörperreaktion von den relativen Konzentrationen der beiden Reaktanten ab. Die Kurve in Fig. 1 veranschaulicht die gebildete Niederschlagsmenge als Funktion der Antigenkonzentration in der Reaktionsmischung für eine vorgegebene Antikörperkonzentration. Wie ersichtlich weist die Kurve drei verschiedene Bereiche auf. Im aufsteigenden Ast der Kurve-liegen die Antikörper im Überschuß vor. Im abfallenden Ast der Kurve besteht ein Antigenüberschuß. Der Bereich maximalen Niederschlages wird als Äquivalenzpunkt bezeichnet, in dem die Konzentration von Antigen und Antikörper einander angepaßt sind.

Die meisten Antikörpermoleküle ^nd bivalent, während die niederschlagsbildenden Anrigene multivaleni sind. Diese Reaktionspartner vereinigen sich in einer Reihe von aufeinanderfolgenden Reaktionen, die in die folgenden Schritte zusammengefaßt werden können:

1. Pr.:näre Assoziationsreaktion unter Bildung eines binären Antigen-Antikörperkomplexes,

2. Gitterbildung durch Reaktion der primären Komplexe unter Bildung größerer Komplexe aus einem Gitter von Antigen- und Antikörpermolekülen,

3. Aggregation dieser gitterartigen Komplexe unter Bildung des sichtbaren Niederschlages.

Die spezifische Struktur des aus dem bivalenten Antikörper und dem multivaJenten Antigen gebildeten stabilen Gitters ist noch unbekannt, da die Anzahl der Möglichkeiten sehr groß ist Es gibt jedoch deutliche Befunde für die Bildung eines stabilen Gitters und es hat den Anschein, daß in dem Bereich des Antikörperüberschusses der Präzipitinkurve in der löslichen Phase natli Bildung des Niederschlags kein freies Antigen nachweisbar ist, obwohl in der oben schwimmenden Flüssigkeit noch Antikörper vorhanden sind. Im Äquivalenzbereich findet man in der oben schwimmenden Flüssigkeit weder Antigen noch Antiköiper, außer vielleicht in sehr kleinen Mengen.

Im Bereich des Antigenüberschusses ist die Komplexbildung selbst ein wesentlich einfacherer Prozeß. In diesem Bereich erfolgt nur eine geringfügige Niederschlagsbildung wegen der hohen Wahrscheinlichkeit, daß jedes Antikörpermolekül gebunden wird, wodurch eine nachfolgende Gitterbildung infolge des Fehlens freie'· Antikörpervalenzen unmöglich wird. Eine Niederschlagsbildung kann somit als Folge eines Wachstums von Antikörper-A ntigsnaggregaten derart, daß jedes Antigenmolekül an mehr als eine Antikörpermolekül gebunden wird und wiederum jedes Antikörpermolekül an mehr als ein Antigenmolekül gebunden wird, verstanden werden. Sobald diese Aggregate ein bestimmtes kritisches Volumen überschreiten, fallen sie infolge der Erhöhung der Sedimentationsgeschwindigkeit durch die Erhöhung des Partikeivulumens spontan aus. Wenn also das in dem Schritt 2 des oben beschriebenen Mechanismus gebildete Gitter ausreichend grob ist, wozu in del Nähe des Äquivalcnzpunktes eine Neigung bestehen wird, erfolgt der Niederschlagsausfall ohne die Aggregation benachbarter

Gitter.

Andererseits verschafft bei Antikörperüberschuß die dichte Packung von AntikörDeriiiolekülen, die an Antigenmolcküle gebunden sind, benachbarten Antikörpermolekülen die Gelegenheit, miteinander durch die Bildung von Ionenbindungen zwischen entgegengesetzt geladenen Gruppen zu reagieren. Als Folge hiervon können Gitter aus einer großen Anzahl von Antikörpermolekülcn relativ hydrophob werden und in steigendem Maß dazu neigen, sich miteinander zu verbinden ■;nd im wachsenden Maß unlöslich zu werden. Das bedeutet, daß bei extremen Antikörperüberschuß entsprechend einer sehir niedrigen Antigenkonzentration, obwohl keine für einen Niederschlag ausreichend großen Gitter auftreten, die Aggregation kleiner hydrophober Gitterelemente aus Antigen niedriger Konzentration noch zu einem sichtbaren Niederschlag führt.

Diese Ansicht wird gestützt durch eine Analyse der Auswirkung der lonenstärke auf die Niederschlagsbildung sowie durch Ex perirnenie über den Fortschritt der Niederschlagsbildung. Gemäß den erwähnten Analysen wird durch steinende Salzkonzentration eine steigende Niederschlagsbildung verursacht. Bei den erwähnten Experimenten wurde festgestellt, daß der Zusatz hydrophiler Λgentien oder Stoffe die effektive I lydrophobizität der den Niederschlag bildenden Stoffe erhöht. Man sieht also, daß bei einer sehr niedrigen Antigenkonzentration eine sichtbare Niederschlagsbildung duch den dritten Schritt, nicht aber durch den zweiten Schritt des o. g. Mechanismus hervorgerufen werden kann. Demgemäß ist bei derart niedrigen Antigenkon/entrationer, die Beziehung zwischen der Menge des gebildeten Niederschlags und der Antigenmolckülkonzentration extrem nicht-linear.

Sobald für einen bekannten Antikörper und sein entsprechendes Antigen eine Präzipitinkurve aufgestellt ist, kann das Antiserum dann zur Messung der Konzentration des Antigens in einer unbekannten Probe verwendet werden. Die Antigenbestimmung wird im Bereich des Antikörperüberschusses (jedoch außerhalb des oben beschriebenen Bereiches sehr niedriger Antigenkonzentration) durchgeführt, da in diesem Bereich eine quantitative Beziehung zwischen dem gebildeten Niederschlag und der Antigenmenge besteht. In dem gesamten Bereich von Antigenkonzentration Null bis /u dem Äquivalenzpunkt wird jeweils das gesamte zur Verfügung stehende Antigen in dem unbekannten Serum mit dem im Überschuß vorhandenen Antikörper einen Komplex bilden und damit einen Niederschlag erzeugen. Hierdurch wird die Präzipitinreaktion zu einem äußerst guten quantitativen Werkzeug. Tatsächlich wird eine auberordentlich hohe Spezifität erreicht, wenn das Antiserum frei von Fremdkörpern ist, die mit anderen Antigenen in der Probenlösung einen Niederschlag bilden könnten. Jedoch ist die Bestimmung der Antigenmenge in dieser Weise nicht eindeutig, da eine gegebene Niederschlagsmenge bei Antikörperüberschuß einen bestimmten Wert der Antigenkonzentralion bedeuten kann, während sie bei Antigenüberschuß einen anderen Weit der Antigenkonzentration bedeuten kann. Das heißt, eine bei einer Antikörper-Antigenreaktion gebildete gegebene Niederschlagsmenge kann zwei verschiedene Antigenkonzentrationswerte entsprechen, je nachdem ob Antikörper oder Antigen im Überschuß vorhanden ist Bei unbekannten Proben bleibt oft unklar, welche dieser beiden Voraussetzungen vorliegt

Es bestehen bereits Methoden zur quantitativen Bestimmung der niederschlagsbildenden Antigene oder Antikörper in Lösungen durch Analyse der bei der Reaktion mit ihrem spezifischen immunochemischen Partner gebildeten Niederschläge. Zumeist wird die Menge des gebildeten Niederschlages dadurch bestimmt, daß man das beim Durchgang eines Lichtstrahles durch die Lösung gestreute Licht mißt. Im allgemeinen wird bei diesem Verfahren die Antigen enthaltende Probe zu einer Antikörperlösung und einem to Puffer zugegeben. Man liiUt die Lösung sodann während der für die vollständige Reaktion der Antigene und der Antikörper erforderlichen Zeit stehen bzw. inkubieren. Nach der voll 'ündigen Reaktion wird die Lösung in eine Meßzelle gebracht, ein kollimicrtcr lichtstrahl durch die Zelle geschickt und die St.irke des senkrecht zur Lichteinfallsrichtung gestreuten Lichtes zur Erzeugung eines nephelometrischen Signals gemessen. Durch graphische Analyse unter Verwendung einer Reihe von Standardkurven wird der Betrag des nephelometrischen Signals in sip Msß cO^r Antigenkonzentration in der Probcnlösung umgewandelt. Hierbei werden die Standardkurven durch graphische Aufzeichnung der Werte der nephelometrischen Signale gewonnen. die man bei der Reaktion von Standardantigciilosungen r. verschiedener Konzentration (in Salzwasser; mit Reagentien bekannter Antikörperkonzentrationen erhält Bei der graphischen Analyse wird mit einer Standardkurve gearbeitet, die bei gleichen Bedingungen von Antige: .erdünnungsgrad und Reagenzkonzentration jo gewonnen wurde, wie sie bei der Untersuchung der Probenlösung zur Erzeugung des nephelometrischen Signals herrschten. Der Betrag d°s nephelometrischen Signals wird graphisch auf der Abszisse für die ausgewählte Standardkurve aufgetragen und ein entsprechender Wert für die Antigenkonzentration auf der Ordinate. Der aufgezeichnete Wert der Antigenkonzentration entspricht der Konzentration des Antigens in der Probenlösung, falls die Probenlösung in der oben erwähnten Weise bei Antikörperüberschuß gemessen wurde.

Nephelometrische Verfahren bieten ein bequemes Mittel zur Überwachung der Immunopräzipitinreaktionen in einem frühen Reaktionsstadium. Mit fortschreitender Reaktion wachsen die anfänglichen 1 : 1 Kom-(5 plexe zu größeren Einheiten, die in wachsendem Umfang Licht streuen, bevor es zur Abscheidung eines Niederschlags kommt. Bei ausreichender Zeit werden ausreichend große Teilchen zur Niederschlagsbildung erzeugt. Man beobachtet jedoch eine signifikant so erhöhte Lichtstreuung, bevor die großen Einheiten sich ausreichend agglomeriert haben, um auszufallen. Daher ist für die Beschreibung des nach nephelc.netrischen Verfahren gemessenen Produktes die Bezeichnung »Streuzentren« genauer und zutreffender als die Bezeichnung »Teilchen« oder »Niederschlag«.

Die Bildung der größeren Komplexe in einem freien Lösungsmedium kann bei Vorhandensein hydrophiler Agentien beschleunigt werden, die einen beträchtlichen Anteil des Wassers binden, so daß sich die Wahren schein! ichkeit einer Protein-Proteinwechselwirkung erhöht Das am häufigsten verwendete hydrophiler Agens ist Polyäthylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 6000. In Gegenwart von etwa 40 g/l Polyäthylenglykol 6000 erfolgt die Bildung as von Komplexen ausreichender Größe zur Erzeugung eines für quantitative Messungen genügenden Lichtstreupegel in einem Zeitintervall von Zehntelsekunden und der maximale Streupegel wird innerhalb von weni-

i;en Minuten erreich!., im Gegensatz zu 30 bis 90 Minuten in Abwesenheit von Polyäthylenglykol. Die hei Gegenwart von Polyäthylenglykol erreichte kurze Reaktionszeit geblattet die schnelle direkte Messung des nicderschlagsbildcnden Antigens durch Messung der Zunahme des durch die größeren aus den primären Antigen-Antikörperkomplexen gebildeten Einheiten gestre>'*en Lichts.

