CH620371A5

CH620371A5 -

Info

Publication number: CH620371A5
Application number: CH672177A
Authority: CH
Inventors: Robert J Anderson
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Priority date: 1976-06-02
Filing date: 1977-06-01
Publication date: 1980-11-28
Also published as: DE2724723B2; FR2353857A1; DE2724723A1; DE2724723C3; JPS52149195A; JPS5855449B2; CA1082594A; JPS5945941B2; GB1563949A; US4101276A; SE7706412L; SE446230B; FR2353857B1; BE855324A; JPS57156544A

Description

La présente invention concerne un procédé et un appareil pour analyser une réaction chimique. L'invention est particulièrement applicable à une réaction du type antigène/anticorps.

Une méthode classique de dosage des antigènes et des anticorps est fondée sur le fait que les antigènes réagissent avec les anticorps correspondants en créant un précipité. La quantité de précipité produite par une réaction antigène/anticorps est proportionnelle à la concentration en anticorps ou en antigène, selon que l'un ou l'autre est présent en excès. Ainsi, s'il y a un excès d'antigène, la quantité de précipité est proportionnelle à la concentration en anticorps, et vice versa. Pour déterminer la quantité de précipité, on emploie souvent les techniques néphélométriques consistant à mesurer la diffusion subie par un faisceau lumineux qui est dirigé sur la zone de réaction antigène/anticorps. Cependant, les mesures ainsi obtenues peuvent représenter deux concentrations différentes en antigène, selon que c'est l'anticorps ou l'antigène qui est présent en excès.

On décrit par ailleurs un système de dosage des antigènes et des anticorps qui est fondé sur la détermination de la variation maximale de la diffusion lumineuse causée par l'apparition du précipité de la réaction antigène/anticorps. Un aspect important de cette méthode est le fait que le temps qui s'écoule entre le début de la réaction antigène/anticorps et l'instant où la variation de la diffusion lumineuse est maximale indique celui des deux composants de la réaction qui est présent en excès. En d'autres termes, pour différencier une réaction avec excès d'antigène et une réaction avec excès d'anticorps, il suffit de mesurer le temps qui s'écoule entre le début de la réaction et l'instant où la variation de la diffusion lumineuse passe par un maximum. Connaissant le composant en excès, il suffit de choisir la bonne valeur de la concentration en antigène parmi les deux possibles. Le problème se ramène donc à une simple mesure de temps pour laquelle il suffit de déclencher un chronomètre en même temps que la réaction démarre et de l'arrêter quand la variation du signal de diffusion lumineuse passe par son maximum.

En plus des dosages d'antigènes et d'anticorps, il y a d'autres domaines de l'analyse biochimique qui nécessitent une connaissance précise de l'instant de démarrage d'une réaction. Par exemple, pour mesurer le temps de prothrombine d'un plasma sanguin, on mélange un échantillon de plasma avec un réactif de coagulation et on détermine le temps nécessaire à la formation du caillot, comme décrit dans les brevets des E.-U.A. N05 3450501 (Ober-hardt) et 3593568 (Schmitz). En général, la coagulation est surveillée par un photodétecteur qui fournit un signal représentatif de la diffusion lumineuse dans le plasma pendant la formation progressive du caillot. Il est évident que la mesure précise du temps de coagulation suppose une détermination précise de l'instant de démarrage de la réaction.

Comme décrit par ailleurs, dans l'analyse d'une réaction type antigène/anticorps, l'opérateur introduit l'un après l'autre à la

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pipette les composants antigène et anticorps dans la cellule de réaction. L'introduction manuelle à la pipette est également utilisée lorsqu'on veut déterminer le temps de prothrombine par les méthodes d'Oberhardt et Schmitz. Pour détecter le démarrage de la réaction, Oberhardt propose de déclencher un circuit de chronométrage au moyen d'un interrupteur actionné par le plongeur de la pipette. Dans cette solution, un interrupteur est fixé au plongeur de la pipette de façon à être actionné au moment où l'opérateur appuie sur le plongeur pour introduire le contenu de la pipette dans la zone de réaction. La fermeture de cet interrupteur commande le démarrage du chronomètre électronique. Bien qu'un tel interrupteur convienne pour certaines applications, dans le cas présent il constitue une cause d'erreurs inacceptables. En effet si, pour une raison quelconque, la pipette est vide, le fait d'appuyer sur le plongeur déclenche le chronomètre sans qu'aucun produit soit introduit dans la zone de réaction. La même erreur peut se produire sur la nature de la substance introduite. De plus, il y a toujours un risque de fermeture accidentelle de l'interrupteur à un moment quelconque du cycle opératoire. On peut résoudre ce problème en ajoutant un interrupteur d'armement sur le tableau de commande de l'analyseur de manière à empêcher tout déclenchement intempestif du circuit de chronométrage. Cependant, la présence de cet interrupteur d'armement complique l'installation et le mode opératoire. Ainsi, si l'opérateur oublie de fermer au bon moment l'interrupteur d'armement, il introduit le produit dans la zone de réaction sans que le circuit de chronométrage soit déclenché et l'analyse doit donc être recommencée.

