JP2020535403A - 自家蛍光消光アッセイおよび装置 - Google Patents

Abstract

蛍光消光イムノアッセイ法は、基材の自家蛍光信号の消光に依存して液体試料中の分析物の存在または濃度を決定することを含む。蛍光消光イムノアッセイ法を行うための装置も記載される。【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光消光アッセイのための方法および装置に関する。

分析物の存在および／または濃度に対する生物学的試験は、他の用途の中でも、予備診断、規制物質の存在のための試料のスクリーニング、および長期的な健康状態の管理を含む様々な理由のために行われ得る。

側方流動装置（「側方流動イムノアッセイ」としても知られる）は、生物学的試験の一種である。側方流動装置を使用して、分析物の存在について、唾液、血液または尿などの液体試料を試験することができる。側方流動装置の例には、家庭用妊娠検査、家庭用排卵検査、他のホルモンに対する検査、特定の病原体に対する検査、および特定の薬物に対する検査が挙げられる。例えば、欧州特許第０２９１１９４Ａ１号は、妊娠検査を行うための側方流動装置を記載している。

典型的な側方流動試験ストリップでは、液体試料が多孔性ストリップの一端に導入され、次いで、液体試料が毛細管作用（または「ウィッキング」）によってストリップに沿って引き込まれる。側方流動ストリップの一部は、分析物が試料中に存在する場合、分析物に結合して複合体を形成する試薬によって活性化される標識粒子によって前処理される。結合した複合体と、未反応の標識粒子とは、分析物と標識粒子との結合した複合体に結合し、未反応の標識粒子に結合しない固定化結合試薬によって前処理された試験領域に到達するまで、ストリップに沿って伝搬し続ける。標識粒子は、特徴的な色、または他の検出可能な光学的もしくは非光学的特性を有し、１または複数の試験領域内の標識粒子の濃度の変化は、分析物が検出されたという観察可能な指標を提供する。側方流動試験ストリップは、例えば、金ナノ粒子もしくはラテックスナノ粒子、蛍光マーカー分子または磁気標識粒子を使用した比色標識に基づいてもよい。他の側方流動試験ストリップでは、分析物の濃度は、側方流動ストリップの試験部分内に固定化された蛍光色素、タグまたはマーカーの蛍光を消光する標識粒子／物質を使用することに基づいて測定される。

別の様々な生物学的試験には、バイアル、ＰＣＲウェル／プレート、キュベットまたはマイクロ流体セルなどの容器に保持された液体に対して行われるアッセイが含まれる。液体アッセイは、比色分析、蛍光または蛍光消光に基づいて測定され得る。いくつかの液体ベースのアッセイの利点は、それらが非常に小さな（例えば、ピコリットル）容量を使用して試験を行うことを可能にし得ることである。

Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．：「Ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｓｓａｙ」，Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，Ｖｏｌｕｍｅ ８４１，２ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４，Ｐａｇｅｓ ４４ ｔｏ ５０は、ニトロセルロース側方流動ストリップのニトロセルロース膜全体に被覆されたフルオレセイン色素の蛍光を消光するために導入される消光複合体を記載している。分析物を含有すると考えられる液体試料を試料パッドに加え、消光複合体と混合して、液体試料がコンジュゲートパッドを流れる際に分析物消光複合体を形成することができる。分析物消光複合体は、試験ラインに結合し、総蛍光信号を減少させるように作用する。信号のこの減少は、分析物濃度と相関する。この装置は、ニトロセルロース膜全体を蛍光色素によって被覆する必要があり、さらに、分析物の濃度が低い場合、ニトロセルロース膜の自家蛍光によって感度が制限され得る。

欧州特許第０２９１１９４Ａ１号

Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．：「Ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｓｓａｙ」，Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，Ｖｏｌｕｍｅ ８４１，２ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４，Ｐａｇｅｓ ４４ ｔｏ ５０