Im Ufgensalz zu Verfahren, bei denen der Niederschlag physikalisch von der klaren Lösung getrennt wird, gibt das nephelometrische Verfahren eine Möglichkeit /ur Beobachtung der Immuno-Prazipitinreaklion unter dynamischen Bedingungen, d. h. während ihres Ablaufsanhand. Die anfänglichen I : 1 Komplexe sind im allgemeinen zu klein, um sichtbares Licht in einem wesentlich größeren Um'ang zu streuen als die getrennten Komponenten; daher können nurdie sekundär a'jfgcbauten größeren Finheitcn. die als Strcuzeniren dienen, beobachtet werden Jedoch ist der wirkliche Endpunkt einer Immuno-Präzipitinreaktion schwer zu definieren. Das liegt darin, daß der gebildete Niederschlag schließlich die Tendenz hat, sich aus der Lösung abzusetzen, wodurch die Lichtstreuung zu einer Zeit herabgesetzt wird, zu deransonsten ein Maximum der Lichtstreuung vorliegen sollte. Die beobachtete Lichtstreuung hängt daher sowohl von der Materialmenge wie von ihrem Dispersionszustand innerhalb der Meßzclle ab. Es wäre daher vorz.uziehen. nephelometrische Messungen unter dynamischen Bedingungen durchzuführen, statt zu warten, bis die Reaktion vollständig abgelaufen ist.

Statt vollständigen Abschluß der Reaktion abzuwarten, bevor das nephelometrische Signal gemessen wird, kann man das nephelometrische Signal bereits zu messen beginnen, sobald die Antigen- und Antikörperkomponenten in der Lösung miteinander in Kontakt gebracht werden. In diesem Fall stellt man fest, daß das nephelometrische Signal sich innerhalb einer Zeitspanne, die von einigen Minuten bis zu einigen Stunden betragen kann, bis zu einem Endwert entwickelt. Während dieser Ablaufentwicklung der Reaktion nimmt das lijphelometnsche Signal die Form einer Sigma-Kurve an. d. h es beginnt bei einem relativ niedrigen Wert, wachst progressiv mit beschleunigter Geschwindigkeit, bis es in einem bestimmten Zeitpunkt einen Wendepunkt aufweist, wonach die Änderungsgeschwindigkeit wieder abnimmt und das nephelometrische Signal sich schließlich asymptotisch seinem Endwert nähert, wie in F i g. 2 veranschaulicht. Die erste Ableitung des nephelometrischen Signals als Funktion der Zeit entspricht daher einer Gauß"schen Kurve, gemäß Fig. 3. Sie besitzt eine Maximal- oder Spitzenwert beim Wendepunkt, wonach das ansteigende nephelometrische Signal sodann sich seinem asymptotischen Wert anzunähern beginnt. Es wurde festgestellt, daß die Änderungsgeschwindigkeit des nephelometrischen Signals im Wendepunkt in direkter Beziehung zu dem asymptotischen Endwert des nephelometrischen Signals steht. Es ist daher möglich, den Betrag der Immuno-Präzipitinreaktion quantitativ durch Messung der Zeit-Ableitung des nephelometrischen Signais und quantitative Bestimmung des Maximumwerts des so gewonnenen Geschwindigkeitssignals zu ermitteln. Unter geeigneten Bedingungen erhält man einen Maximalwert der Änderungsgeschwindigkeit innerhalb von 10 bis 40 Sekunden nach der Einbringung des auslösenden Reagens (Antigen oder Antikörper) in das Reaktionsgemisch.

Die Heranziehung der Änderungsgeschwindigkeit (»rate of change«) des nephelometn .chen Signals bei der quantitativen Bestimmung bestimmter Protein-Antigcne in Blutsera ist in den nachstehenden Veröffentlichungen angesprochen worden:

(1) Specific Protein Analysis by Light-Scatter Measurement with a Miniature Centrifugal Fast Analyzer. T. O. Tiffany, J. M. Parella. W. F. Johnson und CA. Burtis, Clinical Chemistry, Vol.20. No. 8 (1974), S. 1055;

(2) Kinetics of the IgG Anti-lgG Reaction, as Evaluated by Conventional and Stopped-Flow-Nephelometry, John Savory, Gregory Buffone und Richard Reich, Clinical Chemistry, Vol.20, No. 8 (1974), S. 1071;

(3) LIsc of a Laser-Equipped Centrifugal Analyzer for Kinetic Measurement of Serum IgG, Gregory j. Buffone, juini SavOfy und R. L. C ross. Clinical Chemistry. Vol. 20, No. IO (1974), S. 1320 und

(4) Evalution of Kinetic Light Scattering as an Approach to the Measurement of Specific Proteins with the Centrifugal Analyzer. I. Methodology. Gregory J. Buffone, John Savory, R. E. Cross und J.E. Hammond, Clinical Chemistry. Vol.21, No. 12 (1975). S. 1731.

Bei der Beurteilung dieses Standes der Technik muß

3n jedoch jeweils sorgfältig darauf geachtet werden, in welcher Weise der betreffende Autor den Ausdruck »rate« verwendet. Insbesondere wird der Ausdruck »rate« in bezug auf das nephelometrische Signal häufig einfach anstelle von Intensität verwendet; in dieser Hinsicht ist

J5 zu beachten, daß die momentane Geschwindigkeit der Niederschlagsbildung in direkter Beziehung zur jeweiligen Niederschlagsmenge und damit zur jeweiligen Intensität des nephelometrischen Signals steht. Dieser uneigentliche oder ungenaue Gebrauch der Bezeich-

4n nung »rate« zur Bezeichnung der Intensität ist beispielsweise in den vorstehend genannten Veröffentlichungen 2, 3 und 4 allgemein üblich. So trägt beispielsweise in der Veröffentlichung (2) auf S. 1074, Fig. 7 die Bezeichnung »rate of change of light scattering in polyethylene glycol«. Die Koordinatenachsen der graphischen Darstellung dieser Zeichnungsfigur sind jedoch mit »relative Intensität« und »Zeit« bezeichnet und die Kurve selbst entspricht dem für das nephelometrische Intensitätssignal charakteristischen

so klassischen sigmaförmigen Kurvenverlauf. Demgegenüber ist in der Veröffentlichung (1) die Bezeichnung »rate« in ihrem eigentlichen richtigen Sinn, nämlich für die Änderungsgeschwindigkeit des nephelometrischen Signals in Abhängigkeit von der Zeit verwendet. In die ser Weise wird auch nachfolgend die Bezeichnung »Geschwindigkeit« bzw. Änderungsgeschwindigkeit im Zusammenhang mit der Beschreibung der erfindungsgemäßen Bestimmung des Vorliegens eines Antikörperoder Antigenüberschußzustands bei der immunone- phelometrischen Analyse verwendet

Das Fehlen eines derartigen Verfahrens zur Bestimmung bzw. Diskrimination zwischen einem Antikörperbzw. Antigenüberschußzustands wird in der Veröffentlichung (2) erwähnt, wo es heißt »die Bestimmung des Antigenüberschusses ist auch ein wichtiger Faktor in allen Tmmunoanalyseverfahren. Möglicherweise könnte ein Zentrifugalanalysiersystem dazu verwendet werden, frühzeitig Änderungen der Reaktionsge-

schwindigkeitzu überwachen und ein Mittel liefern, mit dem niedrige Antigenkonzentrationen von sehr hohen Antigenkonzentrationen unterschieden werden können, wie dies in F i g. 4 zu sehen ist«. Der Nachweis von Antigenüberschuß und des üleichgewichtsgebietes stellt ein noch schwieriges Problem dar, da dies aus den w. o. genannten Gründen der wirklich interessierende Bereich in Immunoanalyseverfahren ist, wie im einzelnen im folgenden noch beschrieben wird. Dabei wird sich zeigen, daß für einfache Überschußsituationen im in Gegensatz zu Situationen hohen Überschusses ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung bzw. Diskrimination des jeweiligen Antikörper/Antigenüberschusses benötigt wird, bevor eine wirkliche Geschwindigkeitsanalyse eines nephelometrischen Signals nutzbringend im Sinn eines wirklich kinetischen Verfahrens für die Bestimmung von Proteinkonzentrationen verwendet werden kann.

Bisher wurde die Anderungsgeschwindigkeit eines nepheiometriscnen Signals duicii pcinjdiscncn Abgriff >o des nephelometrischen Signals bestimmt. Insbesondere wurde die maximale Änderung während solcher Abgriffzeiträume durch ein Sampling- und Vergleichsverfahren bestimmt und nach seiner Auffindung wurde dieser Maximalwert und der nächst niedrige Wert zur >s Berechnung einer in direkter Beziehung zu der Endproteinkonzentration stehenden Neigungs- oder Geschwindigkeitslinie verwendet. Die Genauigkeit eines solchen Verfahrens hängt natürlich von der Abgriffsfrequenz (»sampling frequency«) ab. Je kürzer κ> dieser Zeitraum, d. h. die Abgriffsintervalle, umso grosser ist die Wahrscheinlichkeit, daß der Meßabgriff gerade zu dem Zeitpunkt erfolgt, in dem die Anderungsgeschwindigkeit des nephelometrischen Signals ein Maximum annimmt. Unter solchen Umständen η wird wahrscheinlich ein einigermaßen genauer Näherungswert des Maximums der Anderungsgeschwindigkeit erreicht. Jedoch besteht bei derartigen Wahrscheinlichkeitsverfahren auch eine erhebliche Gefahr von Irrtümern und ungenauer Bestimmungen der Proteinkonzentration. Darüber hinaus liefern die bisher verwendeten Verfahren nur eine Näherung der bis zum Auftreten des Maximums der Anderungsgeschwindigkeit verstrichenen Zeit und sind daher ziemlich ungenau bei der Bestimmung des Antigenüberschusses. Daher sind die bisher bekannten Verfahren auch wenn die maximale Anderungsgeschwindigkeit bestimmt wurde, ungenau bei der Bestimmung, welcher der beiden möglichen zugehörigen Konzentrationswerte vorliegt.

Die Erfindung geht somit aus von einem kinetischen Verfahren zur immuno-nephelometrischen Probenanalyse, bei welchem ein der Anderungsgeschwindigkeit (ersten Zeitableitung) des nephelometrischen Primärsignals (Streulichtsignals) proportionales Signal gebildet und dessen Maximum bestimmt wird, das ein gewisses Maß für die gesuchte Konzentration der (bzw. eines der) Reaktanten der Antikörper/Antigen-Präzipitin-Reaktion bildet.