Les brevets d'Oberhardt et de Schmitz proposent une seconde solution pour détecter et signaler le début de la réaction chimique dans une détermination de vitesse de coagulation. Pour déterminer le temps de coagulation, un système photoéléctrique détecte la diffusion d'un faisceau lumineux par le caillot en formation et produit un signal électrique représentatif. Dans les deux brevets mentionnés ci-dessus, l'introduction de l'un des composants dans la zone de réaction se traduit par une légère fluctuation du signal électrique qui permet de détecter le début de la réaction. Bien que séduisante, cette solution est difficile à appliquer. En premier lieu, la variation du signal n'est pas un phénomène stable et reproductible. De plus, en particulier dans le cas de mesures néphélomé-triques sur des réactions type antigène/anticorps, l'introduction du second composant réactif ne produit théoriquement aucune variation de la diffusion lumineuse. En effet s'ils sont correctement préparés, les deux composants réactifs sont essentiellement transparents et n'influencent pas sensiblement la diffusion de la lumière. Il est donc évident que cette méthode ne permet pas de connaître avec une bonne précision l'instant de démarrage de la réaction antigène/anticorps, car la variation du signal de diffusion ne devient perceptible qu'au bout d'un certain temps, quand le précipité commence à se former.

En résumé, il existe un besoin certain pour un procédé et un appareil simples et fiables d'analyse d'une réaction chimique fournissant une indication précise de l'instant du démarrage de la réaction. C'est précisément les objets de la présente invention tels qu'ils sont définis dans les revendications 1 et 11 du présent brevet.

Dans le procédé selon l'invention, on ajoute une substance marqueuse au moins au composant introduit en dernier dans la zone de réaction. La substance marqueuse doit être chimiquement inerte vis-à-vis de la réaction. C'est de préférence un composé fluorescent. Dans un mode d'analyse fondé sur la variation d'une caractéristique optique de la zone de réaction, telle que la diffusion de la lumière, la substance marqueuse fluorescente doit de préférence émettre dans une bande spectrale à laquelle le photodétecteur de mesure n'est pas sensible. Plus précisément, on choisira la substance marqueuse de manière qu'elle n'interfère ni avec la réaction chimique, ni avec la mesure néphélométrique. Dans certains cas, on peut incorporer une substance marqueuse à plus d'un composant réactif et ne signaler le démarrage de la réaction qu'après l'introduction de tous les composants marqués.

Les dessins annexés représentent à titre d'exemple un mode de réalisation de l'objet de l'invention.

La fig. 1 est une coupe schématique dans un plan horizontal d'un appareil d'analyse qui comprend une cellule de réaction antigène/anticorps associée à un système néphélométrique et à un détecteur de fluorescence destiné à signaler le démarrage de la réaction.

La fig. 2 est un graphique transmission optique/longueur d'onde illustrant les bandes passantes des différents filtres utilisés dans l'appareil objet de l'invention.

La fig. 3 est un graphique des sensibilités des photodétecteurs mettant en évidence la séparation des réponses du tube photomultiplicateur et de la photodiode.

La fig. 4 donne les caractéristiques d'absorption et d'émission d'une substance marqueuse fluorescente.

La fig. 5 est un graphique du signal de fluorescence et de sa dérivée par rapport au temps dans une application où deux composants marqués sont successivement introduits dans la cellule de réaction.