第１の態様によれば、基材の自家蛍光信号の消光に依存して液体試料中の分析物の存在または濃度を決定することを含む蛍光消光イムノアッセイ法が提供される。

基材は、本質的に蛍光性である材料から形成されてもよい。

基材は、添加されたフルオロフォアまたはリン光物質を含まないか支持しない。基材は、蛍光色素、蛍光タグまたは蛍光分子によって処理されていなくてもよい。

基材は多孔性であってよい。基材は繊維材料から形成されてもよい。繊維材料は、マット、フェルト、または繊維の生地の形態をとってもよい。基材は天然繊維から形成されてもよい。基材は合成有機繊維から形成されてもよい。

基材は、セルロース、ニトロセルロース、リグニン、コラーゲン、コットンおよびシルクのうちの１つ以上を含む繊維から形成されてもよい。基材は紙から形成されてもよい。

該方法は、側方流動イムノアッセイ装置を使用して行われてもよい。

該方法はまた、基材の自家蛍光信号の消光と、基材の自家蛍光信号の消光を引き起こす消光物質の吸光度との組合せに依存して、分析物の存在または濃度を決定することを含んでもよい。

基材は、分析物消光複合体に選択的に結合するための固定化結合試薬によって処理された少なくとも１つの試験領域を含んでもよい。該方法はまた、分析物に選択的に結合して分析物消光複合体を形成するために、液体試料を消光物質に曝露することを含んでもよい。該方法はまた、曝露された液体試料を基材に適用することを含んでもよい。該方法はまた、各試験領域について、対応する自家蛍光信号の減少に依存して分析物の存在または濃度を決定することを含んでもよい。

消光物質は、基材の自家蛍光を消光する消光標識を含んでもよく、消光標識は、抗体または抗原に結合している。固定化結合剤は、抗体または抗原を含んでもよい。消光標識は、エネルギー移動により、電子移動により、および／または基材材料の１つ以上の励起波長の光を吸収することにより、基材の自家蛍光を消光してもよい。

消光物質は、金ナノ粒子を含んでもよい。

基材の自家蛍光は、１つ以上の励起波長によって励起されてもよく、消光物質は、１つ以上の励起波長と重なる第１の波長範囲内で吸収してもよい。分析物の存在または濃度は、各試験領域について、第１の波長範囲の光による照明に応答した試験領域からの自家蛍光信号の変化と、第１の波長範囲内の、試験領域の吸光度の変化との組合せに依存して決定され得る。

該方法は、少なくとも１つの試験領域を含む多孔性ストリップの形態の基材と、多孔性ストリップとの流体連通を可能にするように配置された多孔性コンジュゲートパッドとを含む側方流動イムノアッセイ装置を使用して行われてもよく、コンジュゲートパッドは消光物質を含む。

第２の態様によれば、該方法を行うように構成された装置が提供される。

第３の態様によれば、該方法を行うように適合されたキットが提供される。

第４の態様によれば、液体試料中の分析物の存在または濃度を決定するように構成された蛍光消光イムノアッセイ装置が提供される。装置は、自家蛍光を示す基材を含む。装置はまた、基材の自家蛍光信号を検出するように構成された１つ以上の光検出器を含む。装置はまた、基材の自家蛍光信号の消光に依存して分析物の存在または濃度を決定するように構成された制御装置を含む。

基材は、本質的に蛍光性である材料から形成されてもよい。

基材は、添加されたフルオロフォアまたはリン光物質を含まないか支持しない。基材は、蛍光色素、蛍光タグまたは蛍光分子によって処理されていなくてもよい。

基材は多孔性であってよい。基材は繊維材料から形成されてもよい。繊維材料は、マット、フェルト、または繊維の生地の形態をとってもよい。基材は天然繊維から形成されてもよい。基材は合成有機繊維から形成されてもよい。

基材は、セルロース、ニトロセルロース、リグニン、コラーゲン、コットンおよびシルクのうちの１つ以上を含む繊維から形成されてもよい。基材は紙から形成されてもよい。

装置は、側方流動イムノアッセイ装置の形態をとってもよい。

１つ以上の光検出器は、基材の自家蛍光信号を検出するように構成された少なくとも１つの第１の光検出器を含んでもよい。１つ以上の光検出器は、基材の自家蛍光信号の消光を引き起こす消光物質の吸光度を検出するように構成された少なくとも１つの第２の光検出器を含んでもよい。制御装置は、基材の自家蛍光信号の消光と消光物質の吸光度との組合せに依存して分析物の存在または濃度を決定するようにさらに構成されてもよい。