Ein derartiges kinetisches Verfahren, auf welches sich die Erfindung bezieht, steht im Gegensatz zu den statio- so nären Verfahren mit Messung der sich nach Einstellung des stationären Gleichgewichtszustandes ergebenden Streulichtintensität (entsprechend dem asymptotischen Kurvenast am rechten oberen Ende der Intensitätsdarstellung des nephelometrischen Signals in Fig. 2 der Anmeldezeichnung). Derartige Messungen im stationären Gleichgewichtszustand haben den Nachteil, daß sie außerordentlich langwierig sind, da die Einsteilung des stationären Gleichgewichtszustandes in der Größenordnung von Stunden bis zu Tagen liegen kann. Demgegenüber erfolgt Dei den kinetischen Meßverfahren die Messung im nicht-stationären Zustand des Reaktionsablaufs, d. h. im linken Teil der sigmaförrnigen Kurve gemäß Fig. 2 der Anmeldezeichnung, lange vor Erreichen des stationärer· Gleichgewichtszustandes: eigentlich interessierende Meßgröße ist hierbei die Anderungsgeschwindigkeit des Streulichtsignals; diese Anderungsgeschwindigkeit spiegelt den dynamischen Verlauf der Niederschlagsbildung im Verlauf der über wachten Präzipitin-Antikörper/Antigen-Reaktion wieder. Der Maximumwert dieser Änderungsgeschwindit;-keit, d. h. der Differentialquotient des primären nephelometrischen Signals aus Fig. 2 im Wendepunkt der üblicherweise sigmaförmigen Kurve, bildet ein gewisses Maß für die insgesamt im Verlauf der Reaktion "i erwartende Niederschlagsmenge, die ihrerseits ein NL)Li für die Konzentration des die Reaktion kontrollieronden (ei. π. im jeweiligen Unterschuß vorüegirukn» Reaktanten darstellt. Das kinetische Verfahren gestattet somit eine Bestimmung bzw. Abschätzung einer sich letztlich erst im stationären Gleichgewichtszustand nach langer Zeit einstellenden Größe (insgesamt erzeugte Niederschlagsmenge) durch Messung einer dynamischen Größe (Anderungsgeschwindigkeit des nephelometrischen Signals) in einem vergleichsweise frühen Stadium des gesamten Reaktionsablaufs, und damit mit einem gegenüber den stationären Gleiehcewichtsmessungen größenordnungsmäßig verringertem Zeit-(und Kostenaufwand.

Soweit wie oben dargelegt kinetische immunonephelometrische Verfahren bisher bereits vorgeschlagen oder erwogen wurden, bestand bisher das Problem, daß einem jeweiligen bestimmten Meßwert (Betrag des ermittelten Maximalwerts des Anderungsgeschwindigkeitssignals) zwei mögliche Werte der gesuchten Konzentration des betreffenden Reaktanten entsprechen, wie in Fig. 1 der Anmeldezeichnung veranschaulicht, welche den Verlauf der gebildeten Niederschlagsmenge in Abhängigkeit von der Konzentration eines Reaktanten zeigt, wobei sich infolge der K urvenfoi τι mit einem aufsteigenden Ast (Antikörperüberschuß) und einem absteigenden Ast (Antigenüberschuß) mit dazwischen befindlichem Äquivalenzbereich die erwähnte Mehrdeutigkeit der Messung ergibt.

Dies stellte für die ansonsten wegen ihrer Schnelligkeit in der praktischen Anwendung vorteilhaften kinetischen Meßverfahren ein wesentliches Handikap dar, das ihren praktischen Anwendungsbereich einschränkte. Die zur eindeutigen Zuordnung des Meßergebnisses erforderliche Bestimmung, ob die Messung im Antikörper- oder im Antigenüberschußbereich erfolgte, machte zusätzliche Meßvorgänge erforderlich, durch welche die Vorteile der kinetischen Verfahren praktisch wieder aufgehoben wurden. (Das Problem der Diskrimination zwischen Antikörper- bzw. Antigenüberschuß besteht selbstverständlich auch für stationäre Gleichgewichtsmessungen, da auch hierbei einem Meßwert (Gesamtniederschlagsbildung im Verlauf der Reaktion) zwei mögliche Konzentrationswerte des gesuchten Reaktanten entsprechen; da jedoch diese stationären Gleichgewichtsmethoden ohnehin außerordentlich zeitaufwendig sind, spielt die zusätzliche Erschwernis durch die erforderliche Bestimmung des jeweiligen Überschußzustandes keine vergleichbare Rolle wie bei den kinetischen Verfahren.) Das mit der Bestimmung des Überschußzustandes

Il

zusammenhängende Problem ist im Stand der Technik in der o.g. Literaturstelle (If auf S. 1060 behandelt; dabei ist, im Rahmen eines insgesamt stationären Verfahrens virgesehen, im stationären Gleichgewichtszustand im System eine kleine Menge AntikörpersubstiiriZ zuzusetzen; war die ursprüngliche Primärrne.,sung (im stationären Gleichgewichtszustand) unter Antikörperüberschußbedingungen erfolgt, so hat die Zugabe einer zusätzlichen kleinen Antikörpermenge keine wahrnehmbare Auswirkung; lag jedoch ein Antigenüberschuß \or, so äußert sich die Zugabe der kleinen Antikörpermenge in einer signifikanten Änderung des nephelometrischen Signals. Dieses Verfahren ist selbstverständlich mit dem grundsätzlichen Nachteil der stationären Gleichgewichtsmessungcn (zeitliche Aul'wen- ι* digkeit) behaftet. Die nachträgliche Bestimmung des Üherschußzustandes ist ebenfalls kein kinetisches Verfahren. In den o. g. weiteren Veröffentlichungen (2) und (3t. bei welchen die Primärmessung nach einem halbkini?tischen Zweinunktverfahren durch Frmittliing clrr μ durchschnittlichen oder mittleren Änderung der streuinteiiiUit (d. h. des nephelometrischen Signals) zwischen zwei festen Zeitpunkten erfolgt, ist ein Verfahren zur Unterscheidung hinsichtlich Antigen- bzw. Antikörperüberschuß nicht angegeben. In der nachfol >i genden Veröffentlichung (4) kommen die Autoren zu der negativen Feststellung, daß mit kinetischen Verfahren eine direkte Bestimmung von Antigenüberschuß nicht möglich ist.

Insgesamt ist somit dem gesamten Stand der Technik sn kein voll-kinetisches Analyseverfahren zu entnehmen, das zu eindeutigen Ergebnissen führt, d. h. außer der Bestimmung des Meßwertes selbst auch eine Bestimmung über den jeweiligen Überschußzustandes gestattet; darüber hinaus ist im Stand der Technik die Mög- j> lichkeil der Überschußzustandsdiskrimination mittels kinetischer Verfahren überhaupt negativ beurteilt.

Der Erfindung liegt daher als Aufgabe die Schaffung eines voll-kinetischen immunonephelometrischen Analyseverfahrens und einer Vorrichtung hierfür to zugrunde, das neben der Bestimmung einer der Reaktantenkonzentration proportionalen Meßgröße (Betrag des Maximums der Änderungsgeschwindigkeit des nephelometrischen Signals) gleichzeitig im Verlauf der kinetischen Messung und ohne zusätzlichen zeitliehen «5 Aufwand die für eine eindeutige Zuordnung des Meßwertes erforderliche Bestimmung bzw. Unterscheidung des jeweiligen Überschußzustandes (Antikörper- oder Antigenüberschuß) gestattet.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist bei einem Verfahren der im Oberbegriff des Anspruchs 1 angegebenen Art gemäß der Erfindung vorgesehen, daß zur Bestimmung des Vorliegens eines Antikörper- oder Antigen-Überschußzustandes während und als Teil des kinetischen Meßverfahrens eint Funktion des Maximumwerts des Änderungsgeschwindigkeitssignals mit einem einen Antikörperüberschußbereich von einem Antigenüberschußbereich diskriminierenden Schwellenwert dieser Funktion verglichen wird.

Der Erfindung liegt somit die grundsätzliche und überraschende Erkenntnis zugrunde, daß bestimmte Funktionen der Meßgröße Maximalwert des Änderungsgeschvvindigkeitssignals ihrerseits je nach dem jeweiligen Überschußzustand charakteristisch unterschiedliche Werte besitzen und daher zur Diskrimination zwischen den verschiedenen Überschußziistäßden herangezogen warder. Vönaen, und daß die Bildung und Überwachung dieser Funktion sev ie Γα." laufende irs-Vergleichsetzung mit einem Diskriminationsschwelienwert uno actu und gleichzeitig mit der kinetischen nephelometrischen Betragsmessung erfolgen können. Auf d'^^ce Weise ki'i-Tsen ^r.!ie Vn-tcile der kinetischen iivrrvmunephelometrischen Analyse voll zum Tragen, bei gleichzeitiger eindeutiger Zuordnung der Meßergebnisse zu der gesuchten Reaktantenkonzcntration.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann als Diskriminatorfunktion die von der Reaktionsauslösung bis zum Auftreten de* Maxima, werts (H) des Ändcrungsgeschwindigkeitssignals verstrichene Zeit (T") dienen; die Funktionsbildung und -überwachung besteht in diesem lall in der Feststellung eines der Reaktionsauslösung zugeordneten Startsignals und in der Zeitmessung von diesem Startsignal bis zum Auftreten des Anderungsgcsi.hwindigkcilsnia.ximums; diese Funktionsbildung und -überwachung 'rinnen in einfacher Weise gleichzeitig mit und während der eigentlichen kinetischen Konzentrationsmessung i'rfplijpn iinrt ςη in ri;i<; kinplisrhf* Cff;;imfverl:ihrv.n integriert werden.

Gemäß :iner vorteilhaften alternativen Ausführungsform kann die zweite Zeitableitung des nt^phclomctrischen Signals (d. h. also die Ableitung der Anderungsgeschwindigkeit) gebildet und auf das Auftreten eines Maximums überwacht werden und als üiskriminatorfunktion eine Funktion des zeitlichen Abstands zwischen dem Auftreten der Maxima des zweiten und des ersten Ableitungssignals sowie des vom Reaktionsbcginn bis zum Auftreten des Maximums der ersten Zeitableitung verstrichenen Zeit dienen und wiederum mit einem entsprechenden Schwellenwert verglichen werden.

Für die praktische Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann gemäß vorteilhaften Ausgestaltungen vorgesehen sein, daß die Funktion (/(//) des Maximumwerts (H) des Anderungsgeschwindigkeitssignals in einem ersten Koordinatensystem aufgezeichnet wir■'. in welches auch der Diskriminations-Schwellwert dieser Funktion eingetragen wird (wobei einem Funktionswert auf der einen Seite des Schwellwerts ein Antigenüberschuß und einem Funktionswert auf der anderen Seite des Schwellwerts ein Antikörperüberschuß entsprechen); ggf. kann die Funktionsdirstellung in ein zweites Koordinatensystem transformiert und auch der zugehörige Schwellenwert in dieses zweite Koordinatensystem transformiert werden, bevor der betreffende Funktionswert mit dem Schwellenwert verglichen wird.

Die Erfindung betrifft auch eine immunonephelometrische Analysevorrichtung zur Durchführung des kinetischen Analyseverfahrens; eine derartige Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 7 kennzeichnet sich dabei erfindungsgemäß durch Schaltmittel zur BiI-dung und Überwachung einer Funktion (/(//)) des Maximumwerts (H) des Änderungsgeschwindigkeitssi·· gnals und zum Vergleich dieser Funktion mit einem vorgegebenen Schwellenwert zur Unterscheidung zwischen dem Vorliegen eines Antikörper- oder Antigenüberschußzustandes.