La fig. 1 représente schématiquement un appareil d'analyse chimique dont la cellule de réaction 10 comprend un bloc opaque 12 dans lequel est formée une chambre de réaction 14. La partie inférieure de la chambre de réaction est munie d'un récipient de verre 16 qui laisse passer la lumière de ou vers le contenu de la zone de réaction. Pour étudier une réaction de type antigène/anticorps par la méthode néphélométrique, l'analyseur comporte un système d'illumination 18 qui dirige un faisceau lumineux dans une ouverture 20 du bloc opaque 12. Ce faisceau traverse le verre 16 et illumine la zone de réaction. La lumière diffusée par le contenu de la zone de réaction est détectée par un système de mesure 22. Le système d'illumination 18 se compose d'une source lumineuse 24, par exemple une lampe à incandescence à filament de tungstène, d'une optique de collimation 26 formant un faisceau parallèle dirigé vers la cellule d'analyse et d'un filtre primaire 28 que le faisceau lumineux traverse avant d'atteindre la zone de réaction.

Le système de mesure 22 comprend un guide d'ondes lumineuses 30 monté dans un trou du bloc 12 avec l'une de ses extrémités adjacente à la zone de réaction pour recueillir une fraction de la lumière diffusée et la transmettre à un détecteur approprié, par exemple un tube photomultiplicateur 32. La sortie du tube photomultiplicateur 32 est appliquée à un circuit de mesure et d'affichage 34 qui fournit une indication du signal lumineux reçu. Un filtre secondaire 36 est interposé entre le guide 30 et le photomultiplicateur 32 pour sélectionner certaines longueurs d'onde de la lumière diffusée par le contenu de la zone de réaction.

Pour un dosage de réaction type antigène/anticorps, les deux composants sont introduits l'un après l'autre dans la zone de réaction de la cellule d'analyse 10 au moyen d'une pipette. Leur mise en présence provoque une réaction qui se manifeste par l'apparition d'un précipité dans la zone de réaction. Le faisceau d'illumination dirigé sur la zone de réaction est diffusé par le précipité et la lumière correspondante est reçue par le système de mesure 22 qui la convertit en un signal électrique représentatif de la quantité de précipité. Cependant, comme on l'a vu plus haut, une même quantité de précipité peut correspondre à deux valeurs possibles de la concentration en antigène suivant que le composant en excès est l'antigène ou l'anticorps. Pour lever ce doute, il suffit de déterminer avec précision le temps qui s'écoule entre le début de la réaction et l'apparition du précipité.

Selon le principe de base de la présente invention, une substance marqueuse fluorescente est ajoutée au moins au dernier composant à être introduit dans la zone de réaction 14 et l'apparition de la fluorescence est surveillée par un système de détection 38. Etant donné que la réaction antigène/anticorps débute quand les deux composants sont mis en présence, l'apparition de la fluorescence signale avec précision l'instant de démarrage de la réaction.

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Le système de détection 38 comprend un filtre passe-haut 40 qui est monté au voisinage de la zone de réaction 14 et un photodétecteur 42, par exemple une photodiode, monté derrière le filtre 40. Le signal de sortie du photodétecteur 42 est appliqué à un circuit de déclenchement 44 qui commande d'autres circuits et en particulier une horloge de chronométrage 46. En résumé, l'introduction du composant marqué dans la zone de réaction produit une fluorescence qui excite le détecteur 42 et le circuit de déclenchement 44. L'horloge 46 est ainsi déclenchée au moment précis où débute la réaction antigène/anticorps.

Le circuit de déclenchement 44 peut comporter un amplificateur 48 recevant le signal de sortie de la photodiode 42, un différen-ciateur 50 et un circuit logique 52. Le différenciateur 50 est sensible aux variations du signal amplifié et fournit des impulsions à la logique 52 qui déclenche l'horloge 46. En variante, on peut remplacer le différenciateur 50 par un circuit à seuil ou un détecteur de niveau qui actionne la logique 52 lorsque le signal du photodétee-teur atteint une valeur prédéterminée. Ce genre de circuit de déclenchement est tout à fait classique.

Pour que le système de détection 38 fonctionne correctement, il faut que l'émission et l'absorption de lumière par la substance fluorescente n'interfèrent pas avec la lumière diffusée qui est transmise au système de mesure 22. Autrement dit, la substance marqueuse ne doit ni absorber ni émettre de la lumière dans la bande spectrale utilisée pour mesurer la diffusion. De plus, pour permettre une bonne discrimination de la lumière émise par la substance marqueuse, il faut que cette émission ait lieu dans une bande spectrale distincte de celle qui est utilisée pour l'excitation de la substance fluorescente. On peut satisfaire à ces différentes conditions en choisissant la substance fluorescente, le filtre primaire 28, le filtre secondaire 36 et le filtre passe-haut 40 de façon à définir trois bandes spectrales séparées. La première de ces bandes est utilisée pour l'excitation et pour la mesure de la lumière diffusée par le précipité. La seconde bande spectrale correspond à la bande d'absorption de la substance fluorescente. La troisième bande spectrale correspond à la bande d'émission de la substance fluorescente.

