DE2724723C3

DE2724723C3 - Verfahren und System zur kontrollierten Vereinigung von Komponenten einer chemischen Reaktion

Info

Publication number: DE2724723C3
Application number: DE2724723A
Authority: DE
Inventors: Robert J. Orange Calif. Anderson (V.St.A.)
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1976-06-02
Filing date: 1977-06-01
Publication date: 1981-01-15
Also published as: US4101276A; BE855324A; FR2353857A1; CH620371A5; CA1082594A; JPS5945941B2; DE2724723B2; DE2724723A1; JPS5855449B2; JPS57156544A; GB1563949A; JPS52149195A; SE7706412L; FR2353857B1; SE446230B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontrollierten Vereinigung der Komponenten einer chemischen Reaktion, bei welchem die Reaktionskomponenten zur Ingangsetzung der chemischen Reaktion in eine Reaktionszone zugeführt werden und danach eine charakteristische Größe der Reaktion gemessen wird. Die Erfindung betrifft ferner auch ein elektrochemisches System zur kontrollierten Vereinigung der Komponenten einer chemischen Reaktion nach einem derartigen Verfahren, sowie eine Analysatorvorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens. Die Erfindung eignet sich besonders zur Anwendung auf dem Gebiet der nicht-isotopischen Immunojnalyse (»immunoassay«) zum Nachweis der Komponenten von Antigen-Antikörper-Reaktionen.

Ein bekanntes Verfahren zur Analyse von Antigenen und Antikörpern beruht auf dem Umstand, daß Antigene mit ihren entsprechenden Antikörpern unter Erzeugung e^ner Ausfällung reagieren. Die Menge der in einer derartigen Antigen-Antikörper-Reaktion erzeugten Ausfällung ist proportional entweder der Antikörperkonzentration oder der Antigenkonzentration, je nachdem, welche der Komponenten im Überschuß vorliegt Das heißt, für einen Antigenüberschuß ist die Niederschlagsmenge proportional der Antikörperkonzentration, während umgekehrt bei Antikörperüberschuß die Niederschlagsmenge proportional der Antikörperkonzentration ist. Die erzeugte Niederschlagsmenge wird üblicherweise mit nephelometrischeil Verfahren (Trübungs- bzw, Streuilichtmessungen) bestimmt, indem man die Streuung eines auf die Zone der Antigeri'Ahtikörper*Reaktioh gerichteten Lichtbündels an der Ausfällung mißt. Eine bestimmte Niederschlagsmenge kann jedoch aus den angegebenen Gründen zwei möglichen Werten der Antigenkonzentration entsprechen) je nachdem, ob der Antikörper oder das AnHgen im Oberschuß vorliegt

In der prioritätsgieichen DE-OS 27 24 722, betreffend »Verfahren und Vorrichtung zur immunonephelometrischen Analyse«, ist ein System für die Analyse von Antigenen und Antikörpern beschrieben, bei welchem der Maximumwert der Änderungsgeschwindigkeit des im Verlauf der Bildung des Niederschlags während der Antigen-Antikörper-Reaktion erzeugten Streulichtsignals gemessen wird. Wie dort im einzelnen auseinsJidergesetzt, wurde gefunden, daß der zeitliche Abstand, in welchem diese maximale Änderungsgeschwindigkeit nach dem Beginn der Antigen-Antikörper-Reaktion auftritt eine signifikante Anzeige dafür darstellt, welche der beiden Reaktionskomponenten im Oberschuß vorliegt Mit anderen Worten, ein Zustand mit Antigenüberschuß läßt sich von einem Zustand mit Antikörperüberschuß dadurch unterscheiden, daß man die Zeitdauer nach dem Beginn der Reaktion bis zum Auftreten der maximalen Änderung .eschwindigkeit des Streuüchtsignals beobachtet Die lCsnitnis davon, welche Reaktionskomponente im Oberschuß vorliegt, ermöglicht die richtige Zuordnung der gemessenen Niederschlagsmenge zu dem einen der beiden möglichen Werte der Antigenkonzentration. Zur Messung der Zeitdauer zwischen dem Beginn der Reaktion und der maximalen Änderungsgeschwindigkeit des Streulichtsignals muß zunächst der Zeitpunkt des Reaktionsbeginns festgelegt werden. Dann kann nämlich ein Zeitgeber gleichzeitig mit der Reaktion in Gang gesetzt und so die Zeitdauer bis zum Auftreten der maximalen Änderungsgeschwindigkeit gemessen werden.

Die Notwendigkeit der Bestimmung bzw. Festlegung des Anfanjszeitpunktes einer chemischen Reaktion besteht außer bei der Analyse von Antigenen und Antikörpern auch noch auf anderen Gebieten der chemischen Analyse. So werden beispielsweise bei Messungen der Prothrombinzeit von Blutplasma eine Blutplasmaprobe und ein Gerinnungsmittel miteinander zusammengebracht und die bis zur Gerinnung der Plaspaprobe erforderliche Zeitdauer gemessen, vergleiche beispielsweise die US-Patentschriften 34 50 501 und 35 93 568. Typischerweise wird die Gerinnung mit einem Photodetektor gemessen, der auf an dem Gerinsel während dessen Bildung gestreutes Licht anspricht und in Abhängigkeit hiervon ein elektrisches Signal erzeugt, dessen Betrag eine Anzeige für das Ausmaß der Gerinselbildung darstellt. Offensichtlich ist hierbei zur genauen Messung der verstrichenen Gerinnungszeit zunächst eine Festlegung des Anfangs· punktes der Gerinnungsreaktion erforderlich.