Im folgenden werden Ausfuhrungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung beschrieben; in dieser zeigt

Fig. 1 eine Kurvendarstellung der gebildeten Nieder-Schlagsmenge als Funktion der Antigen-Konzentration, mit Bereichen^ entsprechend einem Antikörperüberschuß, einem Aquivalenzbereich und einem Antigenübers· nuß.

Fig. 2 eine Kurvendarstellung des nephelometrischen Signals im Verlauf der quantitativen Antigen/ Antikörperbestimmung und der Überschußbestimraung als Funktion der Zeit,

Fig. 3 eine Kurvendarstellung der Änderungsgeschwindigkeit oder der Ableitung des nephelometrischen Signals im Verlauf der quantitativen Antigen/ Antikörperbestimmung und der Überschußbestimmung als Funktion der Zeit,

Fig. 4 ein Blockdiagramm einer bevorzugten erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur quantitativen Antigen/Antikörperbestimmung und zur Überschußbestimmung,

F i g. 5 in vereinfachter Darstellung das in der Vorrichtung nach Fig. 4 verwendete optische System,

Fig. 6 dio in Fig. 2 dargestellte Kurve, jedoch in Überlagerung des nephelometrischen Signals während der Antigen/Antikörperbestimmung und der Überschußbestimmung mit unipolarem Rauschen,

Fig. 7 eine Kurvendarstellung des Maximal- bzw. Spitzenwerts der Änderungsgeschwindigkeit des nephelometrischen Signals, zusammen mit eine; Kurvendarstellung der Zeiten bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeiten während der Antigen/Antikörperbestimmung und der Überschußbestimmung, wobei beide Kurven als Funktion der Antigenkonzentration dargestellt sind,

I i g. 8 eine Kurvendarstellung der Spitzengeschwindigkeit als Funktion der bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit verstrichenen Zeit, für drei Bedingungen für A C/C (wie in Fig. 7 definiert): A C/C = 0, A C/C = 0,1 und A C/C = 0,2,

F i g. 9 eine Kurvendarstellung der Spitzengeschwindigkeit des nephelometrischen Signals als Funktion der bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit verstrichenen Zeit, für einen einzelnen Wert von A C/C 4 0 transformiert auf zwei neue Funktionsvariable um neue Funktions- bzw. Koordinatenachsen, welche gewährleisten, daß das Maximum der parabolischen Spitzengeschwindigkeitskurve auf der vertikalen Achse auftritt,

Fig. 10 die Kurvendarstellung von TIA T als Funktion der Spitzengeschwindigkeit des nephelometrischen Signals, wobei T die Zeit bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit darstellt und Δ T die zeitliche Differenz zwischen der Spitzengeschwindigkeit und der Spitzengeschwindigkeit der zweiten Ableitung des nephelometrischen Signals während der quantitativen Antigen/Antikörperbestimmung und der Überschußbestimmung darstellt,

Fig. 11 eine Kurvendarstellung der Spitzengeschwindigkeit (H) des nephelometrischen Signals als Funktion der Zeit (T) bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit für eine typische Reaktion eines bestimmten Proteins in Serum bei einer Reihe von fixierten Verdünnungen in Salzwasser mit seinem entsprechenden Antikörperreagenz bekannter Konzentration zur Gewinnung einer Kalibrierkurve,

Fig. 12 die Kurvendarstellung aus Fig. 11 in solcher Überlagerung mit einem zweiten Koordinatensystem (WT'), daß eine durch die Parabel gezogene Achse, die auf der Scheitelpunkttangente senkrecht steht, auch senkrecht steht auf der 7" Achse,

Fig. 13 das WT' Achsensystem tier Fig. 12 in eine vertikale Stellung gedreht, wobei der interessierende Schwellwert Γ',/Γ,,,_η>ι eingezeichnet ist,

Fig. 14 das WT' Achsensystem aus Fig. 13 mit solcher Verschiebung der Parabel, daß der Schwellwcrt im Nullpunkt des neuen Koordinatensystems H¹T" auftritt,

F i g. 15 eine Kurvendarstellung mit der in F i g. 11 dargestellten Form für den speziellen Fall einer dritten Komponente aus Serumkomplement (C 3) verdünnt 1: 6 mit einer Pufferlösung aus 0,1 M NaCl + 2% PoIyäthylenglykol,

F i g. 16 eine Kurvendarstellung in der Form der F i g. 13, jedoch abgeleitet von Fig. 15,

ίο F i g. 17 eine Kurvendarstellung der Form gemäß F i g.

11 für den speziellen Fall menschlichen Serums Immu noglobolin G (IgG) verdünnt 1: 8 in einer Pufferlösung aus 0,1 M NaCl + 3% Polyäthylenglykol,

Fig. 18 eine Kurvendarstellung nach Art vonFig. 13,

jedoch abgeleitet von Fig. 17,

F i g. 19 eine Kurvendarstellung der Spitzengeschwindigkeit des nephelometrischen Signals als Funktion der Konzentration von Antigen in Überlagerung mit entsprechenden Werten von TIA T (wie für Fig. 10 defi- niert). Der Schwellwert für die Anzeige des Antikörperüberschussss ist durch die horizontale Linie durch die Kurve in der Nähe des Gleichgewichtes angedeutet Die Kurve gilt für C 3 verdünnt 1:4 in einer Pufferlösung von 0,1 M NaCl + 4% Polyäthylenglykol,

F i g. 20 eine Kurvendarstellung nach Art von F i g. .19, für IgG verdünnt 1: 5 in einer Pufferlösung von 0,15 M NaCl + 4% Polyäthylenglykol,

Fig. 21 ein Blockdiagramm zusätzlicher Schaltungsmittel zu der in Fig. 4 dargestellten Vorrichtung, zur Durchführung eines alternativen Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung.

Die Bildung von Aggregaten, deren Größe für die Streuung von Licht ausreicht durch eine Antigen-Antikörperreaktion, kapji durch eine Reihe von Schritten folgender Art approximiert werden

Ab + Ag 1

AbAg + AbAg

AbAg

(AbAg)₂

(AbAg)₂ + AbAg » ...

In erster Näherung können jedoch die Kettenreaktionsschritte zweiter Ordnung, die nach der anfänglichen Bildung des binären Komplexes auftreten miteinander verbunden werden, wodurch sich ein Modell von der Art ergibt

Ab+ Ag A, AbAg (1)

AbAg Aj P (2)

worin P das Streuprodukt darstellt, Ar ι eine Geschwin digkeitskonstante zweiter Ordnung und A₂ eine

Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster-Ordnunf

darstellt.

Die differentiellen Geschwindigkeitsgleichungen aul

der Basis dieses vereinfachten Mechanismus zeiger dann die Form

d(Ab)/df = -A₁(Ab)(Ag) = d(Ag)/di (3) d(AbAg)/df= A₁(Ab)(Ag)-A₂(AbAg) (4)

d(P)/dr = A₂(AbAg)

Nimmt man an, daß sich das System in einem mittle

ren Antikörperüberschuß befindet, so ist die Konzen tration der Antikörper (Ab) eine Konstante und dii

Integration von (3) führt /u der Antigcnkonzcntratioi

(Ag) - (Ag)„e

worin \fc', nun .eine Geschwindigkeitskonstante ,erster Ordnung ist, die sowohl k\ als auch die Autikörperkonzentration (Ab).·enthält Die Antigenkonzentration nimmt daher [mit der Zeit ausgehend von seinem Anfangswert (Ag)₀ exponentiell ab. .. , . .

Die Konzentration des Antigen-Antikörperkomplexes (AgAb) erhält man unter der Annahme, daß seine Konzentration zur Zeit / = 0 Null ist

(AbAg)

(A₃ -

(T)

und die Konzentration des Komplexes beginnt bei Null, steigt auf ein Maximum und fällt dann auf eine Konzentration von Null nach langer Zeit ab.

Die Stöchiometrie verlangt nun, daß die drei Geschwindigkeitsausdrücke in den Gleichungen (3) bis (5) sich zu Null summieren, d. h.

d(Ag)/d/ + d(AbAg)/d/ + d(P)/dt = 0. (8)

Wir können aios sofort die Konzentration des Streuproduktes P berechnen zu

[P) = (Ag)₀ 1 +

(Jt t - Jt₂)

i'-k\e-**

(9)

d(P)/d/ = (Ag)₀

ΑΊΑ::

* Ί' —_e-* 2'

(10)

ι d(/')/d λ,...,) = (Ag)₀

A', A ^

A< - A-

* Ί'-ΠΟΛ

a- - a;

A,

= (Ag)_nA-Ie

(ID (12) =16

die der charakteristischen sigmaförmigen Kurve entspricht die bei der Messung des gestreuten Lichtes bei Präzipitinreaktionen erhalten wurde.

Interessanter jedoch ist der Geschwindigkeitsausdruck für die Bildung des Streuproduktes, den man aus Gleichung (5) erhält

Die Bildung dieses Produktes ist zuerst langsam während der Einführungsperiode. Die Dauer dieser Einführungsperiode, die man als die Zeit bis zum Erreichen des Wendepunktes der Kurve für P in Abhängigkeit von / definiert, ist wie leicht einzusehen, gleich der Zeit die (AbAg) benötigt, um sein Maximum zu erreichen, da Tür

d^;(P)/d/^: = 0, d(AbAg)/dr - 0

sich aus Gleichung (5) ergibt. Man muß jedoch beachten, daß die Geschwindigkeilskurvcnampiitude eine Funktion der anfänglichen Antigenkonzentration (Ag)_n ist. Ferner is! die Spitzengeschwindigkeit gegeben durch

■η

worin /...„, die Zeit ist, bei der die Spitzengeschwindigkeit auftritt. Man sieht also, daß die Spitzengeschwindigkeit der Anfangs-Anligenkonzentration proportional ist, wie man experimentell in erster Näherung festgestellt hat. Fig. 2 ist eine Darstellung der Konzentrationen von Antigen (Ag) des Antigen-Antikörperkomplc.xcs (AhAg) und des Produktes /'.wie man es aus den Gleichungen 16). (7) und (9) erhält. Aus den Fig. 2 und 3 zusammen betrachtet, ersieht man. daß die Spitzengeschwindigkeit, die der Konzentration des Antigen-Antikörperkomplexcs (AbAg) proportional ist am Wendepunkt der Produktkonzentrationskurve auftritt.