Le filtre primaire 28 détermine la bande spectrale du faisceau lumineux qui illumine la zone de réaction et qui est diffusé par le précipité. Le filtre 28 sert aussi à définir la bande spectrale d'excitation de la substance fluorescente. Dans un mode de réalisation préféré correspondant à la représentation graphique de la fig. 2, le filtre primaire 28 laisse passer les longueurs d'onde comprises entre environ 400 et 680 nm. En dehors de cette bande, c'est-à-dire en dessous de 400 nm et au-dessus de 680 nm, la lumière est arrêtée par le filtre 28 et ne peut atteindre la zone de réaction.

Le filtre secondaire 36 est associé au tube photomultiplicateur 32 pour isoler certaines longueurs d'onde de la lumière diffusée à détecter. Dans l'exemple de la fig. 2, le filtre secondaire a une longueur d'onde de coupure d'environ 550 nm, c'est-à-dire qu'il arrête les radiations dont les longueurs d'onde sont supérieures à cette valeur.

Le filtre passe-haut 40 du système de détection 38 laisse passer les radiations de longueurs d'onde supérieures à un seuil d'environ 700 nm et arrête toutes les autres radiations en amont de la photodiode 42.

La fig. 3 illustre les réponses du tube photomultiplicateur 32 et de la photodiode 42 associés aux filtres décrits. On voit qu'il y a une bonne séparation spectrale entre la réponse du photomultiplicateur, qui mesure la quantité de précipité, et la réponse de la photodiode, qui indique la présence de la substance marqueuse fluorescente.

En plus de la séparation spectrale entre les réponses du photomultiplicateur et de la photodiode, il est important que la substance marqueuse soit chimiquement inerte vis-à-vis de la réaction antigène/anticorps, c'est-à-dire sans effet sur la formation du précipité et donc sur la diffusion de la lumière. Il est en outre évident que la substance marqueuse ne doit pas introduire dans la zone de réaction une turbidité appréciable qui affecterait la diffusion de la lumière.

Avec les filtres de la fig. 2, on peut utiliser comme substance marqueuse fluorescente l'oxazine-l-perchlorate (O-l-P) qui a un poids moléculaire de 423,90 et un coefficient d'extinction maximal à 645 nm de e= 12,5 x 104 1/mol-cm. Les caractéristiques d'absorp-5 tion et d'émission fluorescente de cette substance sont illustrées sur la fig. 4. On voit que l'O-l-P absorbe la lumière dans une bande spectrale d'environ 550 à 650 nm et la réémet par fluorescence dans une bande d'environ 650 à 800 nm. On notera que ces bandes sont non seulement distinctes, mais aussi séparées spectralement de la io bande dans laquelle est détectée la lumière diffusée. Ainsi, les mécanismes d'absorption et d'émission de la substance fluorescente ne risquent pas d'interférer avec la diffusion de la lumière. Comme indiqué plus haut, cette substance marqueuse n'introduit pas de turbidité appréciable dans la zone de réaction. Elle est de plus 15 chimiquement inerte vis-à-vis de la réaction antigène/anticorps. On est donc certain que la présence de la substance marqueuse ne perturbe ni la réaction elle-même ni les mesures faites sur la lumière diffusée.

20 Exemples:

On prépare une solution de base d'oxazine-l-perchlorate en dissolvant 50 mg d'O-l-P dans 100 ml d'eau désionisée (soit 1,18x10-3 mol/1).

Une solution-tampon de base est également préparée en ajoutant 25 150 mmol de chlorure de sodium,et 4 g de polyéthylèneglycol 6000 à 100 ml d'eau désionisée.

A partir de ces solutions de base, on prépare trois solutions de travail dans lesquelles l'O-l-P est diluée à raison de 1:40,1:101 et 1:201 de la solution totale.

30 Un antisérum de chèvre monospécifique (anticorps) d'un titre de 120-140 mg d'antigène lié par 100 ml, obtenu contre le fragment C'3 du complément humain (ou d'autres protéines telles que IgG, IgA, IgM, etc.) est dilué dans chacune des trois solutions de travail marquées à l'O-l-P à raison d'une partie d'antisérum pour 35 trois parties de solution de travail.

On prépare en outre une nouvelle solution de travail non marquée (sans O-l-P) en dissolvant 150 mmol de chlorure de sodium dans de l'eau désionisée pour diluer des échantillons de sérum (antigène).

