DE2724723A1

DE2724723A1 - Verfahren und system zur kontrollierten vereinigung von komponenten einer chemischen reaktion

Info

Publication number: DE2724723A1
Application number: DE19772724723
Authority: DE
Inventors: Robert J Anderson
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1976-06-02
Filing date: 1977-06-01
Publication date: 1977-12-08
Also published as: CA1082594A; US4101276A; DE2724723C3; FR2353857B1; SE7706412L; JPS5945941B2; SE446230B; BE855324A; DE2724723B2; GB1563949A; JPS57156544A; FR2353857A1; JPS52149195A; JPS5855449B2; CH620371A5

Description

Dip'.-i!-':. c. w::.v-!i Di .■!.-!■■.'.·. Π. \.π/η

Π:·. Τ. !!: ·;- Λ Dip!-'■'·?■ !>. ΓΰΙ-ii niiip

O f/inc'-^n ?. Kauling-.i Λι. C, TiI. (ι:^;") >'4d?/5 München, den 15 908 H/ttu

!Γ77

Bezeichnung:

Verfahren und System zur kontrollierten Vereinigung von Komponenten einer chemiechen Reaktion

Anmelder:

Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CaI., USA

Vertreten Dipl.-Ing. C. Wallach Dipl.-Ing. G. Koch Sr. T. Haibach Dipl.-Ing. R. Feldkamp 8000 München

Erfinder:

Robert J. Anderson Orange, Calif., USA

709849/1169

Verfahren und System zur kontrollierten Vereinigung von Komponenten einer chemischen Reaktion

Die Erfindung betrifft den Nachweis chemischer Reaktionskomponenten und insbesondere den Nachweis von in eine Reaktionszone zugeführten Komponenten zur Signalisierung des Beginns einer chemiechen Reaktion. Die Erfindung eignet sich besonders zur Anwendung auf dem Gebiet der nicht-isotopischen Immunoanalyse ("immunoassay") zum Nachweis der Komponenten von Antigen-Antikörper-Reaktioneno

Ein bekanntes Verfahren zur Analyse von Antigenen und Antikörpern beruht auf dem Umstand, daß Antigene mit ihren entsprechenden Antikörpern unter Erzeugung einer Ausfällung reagieren. Die Menge der in einer derartigen Antigen-Antikörper-Reaktion erzeugten Ausfällung ist proportional entweder der Antikörperkonzentration oder der Antigenkonzentration, Je nachdem, welche der Komponenten im Überschuß vorliegt· Das heißt, für einen Antigenüberschuß ist die Niederschlagsmenge proportional der Antikörperkonzentration, während umgekehrt bei Antikörperüberschuß die Niederschlagsmenge proportional der Antigenkonzentration ist. Die erzeugte Niederschlagsmenge wird üblicherweise mit nephelometrisehen Verfahren (Trübungs- bzw. Streulichtmessungen) bestimmt, indem man die Streuung eines auf die Zone der Antigen-Antikörper-Reaktion gerichteten Lichtbündele an der Ausfällung mißt. Eine bestimmte Niederschlagsmenge kann jedoch aus den angegebenen Gründen zwei möglichen Werten der Antigenkonzentration entsprechen, je nachdem, ob der Antikörper oder das Antigen im Überschuß vorliegen.

709849/1169

In dem Patent (gleichzeitig eingereichte Patentanmeldung P ·· der gleichen Anmelderin mit Priorität sbeanspruchung vom 2. Juni 1976 aus der UB-Patentan-

, ~_θΛ und vom Ij. r-lai 1977 aus der US-Patentmeldung S._ON. Ρ92,Ο?9* betreffend Verfahren und Vorrichtung «ur laaunonephelometriechen Analyse} ist ein System für die Analyse von Antigenen und Antikörpern beschrieben, bei welchem der Maximumwert der inderungsgeschwindigkeit des im Verlauf der Bildung des Niederschlags während der Antigen-Antikörper-Reaktion erzeugten Streulichtsignals gemessen wird· Vie dort im einzelnen auseinandergesetzt, wurde gefunden, daß der zeitliche Abstand, in welchem diese maximale Inderungsgeechwindigkeit nach dem Beginn der Antigen-Antikörper-Reaktion auftritt, eine signifikante Anzeige dafür darstellt, welche der beiden Reaktionskomponenten im Überschuß vorliegt. Hit anderen Worten, ein Zustand mit Antigenüberschuß läßt sich von einem Zustand mit Antikörperüberschuß dadurch unterscheiden, daß man die Zeitdauer nach dem Beginn der Reaktion bis zum Auftreten der maximalen Inderungsgeschwindigkeit des Streulichtsignale beobachtetο Die Kenntnis davon, welche Reaktionskomponenteim Überschuß vorliegt, ermöglicht die richtige Zuordnung der gemessenen Niederschlagsmenge zu dem einen der beiden möglichen Veite der Antigenkonzentration. Zur Messung der Zeitdauer zwischen dem Beginn der Reaktion und der maximalen Inderungsgeschwindigkeit des Streulichteignais muß zunächst der Zeitpunkt des Reaktionsbeginns festgelegt werden. Dann kann nämlich ein Zeitgeber gleichzeitig mit der Reaktion in Gang gesetzt und so die Zeitdauer bis zum Auftreten der maximalen Änderungegeschwindigkeit gemessen werden.