Die obige Behandlung liefert nur eine angenäherte Darstelluiia des Verhalten^ dieses komplexen Reak-

üonssystems. Sp zeigt d, ie tnaximaje Geschwindigkeit unter mittleren Antikörperüberschußbedingungen einen angenähert linearen Anstieg mit der Antigenkonzentration. Die tatsächliche Abhängigkeit bei extremen Antikörperüberschuß ist jedoch eher fas,t quadratisch. Das rührt dsber,daß die Vereinfachung der Gleichung (2) unter diesen Bedingungen nicht aufrechtzuerhalten ist, bei denen derMechanismus des Aufbaus von Streuzentren hydrophobische Zwischenwirkungen kleinerer Gilter erfordert Diese vereinfachte Behandlung eignet sich nicht zur Behandlung der Bereiche in der Nähe der Gleichwertigkeit oder für den Antigenüberschuß, in denen die Annahme einer konstanten Antikörperkonzentration nicht länger anwendbar ist

Die vorliegende Erfindung basiert auf dem'Prinzip, daß das Maximum der Änderungsgeschwindigkeit eines nephelometrischen Signals, das von dem durch eine niederschlagsbildende Antigen-AntikUtperreaktion gestreute Licht erzeugt wird, direkt proportional ist dem nephelometrischen Endsignal innerhalb eines vernünftigen Bereiches von Antigenkonzentrationen und was noch wichtiger ist, daß die Spitzengeschwindigkeit monoton ansteigt und angenähert linear proportional ist mit der Antigenkonzentration innerhüb eines gewissen K onzentrationsbereiches. In der Tat ist innerhalb dieses Bereiches Rate_m„ = AT(Ag), worin K eine Konstante und (Ag) die Antigenkonzentration darstellt. Man hat ferner gefunden, daß die genaue Zeit zu der die Spitzenänderungsgeschwindigkeit des nephelometrisehen Signals nach dem Beginn der Reaktion der Antigen und Antikörperlösungen auftritt kennzeichnend ist dafür, welcher der beiden Reaktionspartner im Überschuß vorliegt Das heißt die Antigenüberschußsituation kann von der Antikörperüberschußsituation dadurch unterschieden werden, daß die Eigenschaften der Daten, wie der exakten Zeit, zu der die Spitzengeschwindigkeit nach dem Reaktionsbeginn auftritt, beobachtet werden. Daher liefert eine einzige gleichzeitige Messung der Spitzengeschwindigkeit und des Zeitintervalls zwischen dem Reaktionsbeginn bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit sowohl einen Wert für die Antigenkonzentration als auch ein Kennzeichen dafür, ob dieser Wert einer Antigenüberschuß- oder Antikörperüberschußsituation entspricht wodurch die durch die in Figur 1 dargestellte Präzipitinkurve hervorgerufene Doppeldeutigkeit beseitigt wird.

Die durch die vorliegende Erfindung erzielten Vorteile liegen auf der Hand. Erstens, ist die Bestimmung schnell und kann üblicherweise in einer Zeit von weniger als 60 Sekunden vollendet werden. Diese Zeit ist zu vergleichen mit Endpunktbestimmungen, die Zeiten im Bereich zwischen einigen Minuten und einigen Stunden erfordern. Zweitens, erhält man eine eindeutige Bestimmung, bei der die Antikörperüberschußsituation leicht von der Antigenüberschußsituation unterschieden werden kann. Auch kann die Bestimmung auf Grund ihrer Schnelligkeit in einer diskreten Zelle durchgeführt werden, statt in einem Fließsystem oder einem Schubsystem, das die vollständige Reaktion der Probe gestattet. Die Erfindung liefert also ein Gesc'hwindigkeitsverfahren zur Bestimmung eines bestimmten niederschlagsbildenden Antigens, das einfach, genau und schnell arbeitet.

I"ig. 4 zeigt ein Blockdiagramm eines Systems zur Durchführung der vorliegenden Erfindung. In I ig. 4 sind die optischen Pfade durch Pfeile mit unterbrochenen Linien gekennzeichnet und die elektrischen Pfade durch Pfeile mit durchgezogenen Linien. Das System

verwendet eine Probenzelle 10, eine Lichtquelle 12 in Verbindung mit einer optischen Vorrichtung 14 richtet einen wohl definierten Lichtstrahl 16 durch die Probenzelle 10. Ein faseroptisches Koppelglied 18 oder eine andere lichtsammelnde optische Vorrichtung, die die Beobachtung des unter einem bestimmten Winkel von dem Lichtpfad durch die Probe gestreuten Lichtes gestattet, ist mit der Probenzelle 10 verbunden. Pufferlösungen und andere notwendige Standardbestandteile der Reaktion mit Ausnahme der Probe können der Probenzelle 10 automatisch zugeführt werden, gegebenenfalls mit Hilfe einer nicht gezeigten Pumpe oder dgl. während die Probenzelle in gleicher Weise mit Hilfe einer ebenfalls nicht gezeigten zweiten Pumpe automatisch entleert werden kann. Die zu untersuchende Antigenprobe (oder ihr entsprechender Antikörper, wenn dieser Weg gewählt wird) wird in die Zelle 10 eingeführt, um die Reaktion mit der vorher in vorherbestimmten gemessenen Mengen in Zelle 10 gepumpten Lösung zu begjmen. Ein Photozellenverstärker (Photomultiplier) 20 ist mit dem anderen Ende des faseroptischen Koppelgliedes 18 verbunden und empfängt das gestreute Licht und erzeugt ein hierzu proportionales elektrisches Signal (nephelometrisches Signal). Ein Synchronverstärker 22 ist mit dem Photozellenverstärker 20 zur Verstärkung des nephelometrischen Signals verbunden. Das verstärkte nephelometrische Signal wird dann einem Signalformer 24 zugeführt, der solche Teile des Signals entfernt, die durch Streulicht hervorgerufen wurden, die nich auf der Bildung der Streuzentren auf Grund der Antikörper-Antigenreaktion beruhen (im folgenden als Rauschen bezeichnet). Das geformte nephelometrische SigL^al wird dann einem Geschwindigkeitsverstärkes Id zugeführt, der ein Signal liefert, das der Änderung»; ischwindigkeit des nephelometrischen Signals entspricht Der Ausgang des Geschwindigkeitsverstärkers 26 wird mit dem Spitzengeschwindigkeitssucher 28 verbunden, der das Geschwindigkeitssignal des Geschwindigkeitsverstärkers 26 überwacht und seinen Maximalwert oder Spitzenwert sucht, der dann gespeichert wird. Eine erste Ausgangsanzeige 30, die mit dem Spitzengeschwindigkeitssucher 28 verbunden ist, zeigt die gemessene Spitzengeschwindigkeit an. Sie kann aus einem konventioneilen digitalen Schalttafelmeßgerät bestehen. Weiterhin enthält das System einen Auslöser 32, der die Funktion einer Zeitschaltung 34 steuert, um die Zeit zwischen Reaktionsbeginn und dem Auftreten der Spitzengeschwindigkeit zu messen, die durch ein Eingangssignal von dem Spitzengeschwindigkeitssucher 28 angezeigt wird. Eine zweite Ausgangsanzeige 36 ist mit der Zeitschaltung 34 verbunden und zeigt die genannte Zeit an.

Der optische Teil des Systems ist im einzelnen in F i g. 5 dargestellt. Er umfaßt eine Wolframlampe mit Filier 12', eine Reihe von Kondensorlinsen 38 und einen optischen Zerhacker 40, die alle konventionell aufgebaut sind. Der optische Zerhacker 40 arbeitet auf der gleichen Bezugsfrequenz wie der Synchronverstärker 22 und verhindert mit diesem zusammen äußere Lichtinterferenzen. Der von der Wölffäffilämpe 12' und den Kondensorlinsen 38 erzeugte Lichtstrahl 16 kann durch ein Paar zueinander ausgerichteter Öffnungen oder Fenster in gegenüberliegenden Wänden der Probenzelle 10 durch die Proben?elle hindurchtreten. Beim Auftreten auf die Streuzentren, die durch die .•Vitikörper-Antigenreaklion in der Zelle 10 erzeugt werden, wird I icht gestreut und vorzugsweise durch ein faseroptisches Koppelglied 18', das in die Zelle unter einem dem Pfad des in die Zelle einfallenden Lichtes abgewandten Winkel eingeführt ist, aufgenommen.

Der Winkel unter dem das Streulicht mit Hilfe des faseroptischen Koppelgliedes beobachtet wird, sollte optimal gewählt werden, um das Signal/Rausch-Verhältnis möglichst groß zu machen. Die Größe des bevorzugten Winkels hängt von der Konfiguration der Zelle 10 ab und muß fürjede voneinander abweichende Zellkonfiguration unabhängig bestimmt werden, um das Signal/Rausch-Verhältnis möglichst groß zu machen. Hierbei ist das Signal das nephelometrische Signal, das man mit Hilfe des Streulichtes aus den bei der Reaktion gebildeten Streuzentren erhält. Das Rauschen ist das in dem Photozellenverstärker 20 erzeugte Signal, das von den Wänden der Probenzelle 10 gestreut wird oder Licht von anderen Streulichtquellen im System. Bei der Wahl eines optimalen Winkels für die Überwachung des gestreuten Lichtes sollte eine zweite Betrachtung angestellt werden, nämlich daß die Größe des nephelometrischen Signals (von dem gestreuten Licht, das vom faseroptischen Koppelglied IS aufgenommen wird) als Funktion des Winkels des faseroptischen Kopplers 18 gegenüber der Probenzelle 10 (Beobachtungswinkel) auf Grund der Änderung der Teilchengröße als Funktion der Zeit während der Immunopräzipitinreaktion vaiiert. Vorzugsweise wird, wie eben gesagt, als Lichtquelle 12 eine Wolframlampe 12' verwendet Wie in F i g. 5 dargestellt, wird sie in Verbindung mit einem Breitbandfilter 42 verwendet, das den Wellenlängenbereich zwischen 400 und SOO nm selektiert im Gegensatz zu einer Lichtquelle, wie z. B. ein Heliumneonlaser, die Licht einer einzelnen Wellenlänge aussendet. Obwohl auch eine solche Lichtquelle verwendet werden kann, wird eine Wolframlampe 12' bevorzugt, weil die Beobachtung in einem breiten Wellenlängenband der bei einer einzelnen Wellenlänge überlegen ist. Insbesondere ändern sich die Teilchengrößen während der Bildung des Niederschlages, was dazu führt, daß die Streuung die Streufunktion bei einer einzelnen Wellenlänge regellos schwankt, während die durchschnittliche Teilchenstreuungsfunktion innerhalb eines Wellenlängenbereiches relativ konstant bleibt. Das nephelometrische Signal, das über ein breites Lichtwellenband gewonnen wurde, neigt daher dazu, weniger mit Rauschen behaftet zu sein und stabiler zu sein als das unter Verwendung einer Lichtquelle einer einzelnen Wellenlänge gewonnene, wie es z. B. durch einen kleinen Laser geliefert wird.

Vorzugsweise sollte das Streulicht auch von kurzer Wellenlänge sein, beispielsweise in dem blauen und grünen Bereich des Spektrums, da die Größe oder Stärke des an den Streuzentren gestreuten Lichtes mit der vierten Potenz der Frequenz der beleuchteten Lichtquelle ansteigt. Die Verwendung kürzerer Wellenlängen oder höherer Frequenzen gestattet somit die Verwendung weniger empfindlicher und damit billigerer Photozellenverstärker.