.40 Un sérum de contrôle (appelé RSC-19) est dilué avec la nouvelle solution de travail dans les rapports 1:199, 1:39,1:14 et 1:6 rapports sérum/solution de travail). On sait que le sérum RSC-19 contient 350 mg de fragment C'3 par 100 ml.

Chacune des trois solutions d'anticorps contenant la substance 45 marqueuse O-l-P est mélangée avec chacune des solutions de sérum dans la cellule de réaction. Pour chaque essai, on introduit à la pipette 700 (il (le solution-tampon, puis successivement 50jil de chacune des solutions d'antigène et d'anticorps. La solution d'anticorps est introduite la dernière et on mesure la variation correspon-50 dante du signal de tension fourni par la photodiode 42. Avec un filtre primaire 28 coupant à 680 nm, on note une variation de tension de 5 V, 2 V et 1,1 V pour des solutions d'anticorps respectivement diluées à 1:40, 1:101 et 1:201. Avec un filtre primaire coupant à 620 nm, on obtient, dans les mêmes conditions, des variations de 55 tension respectives de 2,8 V, 1,1 V et 0,5 V.

Dans l'exemple ci-dessus, la substance marqueuse fluorescente est incorporée à la solution d'anticorps qui est introduite la dernière dans la zone de réaction. Dans une autre expérience, du sérum de contrôle (antigène) dilué dans les différentes solutions de travail 60 marquées à l'O-l-P est introduit le dernier dans la zone de réaction. La variation de tension obtenue à la sortie de la photodiode 42 est sensiblement la même que dans le premier exemple. On peut donc ajouter la substance marqueuse à n'importe lequel des composants de la réaction antigène/anticorps.

65 Pour assurer un contrôle positif de la présence des deux composants différents dans la zone de réaction, on peut ajouter la substance marqueuse à chacun d'eux, et non pas seulement au dernier à être introduit dans la zone de réaction. Dans ce cas, le système de

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détection 38 signale une variation de l'émission fluorescente chaque fois qu'un composant est introduit. Ce signal de fluorescence est représenté par la courbe en tirets de la fig. 5 qui présente deux décrochements correspondant à l'introduction de chacun des composants. Dans ce système, on peut avantageusement remplacer le 5 différenciateur 50 par un détecteur de niveau classique. Le seuil du détecteur est réglé de façon à produire une impulsion lorsque le signal de fluorescence atteint une valeur correspondant à la présence des deux composants dans la zone de réaction. L'impulsion du détecteur 50 est appliquée à la logique 52 qui déclenche l'horloge 46 io lorsque les deux composants ont été introduits dans la zone de réaction.

La courbe en trait plein de la fig. 5 représente la sortie du différenciateur 50 (s'il est utilisé dans le circuit de déclenchement 44), c'est-à-dire la dérivée du signal de fluorescence représenté en tirets. is Dans ce cas, la logique 52 peut être un compteur à deux étages ne déclenchant l'horloge 46 qu'après avoir reçu les deux impulsions du différenciateur 50 qui matérialisent l'introduction de chaque composant. Un tel compteur est automatiquement remis à zéro après le déclenchement de l'horloge et au bout d'un temps prédéterminé 20 après la réception de la première impulsion.

Pour éviter que le chronométrage soit déclenché par deux injections successives du même composant réactif, on peut ajouter des doses différentes de substance marqueuse aux deux composants. Ainsi, si le composant antigène contient par exemple une unité de 25 substance marqueuse et le composant anticorps par exemple deux unités, leur présence simultanée dans la zone de réaction produira une fluorescence correspondant à trois unités de substance marqueuse. Si, à la suite d'une erreur de manipulation, deux doses de composant antigène sont introduites dans la zone de réaction, la fluorescence résultante sera de deux unités de substance marqueuse. De même, si deux doses de composant anticorps sont introduites dans la zone de réaction, la fluorescence résultante sera de quatre unités de substance marqueuse. En d'autres termes, la valeur correcte (trois unités) n'est obtenue que pour une dose de composant antigène et une dose de composant anticorps. Dans ce cas, le circuit de déclenchement 44 peut comporter un discriminateur qui établit une «fenêtre» de détection centrée sur un signal de fluorescence correspondant à trois unités de substance marqueuse.