装置は、液体試料を受容するための多孔性試料受容パッドを含んでもよい。装置はまた、試料受容パッドとの流体連通を可能にするように配置された多孔性コンジュゲートパッドを含んでもよい。コンジュゲートパッドは、分析物に選択的に結合して分析物消光複合体を形成する消光物質を含んでもよい。基材は、コンジュゲートパッドとの流体連通を可能にするように配置された多孔性試験パッドの形態をとってもよい。試験パッドは、分析物消光複合体に選択的に結合するための固定化結合剤によって処理された少なくとも１つの試験領域を含んでもよい。試験パッドは、自家蛍光を示す材料から形成されてもよい。装置はまた、試験パッドとの流体連通を可能にするように配置されたウィックパッドを含んでもよい。各光検出器は、対応する試験領域の自家蛍光信号を検出するように構成されてもよい。制御装置は、各試験領域について、対応する自家蛍光信号の減少に依存して分析物の存在または濃度を決定するように構成されてもよい。試料受容パッドに適用された液体試料は、ウィッキング機構により、コンジュゲートパッドおよび試験パッドを介してウィックパッドに向かって引き込まれてもよい。

装置はまた、基材の自家蛍光を励起するように構成された１つ以上の発光体を含んでもよい。

消光物質は、基材の自家蛍光を消光する消光標識を含んでもよい。消光標識は抗体または抗原に結合していてもよい。固定化結合剤は、抗体または抗原を含んでもよい。消光標識は、エネルギー移動により、電子移動により、および／または基材材料の１つ以上の励起波長の光を吸収することにより、基材の自家蛍光を消光してもよい。

消光物質は、金ナノ粒子を含んでもよい。

１つ以上の光検出器は、少なくとも第１および第２の光検出器を含んでもよい。基材の自家蛍光は、１つ以上の励起波長によって励起されてもよい。消光物質は、１つ以上の励起波長と重なる第１の波長範囲内の光を吸収してもよい。制御装置は、各試験領域について、第１の光検出器を使用して測定された第１の波長範囲の光による照明に応答した試験領域からの自家蛍光信号の変化と、第２の光検出器を使用して測定された第１の波長範囲内の、試験領域の吸光度の変化との組合せに依存して、分析物の存在または濃度を決定するように構成されてもよい。

第１および第２の光検出器は、相互嵌合してもよい。

ここで、本開示の特定の実施形態が、例として、添付の図面を参照して説明される。

蛍光消光イムノアッセイ法を示す。 蛍光消光イムノアッセイ法のプロセスフロー図である。 紫外（ＵＶ）光を使用して照射した際のニトロセルロースを含む基材の自家蛍光のスペクトルを示す。 青色光を使用して照明した際のニトロセルロースを含む基材の自家蛍光のスペクトルを示す。 ニトロセルロース製の基材上の蛍光タンパク質Ｒ−ＰＥの蛍光スペクトルを示す。 蛍光タンパク質Ｒ−ＰＥタグの面積密度の関数としてのピーク蛍光強度の変化を示す。 ニトロセルロースについて測定されたフォトルミネッセンス量子収率（ＰＬＱＹ）を示す。 液体試料を消光物質に曝露する第１の方法を示す。 液体試料を消光物質に曝露する第２の方法を示す。 液体試料を消光物質に曝露する第３の方法を示す。 液体試料を消光物質に曝露する第４の方法を示す。 側方流動試験ストリップを使用して蛍光消光イムノアッセイを行う方法を示す。 側方流動試験ストリップを使用して蛍光消光イムノアッセイを行う方法を示す。 第１の蛍光消光イムノアッセイ装置を示す。 第２の蛍光消光イムノアッセイ装置を示す。 第３の蛍光消光イムノアッセイ装置を示す。 蛍光消光と吸光度とを組み合わせたイムノアッセイ装置を示す。 消光標識による蛍光消光と消光標識の吸光度との組合せに基づく分析物濃度の評価を示す。 蛍光消光イムノアッセイ装置を組み込んだ内蔵型使い捨て側方流動試験装置を示す。