Die Notwendigkeit der Bestimmung bzw. Festlegung des

709849/1169

Anfangezeitpunkte einer chemiechen Reaktion besteht außer bei der Analyse von Antigenen und Antikörpern auch noch auf anderen Gebieten der chemischen Analyse. So werden beispielsweise bei Messungen der Frothrombinzeit von Blutplasma eine Blutplasmaprobe und ein Gerinnungemittel miteinander zusammengebracht und die bis zur Gerinnung der Plasmaprobe erforderliche Zeitdauer gemessen» vergleiche beispielsweise die US-Patentschriften 3 4-50 501 und 3 593 568. Typischerweise wird die Gerinnung mit einem Photodetektor gemessen, der auf an dem Gerinsel während dessen Bildung gestreutes Licht anspricht und in Abhängigkeit hiervon ein elektrisches Signal erzeugt, dessen Betrag eine Anzeige für das Ausmaß der Gerinselbildung darstellt. Offensichtlich ist hierbei zur genauen Messung der verstrichenen Gerinnungezeit zunächst eine Festlegung des Anfangezeitpunkts der Gerinnungereaktion erforderlich.

Bei der Analyse von Antigen-Antikörper-Reaktionen, wie sie in dem erwähnten Patent (gleichzeitig eingereichte Patentanmeldung wie oben erwähnt) beschrieben ist, werden die Antigen- und die Antikörper-Reaktionskomponenten jeweils aufeinanderfolgend von Hand von einem Operator in eine Reaktionszeit pipettiert. Manuelle Pipettlerung findet auch bei den Prothromblnzeitbestimmungen gemäß den vorstehenden OS-Patentschriften 3 4-50 501 und 3 593 568 Anwendung. In der UB-Patentschrift 3 4-50 501 ist vorgesehen, daß ein Zeitgeber am Beginn der Reaktion mittels eines beim Hineindrücken des Pipettenkolbens betätigten Schalters in Gang gesetzt wird. Bei dieser Lösung ist dem Pipettenkolben ein mechanischer Schalter zugeordnet; wenn der Operator den Pipettenkolben zum Ausdrücken der Reaktionskomponente aus der Pipette nach unten drückt, wird

709849/1 169

der Schalter geschlossen und hierdurch ein Triggerstromkreie zur ßignalieierung des Beginns der Reaktion geechloeeen· Die manuelle Triggerung mittels des Schalters mag zwar für bestimmte Zwecke ausreichen, sie unterliegt jedoch in hohem Ausmaße Fehler- und Irrtumsmöglichkeiten des Operators. Falls beispielsweise aus irgendeinem Grund die Pipette leer ist, erfolgt gleichwohl die Triggerung beim Herunterdrücken des Pipettenkolbens, obwohl tatsächlich keinerlei Substanz aus der Pipette ausgespritzt wird. Falls des weiteren in der Pipette eine falsche Reaktionskomponente aufgesaugt wurde, erfolgt die Triggerauslösung gleichwohl, wenn diese Komponente in die Reaktionszone ausgespritzt wird. Darüber hinaus kann es möglicherweise zu zufälligen Auslösebetätigungen des Schalters kommen, derart, daß die Triggerschaltung während eines unrichtigen Teils des Analysezyklus betätigt wird. Um derartige unbeabsichtigte Triggerauslösungen zu vermeiden, muß auf der Schalttafel des Analysators ein "Schärfungs"-Schalter vorgesehen sein, durch den eine Triggerung verhindert wird, falls nicht zuvor der Schärfungeschälter betätigt wurde. Ein derartiger Schärfungeschalter erhöht jedoch die mechanische und funktionsmäfiige Komplexität des Systems. Außerdem besteht die Gefahr, daß der Schärfungeschälter beim Einführen der Probe nicht betätigt wird und so die Triggerauslösung nicht funktioniert und die Analyse wiederholt werden muß.

In den oben erwähnten US-Patentschriften 3 4-50 501 und 3 593 568 ist auch ein zweites Verfahren zur Signalisierung des Beginns einer chemischen Reaktion im Zusammenhang der Blutgerinnungereaktionen angegeben. Bei der Bestimmung von Blutgerinnungezeiten überwacht, wie bereits erwähnt,

709849/1169

ein Detektor das von dem Gerinsel gestreute Licht und erzeugt ein Signal, das ale Anzeige für das Ausmaß der Gerinselbildung dient. In den beiden DB-Patenten ist vorgesehen, bei der Einspritzung einer Reaktionskomponente in die Reaktionszone eine hierdurch bedingte kleine Störung bzw. Änderung in dem Streulichtsignal nachzuweisen und als Signal für den Beginn der Reaktion zu verwerten. Leider ist diese Lösung häufig nur schwierig auszuführen. Zum einen ist die kleine Änderung in dem Streulichtsignal kein ausreichend beständiges und reproduzierbares Phänomen. Wichtiger noch, und dies gilt insbesondere für die nephelometrische Analyse von Antigen-Antikörper-Reaktionen, soll das Streulichtslgnal im Idealfall im Zeitpunkt der Zugabe der letzten Reaktionskomponente keine wahrnehmbare Änderung zeigen. Und zwar deshalb, weil bei richtiger Präparierung die Antigen- und Antikörper-Reaktionskomponenten im wesentlichen durchsichtig sind und daher, wenn überhaupt, so nur eine ganz geringe Lichtstreuung verursachen. Daraus ist ersichtlich, daB das Streulichtsignal kein genaues Maß für den Beginn der Antigen-Antikörper-Reaktion zu liefern vermag, da dieses Signal sich erst einige Zeit nach dem Beginn der Reaktion, nämlich dann, wenn sich eine Ausfällung zu bilden beginnt, wahrnehmbar verändern wird.

Aus den vorstehenden Darlegungen ergibt sich, daß ein Bedürfnis nach einem einfachen und zuverlässigen Verfahren und einer Vorrichtung zur Überwachung der Komponenten einer chemischen Reaktion und zur Signalisierung des Beginns der Reaktion besteht. Der Erfindung liegt daher als Aufgabe die Schaffung eines Verfahrene und einer Vorrichtung zur Überwachung der Komponenten einer chemischen

709849/1 169

Reaktion zugrunde, das die Signalisierung der Einbringung der Komponenten in eine Reaktionszone und die Signalisierung dee Beginns der chemischen Reaktion in besserer Weise als die bekannten Systeme und ohne deren Nachteile gewährleistet.