Bei der Analyse von Antigen-Antikörpern-Reaktionen, wie sie in der erwähnten prioritätsgleichen DE-OS 27 24 TIl beschrieben ist, werden die Antigen- und die Antikörper-Reaktionskomponenten jeweils aufeinaii-

■ϊ5 derfolgend von Hand von einem Operator in eine Reaktionszelle pipettiert. Manuelle Pipettierung findet auch bei den Prothrombinzeitbestimmungen gemäß den vorstehenden US Patentschriften 34 50 501 und 35 93 568 Anwendung. In der US-Patentschrift 34 5Ö 501 ist vorgesehen, daß ein Zeitgeber am Beginn der Reaktion mittels eines beim Hineind/iicxen des Pipettenkolbens betätigten Schalters in Gang gesetzt wird. Bei dieser Lösung ist dem Pipettenkolben ein mechanischer Schaltei zugeordnet; wenn der Operator

den Pipettenkolben zum Ausdrucken der Reaktionskomponente aus der Pipette nach unten druck- wird der Schalter geschlossen und hierdurch ein Triggerstromkreis zur Signalisierung des Beginns der Reaktion

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geschlossen. Die manuelle Triggerung mittjls des Schalters mag z'evar für bestimmte Zwecke ausreichen, sie unterliegt jedoch in hohem Ausmaße Fehler^ und Irrtumsmöglicnkeiten des Operators; Falls beispielsweise aus irgendeinem Grund die Pipette leer ist, erfolgt gleichwohl die Ifriggerung beim Herunterdrücken des Pipettcnkolbcrtsi obwohl tatsächlich keinerlei Substanz aus der Pipette liüsgespritzt wird. Falls des weiteren in der Pipette eine¹ fälsche Reaktiöriskoriiporienfe aufgesaugt wurde, erfolgt die Triggerauslösung gleichwohl, wenn diese Komponente in die Reäktionszone ausgespritzt wird. Darüber hinaus kann es möglicherweise zu zufälligen Auslösebetätigungen des Schalters kommen, derart, daß die Triggerschaltung während eines unrichtigen Teil« des Analysezyklus betätigt wird. Um derartige unbeabsichtigte Triggerauslösungen zu vermeiden, muß auf der Schalttafel des Analysators ein »Schärfungsw-Schalter vorgesehen sein, durch den eine triggerung verhindert wird, (aus nicht zuvor der Schärfungsschalter betätigt wurde. Ein derartiger Schärfungsschalter erhöht jedoch die mechanische und funktionsmäßige Komplexität des Systems. Außerdem besteht die Gefahr, daß der Schärfungsschalter beim Einführen der Probe nicht betätigt wird und so die Triggerauslösung nicht funktioniert und die Analyse wiederholt werden muß.

In den oben erwähnten US-Patentschriften 34 50 501 und 35 93 568 ist auch ein zweites Verfahren zur Signalisierung di:s Beginns einer chemischen Reaktion im Zusammenhang der Blutgerinnungsreaktionen angegeben. Bei der Bestimmung von Blutgerinnungszeiten überwacht, wie bereits erwähnt, ein Detektor das von 'dem Gerinsel geütreute Licht und erzeugt ein Signal, das als Anzeige für das Ausmaß der Gerinselbildung dient. In den beiden US-Patenten ist vorgesehen, bei der Einspritzung einer RecHionskomponente in die Reaktionszone eine hierdurch bedingte kleine Störung bzw. Änderung in dem Streulichtsignal nachzuweisen und als Signal für den Beginn der Reaktion zu verwerten. Leider ist diese !Lösung häufig nur schwierig auszuführen. Zum einen ist die kleine Änderung in dem

SfrpiilirhKicrnal kpin ancrpirhpnH hpctanHicrPQ unH

reproduzierbare!! Phänomen. Wichtiger noch, und dies gilt insbesondere: für die nephelometrische Analyse von Antigen-Antikörper-Reaktionen, soll das Streulichtsignal im Idealfall im Zeitpunkt der Zugabe der letzten Reaktionskomponente keine wahrnehmbare Änderung zeigen. Und zwar deshalb, weil bei richtiger Präparierung die Antigen- und Antikörper-Reaktionskomponenten im wesentlichen durchsichtig sind und daher, wenn überhaupt, r? nur eine ganz geringe Lichtstreuung verursachen. Daraus ist ersichtlich, daß das Streulichtsignal kein genaues Maß für den Beginn der Antigen-Antikörper-Reaktäon zu liefern vermag, da dieses Signal sich erst einige Zeit nach dem Beginn der Reaktion, nämlich dann, wenn sich eine Ausfällung zu bilden beginnt w ahrnehmbar verändern wird.

Aus den vorsiehenden Darlegungen ergibt sich, daß ein Bedürfnis nach einem einfachen und zuverlässigen Verfahren und eaier Vorrichtung zur Überwachung der Komponenten einer chemischen Reaktion und zur Signalisierung des Beginns der Reaktion besteht Der Erfindung Hegt daher als Aufgabe die Schaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur Überwachung der Komponenten einer chemischen Reaktion zu Grunde, daß die Signalisierung der Einbringung der Komponenten in eine Reaktionszone und die Signalisierung des Beginns der chemischen Reaktion in besserer

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65 Weise als die bekannten Systeme und ohne deren Nachteile gewährleistet.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist bei eineifi Verfahren der eingangs genannten Art gemäß der Erfindung vorgesehen, daß man zui* Überwachung und Signalisierung des Beginns der chemischen Reaktion vor derefi Ingangsetzung wenigstens der als letztes in die Reäktionszone zügeführten" Reaktionskomponente eine Mafkiersübstanz beifügt, welche gegenüber der über wachten Reaktion chemisch isoliert bzw. inert ist, und daß man die Reäktiortszöne auf das Auftreten der Markiersubstanz überwacht und beim Nachweis der Markiersubstanz ein Signal als Anzeige für den Beginn der chemischen Reaktion erzeugt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann vorgesehen sein, daß als Markiersubstanz eine Fluoreszenzsubstanz, vorzugsweise Oxazin-1 -perchlorat. verwendet wird und daß die Überwachung durch Nachweis des von der Fiuoreszenzsubstanz emittierten Fluoreszenzlichtes als Signal für den Beginn der chemischen Reaktion erfolgt.