On voit donc que la présente invention représente un progrès notable par rapport aux méthodes et aux appareils actuellement utilisés pour surveiller l'introduction des composants chimiques dans une zone de réaction et pour détecter le démarrage de la réaction. Le fait d'incorporer une substance marqueuse au moins au dernier des composants réactifs introduits élimine la nécessité d'un déclenchement manuel du chronométrage au moment de l'introduction du dernier composant. La possibilité de séparer la réaction chimique des effets de la substance marqueuse permet d'effectuer des mesures sur une caractéristique de la réaction, telle que la diffusion de la lumière par un produit de réaction, sans interférence de la part de la substance marqueuse. En outre, le démarrage de la réaction est détecté indépendamment des mesures néphélométriques ou autres. Avec une substance marqueuse fluorescente, on peut éviter une interférence entre les deux phénomènes en choisissant des bandes spectrales distinctes pour la mesure de la lumière diffusée et pour la détection de la fluorescence.

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Claims

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REVENDICATIONS

1. Procédé pour analyser une réaction chimique se produisant entre des composants introduits dans une zone de réaction, suivant lequel on mesure un effet de la réaction, caractérisé en ce que l'on ajoute une substance marqueuse au moins au composant de la réaction introduit en dernier dans la zone de réaction, la substance marqueuse restant chimiquement inerte vis-à-vis de la réaction,

et en ce que l'on produit un signal indiquant l'introduction de la substance marqueuse dans la zone de réaction sans modifier la mesure dudit effet de la réaction.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on ajoute la substance marqueuse à un second composant de la réaction introduit dans la zone de réaction avant ledit composant introduit en dernier; et en ce que l'on produit un signal séparé indiquant l'introduction de la substance marqueuse avec le second composant dans la zone de réaction.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on ajoute la substance marqueuse aux premier et second composants de la réaction en quantités différentes, la valeur des signaux produits étant fonction de la quantité de substance marqueuse dans la zone de réaction, et en ce que l'on sélectionne le signal dont la valeur correspond à la quantité de substance marqueuse présente dans la zone de réaction après introduction du composant de la réaction introduit en dernier.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance marqueuse est une substance fluorescente; et en ce que l'on détecte de la lumière émise par la substance fluorescente pour produire le signal.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la substance fluorescente est de l'oxazine-1-Perchlorate.
6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'effet mesuré de la réaction est un effet optique mesuré dans une première bande spectrale, et en ce que la substance fluorescente est choisie pour qu'elle absorbe et qu'elle émette de la lumière respectivement dans une deuxième et une troisième bande spectrales séparées de la première bande spectrale.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'effet optique est de la lumière diffusée par un précipité formé au cours de la réaction.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la lumière est produite par une source lumineuse munie d'un filtre primaire qui laisse passer la lumière desdites première et deuxième bandes spectrales jusque dans la zone de réaction tout en arrêtant la lumière de ladite troisième bande spectrale.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on filtre la lumière diffusée au moyen d'un filtre secondaire qui laisse passer la lumière de ladite première bande spectrale tout en arrêtant la lumière desdites deuxième et troisième bandes spectrales.
10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on filtre la lumière émise par la substance marqueuse fluorescente au moyen d'un filtre qui laisse passer la lumière de ladite troisième bande spectrale tout en arrêtant la lumière desdites première et deuxième bandes spectrales.
11. Appareil pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 1, comprenant une chambre de réaction pour recevoir successivement une pluralité de composants de réaction, et des moyens pour mesurer ledit effet de la réaction chimique, caractérisé par des moyens séparés pour produire un signal indiquant une variation de la quantité d'une substance marqueuse dans la chambre de réaction, lesdits moyens étant insensibles audit effet de la réaction chimique.
12. Appareil selon la revendication 11, caractérisé en ce que les moyens de mesure mesurent un effet optique de la réaction, et en ce que les moyens pour produire le signal détectent de la lumière fluorescente émise par une substance marqueuse fluorescente qui

émet dans une bande spectrale séparée de celle de l'effet optique de la réaction.
13. Appareil selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens d'excitation pour projeter de la lumière destinée à être diffusée par le contenu de la chambre de réaction, et en ce que les moyens de mesure sont agencés pour mesurer la lumière diffusée.
14. Appareil selon la revendication 11, caractérisé en ce que les moyens pour produire un signal sont agencés pour produire un signal électrique, et en ce qu'il comprend en outre une horloge de chronométrage et des moyens pour conduire le signal électrique à une entrée de déclenchement de l'horloge.
15. Application du procédé selon la revendication 1 à une réaction chimique entre un antigène et un anticorps.