蛍光色素、タグ、分子または他の類似の蛍光マーカーもしくはリン光マーカーの蛍光を消光することに基づく蛍光消光アッセイが提案されてきた。このような特異的に添加された蛍光マーカーは、時にフルオロフォアとも呼ばれ、アッセイを行うために使用される基材上に被覆される。これは、アッセイを行うのに複雑さおよび費用を加える。さらに、基材は、自家蛍光を示す材料から作製されることが多く、言い換えれば、基材材料自体が本質的に蛍光性である場合がある。基材の自家蛍光は、最小化または回避しなければならない誤差の原因と考えられてきた。例えば、自家蛍光を除去するための時間ゲートにリン光色素を使用することによって、または大きなストークスシフトを有する色素を使用することによって。

本明細書では、蛍光色素、タグ、分子または他の類似の蛍光マーカーもしくはリン光マーカーを添加する必要なく、蛍光消光アッセイを行うことを可能にする方法および装置を説明する。代わりに、本明細書は、基材材料の自家蛍光を消光することに基づく蛍光消光イムノアッセイ法および装置に関する。

図１を参照すると、蛍光消光イムノアッセイ法が示されている。

蛍光消光イムノアッセイ法は、自家蛍光光５の形態の、基材４の自家蛍光信号３の消光に依存して、液体試料２中の分析物１の存在または濃度を決定することを含む。液体試料２は、分析物１以外の分子／物質６を含んでもよく、蛍光消光イムノアッセイ法は、目的の分析物１の存在または濃度に特異的である。

基材４は、本質的に蛍光性である材料から形成される。言い換えれば、基材４は、基材４を蛍光させるために、フルオロフォアまたはリン光物質を含まず、および／またはフルオロフォアまたはリン光物質によって処理されていない。例えば、基材４は、蛍光色素もしくはリン光色素、蛍光タグもしくはリン光タグまたは蛍光分子もしくはリン光分子によって処理されていない。

基材４は多孔性であり、繊維材料から形成されてもよい。基材４を形成する繊維材料は、マット、フェルト、または繊維の生地の形態をとってもよい。基材４は、例えば、セルロース、ニトロセルロース、リグニン、コラーゲン、コットンおよびシルクのうちの１つ以上を含む繊維などに由来する天然繊維または合成有機繊維から形成されてもよい。好ましくは、基材４はニトロセルロース繊維から形成される。しかし、他の例では、基材４は紙などの材料から形成されてもよい。

また、図２を参照して、第１の蛍光消光イムノアッセイ法の例を説明する。

この例では、基材４は、分析物消光複合体９に選択的に結合するための固定化結合試薬８によって処理されている少なくとも１つの試験領域７を含む。

分析物１を含有する疑いのある液体試料２は、分析物１に選択的に結合して分析物消光複合体９を形成することができる消光物質１０に曝露される（工程Ｓ１）。消光物質１０は、分析物１に選択的に結合することができる特異的結合試薬１２に結合した消光標識１１を含む。消光標識１１は、基材４による自家蛍光光５の放射を消光する任意の物質、化合物または粒子であり得る。例えば、消光物質１０は、金ナノ粒子、他の金属ナノ粒子、分子消光剤などの形態の消光標識１１を含んでもよい。消光標識１１は、任意の好適な機構により、例えば、エネルギー移動により、電子移動により、および／または基材４材料の自家蛍光を励起する１つ以上の波長の光の吸収などにより、基材の自家蛍光を消光してもよい。特異的結合試薬１２は一般に抗体であるが、いくつかのアッセイでは抗原であってよい。