Indem nach dem Grundgedanken der Erfindung wenigstens der letzten in die Reaktionszone zugeführten Reaktionskomponente eine gegenüber zu überwachenden Reaktion chemisch isolierte bzw. inerte Markiersubstanz zugesetzt und das Auftreten der Markiersubstanz in der Reaktionszone überwacht und zur Fei.iegung und Anzeige des Reaktionsbeginns ausgewertet wird, wird eine eindeutige, selbsttätige und von den Fehlermöglichkeiten und Ungenauigkeiten der bekannten Verfahren freie Festlegung ues Reaktionsbeginns zuverlässig gewährleistet, ohne daß hierdurch der eigentliche Reaktionsverlauf bzw. dessen Überwachung und Messung beeinträchtigt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren, insbesondere auch in der bevorzugten Ausgestaltung mit der Verwendung einer Fluoreszenzsubstanz als Markiersubstanz, eignet sich insbesondere vorteilhaft zur Anwendung bei Systemen, in welchen eine optische charakteristische Größe der Reaktion, wie etwa das Streulicht gemessen wird, insbesondere bei den eingangs erwähnten immunn-nenhplnmptrUrhen Verfahren zur Antigen-Antikörper-Analyse oder bei den erwähnten Blutgerinnungsmessungen. Bei diesen Anwendungen kann die fluoreszierende Markiersubstanz zweckmäßig so gewählt werden, daß ihre Fluoreszenzemission in einem vom Spektralberaich des Streulichtes getrennten Spektralbereich liegt Da die Markiersubstanz chemisch gegenüber der Reaktion isoliert bzw. inert ist und das von der Markiersubstanz emittierte Fluoreszenzlicht gegenüber dem Spektralbereich des Streulichtes »pektral verschieden ist, wird der Nachweis und die Messung des Streulichts durch die Markiersubstanz in keiner Weise störend beeinträchtigt Gemäß einer Ausgestaltung kann zu mehr als einer Komponente der chemischen Reaktion eine Markiersubstanz zugesetzt werden, wobei Vorrichtungen vorgesehen sind, welche die Reaktionszone auf jede Markiersubstanz überwachen und den Beginn der Reaktion erst dann signalisieren, sobald sämtliche markierten Reaktionskomponenten nachgewiesen sind.

Die Erfindung betrifft auch ein elektrochemisches System zur kontrollierten Vereinigung der Komponenten einer chemischen Reaktion nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, mit einer Reaktionskammer, in die aufeinanderfolgend mehrere Komponenten der chemischen Reaktion zugeführt werden, sowie mit der Kammer zugeordneten Vorrichtungen zur Messung

einer charakteristischen Größe der chemischen Reak* tion; erfindungsgemäß kennzeichnet sich ein derartiges System durch eine wenigstens der letzten in die Kammer zugeführten Keaklionskompönente beigefügten Mafkiersübstanz, welche bezüglich der Reaktion chemisch isoliert bzw. inert ist; durch der ReaktiönskaiTimV? zugeordnete, bezüglich der zu messenden charakteristischen Größe der chemischen Reaktion unempfindliche Vorrichtungen zum Nachweis der Markiersubstanz; sowie durch auf den Nachweis der Markiersubslanz ansprechende Vorrichtungen, welche die Vereinigung der Reaktionskomponenten und damit den Beginn der chemischen Reaktion signalisieren.

Besonders vorteilhaft ist die Ausbildung des erfindungsgemäßen elektrochemischen Systems als nephelometnscher chemischer Analysator für die erwähnten Analysezwecke mit Streulichtmessung; ein derartiger

15 veranschaulicht ferner auch die Ableitung des Fluoreszenzsighals ifi den genannten Zeitpunkten der Einführung der Reaktionskomponenten,

Wie in den Zeichnungsfiguren und speziell in F i g, 1 veranschaulicht, betrifft das gezeigte Ausführungsbeispiel der Erfindung ein chemisches Analysesystem mit einer Probenzelle 10; diese umfaßt einen Block 12 aus einem isolierenden Material niit einer darin befindlichen¹ Vertikalen Bohrung; welche eine Reaktiofiskäfnmef oder -zone Ϊ4 zur Aufnahme von in die Probenzelle iO eingebrachten chemischen Reaktanten definiert. Im unteren Teil ist die Reaktionszone 14 mit einer zylindrischen Glasauskleidung versehen, durch welche Licht in die Reaktionszone 14 hinein und aus dieser heraus zu bzw. von dem Inhalt der Reaktionszone 14 hindurchgelassen wird. Für die nephelometrische Analyse von Antigen- und Antikörper-Reaktionskom-

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Analysator kennzeichnet sich durch eine Reaktionskammer zur Aufnahme der Komponenten der zu überwachenden chemischen Reaktion; durch Anregungsvorrichiungen zur Bestrahlung der Reaktionskammer mit Licht innerhalb eines ersten Spektralbereichs, das an Bestandteilen innerhalb der Reaktionskammer gestreut wird sowie Vorrichtungen zur Messung des Streulichtes als charakteristische Größe der Reaktion für Zwecke der nephelometrischen Analyse; durch eine fluoreszierende Markierungssubstanz in wenigstens einer der Zuletzt in die Reaktionskammer zugeführten Reaktionskomp nenten, weiche chemisch gegenüber der zu überwachenden chemischen Reaktion isoliert bzw. inert ist und Licht in einem zweiten Spektralband absorbiert und Fluoreszenzlicht in einem von dem ersten und dem zweiten Spektralbereich verschiedenen dritten Spektralbereich emittiert; durch der Reaktionskammer zugeordnete bezüglich der Streulichtkenngröße in dem erwähnten Spektralbereich unempfindliche gesonderte Vorrichtungen zum Nachweis der Fluoreszenzemission der fluoreszierenden Markiersubstanz in dem dritten Spektralbereich; sowie durch auf den Nachweis der Markiersubstanz ansprechende Vorrichtungen.