Zu diesem Zweck ist nach dem Grundgedanken der Erfindung die Einlagerung einer Narkiersubstanz wenigstens in der letzten in die Reaktionszone zugeführten Reaktionskomponente vorgesehen. Sie Harkiersübstanz ist dabei so gewählt, daß sie chemisch gegenüber der Reaktion in der Reaktionszone isoliert bzw. inert ist· Es sind Vorrichtungen zur überwachung der Reaktionszone auf das Auftreten der Markiersubstanz vorgesehen, sowie Vorrichtungen, die beim Nachweis des Auftretens der Markiersubstanz den Beginn der chemischen Reaktion signalisieren.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung eines fluorophoren Stoffs als Markiersubstanz vorgesehen. In Anwendung bei einem System, in welcher eine optische charakteristische Größe der Reaktion, wie etwa das Streulicht, gemessen wird, wiifl die fluoreszierende Markiersubstanz so gewählt, daß ihre Pluoreszenzemission in einem vom Spektralbereich des Streulichts getrennten Spektralbereich liegt. Da die Markiersubstanz chemisch gegenüber der Reaktion isoliert bzw. inert ist und das von der Markiersubstanz emittierte Fluoreszenzlicht gegenüber dem Spektralbereich des Streulichts spektral verschieden ist, wird der Nachweis und die Messung des Streulichte durch die Markiersubstanz in keiner Weise störend beeinträchtigt. Gemäß einer Ausgestaltung kann zu mehr als einer Komponente der chemischen Reaktion

709849/1169

eine Markiersubstanz zugesetzt werden, wobei Vorrichtungen vorgesehen sind, welche die Reaktionszone auf jede Markiersubetanz überwachen und den Beginn der Reaktion erst dann signalisieren, sobald sämtliche markierten Reaktionskomponenten nachgewiesen sind.

Im folgenden werden Ausführungsbeispiele der Erfindung an Hand der Zeichnung beschrieben; in dieser zeigen:

Fig. 1 in schematischer Schnittansicht im Schnitt längs

einer im wesentlichen horizontalen Ebene die Reaktionszelle eines Antigen-Antikörper-Analysesystems und zusätzlich in Blockschaltbildform eine Apparatur zur Signalisierung des Beginne einer Reaktion in der Reaktionszone,

Fig. 2 eine graphische Darstellung der optischen Durchlässigkeit in Abhängigkeit von der Wellenlänge zur Veranschaulichung der Bandpaficharakteristiken der in dem System verwendeten Filter,

Fig. 3 eine graphische Darstellung der optischen Ausgangsgröße in Abhängigkeit von der Wellenlänge zur Veranschaulichung der spektralen Trennung zwischen den Ausgangsgrößen der Photomultiplierröhre und der Photodiode in dem System,

Fig. 4 eine graphische Darstellung der optischen Absorption und Fluoreszenzemission in Abhängigkeit von der Wellenlänge für eine fluoreszierende Markiersubstanz,

709849/1169

Pig. 5 eine graphische Darstellung dee Fluoreszenzsignale In Abhängigkeit von der Zeit zur Veranschaulichung der Änderung des Fluoreszenzsignals in dem der Einführung der ersten und der zweiten Reaktionakomponente entsprechenden jeweiligen Zeitpunkt; die Figur veranschaulicht ferner auch die Ableitung des Fluoreszenzeignais in den genannten Zeitpunkten der Einführung der Reaktionskomponenten.

Vie in den Zeichnungefiguren und speziell in Fig. 1 veranschaulicht, betrifft das gezeigte Ausführungsbeispiel der Erfindung ein chemisches Analysesystem mit einer Probenzelle 10; diese umfaßt einen Block 12 aus einem isolierenden Material mit einer darin befindlichen vertikalen Bohrung, welche eine Reaktionskammer oder -zone 14 zur Aufnahme von in die Probenzelle eingebrachten chemischen Reaktanten definiert. Im unteren Teil ist die Reaktionszone mit einer zylindrischen Glasauekleidung versehen, durch welche Licht in die Reaktionszone hinein und aus dieser heraus zu bzw. von dem Inhalt der Reaktionazone hindurchgelassen wird. Für die nephelometrieche Analyse von Antigen-und Antikörper-Reaktionskomponenten weist der Analysator ein optisches Anregungssystem 18 auf, mittels welchem ein Lichtbündel durch eine Öffnung 20 in dem Isolierblock 12 und durch die Glasauekleidung 16 In die Reaktionszone eingestrahlt werden kann; der Analysator weist ferner ein optisches Nachweissyetem 22 zur Messung von durch den Inhalt der Reaktionszone gestreutem Licht auf.

Das Anregungesystem 18 weist eine Lichtquelle 24, wie beispielsweise eine VoIframglühlampe, ein Eollimationslinsen-

709849/1169

syetern 26, welches das von der Lampe kommende Licht kolliniert und auf die Probenzelle 10 richtet, sowie ein Primärfilter 28 zur Filterung des durch die Reaktionszone hindurchtretenden Lichte auf.