液体試料２と、消光物質１０が溶解または懸濁されている第２の液体１３（図８）とを混合することによって、液体試料２を消光物質１０に曝露してもよい。あるいは、液体試料２は、消光物質１０によって被覆されているか消光物質１０が含浸された第２の基材１４（図１０）または容器１５（図１１）に適用されてもよい。この後者の場合、消光物質１０は液体試料２によって溶解され得る。

曝露された液体試料１６では、特異的結合試薬１２は分析物１分子に結合するが、非分析物分子６には結合しない。このように、消光物質１０に結合した分析物１を含む分析物消光複合体９が形成される。液体試料２を消光物質１０に曝露してから一定期間が経過した後、曝露された液体試料１６が基材４に適用される（工程Ｓ２）。

例えば、曝露された液体試料１６は、ピペットまたは同様の装置を使用して基材４に直接適用されてもよい。あるいは、曝露された液体試料１６は、試験領域７から離れた基材４の一部に、または基材４と流体連通する別個の基材に適用されてもよく、その後、例えば毛細管作用によって、液体輸送経路に沿って試料４の試験領域７に、曝露された液体試料１６が輸送されてもよい。曝露された液体試料１６が基材４に直接適用される場合、曝露と適用との間の期間は予め決定されていてもよい。あるいは、曝露された液体試料１６が、例えば毛細管流によって試験領域７に輸送される場合、期間は、液体輸送経路の長さ、多孔性、材料および／または他の特性によって決定され得る。

曝露された液体試料１６が基材４の試験領域７に適用／輸送されると、固定化結合試薬８が分析物消光複合体９に特異的に結合して、固定化結合試薬８、分析物１、特異的結合試薬１２および消光標識１１を含む固定化消光複合体１７を形成する。固定化結合剤８は一般に抗体の形態をとるが、いくつかのアッセイでは抗原が使用され得る。固定化結合試薬８は、固定化結合試薬８が非分析物分子６、非結合標識物質１０などに結合しないという意味で特異的である。固定化結合剤８は、基材４上および／または基材４を通る曝露された液体試料１６の流れによる除去を防ぐのに少なくとも十分に試験領域７内の基材４に付着するという意味で固定される。

水または別の好適な溶液もしくは溶媒を用いて基材４を洗浄またはリンスして、試料４の自家蛍光信号３を測定する前にあらゆる非結合標識物質１０および／または非分析物分子６が確実に除去されるようにしてもよい（工程Ｓ３）。

基材４の自家蛍光信号３が測定され、特に、試験領域７または各試験領域７に対応する自家蛍光信号３が測定される（工程Ｓ４）。例えば、自家蛍光信号３は、基材４を励起光１８に曝露し、光検出器を使用して基材４によって放射される結果的に生じる自家蛍光光５を検出することによって測定されてもよい。一般に、光検出器は、迷光および／または散乱励起光１８の検出を回避または最小化するように配置すべきである。例えば、励起光１８を遮断するフィルタを使用することにより、または励起光１８に対して不感であるか、感度が低い光検出器を使用することにより。励起光１８は、特別に設けられた光源によって提供されてもよいか、励起光１８は周囲光であってもよい。周囲光が使用される場合、基材４が自家蛍光を示す波長の光を減衰させながら、所望の励起光、例えばＵＶまたは青色光を通過させるフィルタを通る周囲光によって、基材４が照明され得る。周囲光を使用する実用性は、周囲光の強度および変動性、ならびに周囲光に対する基材４の自家蛍光反応の強度によって制限される場合がある。

試験領域７または各試験領域７内の分析物１の存在または濃度は、その試験領域について測定された自家蛍光信号３の減少ΔＩ（消光とも呼ばれる）に依存して決定される（工程Ｓ５）。減少ΔＩは、曝露された液体試料１６の適用前の試験領域７に対応する初期自家蛍光信号３を参照して決定され得る。基準初期自家蛍光信号３は、アッセイを開始する前の較正工程中に測定されてもよい（工程Ｓ０）。あるいは、減少ΔＩは、試験領域７または各試験領域７に隣接し、固定化結合試薬８によって処理されていない、試料４の領域について観察された自家蛍光信号３を参照することにより決定され得る。