Im folgenden werden Ausführungsbeispiele der Erfindung an Hand der Zeichnung beschrieben, in dieser zeigt

Fig. I in schematischer Schnittansicht im Schnitt längs einer im wesentlichen horizontalen Ebene die Reaktionszelle eines Antigen-Antikörper-Analysesystems und zusätzlich in Blockschaltbildform eine Apparatur zur Signalisierung des Beginns einer Reaktion in der Reaktionszone,

Fig.2 eine graphische Darstellung der optischen Durchlässigkeit in Abhängigkeit von der Wellenlänge zur Veranschaulichung der Bandpaßcharakteristiken der in dem System verwendeten Filter,

Fig.3 eine graphische Darstellung der optischen Ausgangsgröße in Abhängigkeit von der Wellenlänge zur Veranschaulichung der spektralen Trennung zwischen den Ausgangsgrößen der Photomultiplierrohre und der Photodiode in dem System,

Fig.4 eine graphische Darstellung der optischen Absorption und Fluoreszenzemission in Abhängigkeit von der Wellenlänge für eine fluoreszierende Markiersubstanz,

Fig.5 eine graphische Darstellung des Fluoreszenz-

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chung der Änderung des Fluoreszenzsignals in dem der Einführung der ersten und der zweiten Reaktionskomponente entsprechenden jeweiligen Zeitpunkt; die Figur gungssystem 18 auf, mittels welchem ein Lichtbündel durch eine öffnung 20 in dem Isolierblock 12 und durch die Glasauskleidung 16 in die Reaktionszone 14 eingestrahlt werden kann; der Analysator weist ferner ein optisches Nachweissystem 22 zur Messung von durch den Inhalt der Reaktionszone 14 gestreutem Licht auf.

Das Anregungssystem 18 weist eine Lichtquelle 24, wie beispielsweise eine Wolframglühlampe, ein Kollimationslinsensystem 26, welches das von der Lampe kommende Licht kollimiert und auf die Probenzelle 10 richtet, sowie ein Primärfilter 28 zur Filterung des durch die Reaktionszone hindurchtretenden Lichtes auf.

Das Nachweissystem 22 weist einen in einer Bohrung in dem Block 12 angeordneten Lichtleiter 30 auf; das eine Ende des Lichtleiters 30 ist benachbart der Reaktionszone 14 angeordnet und nimmt auffallendes Licht, das durch den Inhalt der Reaktionszone 14 gestreut ist, auf; an seinem entgegengesetzten Ende gibt der Lichtleiter 30 das von ihm aufgenommene und weitergeleitete Licht an einen geeigneten Detektor, wie beispielsweise eine Photomultiplierrohre 32, ab. Ausgangsseitig ist der Photomultiplierer 32 mit einer Meß- und Anzeigeschaltung 34 verbunden, welche in geeigneter Form eine Aufzeichnung des Streulichtsignals liefert. Im Lichtweg zwischen dem Lichtleiter 30 und der Photomultiplierrohre 32 ist ein Sekundärfilter 36 zur Aussonderung der Wellenlängen des Streulichtsignals angeordnet.

Bei der Überwachung bzw. Analyse einer Antigen-Antikörper-Reaktion können die Antigen- und Antikörper-Reaktionskomponenten jeweils einzeln aufeinanderfolgend mittels einer von Hand betätigten Pipette in die Reaktionszone 14 der Probenzelle 10 injiziert bzw. zugeführt werden. Bei Vereinigung der Antigen- und Antikörper-Reaktionskomponenten in der Reaktionszone 14 wird eine chemische Reaktion in Gang gesetzt, welche zur Bildung einer Ausfällung bzw. eines Niederschlags in der Reaktionszone 14 führt Das von der Lampe 24 auf die Reaktionszone 14 gerichtete Licht wird durch die Ausfällung gestreut; dieses Streulicht wird in dem optischen Nachweissysterr 22 gemessen und in ein Signal umgewandelt, das ein Maß für die Menge der erzeugten Ausfällung und damit ein Maß für die interessierenden Reaktionskomponenten darstellt Jedoch kann, wie eingangs dargelegt, die jeweilige Aüsiällungsrnenge rwei möglichen Werten der Antigenkonzentration entsprechen, je nachdem, ob das Antigen oder der Antikörper im Oberschuß vorliegt Ein Antigenüberschuß läßt sich jedoch von einem Antikör-

perÜberschuß durch Messung der Zeitdauer zwischen dem Beginn der Reaktion und der Ausfällungsmessung unterscheiden.

Gemäß dem Grundgedanken der vorliegenden Erfindung ist zumindest mit der letzten in die Reaktionszone 14 zugefühften Reaktionskomponente eine fluoreszierende Markiersubstanz verbunden, und die Reaktionszone wird durch ein Signalisiefsystem 38 auf das Auftreten der Fluoreszenzsubstanz überwacht. Da die Antigen-Antikörper^Reaktion mit der Einführung der letzten Reaktionskomponerlte beginnt, zeigt der Nachweis der Markiersubstanz in der letzten eingeführten Reaktionskomponente gleichzeitig den Zeitpunkt des Beginns der Reaktion an.

Das Signalisiersystem 38 weist ein zwischen der Reaktionszone 14 und einem Photodetektor 42, beispielsweise einer lichtempfindlichen Photodiode, angeordnetes Hochpaßfilter 40 mit unterer Grenzfrequcii/. und langem oberem Durchiaßbereich auf; das von dem Filter 40 durchgelassene Licht wird in der Photodiode 42 nachgewiesen. Das Ausgangssignal des Detektors 42 wird seinerseits einer Triggerschaltung 44 zugeführt, weiche ein Triggersignal zur Auslösung anderer Schaltkomponenten, wie beispielsweise eines Zeitgebers 46, aufweist. Daher spricht bei Einbringung der die fluoreszierende Markiersubstanz enthaltenden Reaktionskomponente in die Reaktionszone der Detektor 42 und die Triggerschaltung 44 auf die Lichtemission der Fluoreszenzsubstanz an und löst hierbei den Zeitgeber 46 im Zeitpunkt des Beginns der Antigen-Antikörper-Reaktion aus.