Das Nachweissystem 22 weist einen in einer Bohrung in dem Block 12 angeordneten Lichtleiter 30 auf; das eine Ende des Lichtleiters ist benachbart der Reaktionszone angeordnet und nimmt auffallendes Licht, das durch den Inhalt der Reaktionszone gestreut ist, auf; an seinem entgegengesetzten Ende gibt der Lichtleiter das von ihm aufgenommene und weitergeleitete Licht an einen geeigneten Detektor, wie beispielsweise eine Photomultiplierröhre 32, ab. Ausgangsseitig ist der Photomultiplier mit einer HeB- und Anzeigeschaltung 34 verbunden, welche in geeigneter Form eine Aufzeichnung des Streulichtsignals liefert. Im Lichtweg zwischen der Lichtleitung und der Photomultiplierröhre ist ein Sekundärfilter 36 zur Aussonderung der Wellenlängen des Streulichtsignals angeordnet.

Bei der überwachung bzw. Analyse einer Antigen-Antikörper-Reaktion können die Antigen- und Antikörper-Reaktionskomponenten Jeweils einzeln aufeinanderfolgend mittels einer von Hand betätigten Pipette In die Reaktionszone 14 der Probenzelle 10 injiziert bzw. zugeführt werden. Bei Vereinigung der Antigen- und Antlkörper-Reaktionskomponenten in der Reaktionszone wird eine chemische Reaktion in Gang gesetzt, welche zur Bildung einer Ausfällung bzw. eines Niederschlags in der Reaktionszone führt. Das von der Lampe 24 auf die Reaktionszone gerichtete Licht wird durch die Ausfällung gestreut; dieses Streulicht wird In dem optischen Nachweissystem 22 gemessen und in ein Signal

7Q9849/1169

umgewandelt, daa ein Haß für die Menge der erzeugten Auefällung und damit ein Haß für die interessierenden Reaktionekomponenten darstellt. Jedoch kann, wie eingangs dargelegt, die jeweilige Ausfällungemenge zwei möglichen Werten der Antigenkonzentration entsprechen, je nachdem, ob das Antigen oder der Antikörper im Überschuß vorliegt. Ein Antigenüberschuß läßt sich jedoch von einem Antikörper-Überschuß durch Hessung der Zeitdauer zwischen dem Beginn der Reaktion und der Auefällungsmeseung unterscheiden.

Gemäß dem Grundgedanken der vorliegenden Erfindung ist zumindest mit der letzten in die Reaktionszone 14 zugeführten Reaktionskomponente eine fluoreszierende Markiersubetanz verbunden, und die Reaktionszone wird durch ein Signallsiersystem 38 auf das Auftreten der Fluoreszenzsubetanz überwacht. Da die Antigen-Antikörper-Reaktion mit der Einführung der letzten Reaktionskomponente beginnt, zeigt der Nachweis der Markiersubstanz in der letzten eingeführten Reaktionskomponente gleichzeitig den Zeitpunkt des Beginne der Reaktion an.

Bas Signalisiersystem 38 weist ein zwischen der Reaktionszone 12 und einem Photodetektor 42, beispielsweise einer lichtempfindlichen Photodiode, angeordnetes Hochpaßfilter 40 mit unterer Grenzfrequenz und langem oberem Durchlaßbereich auf; das von dem Filter 40 durchgelassene Licht wird in der Photodiode 42 nachgewiesen. Das Auegangssignal dee Detektors 42 wird seinerseits einer Triggerschaltung 44 zugeführt, welche ein Triggersignal zur Auslösung anderer Schaltkomponenten, wie beispielsweise eines Zeitgebers 46, aufweist. Daher spricht bei Einbringung der die fluoreszierende Markiersubstanz enthaltenden Reaktionskomponente

709849/1164

In die Reaktionszone der Detektor 42 und die Triggerschaltung 44 auf die Lichtemieeion der Fluoreszenzsubstanz an und löst hierbei den Zeitgeber im Zeitpunkt dee Beginne der Antigen-Antikörper-Reaktion aua.

Die Triggerschaltung 44 kann folgende Teile aufweisen: einen Verstärker 48 zur Verstärkung dee Ausgangesignale

el· der Photodiode; eine Differenzier- bzvr./'öcnwellwertdetektorvorrichtung 50, welche auf das verstärkte Signal anspricht und in Abhängigkeit hiervon ein Impulseignal erzeugt; sowie eine auf das von der Differenzier- oder Schwellwertdetektorschaltung gelieferte Impulssignal ansprechende logische Schaltung 52, welche ein den Zeitgeber 46 in Gang setzendes Triggersignal erzeugt. Anstelle der Differenziervorrichtung 50 kann alternativ, wie gesagt, eine Schwellwertdetektorschaltung vorgesehen sein, welche der logischen Schaltung 52 ein Ausgangsimpulssignal zuführt, sobald das verstärkte Fhotodiodenausgangssignal einen vorgegebenen Wert erreicht. Diese verschiedenen Teile der Triggerschaltung sind sämtlich bekannter Art.

Für die gewünschte richtige Wirkungsweise des Signalisiersysteme 38 ist es erwünscht, daß das von der fluoreszierenden Markiersubstanz absorbierte und als Fluoreszenz wieder emittierte Licht nicht die Streulichtmessung für die Analyse derAntigen- oder Antikörper-Reaktionskomponenten stört. Daher sollte die Markiersubstanz in dem für die Messung des Antigen-Antikörper-Streulichtsignale verwendeten Spektralbereich weder Licht absorbieren noch emittieren. Des weiteren ist für eine genaue Messung des von der Markiersubstanz emittierten Lichts erforderlich, daß dieses emittierte Licht in einem von dem für die Anregung der

70 9849/1169

Markiersubstanz verwendeten Spektralband abgetrennten Spektralband nachgewiesen wird. Um dies zu gewährleisten, werden die fluoreszierende Markiersubstanz, das Primärfilter 28, das Sekundärfilter 36 und das Hochpaßfilter 40 mit unterer Grenzfrequenz so gewählt, daß sie drei getrennte Spektralbänder definieren. Sas erste Spektralband dient zur Anregung und Messung des von der Ausfällung gestreuten Lichts· Das zweite Spektralband definiert das Absorptionsband der fluoreszierenden Markiersubstanz. Das dritte Spektralband schließlich definiert das Fluoreszenzemissionsband der Markiersubstanz.