Wie oben dargestellt, erfolgt der Nachweis des gestreuten Lichtes mit Hilfe eines Photozellenverstärkers 20, der mit dem faseroptischen Koppelglied 18' verbunden ist, um das unter einem Winkel zu dem Lichtstrahl 16 gestreute Licht zu beobachten. Der Photozellenverstärkcr 20 wandelt das durch das faseroptische Koppelglied 18' beobachtete Licht in ein elektronisches Signal um, das dann, wie in Fig. 4 dargestellt, durch den Synchronverstärker 22 verstärkt wird. Der

Synchronverstärker 22 ist konventionell aufgebaut und spricht nur auf Signale der gleichen Phase an, wie der optische Zerhacker 40. Wie dargestellt, besteht eine Bezugssignalverbindung 41 zwischen dem optischen Zerhacker 40 und dem Synchronverstärker 22, um sicherzustellen, daß der Synchronverstärker mit dem optischen Zerhacker 40 synchronisiert ist Der Synchronverstärker 22 spricht daher nur auf solche Lichtsignale an, die mit einer Frequenz auftreten, die identisch ist mit derjenigen, mit der der optische Zerhacker 14 das Licht durch die ZeUe 10 zerhackt Diese Technik ist wohl bekannt und bildet kein Teil der vorliegenden Erfindung. Das Zerhacken in Verbindung mit dem Synchronverstärker 22 trennt das gewünschte Signal vondem Rauschen, das vom Zimmerlicht oder anderen äußeren Lichtquellen herrührt Dies ist besonders wichtig, um den Gebrauch der vorliegenden Erfindung in einem beleuchteten Laboratorium zu gestatten, ohne daß lästige und teure Lichtsperren in die Zelle eingebaut werden müssen.

Die vorherrschende RauschqueUe des Systems ist die Streuung an anderen Gegenständen als den Streuzentren der Immunopräzipitinreaktion (beispielsweise Staub oder Luftblasen in der Probenzelle). Man hat hier festgestellt, daß das von dem Verstärker 22 kommende Signal aus dem gewünschten nephelometnschen Signal und einer Reihe unipolarer Rauschspitzen besteht, die in der in F i g. 6 dargestellten Weise überlagert sind. Da solche äußeren Streuteilchen in der Zelle dazu tendieren, die Größe des nephelometrischen Signals zu erhöhen, ist es wünschenswert, ihre Wirkung zu beseitigen statt zur Erzielung eines Mittelwertes über eine gewisse Zeit zu integrieren. Im vorliegenden Fall wird dies ganz einfach mit Hilfe eines »bottom follower« erreicht In anderen Worten, da das Rauschen der Spitze des Signals überlagert ist, bildet die Basis der Signalkurve oder der kontinuierlich niedrigste Augenblickswert das nephelometrische Signal der Zelle 10. Die erfindungsgemäße elektronische Schaltung enthält daher vorzugsweise den Signalformer 24, der in der Art eines »bottom followers« arbeitet und die auf Grund der Anwesenheit von Staub oder Luftblasen in der Probe vorhandenen Rauschspitzen beseitigt und nur den Teil des elektronischen Signals, der von dem Antikörper-Antigenniederschlag gestreuten Licht herrührt, weiterleitet. Es hat sich weiter ergeben, daß entgegen der üblichen Praxis es zweckmäßig ist, die Lösung in der Piobenzelle 10 ständig, z. B. mit einem Magnetrührer, während der ganzen Reaktionszeit mindestens bis zu dem Zeitpunkt der Feststellung der Höchstgeschwindigkeit umzurühren. Durch das Umrühren der Lösung werden die Luftblasen usw. bewegt so daß ihre Anwesenheit nur eine Reihe scharfer Spitzen erzeugt die durch den Signalformer 24 leicht beseitigt werden können, wodurch man ein genaueres Signal erhält.

Kehrt man nun wiederum zur F i g. 4 zurück, so sieht man, daß das verformte nephelometrische Signal ständig in dem Geschwindigkeitsvers*.ärker 26 differenziert wird, wobei ein Geschwindigkeitsausgangssignal erzeugt wird, das ein Maß ist für die Änderungsgeschwindigkeit des nephelometrischen Signals in bezug auf die Zeit und damit für die Antigenkonzentration gemäß der Formel Rate_max = A^-(Ag). (Bei der quantitativen Bestimmung von Antikörpern würde diese natürlich lauten Rate„,_ax = Af(Ab).) Der Geschwindigkeitsverstärker ist ebenfalls konventionell aufgebaut und liefert das Geschwindigkeibsignal an den Spitzengeschwindiekeitssucher 28. der ebenfalls von konventioneller Bauart ist Der Spitzengeschwindigkeitssucher 28 sucht das Maximum des Geschwindigkeitssignals und erfaßt ein Signal, dessen Wert hierzu proportional ist für die Verwendung durch einen Rechner oder die Anzeige

■> durch ein digitales Schalttafelmeßgerät Ferner stoppt der Spitzengeschwindigkeitssucher 28, sobald er die Spitzengeschwindigkeit feststellt, die Zeitschaltung 34.

Eine zusätzliche Schaltung, die der Vorrichtung der

Fig. 4 hinzugefügt werden kann, um eine bestimmte

in Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens durchzuführen, zeigt F i g. 21. Hierin ist nur der Teil der in F i g. 4 dargestellten Vorrichtung gezeigt, der für die Anschlüsse der zusätzlichen Schaltung erforderlich ist Der Zweck der zusätzlichen Vorrichtung besteht in der

ι ι Bestimmung des Auftretens eines Maximums der zweiten Ableitung des nephelometrischen Signals und in der Bestimmung der Zeitdauer zwischen diesem Maximum dieses Signals der zweiten Ableitung und dem Maximum in dem Signal der ersten Ableitung.

_>n Zu diesem Zweck ist ein zweiter Geschwindigkeitsverstärker 44 mit dem Ausgang de^r. Geschwindigkeitsverstärkers 26 verbunden. Gesch;vii>digkeiisverstärker26 liefert ein Ausgangssignal, das ein Maß der Änderungsgeschwindigkeit des nephelometrischen j Signals in Abhängigkeit von der Zeit ist (die erste Ableitung). Wenn man dieses Signal als Eingangssignal für den zweiten Geschwindigkeitsverstärker 44 verwendet, so ist das Ausgangssignal des Geschwindigkeitsverstärkers 44 ein Maß der Änderungsgeschwindigkeit in

in Abhängigkeit von der Zeit für die ersie Ableitung des nephelometrischen Signals (die zweite Ableitung). Der zwaite Geschwindigkeitsverstärker 44 ist mit einem zweiten Spitzengeschwindigkeitssucher 46 verbunden, der das zweite Ableitungssignal auf das Auftreten eines

r> Maximalwerts überwacht Eine zweite Zeitschaltung 48 ist mit beiden Spitzengeschwindigkeitssuchern 28 und 46 verbunden. Die Zeitschaltung 48 wird durch den Spitzengeschwindigkeitssucher 28 in Gang gesetzt wenn diese ein Maximum der ersten Ableitung des

■"> nephelometrischen Signals feststellt und durch den zweiten Spitzengeschwindigkeitssucher 46 gestoppt wciin diese ein Maximum in der zweiten Ableitung des nephelometrischen Signals feststellt. Eine dritte Ausgangsanzeige 50 ist mit der Zeitschaltung 48 verbun-

^; ί den, um die von der Zeitschaltung 48 berechnete Zeit zwischen den Maxima der ersten und zweiten Ableitungen des nephelometrischen Signals anzuzeigen.

Nicht nur die Bestimmung der Antikörper/Antigen-Konzentration aus dem einzelnen Spitzengeschwindig-

'>" keitswert ist wichtig, sondern auch die Bestimmung des Antigenüberschusses aus dem genauen Zeitpunkt des Auftretens der Spitzengeschwindigkeit Man hat festgestellt, daß die Form der Vorderflanke der Geschwindigkeilr'iurve bei einer Antikörper/Antigenreaktion im

'■>'< Bereich des Antikörperüberschusses unterschiedlich ist von der der Vordej kante der Geschwindigkeitskurve bei Antigenüberschuß. Ferner wurde festgestellt daß dis genaue Zeit zu der die Spitzengeschwindigkeit nach der Auslösung der Antigen-Antikörperreaktion auftritt

hi als Indikator dafür benutzt werden kann, welche der beiden Reaktionsbestandteile Antigen oder Antikörper im Überschuß vorliegt. Es ist daher vorzuziehen, zusätzlich zum Messen und Aufzeichnen der Spitzengeschwindigkeit als Funktion der Konzentration den

^h'· genaue^ 7eitpunkt des Auftretens der Spitzengeschwindigkeit als Funktion der Konzentration aufzuzeichnen.
Fig. 7 zeigt eine Kurve der Spitzengeschwindig-

keil (H) in Abhängigkeit von der Antigenkonzentration (C) Tür eine gegebene Antikörperkonzentration, sowie eine überlagerte Kurve der Zeitdauer bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit (T) in Abhängigkeit von der Konzentration. Beide Kurven sind annähernd parabolisch in einem Bereich in der Nähe der Antikörper/ Antigengleichwertigkeit, wobei diese Gleichwertigkeit definiert wird als das Symmetriezentrum der Spitzengeschwindigkeitskurve und der Ort des Maximums der Spitzengeschwindigkeitskurve. Die Zeitkurve ist gegenüber der Spitzengeschwindigkeitskurve invertiert und hat ihr Minimum in der Nähe des Gleichwertigkeitspunkts der Spitzengeschwindigkeitskurve. Obwohl das Minimum der Zeitkurve mildem Maximum in der Spitzengeschwindigkeitskurve zusammenfallen kann, trifft dies in den meisten Fällen nicht zu. Es wurde festgestellt, daß die relative Lage des Minimums der Zeitkurve in bezug aufden Gleichwertigkeitspunkt der Spitzengeschwindigkeitskurve durch Änderung der Eigenschaften der Reagenzlösungen, beispielsweise das Ionisierungsvermögen, die Ionensorten, die Polyäthylenglykol-Konzentration usw. eingestellt werden kann. Definiert man Δ C als die Differenz der Konzentrationseinheiten zwischen dem Maximum der Spilzengeschwindigkeitskurve und dem Minimum der Zeitkurve, so kann man sehen, daß die beiden Kurven invertiert, aber symmetrisch zueinander sind, wenn A C zu Null wird. Ist Λ C größer als Null, so sind die Kurven asymmetrisch um einen Δ C proportionalen Betrag.

Fig. 8 ist eine Darstellung der Spitzengeschwindigkeit (H) in Abhängigkeit von der Zeit, die bis zu dem Auftreten der Spitzengeschwindigkeit verläuft (T) für die drei Werte ACZC = O, ACzC = OA und A CC - 0,2. Die gerade Linie, die die symmetrischen Bedingungen A CZC = 0 darstellt, ist der Ort aller Punkte für endliche Werte von H und T. Falls Asymmetrie auftritt, so daß A CZC einen positiven Wert annimmt, so entwickelt sich die Darstellung von H in Abhängigkeit von T zu einer Projektion einer Parabel, in die HT Ebene, in der die Pfeile die Richtung der H und T Werte bei steigender Konzentration anzeigen. In diesem Fall entsprechen Konzentrationen mit Antikörnerijberschuß der rechten Seite der geraden Linie, die Jf = O darstellt und solche mit Antigenüberschuß der linken Seite der Zeichnung. Wenn die Asymmetrie nach der entgegengesetzten Seite gerichtet ist, so daß Δ C negative Werte annimmt, tritt das Minimum von T vor dem Gleichwertigkeitspunkt auf und die Ergebnisse sind die gleichen wie in Fig. 8 mit der Ausnahme jedoch, daß die Pfeile umgekehrte Richtung aufweisen und An'^enüberschuß der rechten Seite der Parabelprojektion von H in Abhängigkeit von T entspricht, während Antikörperüberschuß der linken Seite entspricht.