Die Triggerschaltung 44 kann folgende Teile aufweisen: einen Verstärker 48 zur Verstärkung des Ausgangssignals der Photodiode 42; eine Differenzier- bzw. eine Schwellwertdetektorvorrichtung 50, welche auf das verstärkte Signal anspricht und in Abhängigkeit hiervon rin Impulssignal erzeugt; sowie eine auf das von der Differenzier- oder Schwellwertdetektorschaltung 50 gelieferte Impulssignal ansprechende logische Schaltung 52, welche ein den Zeitgeber 46 in Gang setzendes Triggersignal erzeugt. Anstelle der Differenziervorrichtune50 kann alternativ, wit p-psatrt pinp Srhwpllwprtdptektorschaltung vorgesehen sein, welche der logischen Schaltung 52 ein Ausgangsimpulssignal zuführt, sobald das verstärkte Photodiodenausgangssignal einen vorgegebenen Wert erreicht. Diese verschiedenen Teile der Triggerschaltung sind sämtlich bekannter ArL

Für die gewünschte richtige Wirkungsweise des Signalisiersystems 38 ist es erwünscht, daß das von der fluoreszierenden Markiersubstanz absorbierte und als Fluoreszenz wieder emittierte Licht nicht die Streulichtrnessung für die Analyse der Antigen- oder Antikörper-Reaktionskojnponenten stört Daher sollte die Markiersubstanz in dem für die Messung des Antigen-Antikörper-Streulichtsignals verwendeten Spektralbereich weder Licht absorbieren noch emittieren. Des weiteren ist für eine genaue Messung des von der Markiersubstanz emittierten Lichts erforderlich, daß dieses emittierte Licht in einem von dem für die Anregung der Markiersubstanz verwendeten Spektralband abgetrennten Spektralband nachgewiesen wird. Um dies zu gewährleisten, werden die fluoreszierende Markiersubstanz, das Primärfilter 28, das Sekundärfilter 36 und das Hochpaßfilter 40 mit unterer Grenzfrequenz so gewählt, daß sie drei getrennte Spektralbänder definieren. Das erste Spektralband dient zur Anregung und Messung des von der Ausfällung gestreuten Lichtes. Das zweite Spektralband definiert das Absorptionsband der fluoreszierenden Markiersubstanz. Das dritte Spektralband schließlich definiert das Fluoreszenzemissionsband der Markiersubstanz.
Das Primärfilter 28 begrenzt das Spektralband des auf die Reaktionszone auftreffenden und an der in der Reaktionszone befindlichen Ausfällung gestreuten Lichts. Außerdem bestimmt das Filter 28 auch das Spektralband der Anregungsstrahlung für die fluoreszierende Markiersubstanz. In dem in F i g. 2 veranschau-

iö lichten bevorzugten Ausführungsbeispiel läßt das Primärfilter 28 im Bereich zwischen etwa 400 nm und etwa 680 nm Licht durch. Licht außerhalb dieses Bandes, das heißt mit Wellenlängen unterhalb 400 nm oder oberhalb 680 nm, wird von dem Filter 28 unterdrückt

(5 und kann nicht in die Reaktionszone gelangen.

Das in der Nähe der Photomultiplierröhre 32 angeordnete Sekundärfilter 36 dient zur Aussonderung der Wellenlängen des mit dem Photomultiplierer 32 gemessenen Streulichtes. Wie in F i g. 2 veranschaulicht,

2ö besitzt das Sekundärfilter 36 beispielsweise eine obere Grenzwellenlänge von etwa 550 nm, das heißt Wellenlängen über dieser Grenzwertlänge werden von dem Sekundärfilter nicht durchgelassen und können daher den Photomu'itiplier nicht erreichen.

Das Lang- bzw. Hochpaßfilter 40 in dem Signalisiersystem 38 besitzt eine ziemlich hoch liegende untere oder Anschnitts-Grenzfrequenz von etwa 700 nm, das heißt alle unterhalb dieser Grenzfrequenz liegenden Wellenlängen werden von dem Filter nicht durchgelassen und können daher die Photodiode 42 nicht erreichen.

Fig.3 veranschaulicht das Ansprechverhalten der Photomultiplierröhre 32 und der Photodiode 42 bei Verwendung der vorstehend genannten Filter. Es wird eine spektrale Trennung zwischen der Photomultiplierausgangsgröße, welche als Maß für die Menge der erzeugten Ausfällung dient, und der Photodiodenausgangsgröße, welche das Vorliegen der fluoreszierenden Markiersubstanz anzeigt, erreicht.

Außer der spekti alen Trennung zwischen der als Maß für das Streulichtsignal dienenden Photomu! !plierausgansspröße und der ak Maß für rlip fliinrpc7iprpnrlp Markiersubstanz dienenden Photodiodenausgangsgröße ist es wesentlich, daß die Markiersubstanz chemisch von der Antigen-Antikörper-Reaktion isoliert bzw. gegenüber dieser inert ist, derart, daß die Markiersubstanz die Bildung der Ausfällung und damit den Betrag des Streulichtsignals nicht beeinflußt. Außerdem soll die Markiersubstanz ihrerseits selbst keine nennenswerte Trübung in die Reaktionszone einführen, welche ebenfalls den Betrag des Streulichtsignals beeinflussen würde.