Das Primärfilter 28 begrenzt das Spektralband des auf die Reaktionszone auftreffenden und an der in der Reaktionszone befindlichen Ausfällung gestreuten Lichts. Außerdem bestimmt das Filter 28 auch das Spektralband der Anregungestrahlung für die fluoreszierende Markiersubstanz. In dem in Fig. 2 veranschaulichten bevorzugten Ausführungsbeispiel läßt das Primärfilter 28 im Bereich zwischen etwa 400 nm und etwa 680 nm Licht durch. Licht außerhalb dieses Bandes, das heißt mit Wellenlängen unterhalb 400 nm oder oberhalb 680 nm, wird von dem Filter 28 unterdrückt und kann nicht in die Reaktionszone gelangen.

Bas in der Nähe der Photomultiplierröhre 32 angeordnete Sekundärfilter 36 dient zur Aussonderung der Wellenlängen des mit dem Photomultiplier 32 gemessenen Streulichts. Wie in Fig· 2 veranschaulicht, besitzt das Sekundärfilter 36 beispielsweise eine obere Grenawellenlänge von etwa 550 nm, das heißt Wellenlängen über dieser Grenzwert länge werden von dem Sekundärfilter nicht durchgelassen und können daher den Photomultiplier nicht erreichen.

709849/1169

Dae Lang- bzw. Hochpaßfilter 40 In dem Signalieiereyetem 38 besitzt eine ziemlich hoch liegende untere oder Anechnitte-Grenzfrequenz von etwa 700 nm, das heißt alle unterhalb dieser Grenzfrequenz liegenden Wellenlängen werden von dem Filter nicht durchgelassen und können daher die Photodiode 42 nicht erreichen.

Fig. 3 veranschaulicht das Ansprechverhalten der Photomultiplierröhre 32 und der Photodiode 42 bei Verwendung der vorstehend genannten Filter. Ee wird eine spektrale Trennung zwischen der Photomultiplierausgangsgröße, welche als Haß für die Menge der erzeugten Ausfällung dient, und der Photodiodenausgangsgröße, welche das Vorliegen der fluoreszierenden Markiersubstanz anzeigt, erreicht.

Außer der spektralen Trennung zwischen der als Maß für das Streulichtsignal dienenden Photomultiplierausgangsgröße und der als Maß für die fluoreszierende Markiersubstanz dienenden Photodiodenausgangsgröße ist es wesentlich, daß die Markiersubstanz chemisch von der Antigen-Antikörper-Reaktion isoliert bzw. gegenüber dieser inert ist, derart, daß die Markiersubstanz die Bildung der Ausfällung und damit den Betrag des Streulichtsignals nicht beeinflußt. Außerdem soll die Markiersubstanz ihrerseits selbst keine nennenswerte Trübung in die Reaktionszone einführen, welche ebenfalls den Betrag des Streulichtsignale beeinflussen würde.

Eine zur Verwendung in Verbindung mit den Filtern gemäß Fig. 2 geeignete fluoreszierende Markierungssubstanz ist Oxazin-1-perchlorat (0-1-P), das ein Molekulargewicht von 423,90 und ein Extinktionskoeffizient-Maximum von

7098 4 9/1169

" ^2Λ " 272Λ723

g m 12,5 x 1O⁴ 1/mol cm bei 645 nm besitzt. Die Absorptionsund Fluoreszenzemissionseigenechaften dieser Substanz sind in Fig. 4 veranschaulicht. Wie ersichtlich, absorbiert 0xazin-1-perchlorat Licht in einem Spektralband zwischen etwa 550 und etwa 650 nm und fluoresziert in einem Spektralband zwischen etwa 650 und etwa 800 nm. Es sei darauf hingewiesen, daß die Absorptions- und die Emissionsbanden dieser Substanz spektral sowohl voneinander als auch vom Spektralband für den Nachweis des Streulicht-Signals getrennt sind· Somit wird das Streulichtsignal durch die Absorption und Emission der Markiersubstanz nicht störend beeinträchtigt oder überlappt, und umgekehrt durch die Markiersubstanz auch keine nennenswerte Trübung in die Reaktionszone eingeführt. Außerdem ist die Markiersubstanz chemisch inaktiv bzw. inert bezüglich der Antigen-Antikörper-Reaktion. Somit gehen von der Markiersubetanz keinerlei störende Beeinträchtigungen für den Nachweis des Streulichtsignale aus.

Beispiele

Zunächst wird eine Vorratslösung von Oxazin-1-perchlorat hergestellt, indem man 50 mg des 0-1-P in 100 ml entionisiertem Wasser löst, d. h. 1,18 χ 10~⁵ Mol/l.

Des weiteren wird eine Puffervorratslösung hergestellt, indem man150 mMol Natriumchlorid zusammen mit 4 g PoIyäthylenglykol 6000 in 100 ml entionisiertem Wasser löst. Sodann werden drei verschiedene Arbeitslösungen in Form

7ü9849/1 169

einer Kombination der O-1-P-Vorratslösung und der Puffervorratslösung in Yerdünnungeverhältnieeen von 1:40, 1:101 bzw. 1:201 (Vorratslösung : Geeamtlösung) hergestellt,

Honoepezifisches Ziegenantiserum (Antikörper) mit einem Titerpegel von 120 bis 140 mg gebundenem Antigen pro 100 ml Präparat gegen menschliches C'3-Komplement (oder ein anderes Protein, wie beispielsweise IgG, IgA oder IgM usw.) wurde jeweils mit jeder der drei die O-1-P-Markiersubstanz enthaltenden Arbeitslösungen im Verhältnis von 1 Teil Antiserum plus 3 Teile Arbeitelösung verdünnt.