試験対象の液体試料２がさらに存在する場合、プロセスが繰り返される（工程Ｓ６）。

蛍光消光イムノアッセイ法のさらなる特徴は、以下に記載される実施例を参照することにより明らかになるであろう。

また、図３および図４を参照すると、紫外線（ＵＶ）波長（図３）または青色波長（図４）の励起光１８の場合について、ニトロセルロース繊維を含む基材４に対する自家蛍光測定値が示されている。ＵＶ波長の励起光１８は３６５ｎｍ〜３６７ｎｍであり、４０５〜４１０ｎｍのカットオフ波長を有するロングパスフィルタを使用して、自家蛍光スペクトルから励起光１８を濾波した（図３）。青色波長の励起光１８は４４５ｎｍ〜４９０ｎｍであり、５００ｎｍのカットオフ波長を有するロングパスフィルタを使用して、自家蛍光スペクトルから励起光１８を濾波した（図４）。

特に図３を参照すると、下地を有しないニトロセルロースの試料１９（実線）、厚さ１００μｍのポリエステルの透明下地（破線）を有するニトロセルロースの試料２０、およびスライドガラス（点線）上に支持されたニトロセルロースの試料２１に対応する自家蛍光スペクトルが示されている。図４は、各試料１９、２０、２１が青色波長の励起光１８を使用して照射されたことを除いて、同じ試料１９、２０、２１から得られたデータを示す。ニトロセルロース試料のいずれも、蛍光タグまたはリン光タグ、蛍光色素またはリン光色素などのようなリン光材料のフルオロフォアを含有していないか、それらを用いて処理しなかった。

図３および図４から、蛍光タグが存在しない場合であっても、ニトロセルロースが蛍光信号を有することが観察され得る。多くの有機材料のこの現象は、特異的に添加されたタグ／色素などによる蛍光と区別するために、一般に自家蛍光として知られている。典型的には、自家蛍光は、特異的に添加されたタグ／色素の蛍光よりも弱く、広い波長範囲にわたって発生する。図３および図４は、ニトロセルロースの自家蛍光が、ＵＶ波長および青色波長の励起光１８によって励起され得ることを示す。しかし、一部の自家蛍光は、赤色波長の励起光１８を使用しても観察される場合がある。

下地を有しない試料１９と透明下地を有する試料２０との比較は、観察された自家蛍光信号３が、積層または下地ではなく、ニトロセルロース自体に左右されることを示す。下地を有しない試料１９および透明下地を有する試料２０はいずれも、少なくとも２００μｍの厚さのニトロセルロース層を含んでいた。下地を有する、および下地を有しない試料１９、２０は、さらに低い蛍光信号を有する、スライドガラス上のニトロセルロース２１と比較することもできる。スライドガラス上のニトロセルロース２１からの減少した自家蛍光信号は、下地を有する、および下地を有しない試料１９、２０よりも著しく薄い１２μｍの厚さのニトロセルロースから生じる可能性がある。側方流動イムノアッセイ試験では、ニトロセルロース繊維製の多孔性基材４が一般的に使用される。ただし、ニトロセルロース基材４は他のタイプのアッセイに使用される場合がある。さらに、ニトロセルロースと同じ方法で自家蛍光消光アッセイを行うために利用され得る、例えばセルロース、リグニン、コラーゲン、コットン、シルク、紙などの多くの他の材料も自家蛍光を示す場合がある。