Eine zur Verwendung in Verbindung mit den'Filtern gemäß F i g. 2 geeignete fluoreszierende Markierungssubstanz ist Oxazin- 1-perchlorat (O-l-P), das ein Molekulargewicht von 423,90 und ein Extinktionskoeffizient-Maximum von ε= 12,5 χ lOH/molcm bei 645 nm besitzt Die Absorptions- und Fluoreszenzemissionseigenschaften dieser Substanz sind in Fig.4 veranschaulicht Wie ersichtlich, absorbiert Oxazin-1-perchlorat Licht in einem Spektralband zwischen etwa 550 und etwa 650 nm und fluoresziert in einem Spektralband zwischen etwa 650 und etwa SOO nm. Es sei darauf hingewiesen, daß die Absorptions- und die Emissionsbanden dieser Substanz spektral sowohl voneinander als auch vom Spektralband für den Nachweis des Streuiichtsignals getrennt sind. Somit wird das Streulichtsigna] durch die Absorption und

Emission der Markiersubstanz nicht iiörend beeinträchtigt oder übprlappt( und umgekehrt durch die Markief-Substanz auch keine nennenswerte Trübung in die Reaktionszöne eingeführt. Außerdefn ist die Msrkiersubstanz chemisch inaktiv bzw. inert bezüglich der Antigen-Antikörper-Reaktion. Somit gehen von der Markiersubstanz keinerlei störende Beeinträchtigungen für den Nachweis des Streulichtsignals aus.

Beispiele

Zunächst wird eine Vorratslösung von Oxazin-1-perchlorat (0-1-P) hergestellt, indem man 50 mg des O-l-P in 100ml entionisiertem Wasser löst, d.h. 1,18 χ lO-JiVlcl/L

Des weiteren wird eine Puffervorratslösung hergestellt, indem man 150 m Mol Natriumchlorid zusammen mit 4 g Polyäthylenglykol 6000 in 100 ml entionisiertem Wasser löst. Sodann werden drei verschiedene Arbeitsiösungen in f-orm einer Kombination der O-1-P-Vorratslösung und der Puffervorratslösung in Verdünnungsverhältnissen von 1:40, 1:101 bzw. 1:201 (Vorratslösung : Gesamtlösung) hergestellt.

Monospezifisches Ziegenantiserum (Antikörper) mit einem Titerpegel von 120 bis 140 mg gebundenem Antigen pro 100 ml Präparat gegen menschliches C'3-Komplement (oder ein anderes Protein, wie beispielsweise IgG, IgA oder IgM usw.) wurde jeweils mit jeder der drei die O-1 -P-Markiersubstanz enthaltenden Arbeitslösung im Verhältnis von 1 Teil Antiserum pin j 3 Teile Arbeitslösung verdünnt.

Des weiteren wurde eine frische Arbeitslösung ohne Ö-l-P hergestellt, welche 150 m Mol Natriumchlorid in entionisiertem Wasser enthielt, zur Verdünnung von Serum (Antigen)-Proben.

Ein (als RSC-10 bezeichnetes) Kontrollserum wurde mit der neuen Arbeitslösung in den nachfolgenden Verhältnissen von Serum zu Arbeitslösung verdünnt, nämlich 1 :199, 1 :39, 1 :14 und 1 :6. (Das RSC-19 Kontrollserum enthielt 350 mg/100 ml C'3-Komplement.)

Jede der drei die Markiersubstanz O-l-P enthaltenden AntiVörnerlösungen wurde jeweils rr.it jeder der Serumlösungen in einer Reaktionszelle zusammengebracht. Für jede der so kombinierten Antikörper- und Antigen-Reaktionskomponenten wurde die Reaktionsielle mit 700 μΐ der Puffervorratslösung gefüllt und jeweils die einzelnen Antigen- und Antikörperlösungen in Mengen von 50 μΐ von Hand aufeinanderfolgend in die Vorratspufferlösung in der Zelle pipettiert. Die Antikörperlösung wird zuletzt einpipettiert und die Änderung des von der Photodiode 42 gelieferten Spannungssignals gemessen. Bei Anbringung eines Primärfilters 28 mit 640 nm betrugen die Spannungsänderungen für die Antikörperverdünnungen von 1 :40, 1 :101 und 1 :201 jeweils 5 V, 2 V bzw. 1,1 V. Mit einem 620 nm-Primärfilter 28 betrugen die Spannungsänderungen für die gleichen Verdünnungen 2,8 V, 1,1 V bzw. 0,5 V.

In dem vorstehenden Beispiel war die Fluoreszenz-Markiersubstanz in den Antikörperreaktionskomponenten enthalten, und die Antikörperkomponente wurde jeweils zuletzt in die Reaktionszone eingebracht, als Anzeige für den Beginn der Antigen-Antikörper-Reaktion. In einem weiteren Beispiel wurde das Kontrollserum (Antigen) mit den verschiedenen O-l-P-Arbeitslösungen verdünnt und die Antigenkomponente als letzte in die Reaktionszone eingebracht In diesem Beispiel bewirkte die 0-1-P-Markiersubstanz in der Antigenreaktionskomponente in der Ausgangsgröße der Photodiode 42 ähnliche Spannungsänderungen wie für die zuvor beschriebenen markierten Antikörpel'reaktionskomponenten. Daraus ergibt sich, daß die Markiersubstanz gleich gut sowohl mit der Antigen- wie auch mit der Antikörperreaktionskomponente funktioniert und in der einen oder in der anderen eingeführ* werden kann.
Um zu gewährleisten, daß beide Reaktionär* nponenten in der Reaktionszone vorliegen, Kann die Markiersubstanz sowohl in der Antigen- wie auch in der Antikörperreaktionskomponente statt nur <a der jeweils letzten in die Reaktionszone zugeführieh Reaktionskomponente vorliegen. In diesem Fall weist das