Des weiteren wurde eine frische Arbeitelösung ohne 0-1-P hergestellt, welche 150 mHol Natriumchlorid in entionisiertem Wasser enthielt, zur Verdünnung von Serum (Antigen) -Proben.

Ein (als HSC-19 bezeichnetes) Kontrollserum wurde mit der neuen Arbeitelösung in den nachfolgenden Verhältnissen von Serum zu Arbeitelöeung verdünnt, nämlich 1:199, 1:59« 1:14 und 1:6. (Das BSC-19 Kontrollserum enthielt 350 mg/100 ml C'3-Komplement.)

Jede der drei die Markiersubstanz 0-1-P enthaltenden Antikörperlösungen wurde jeweils mit jeder der Serumlösungen in einer Reaktionszelle zusammengebracht. Für jede der so kombinierten Antikörper- und Antigen-Reaktionskomponenten wurde die Reaktionszelle mit 700 al der Puffervorratslösung gefüllt und jeweils die einzelnen Antigen- und Antikörperlösungen in Mengen von 50 μ 1 von Hand aufeinanderfolgend in die Vorratspufferlösung in der Zelle pipettiert. Die Antikörperlösung wird zuletzt einpipettiert und

709849/1 169

die Änderung dee von der Photodiode 4-2 gelieferten Spannungssignals gemeeeen. Bei Anbringung eines Primärfiltere 28 mit 640 nm betrugen die Spannungaänderungen für die Antikörperverdünnungen von 1:40, 1:101 und 1:201 jeweils 5 V, 2 V bzw. 1,1 V. Mit einem 620 nm-Primärfilter 28 betrugen die Spannungeänderungen für die gleichen Verdünnungen 2,8 V, 1,1 V bzw. 0,5 V.

In dem vorstehenden Beispiel war die Fluoreszenz-Markier-BUbstanz in den Antikörperreaktionskomponenten enthalten, und die Antikörperkomponente wurde jeweils zuletzt in die Reaktionszone eingebracht, als Anzeige für den Beginn der Antigen-Antikörper-Reaktion. In einem weiteren Beispiel wurde das Kontrollserum (Antigen) mit den verschiedenen O-1-P-Arbeitslöffungen verdünnt und die Antigenkomponente als letzte in die Reaktionszone eingebracht. Xn diesem Beispiel bewirkte die 0-1-P-Markiersubstanz in der Antigenreaktionskomponente in der Ausgangsgröße der Photodiode 4-2 ähnliche Spannungsänderungen wie für die zuvor beschriebenen markierten Antikörperreaktionekomponenten. Daraue ergibt sich, daß die Harkiersubstanz gleich gut sowohl mit der Antigen- wie auch mit der Antikörperreaktionskomponente funktioniert und in der einen oder in der anderen eingeführt werden kann.

Um zu gewährleisten, daß beide Reaktionskomponenten in der Reaktionszone vorliegen, kann die Markier sub stanz sowohl in der Antigen- wie auch in der Antikörperreaktionskomponente statt nur in der jeweils letzten in die Reaktionszone zugeführten Reaktionskomponente vorliegen. In diesem Pail weist das Signalisiersystem 38 die Fluoreszenzemission der Markiersubstanz in jeder Reaktionskomponente

709849/1169

nach. Dies wird durch die gestrichelte Kurve in Fig. 5 veranschaulicht, welche die Zunahme des nachgewiesenen Fluoreezenzsignale bei der getrennten Einbringung der beiden Reaktionskomponenten zeigt. Für diesen Beiepielsfall kann die Differenziervorrichtung 50 in der oben erwähnten Weise durch einen herkömmlichen Schwellwert- oder Fegeldetektor ersetzt werden. Der Schwellwertdetektor ist so eingestellt, daß er erst dann einen Ausgangsimpuls an die logische Schaltung 52 zur Auslösung des Zeitgebers 46 liefert, wenn das Fluoreszenzsignal einen Pegel annimmt, der anzeigt« daß sowohl die erste Komponenteneinbringung wie auch die zweite Komponenteneinbringung stattgefunden haben. Auf diese Weise wird sichergestellt, daß der Zeitgeber 46 erst ausgelöst wird, nachdem beide markierten Reaktionskomponenten in die Reaktionszone zugeführt wurden.

Die voll ausgezogene Kurve in Figo 5 stellt die Ableitung des Fluoreszenzsignals für die erste und die zweite Komponentenzufuhr für den Fall dar, daß in der Triggerschaltung 44 die Differenziervorrichtung 50 verwendet wird. In diesem Fall kann die logische Schaltung 52 einen herkömmlichen ZweiStufenzähler aufweisen, derart, daß der Zeitgeber 46 nur ausgelöst wird, wenn sowohl ein erster und ein zweiter Impuls von der Differenziervorrichtung 50 erzeugt wurde, als Anzeige dafür, daß die erste und die zweite Reaktionskomponente in die Reaktionszone zugeführt wurde. Selbstverständlich könnte dabei eine automatische Rückstellung des Zählers nach der Auslösung des Zeitgebers 46 bzw. nach Verstreichen einer vorgegebenen Zeit zwischen Eingangeimpulsen vorgesehen sein.