Da durch die vorliegende Erfindung ein Antigen-Antikörperüberschuß aus einer einzigen Bestimmung der Spitzengeschwindigkeit und der Zeit bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit bestimmt werden soll, wäre es erwünscht, wenn man die erhaltene Zeit für die Antigen/Antikörperüberschußbestimmung mit einem einzigen Schwellwert vergleichen könnte. Wie man jedoch aus F i g. 8 erkennt, existiert, wenn H und T als Funktion steigender Konzentration von Antigen aufgezeichnet werden, kein einzelner Zeitwert, bei dem der AntikörperüberschuBkurventei! auf der einen Seite dieses Wertes und der Antigenüberschuß-Kurventeil auf der anderen Seite läge. Die gewünschte Einzelwertbestimmung ist daher schwer durchzuführen. Es wurde jedoch gefunden, daß zur Erreichung der Ziele der vorliegenden Erfindung möglich ist, eine Koordinatentransformation der Daten der Fig. 8 derart duchzuführen, daß ein Einzelwert gewonnen wird mit dessen Hilfe die Antigen/Anlikörperüberschußprobe gemacht werden kann.

In Fig. 9 wurden H und T in zwei neue Variablen J(H, T) und /'(//, T) transformiert, so daß. falls f'(H, T) größer istals eine bestimmte Konstante /O, die

ίο Lösung sich im Bereich des Antikörperüberschusses befindet und, falls /'(//, T) kleiner ist als /O, Antigenüberschuß vorliegt, "ei dem bevorzugten Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung erfolgt die Koordinatentransformation in folgender Weise:

1. Zeichne H in Abhängigkeit von T als nicht vertikale Parabel aus Werten für // und T, die durch die Reaktion von Antigenserum, das in Salzwasser in einer als Kalibrierbasis gedachten Menge verdünnt ist, bei verschiedenen Antigenkonzentrationsniveaus mit dem beabsichtigten Antikörper in einer beliebigen Pufferlösung erhalten wurden. Man erhält hier eine Kurve wie in Fig. 8.

Ziehe eine Linie durch die angenäherte Parabel, die senkrecht zu der Tangente am Scheitelpunkt der Parabel ist, wie dies Fig. II zeigt. Diese Linie stellt die durchzuführende Drehung um den Win-

kelj3 = tan

dar.

3. Drehe die H, Γ-Koordinatenachsen in die neue Stellung //', T'. so daß die Linie des Schrittes (2) wie in Fig. 12 gezeigt auf der 7"-Achse senkrecht steht.

y-> 4. Suche die neuen Koordinaten für die Werte des Schrittes (1) durch die Gleichungen

(13)

7" = T cos β + H sin ^

und

H' = T sin β + H cos/ (14)

Die neuen Koordinatenwerte für T' und H' werden dann auf dem neuen //T'-Koordinatensystem gezeichnet, wobei man die um 90° gegenüber der 7~'-Achse gerichtete Parabel erhält, die Fig. 13 zeigt.

Bestimme den Wert von T' für den H' ein Maximum ist (den Gleichgewichtspunkt), um den Schwellwert zu bestimmen. Die Gleichung der Parabel lautet:

H' = a + bT + c(T')² (15)

Ein Maximum tritt auf für:

ψ = ο = b + 2 er -

(16)

Zur Erleichterung der Prüfung kann der Wert —subtrahiert werden von allen Γ'-Werten, wodurch die Parabel in den Ursprung verschoben wird, so daß Null dei Schwellwert ist Die neue Parabel, die die Werte des Schrittes (1) darstellt, transformiert auf ein neues H'T" _s5 Koordinatensystem, ist in Fig. 14 dargestellt und entspricht der Formel:

H' = a + bT" + c(T")²

(17)

23

21 24 24

worin gilt:

6.

7" = γ'

V 2c J

(18)

stante ( -

Bestimme den Antigenüberschuß für jedes Wertepaar (HT »durch Transformation von T nach T'mit F^'-fe der Gleichungen (13) und (14) des Schrittes (4) und dann nach T" durch Subtraktion der Kon- (- γ- j wie in Schritt (5) dargestellt. Der

Antigenüberschuß wird dann dadurch bestimmt, ob T" größer oder kleiner als Null ist in Abhängigkeit von der ursprünglichen Parabel in Abhängigkeit von T. Weist beispielsweise die Parabel des Schrittes (1) Antigenüberschußpunkte auf der Mn-

Kalibrierdaten

ken Seite der Mittellinie der Parabel auf, dann bestünde ein AntigenüberschuB, falls T kleiner ist als Null. Diese Bedingungen werden durch die Analyse und die Pufferlösungen, wie in den folgenden Beispielen gezeigt, bestimmt.

Beispiel

siehe Figuren 15 und 16, Analyse von C

Kalibrierbedingungen

Pufferlösungen 0,1 M NaCI + 2% Polyäthylenglykol

Antikörper für C 3 in Pufferlösung 1 : 6 verdünnt

Probe ("' 3

Konzentration
(g/l)

1)
2)
3)
4)

6,384

4,80

3,22

2,4

1,6

34,0
69,2
76,7
70,6
48,5

H'

34,2 31,1 30,7 32,8 38,5

28,16	39,15	-3,60
63,40	41,66	-1,09
70,87	42,46	-0,29
64,52	43,57	+0.82
41,79	4i>,69	+2,94

Berechnung

tan =

= 0,16037

76.7
β = 9.11 =
Γ bei Η¹ max = 42,75

Daher gilt:

T" = Γ - 42,75 .

Für Werte T" < 0 liegt Antigenüberschuß vor. Beispiel einer tatsächlichen Serumuntersuchung unter Verwendung der obigen Kalibrierbedingungen:

Kalibrierdaten

Konzentration
(g/l) (berechnet)

T"

0,96

18,8

58,7

60,94 18,19

Hieraus ergibt sich der Schluß, daß die Probe, die 4fi T" > 0 aufweist, sich im Antikörperüberschuß befindet.

Beispiel 2 siehe Figuren 17 und 18, Analyse von IgG

Kalibrierbedingungsn Pufferlösung
aus 0,1 M NaCl + 3% Polyäthylenglkyol

Antikörper

für IgG 1 : 8 in Pufferlösungen verdünnt

Probe IgG H

Konzentration
(g/l)

H'

2)

3)

5)

6)

7)

25,00
20,00
16,67
14,29
12,50
10,00
5,00

37,1
49,7
61,1
62,0
59,0
50,9

37,6 33,6 25,3 27,5 27,5 27,1 34,6 35,73
38,82
52,03
52,31
49,42
41,56
11,87

46,20 45,74 40,82 43,18 42,37 40,30 39,25

3,04

2,58

-2,34

0,02

-0,79

-2,78

-3,91

*) Beachte die Diskussion für das regellose Verhalten des nephelometrischen Signals in der Nähe des Äquivalenipunktes.

Berechnung	Serumprüfung	5	und damit:	>0.
tan - ¹⁶'⁵ - 0,27966	H		T" = Γ - 43,16 .
= 15,62°	115 141	mit		T"
T bei ff' max = 43,16			Antigenüberschuß liegt vor für T"	14,63 -2,23
Beispiel einer tatsächlichen			den obigen Kalibrierbedingungen	der erste
IgG Konzentration (g/l) (berechnet)		2U	T T'
1 33,33 2 3,75	56,8 57,79 39,6 41,93
Schlußfolgerung	T die Zeit bis zu dem Spitzenwert ι

In Probe 1 liegt ein Antigenüberschuß und in Probe 2 ein Antikörperüberschuß vor.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdekkung, daß ein Teil der Geschwindigkeitskurve des nephelometrischen Signals vom Moment der Auslösung der Reaktion bis zu dem Punkt, an dem die Spitzengeschwindigkeit auftritt, Charakteristika aufweist, die mit dem Wert der Spitzengeschwindigkeit und der Zeit bis zu dem Auftreten der Spitzengeschwindigkeit in solcher Weise in Bezug gesetzt werden könne, daß man die Kurve, die bei Antigenüberschuß auftritt, unterscheiden kann von der Kurve, die bei Antikörperüberschuß auftritt Die oben beschriebene Koordinatentransformationstechnik ist nur eine der Techniken, die für die immunophelometrische Analyse ausgehend von dieser Entdeckung entwickelt worden ist. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Erkennung eines Antigen/Antikörperüberschusses durch Analyse des Teils der Geschwindigkeitskurve zwischen Reaktionsbeginn und dem Auftreten der Spitzengeschwindigkeit Zur Ausführung der beschriebenen Entscheidungstechnik können zahlreiche Mittel verwendet werden, die als solche nicht die vorliegende Erfindung bilden. Beispielsweise können die angezeigten von der beschriebenen Vorrichtung gewonnenen Werte als Ausgangspunkt für weitere Berechnungen verwendet werden. Man kann auch elektronische Schaltungen verwenden. Als besonders vorteilhaft hat es sich jedoch erwiesen, einen Digitalrechner mit den Signalausgängen zu verbinden, so daß der Rechner die Werte von H und T übernehmen und die gewünschten Berechnungen durchführen kann.

Eine zweite Technik, die bei der Analyse des angezeigten Teils der Geschwindigkeitskurve angewandt werden kann und wodurch der Antikörper/Antigenüberschuß bestimmt werden kann, wird im Zusammenhang mit Fig. 10 beschrieben. Diese Technik verlangt eine zusätzliche Schaltung zur Gewinnung der zweiten Ableitung des nephelometrischen Signals, d.h. der Änderungsgeschwindigkeit der G eschwindigkeitskurve in Abhängigkeit von der Zeit Bei dieser Technik wird die bis zu der ersten Ableitung verlaufene Zeit in einen neuen Testwert umgewandelt als Funktion einer zweiten Variablen. In diesem Fall ist die zweite Variable die zweite Ableitung des nephelometrischen Signals. In Fig. 10 ist eine Darstellung von TIA T gezeigt (wobei p
zenwert der ersten Ableitung und dem Spitzenwert der zweiten Ableitung darstellt) als Funktion der Spitzengeschwindigkeit. Wie man aus Fig. 10 ersieht stellt der Formunterschied der Geschwindigkeitskurve zwischen dem Bereich des Antikörperüberschusses und dem Bereich des Antigenüberschusses selbst einen Wechsel des Testwertes Tl A T dar, derart, daß, falls TIA T über einen bestimmten Pegel liegt, ein Antikörperüberschuß vorliegt, während, falls TIA T unter diesem Pegel liegt, ein Antigenüberschuß vorliegt. Es ist zu beachten, daß durch Verwendung der letztbeschriebenen Tecnnik der Wert der Spitzengeschwindigkeit (H) nicht in die Bestimmung des Antigen/Antikörperüberschusses, wie bei der vorher beschriebenen Koordinatentransformationstechnik, eingeht. Bei der die zweite Ableitung verwendenden Technik wird der Antikörper/Antigenüberschuß eine Funktion der Zeit allein. Wie bei der Techno nik, die nur die erste Ableitung verwendet wird die Kalibrierung zuerst nur dazu verwendet den Schwellwert unter bekannten festen Bedingungc zu bestimmen. Nach dessen Bestimmung wird der Schwellwert dazu benutzt, den Antikörper/Antigenüberschuß in

"5 Testsera zu bestimmen, die unter den gleichen festen Bestimmungen zur Reaktion gebracht werden.