is Signalisiersystem 38 die Fluoreszenzemission der Markiersubstanz in jeder Reaktionskomponente nach. Dies wird durch die gestrichelte Kurve in Fig. 5 veranschaulicht, weiche die Zunahme des nachgewiesenen Fluoreszenzsignals bei der getrennten Einbringung der beiden Reaklionskomponenten zeigt. Für diesen Beispielsfall kann die Differenziervorrichtung 50 in der oben erwähnten Weise durch einen herkömmlichen Schwellwert- oder Pegeldetektor ersetzt werden. Der Schwellwertdetektor ist so eingestellt, daß er erst dann einen Ausgangsimpuls an die logische Schaltung 52 zur Auslösung des Zeitgebers 46 liefert, wenn das Fluoreszenzsignal einen Pegel annimmt, der anzeigt, daß sowohl die erste Komponenteneinbringung wie auch die zweite Komponenteneinbringung stattgefunden haben. Auf diese Weise wird sichergestellt, daß der Zeitgeber 46 erst ausgelöst wird, nachdem beide markierten Reaktionskomponenten in die Reaktionszone zugeführt wurden.
Die voll ausgezogene Kurve in Fig.5 stellt die Ableitung des Fluoreszenzsignals für die erste und die zweite Komponentenzufuhr für den Fall dar, daß in der Triggerschaltung 44 die Differenziervorrichtung 50 verwendet wird. In diesem Fall kann die logische Schaltung 52 einen herkömmlichen Zweistufenzähler aufweisen, derart, daß der Zeitgeber 46 nur ausgelöst wird, wenn sowohi ein erster und ein zweiter Impuls von iiCrCPiZiCi VCi FiCmüug

ciz.cugi vvuiuc*

Anzeige dafür, daß die erste und die zweite Reak"'onskomponente in die Reaktionszone zugeführt wurde. Selbstverständlich könnte dabei eine automatische Rückstellung des Zählers nach der Auslösung des Zeitgebers 46 bzw. nach Verstreichen einer vorgegebenen Zeit zwischen Eingangsimpulsen vorgesehen sein.
Um zu verhindern, daß erste und zweite Injektionen derselben Reaktionskomponente bei der oben erwähnten Ausführung zu einer Auslösung des Zeitgebers 46 führen, können in den einzelnen Komponenten unterschiedliche Mengen der Markiersubstanz vorgesehen werden. Falls beispielsweise die Antigenkomponente eine Einheit der Markiersubstanz enthält und die Antikörperkomponente zwei Einheiten Markiersubstanz, so würde die Einbringung der Antigen- und der Antikörperreaktionskomponenten in die Reaktionszone insgesamt eine Gesamtmenge von drei Einheiten der Maridersubstanz in der Reaktionszone zur Folge haben. Falls irrtümlich zwei Antigenkomponenten zugeführt wurden, wären nur zwei Einheiten Markiersubstanz vorhanden, Falls irrtümlich zwei Antikörperkomponenten zugeführt würden, wären vier Einheiten Markiersubstanz vorhanden. Somit ist für zwei Injektionen die richtige Kombination von drei Einheiten Markiersubstanz nur dann vorhanden, fails eine Injektion die richtige Antigenkomponente und die andere Injektion

die richtige Antikörperkomponente betiifft, Eei einer derartigen Ausführungsform wurde man einen Pegeldetektor 50 mit einem bestimmten vorgegebenen »Ansprechfenster« verwenden, in solcher Einstellung, daß ein Ausgangsimpsjs nur bei einer den drei Einheiten der Markiersubstanz entsprechenden Spannungsausgangsgröße der Photodiode 42 erzeugt wird.

Aus den vorstehenden Darlegungen ist ersichtlich, daß durch die Erfindung die bisher zur überwachten Zufuhr chemischer Reaktionskomponenten in eine Reaktionszone und zur Signalisierung des Beginns der chemischen Reaktion verwendeten Methoden und Vorrichtungen verbessert werden. Die Einlagerung einer Markiersubstanz in wenigstens einer der Reaktionskomponenten erübrigt die Notwendigkeit der manuellen Betätigung einer Triggerschaltung nach der

Einfuhr der betreffenden Komponenten. Indem man außerdem für chemische Isolation bzw. Inertheit zwischen der Markiersubstanz und der chemischen Reaktion sorgt, wird gewährleistet, daß die Messung einer Charakteristik der Reaktion, wie beispielsweise die Lichtstreuung an einem Reaktionsprodukt, durch die Markiersubstanz nicht störend beeinträchtigt wird. Außerdem entfällt hierdurch die Notwendigkeit, ein derartiges Streulichtsignal zusätzlich zur Signalisierung der Einbringung der Reaktionskomponenten heranzuziehen. Bei Verwendung einer fluoreszierenden Markiersubstanz wird eine Störung zwischen der Markiersubstanz und dem gemessenen Streulichtsignal dadurch vermieden, daß man für spektrale Trennung zwischen dem von der Markiersubstanz emittierten Licht und dem Streulicht sorgt.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur kontrollierten Vereinigung der Komponenten einer chemischen Reaktion, bei welchem die Reaktionskomponenten zur Ingangsetzung der chemischen Reaktion in eine Reaktionszone zugeführt werden und danach eine charakteristische Größe der Reaktion gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Überwachung und Signalisierung des Beginns der chemischen Reaktion vor deren Ingangsetzung wenigstens der als letztes in die Reaktionszone zugeführten Reaktionskomponente eine Markiersubstanz beifügt, welche gegenüber der überwachten Reaktion chemisch isoliert bzw. inert ist, und daß man die Reaktionszone auf das Auftreten der Markiersubstanz überwacht und beim Nachweis der Markiersubstanz ein Signal als Anzeige für den Beginn der^';emischen Reaktion erzeugt