Um zu verhindern, daß erste und zweite Injektionen

709849/1169

derselben Reaktionskomponente bei der oben erwähnten Ausführung zu einer Auslösung des Zeitgebers 46 führen, können in den einzelnen Komponenten unterschiedliche Mengen der Harkiersübstanz vorgesehen werden* Falls beispielsweise die Antigenkomponente eine Einheit der Markiersubstanz enthält und die Antikörperkomponente zwei Einheiten Markiersubstanz, so würde die Einbringung der Antigen- und der Antikörperreaktionskomponenten in die Reaktionszone insgesamt eine Gesamtmenge von drei Einheiten der Markiersubstanz in der Reaktionszone zur Folge haben. Falls Irrtümlich zwei Antigenkomponenten zugeführt würden, wären nur zwei Einheiten Markiersubstanz vorhanden, Falls Irrtümlich zwei Antikörperkomponenten zugeführt würden, wären vier Einheiten Markiersubetanz vorhanden. Somit ist für zwei Injektionen die richtige Kombination von drei Einheiten Markiersubstanz nur dann vorhanden, falls eine Injektion die richtige Antigenkomponente und die andere Injektion die richtige Antikörperkomponente betrifft. Bei einer derartigen Ausführungeform würde man einen Pegeldetektor 50 mit einem bestimmten vorgegebenen "Ansprechfenster" verwenden, in solcher Einstellung, daß ein Ausgangsimpula nur bei einer den drei Einheiten der Markiersubstanz entsprechenden Spannungsausgangsgröße der Photodiode 42 erzeugt wird.

Aus den vorstehenden Darlegungen ist ersichtlich, daß durch die Erfindung die bisher zuzfüberwacbten Zufuhr chemischer Reaktionskomponenten in eine Reaktionszone und zur Signalisierung des Beginns der chemischen Reaktion verwendeten Methoden und Vorrichtungen verbessert werden. Die Einlagerung einer Markiersubstanz in wenigstens einer der Reaktionskomponenten erübrigt die Notwendigkeit der

709849/1169

BAD ORIGINAL

manuellen Betätigung einer Triggerschaltung nach der Einfuhr der betreffenden Komponenten. Indem man außerdem für chemische Isolation bzw. Inertheit zwischen der Markiersubstanz und der chemischen Reaktion sorgt, wird gewährleistet, daß die Messung einer Charakteristik der Reaktion, wie beispielsweise die Lichtstreuung an einem Reaktionsprodukt, durch die Markiersubstanz nicht störend beeinträchtigt wird. Außerdem entfällt hierdurch die Notwendigkeit, ein derartiges Streulichtsignal zusätzlich zur Signalisierung der Einbringung der Reaktionskomponenten heranzuziehen. Bei Verwendung einer fluoreszierenden Markiersubetanz wird eine Störung zwischen der Markiersubetanz und dem gemessenen Streulichtsignal dadurch vermieden, daß man für spektrale Trennung zwischen dem von der Markiersubstanz emittierten Licht und dem Streulicht sorgt. Die Erfindung wurde vorstehend an Hand bevorzugter Aueführungsbeispiele beschrieben, die jedoch selbstverständlich in mannigfachen Einzelheiten abgewandelt werden können, ohne daß hierdurch der Rahmen der Erfindung verlassen wird.

Zusammenfassung;

Die Erfindung betrifft ein System zur chemischen Analyse von Antigenen oder Antikörpern durch Einleitung einer Antigen-Antikörper-Reaktion in einer Reaktionszone und Messung des an einer durch die Reaktion hervorgerufenen Ausfällung gestreuten Lichts zur Bestimmung der Antigen-

709849/1169

Claims

27/A 723

Pat ent anspräche

Verfahren zur kontrollierten Vereinigung der Komponenten einer chemiechen Reaktion, bei welchem die Reaktionskomponenten zur Ingangsetzung der chemischen Reaktion in eine Reaktionszone zugeführt werden und danach eine charakteristische Größe der Reaktion gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man zur überwachung und Signalisierung des Beginns der chemischen Reaktion vor deren Ingangsetzung wenigstens der als letztes Ij die Reaktionszone zugeführten Reaktionskomponente eine Markiersubstanz beifügt, welche gegenüber der überwachten Reaktion chemisch isoliert bzw. inert ist, und daß man die Reaktionszone auf das Auftreten der Mark!ersubstanz überwacht und beim Nachweis der Markiersubstanz ein Signal als Anzeige für den Beginn der chemischen Reaktion erzeugt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Markiersubstanz außer zu der zuletzt zugeführten Reaktionskomponente auch einer zweiten Reaktionskomponente zugesetzt wird und daß man die Reaktionszone aif das Auftreten jeder zugefügten Markiersubstanz überwacht und beim Nachweis beider Markiersubstanzen das den Beginn der chemischen Reaktinn anzeigende Signal erzeugt.
3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß

die Markier substanz den beiden Reaktionskomponenten in unterschiedlichen relativen Mengen zugesetzt wird und daß man die Reaktionszone auf die Gegenwart einer charakteristischen Kombination aus den verschiedenen

709849/1169

ORIGINAL INSPECTED

-ir

kombinierten relativen Mengenanteilen der Markiersubstanz überwacht.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Markiersubstanz wenigstens der Antigen-Komponente oder der Antikörper-Komponente einer chemischen Antigen-Antikörper-Reaktion zugesetzt wird.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Markiersubstanz eine Fluoreszenzsubstanz verwendet wird und daß die Überwachung durch Nachweis des von der Fluoreszenzsubstanz emittierten Fluoreszenzlichts als Signal für den Beginn der chemischen Reaktion erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzsubstanz Oxazin-1-perchlorat verwendet wird.
7· Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, in Anwendung auf eine Reaktion, bei der als charakteristische Größe der Reaktion eine optische Größe in einem ersten Spektralbereich gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszierende Markiersubstanz so ausgewählt wird, daß sie Licht in einem von dem ersten Spektralbereich verschiedenen dritten Spektralbereich emittiert, und daß die Überwachung der Reaktionszone auf das Vorliegen der Markiersubstanz durch Nachweis der Fluoreszenzemiesion in diesem dritten Spektralbereich erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß

709849/1169

-A-

die fluoreszierende Narkiersubstanz Licht in einem von des ersten und dem dritten Spektralbereich verschiedenen «reiten Spektralbereich absorbiert.
9· Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, in Anwendung auf eine chemische Antigen-Antlkörper-Reaktion, wobei als charakteristische Größe der überwachten Reaktion das an einer im Verlauf der Reaktion erzeugten Ausfällung gestreute Licht gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markiersubetanz eine fluoreszierende Substanz einer Komponente der chemischen Antigen-Antikörper-Reaktion zusetzt.
10· Elektrochemisches System zur kontrollierten Vereinigung der Komponenten einer chemischen Reaktion nach dem Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, mit einer Reaktionskammer, in die aufeinanderfolgend mehrere Komponenten der chemischen Reaktion zugeführt werden, sowie mit der Kammer zugeordneten Vorrichtungen zur Messung einer charakteristischen Größe der chemischen Reaktion, gekennzeichnet durch die Beifügung einer Harkiersubstanz zu wenigstens der letzten in die Kammer zugeführten Reaktionskomponente, wobei die Harkiersubstanz bezüglich der Reaktion chemisch isoliert bzw. inert ist; durch der Reaktionskammer (10, 14) zugeordnete, bezüglich der zu messenden charakteristischen Größe der chemischen Reaktion unempfindliche Vorrichtungen (38) sum Nachwels der Harkiersubstanz; sowie durch auf den Nachweis der Harkiersubstanz ansprechende Vorrichtungen (44), welche die Vereinigung der Reaktionskomponenten und damit den Beginn der chemischen Reaktion signalisieren.

709849/1169
11. System nach Anspruch 10, bei welchem die Meßvorrichtung (22, 34) auf eine optische charakteristische Größe der tiberwachten Reaktion anspricht, dadurch gekennzeichnet, daß die Markiersubstanz eine Fluoreszenzsubstanz ist, deren Fluoreszenzemission in einem vom Spektralbereich der charakteristischen optischen Größe der Reaktion verschiedenen Spektralbereich liegt, und daß die Vorrichtung zum Nachweis der Markiersubstanz auf die Fluoreszenzemiseion der Narkiersubstanz, nicht jedoch auf die charakteristische optische Größe der Reaktion anspricht.
12. Elektrochemisches System nach Anspruch 10 oder 11 in Ausbildung als nephelometrischer chemischer Analysator, gekennzeichnet durch eine Reaktionskammer (10, 14) zur Aufnahme der Komponenten der zu überwachenden chemischen Reaktion; Anregungevorrichtungen (18) zur Bestrahlung der Reaktionskammer mit Licht innerhalb eines ersten Spektralbereiche, das an Bestandteilen innerhalb der Reaktionskammer gestreut wird, sowie Vorrichtungen (22) zur Messung des Streulichts als charakteristische Größe der Reaktion für Zwecke der nephelometrischen Analyse; durch eine fluoreszierende Markierungssubstanz in wenigstens einer der zuletzt in die Reaktionskammer zugeführten Reaktionskomponenten, wobei diese Fluoreszenzmarkiersubstanz chemisch gegenüber der zu überwachenden chemischen Reaktion isoliert bzw. inert ist und die fluoreszierende Markiersubstanz Licht in einem zweiten Spektralband absorbiert und Fluoreszenzlicht in einem von dem ersten und von dem zweiten Spektralbereich verschiedenen dritten Spektralbereich emittiert; durch der Reaktionskammer (10,

709849/1 169

zugeordnete, bezüglich der Streulichtkenngröße in dem ersten Spektralbereich unempfindliche gesonderte Vorrichtungen (36) zum Nachweis der Fluoreszenzemission der fluoreszierenden Markiersubstanz in dem dritten Spektralbereich; sowie durch auf den Nachweis der Markiersubstanz ansprechende Vorrichtungen (44), welche die Vereinigung der Reaktionskomponenten und den Beginn der chemischen Reaktion signalisieren.
13« Analysator nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungevorrichtung (18) eine Lichtquelle (24) und ein mit deren Licht beaufschlagtes Primärfilter (28) aufweist, welches Licht in dem ersten und zweiten Spektralbereich in die Reaktionskammer durchläßt, hingegen Licht in dem dritten Spektralbereich unterdrückte
14. Analysator nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (22) zur Messung der charakteristischen Größe der chemischen Reaktion einen Detektor (32) und eine zugeordnete Sekundärfilteranordnung (36) aufweist, welche mit dem in der Reaktionskammer gestreuten Tßzcni?/xürenfe innerhalb des ersten Spektralbereiche an den Detektor (32) durchläßt, hingegen Licht in dem zweiten und dritten Spektralbereich unterdrückt.
15· Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die gesonderte Vorrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzemission der Markiersubstanz einen Detektor (42) und eine zugeordnete Filtervorrichtung (40) aufweist, die mit Licht aus der

709849/116 9

Reaktionskammer (14) beaufschlagt werden und hiervon nur Licht innerhalb des dritten Spektralbereiche an den Detektor (42) durchläßt, jedoch Licht in dem ersten und zweiten Spektralbereich unterdrückt·
16. System nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 15t dadurch gekennzeichnet, daß die auf den Nachweis der Markiersubstanz ansprechende Vorrichtung, welche nach der Vereinigung der Reaktionskomponenten und zu Beginn der chemischen Reaktion ein elektrisches Signal erzeugt, sowie einen mit dem elektrischen Signal der Triggervorrichtung als Triggereingangesignal beaufschlagten und hierdurch ausgelösten Zeitgeber (46)
aufweist.

709849/1 169