Ein erstes Beispiel für die Kalibrierungstechnik für C 3 wird in Verbindung mit F i g. 19 beschrieben. In diesem Fall war C 3 Antikörper in 0,1 M NaCl + 4% PoIyäthylenglykol Pufferlösung enthalten. Die Antikörperverdünnung in Salzwasser betrug 1 :4. Die Spitzenwerte des nephelometrischen Signals, die bei verschiedenen C 3 Konzentrationen beobachtet wurden, werden durch große Punkte dargestellt, durch die die Spitzengeschwindigkeitskurve gezogen wurde. Dies erfolgt sehr einfach wie im vorliegenden Fall durch Verwendung eines programmierten Rechners in Verbindung mit einer Koordinatenzeichenmaschine, indem die angezeigten Werte eingegeben wurden und die zurDarstellung derartiger Kurven geeignet sind. Der Wert von TIA T berechnet aus den angezeigten Werten von T und A T für jeden Spitzenwertpunkt ist durch ein Kreuz gekennzeichnet, der dem entsprechenden Punkt für die gleiche Konzentration entspricht Wie man in Fig. 19 sieht, so sinkt der Wert von TIA Γ, während die C 3 Konzentration vom Antikörperüberschuß durch ein Gleichgewicht in den Antigenüberschuß übergeht Es ist charakteristisch für eine solche nephelometrische

Analyse, daß die Ablesungen, die im Bereich des Gleichgewichts erhalten werden, unzuverlässig sind (beachte beispielsweise die Daten 3, 4 und 5 im oben beschriebenen Beispiel 2). Bei der quantitativen Bestimmung von Antigen in Sera ist es daher erwünscht, nicht nur die Ablesungen, die sich im deutlichen Antigenüberschußbereich befinden, zu eliminieren, sondern auch jene im Bereich des Gleichgewichtes. Man wählt daher einen Wert als Schwellwert oder Testpunkt des Tesiwertes TIA T wie den, der durch die horizontale Linie für TIA T = 5,2 dargestellt ist, dem ein Spitzengeschwindigkeitswert entspricht, der weit genug im Bereich des Teils der Kurve des Antikörperüberschusses liegt, wobei gilt, daß für Werte TIAT größer als der Schwellwert die Lösung klar im Antikörperüberschußbereich liegt. Beim späteren Gebrauch kann dieser Wert leicht höher eingestellt werden, wenn zufällige Fehlablesungen in der Nähe des Schwellwertes unzeigen, daß der Schwellwert noch als gültig angenommene L^rgctiniSSc ii'i ZU Stäfkci Nähe ücs Giciuiigewichtsteils der Kurve gestattet.

Ii in zweites Beispiel der zum Zweck derSehwellwertbestimmung vorgenommenen Kalibrierung zeigt Fig. 20 unter Verwendung von IgG in 0,15 M NaCI + 4% Poiyäthylenglykol. Die Antikörperverdünnung in Salzwasserbetrug 1 : 5. Wiederum werden die Spitzenwertspunkte des nephelometrischen Signals, die bei verschiedenen Antigenkonzentrationen beobachtet wu.-den, durch große Punkte dargestellt, während die berechneten TIA Γ-Werte durch Kreuze dargestellt werden Das Ku; 'lanpdSsung.j-Rechnerprogramm wai nicht in der Lage eine geeignete Parabel durch die Spitzengeschwindigkeitswerte zu ziehen mit Rücksicht auf die starke Abweichung der Punlf'e für höhere Antigenkonzentrationen. Der interessante Teil der Parabel, der von Hand durch die Punkte gezogen wurde, ist klar

ίο erkennbar und gestattet die Bestimmung eines Schwellwertes für 4,6. Bei der Serumuntersuchung liegt daher für Untersuchungswerte von TIA T über 4,6 eine Lösung im Antikörperüberschuß vor. Fntsprechend zeigt ein Wert von TIA T der kleiner ist als 4,6 an, daß

r> ungeeignete Konzentrationswerte vorliegen, da die Lösung dann entweder im Gleichgewichtsbereich oder im Bereich des Antigenüberschusses liegt.

Man muß verstehen, daß, obwohl der Testwert von TI A T als bevorzugte Zeitfunktion in den vorgenannten

.'Ii AusfünfüügSucispicicfi VcrWciiuci wüluc, die Ailfuiucrungen an die als Testwert zu benutzende Zeitfunktion nur so sein müssen, daß für ansteigende Antigenkonzentrationen ein konstantansteigenderoderabfallender Wert auftreten muß. Man kann auch andere Testwert;:, 2i wie beispielsweise 2 TIA Τ,ΤΙΑ T + 2 usw. zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwenden.

Hierzu 9 Blatt Zeichnungen

Claims

1 Patentansprüche: ίο

1. Kinetisches Verfahren zur immuno-nephelometriscben Analyse einer Probe, bei welchem

(a) in der Probe eine einen Niederschlag bzw. eine Ausfällung bildende Antikörper/Antigen-Präcipitinreaktion ausgelöst,

(b) die Probe mit Lichtstrahlung beaufschlagt,

(c) das an dem durch die Präcipitinreaktion gebildeten Niederschlag gestreute Licht zur Erzeugung eines der Streulichtintensität entsprechenden nephelometrischen Signals gemessen.

(d) ein der ersten Zeit-Ableitung des nephelometrischen Signals entsprechendes Änderungsgeschwindigkeitssignal gebildet, und

(e) der Maximumwert (H) des Änderungsgeschwindigkeitssignals als Maß für die Konzentration emes Reaktanten der Antikörper/Antigenreakiion bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung des Vorliegens eines Antikörper- oder Antigen-Überschußzustandes

(0 während und als Teil des kinetischen Meßverfahrens eine Funktion (J\H)) des Maximumwerts (H) des Änderungsgeschwindigkeitssignals mit einem einen Antikörperüberschußbereich von einem Antigenüberschußbereich dis- so kriminierenden Schwellenwert dieser Funktion verglichen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Beginn der üb rwachten A η ti kör- js per/Antigenreaktion festgestellt, die vom Reaktionsbeginn bis zum Auftreten des Maximumwerts (H) des Änderungsgeschwindigkeitssignals verstreichende Zeit (Γ) gemessen und als Diskriminatorfunktion mit einem vorgegebenen Schwellenwert to verglichen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein der zweiten Zeitabteilung de* nephelometrischen Signals entsprechendes Signal gebildet, daß dieses zweite Ableitungssigna! auf das Auftreten eines Maximumwerts überwacht, daß der zeitliche Abstand (Δ T) zwischen dem Auftreten des Maximumwerts dieses zweiten Ableitungssignals und dem Auftreten (7") des Maximumwerts [H) des ersten Ableitungs- oder Änderungsgeschwindigkeitssignals gemessen und eine Funktion

( -—-) dieser beiden Größen (T) und (A T) als Dis- \ Δ T )

kriminatorfunktion mit einem vorgegebenen « Schwellenwert verglichen wird.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst der Schwellenwert fur die jeweilige zu überwachende Antikörper/Antigenreaktion ermit- ₆., tclt wird.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Schwellenwert auf einen Wert im Bereich zwischen einem eindeutig einem Antikörper- oder „·, Antigenüberschuß entsprechenden Betrag und '■inem dem Glcichgewichtsbereich zwischen Antikörper und Antigen oder dem jeweils entgegengesetzten Überschußbereich entsprechenden Betrag festgelegt wird.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei Feststellung eines Antigenüberschußzustandes die Messung nach entsprechender Verdünnung der Probe zur Erzielung eines Antikörperüberschußzustandes wiederholt wird.

7. Immunonephelometrische Analysevorrinhtung zur Durchführung des kinetischen Analyseverfahrens gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, mit einer Probenzelle zur Durchführung der niederschlagsbildenden Antikörper/ Antigen-Präcipitinreaktion, mit einer Strahlenerzeugungsvorrichtung zur Beaufschlagung der Probenzelle mit der Lichtstrahlung, mit einem auf das von der Probe gestreute Licht ansprechenden lichtelektrischen Detektor zur Erzeugung des der Streulichtintensität entsprechenden nephelometrischen Signals, mit Schaltungsmitteln zur Bildung des der ersten Zeit-Ableitung des nephelometrischen Signais entsprechenden Änderungsgeschwindigkeitssignals, sowie mit einer auf das Änderungsgeschwindigkeitssignal ansprechenden Detektorvorrichtung zur Ermittlung des Maximumwerts (H) des Änderungsgeschwindigkeitssignals, gekennzeichnet durch Schaltnjittel zur Bildung und Überwachung einer Funktion (/(H)) des Maximumwerts (H) des Änderungsgeschwindigkeitssignals und zum Vergleich dieser Funktion mit einem vorgegebenen Schwellenwert zur Unterscheidung zwischen dem Vorliegen eines Antikörper-oder Antigenüberschußzustandes.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Schaltmittel zur Bildung der Diskriminalorfunktion (/(//)) des Maximumwerts (H) des Änderungsgeschwindigkeitssignals eine auf die Auslösung der Antikörper/Antigen-Pracipitinreaktion in der Zelle ansprechende Auslösevorrichtung zur Erzeugung eines Startsignals iowie eine auf das Startsignal der Auslösevorrichtung und das Ausgangssignal der Maximumwert-Detektorvorrichtung ansprechende Zeitmeßvorrichtung zur Bestimmung der zwischen dem Beginn der Antikörper/ Antigen-Reaktion und dem Auftreten des Maximumwerts (H) des Änderungsgeschwindigkeitssignals verstrichenen Zeit (T) als Diskriminatorfunktion (/(//)) aufweisen.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8 zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch eine auf das Änderungsgeschwindigkcitssignal ansprechende Differenziervorrichtung zur Bildung eines der zweiten Zeitableitung des nephelometrischen Signals entsprechenden Signals, durch eine auf dieses zweite Zeitableitungssignal ansprechende Detektorvorrichtung zur Bestimmung eines Maximumwerts dieses zweiten Zeitableitungssignals, sowie durch auf die Ausgangssignale der ersten und der zweiten Maximumwertdetektorschaltung ansprechende Schaltmittel zur Messung der zwischen dem Auftreten des Maximumwerts des zweiten Zeitableitungssignals und dem Auftreten des Maximumwerts (H) des Anderungsgeschwindigkeitssignals verstrichenen Zeit (J T).

10. Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 9, gekennzeichnet durch eine Anzeigevorrichtung für das den Maximumwert (//1 des Änderiingsgeschwindigkeitssignals wiederge-

bende Signal. ·■■■■'-■ ■■ ■■■■■· ..·■..■

11. Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem auf das Streulicht der Probe ansprechenden lichtelektrischen Detektor und den Schalt- s mitteln zur Bildung des der ersten Ableitung des nephelütnetnschen Signds entsprechenden Änderungsgeschwindigkeitssignals Signalformerschaltungmittel zur Beseitigung eines Unipolar-Rauschantcüs aus dem Streulichtsignäl vorgesehen sind.