2. Verfahren nach Ansⁿruch t_? dadurch ^CTekenn- 2^ zeichnet, daß die Markiersubstanz außer zu der zuletzt zugeführten Reaktionskomponente auch einer zweiten Reaktionskomponente zugesetzt wird und daß man die Reaktionszone auf das Auftreten jeder zugefügten Markiersubstanz überwacht und beim Nachweis beider Markiersubstanzen das den Beginn der chemischen Reaktion anzeigende Signal erzeugt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, da T die Markiersubstanz den beiden Reaktionskomponenten in unterschiedlichen relativen Mengen zugesetzt wird und daß man die Reaktionszone auf die Gegenwart einer charakteristischen Kombination aus den νε schiedenen kombinierten relativen Mengenanteilen der Markiersubstanz überwacht.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Markiersubstanz wenigstens der Antigen· Komponente oder der Antikörper-Komponente einer chemischen Antigen-Antikörper-Reaktion zugesetzt wird.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Markiersubstanz eine Fluoreszenzsub- ⁴^ stanz verwendet wird und daß die Überwachung durch Nachweis des von der Fluoreszenzsubstanz emittierten Fluoreszenzlichts als Signal für den Beginn der chemischen Reaktion erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5. dadurch gekenn- sn zeichnet, daß als Fluoreszenzsubstan/ Oxazin-1-perchlorat verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6. in Anwendung auf eine Reaktion, bei der als charakteristische Größe der Reaktion eine optische Größe in M einem Spektralbereich gemessen wird, dad ireh gekennzeichnet, daß die fluoreszierende Markiersubstanz so ausgewählt wird, daß sie Licht in einem von dem Spektralbereich, in dem die optische Größe gemessen Wird Verschiedener Spektralbereich emil· tiert Und daß die Überwachung der Reaktionszone auf das Vorliegen der Markiersubstanz durch Nachweisen der Fluoreszenzemission in diesem letztgenannten Spekt'ralbereich erfolgt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenm zeichnet, daß die Messung der optischen Größe in einem ersten Spektralbereich erfolgt und die fluoreszierende Markiersubstanz in einem zweiten Spektralbereich Licht absorbiert und in einem ,dritten Spektralbereich Licht emittiert.

9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als charakteristische Größe der überwachten Reaktion das an einer im Verlauf der Reaktion erzeugten Ausfällung gestreute Licht gemessen wird.

10. Elektrochemisches System zur kontrollierten Vereinigung der Komponenten einer chemischen Reaktion nach dem Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, mit einer Reaktionskammer, in die aufeinanderfolgend mehrere Komponenten der chemischen Reaktion zugeführt werden, sowie mit der Kammer zugeordneten Vorrichtung zur Messung einer charakteristischen Größe der chemischen Reaktion, gekennzeichnet durch eine wenigstens der letzten in die Kammer zugeführten Reaktionskomponente beigefügten Markiersubstar.z, welche bezüglich der Reaktion chemisch isoliert bzw. inert ist; durch der Reaktionskammer (10, 14) zugeordnete, bezüglich der zu messenden charakteristischen Größe der chemischen Reaktion unempfindliche Vorrichtungen (40, 42) zum Nachweis der Markiersubstanz; sowie durch auf den Nachweii der Markiersubstanz ansprechende Vorrichtungen (44), welche die Vereinigung der Reaktionskomponenten und damit den Beginn der chemischen Reaktion signalisieren.

11. System nach Anspruch 10, bei welchem die Meßvorrichtung (22,34) auf eine optische charakteristische Größe der überwachten Reaktion anspricht, dadurch gekennzeichnet, daß die Markiersubstanz eine Fluoreszenzsubstanz ist, deren Fluoreszenzemission in einem vom Spektralbereich der charakteristischen optischen Größe der Reaktion verschiedenen Spektralbereich liegt, und daß die Vorrichtung (40,42) zum Nachwr^;s der Markiersubstanz derart ausgebildet ist, daß sie auf die Fluoreszenzemission der Markiersubstanz, nicht jedoch auf die charakteristische optische Größe der Reaktion anspricht.

12. Elektrochemisches System nach Anspruch 10 oder 11. in \usbildung als nephelometrischer chemischer Analysator, gekennzeichnet durch eine Reaktionskammer (10, 14) zur Aufnahme der Komponenten der zu überwachenden chemischen Reaktion; durch Anregungsvorrichtungen (18) zur Bestrahlung der Reaktionskammer mit Licht innerhalb eines ersten Spektralbereichs, das an Bestandteilen innerhalb der Reaktionskammer gestreut wird, sowie Vorrichtungen (22) zur Messung des Streulichts als charakteristische Größe der Reaktion für Zwecke der nephelometrischen Analyse; durch eine fluoreszierende Markierungssubstanz in wenigstens einer der zuletzt in die Kea.üionskammer zugeführten Reaktionskomponenten, welche ehe misch gegenüber der zu überwachenden chemischen Reaktion isoliert bzw. inert ist und Licht in einem zweiten Spektralband absorbiert Und Fluoreszenzlicht in einem von dem ersten und dem zweiten Spektralbereich Verschiedenen dritten Spektralbereich emittiert; durch der Reaktionskamtner (10,14) zugeordnete, bezüglich der Stfeülichtkenrigröße in dem ersten Spektralbereich Unempfindliche gesonderte Vorrichtungen (40, 42) zum Nachweis der Fluoreszenzemission der fluoreszierenden Markier* substanz in dem dritten Spektralbereich; sowie

durch auf den Nachweis der Markiersubstanz ansprechende Vorrichtungen (44).

13. Analysator nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungsvorrichtung (18) eine Lichtquelle (24) und ein mit deren Licht beaufschlagtes Primärfilter (28) aufweist, welches Licht in dem ersten und zweiten Spektralbereich in die Reaktionrkammer durchläßt, hingegen Licht in dem dritten Spektralbereich unterdrückt

14. Analysator nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (22) zur Messung der charakteristischen Größe der chemischen Reaktion einen Detektor (32) und eine zugeordnete Sekundärfilteranordnung (36) aufweist

15. Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die gesonderte Vorrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzemission der Markiersubstanz einen Detektor (42) und eine zugeordnete Filtervorrichtung (40) aufweist

16. System nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die auf den Nachweis der Markiersubstanz ansprechende Vorrichtung eine Triggervorrichtung (44) sowie einen mit dem elektrischen Signal der Triggervorrichtung als Triggereingangssignal beaufschlagten und hierdurch ausgelösten Zeitgeber (46) aufweist