本開示は、例えば、色素、タグ、タンパク質などの意図的に添加されたフルオロフォアの消光に基づくアッセイで遭遇する問題を参照して理解することができる。

また、図５を参照すると、ニトロセルロース製の基材４上の蛍光タンパク質Ｒ−ＰＥの蛍光スペクトルが示されている。

図５は、４つの試料から得られたデータを含む。第１の試料２２は、ニトロセルロース繊維（実線）から形成され、Ｒ−ＰＥによって処理されていない基材４であった。第２の試料２３は、ニトロセルロース繊維から形成され、０．０００１％のＲ−ＰＥの溶液によって処理された基材４であった（破線）。第３の試料２４は、ニトロセルロース繊維から形成され、０．００１％のＲ−ＰＥの溶液によって処理された基材４であった（点線）。第４の試料２５は、ニトロセルロース繊維から形成され、０．０１％のＲ−ＰＥの溶液によって処理された基材４であった（鎖線）。測定は、励起光を提供する緑色レーザと、５５０ｎｍロングパスフィルタとを使用して行った。Ｒ−ＰＥは強い蛍光反応をもたらすが、ニトロセルロースから形成された基材４の自家蛍光信号は、低いＲ−ＰＥ濃度では制限因子になることが観察され得る。

また、図６を参照すると、透過２６（実線）形状および反射２７（破線）形状のＲ−ＰＥタグ面積密度の関数としてピーク蛍光強度が示されている。図６には自家蛍光信号３もプロットされている。

Ｒ−ＰＥ蛍光タグの面積密度が減少すると、自家蛍光信号３が反射形状および透過形状の両方の測定値を制限することが観察され得る
従来の蛍光消光ベースのアッセイでは、自家蛍光信号３は望ましくないと考えられ、それを最小化するために多くの方法が用いられてきた。例えば、リン光タグを時間ゲートと組み合わせて使用して、所望の信号のみを測定することができる。ストークスシフトが大きい蛍光色素／タグも使用することができるが、低い分析物濃度範囲では依然として優勢であり得る自家蛍光の寄与が依然として存在する可能性がある。

対照的に、本明細書の発明者らは、最小化または修正しなければならない問題として自家蛍光を見る代わりに、イムノアッセイ法の基礎として自家蛍光信号自体が消光され得ることを認識した。従来の蛍光アッセイでは、基材４の自家蛍光信号の消光は十分に起こり得るが、これは（例えば、時間ゲートまたは大きなストークスシフトに基づくアッセイでは）測定されないか、蛍光タグ／色素／マーカーの消光と区別がつかないほど混同される。あらゆる蛍光タグを省略し、基材４の自家蛍光を意図的に消光することによって、蛍光消光イムノアッセイ法の複雑さを軽減し、高価な蛍光タグ／色素／マーカーの必要性を回避することができる。

また、図７を参照すると、ニトロセルロース（積層された１００μｍポリエステル下地を含む）のフォトルミネッセンス量子収率（ＰＬＱＹ）が波長の関数として示されている。

ＵＶ−青色波長領域では、ニトロセルロースのＰＬＱＹは約１０％であることが観察され得る。したがって、ＰＬＱＹが比較的低くても、消光の検出を可能にするのに十分な自家蛍光信号３が存在することが予測される。

また、図８を参照すると、液体試料２を消光物質１０に曝露する第１の方法が示されている。

液体試料２は、ビーカー、試験管、キュベットなどの容器２８に加えられてもよい。液体試料２は、容器２８内に既に存在していてもよいか、例えば、液体試料２が満たされたピペットスポイト２９またはシリンジ（図示せず）などの任意の好適な手段を使用して加えられてもよい。その後、消光物質１０を含有するある量の第２の液体１３が、例えば、第２の液体１３が満たされたピペットスポイト３０またはシリンジ（図示せず）などの任意の好適な手段を使用して容器２８に加えられてもよい。液体試料２と第２の液体１３とは、容器内で混合して、曝露された液体試料１６を形成する。次いで、曝露された液体試料１６が、容器２８から基材４に移送／適用されてもよい。

また、図９を参照すると、液体試料２を消光物質１０に曝露する第２の方法が示されている。

第２の方法では、アッセイプレート３１を使用して、複数の液体試料２の迅速かつ簡便な試験を可能にする。アッセイプレート３１は、透明基部３２を含む。透明基部３２から多数の中空シリンダ３３が垂直に延びて、多数の試料ウェル３４、例えば第１の試料ウェル３４ａ、第２の試料ウェル３４ｂなどを提供する。各試料ウェル３４が異なる液体試料２を備えてもよいか、いくつかの試料ウェル３４が同じ液体試料２を保持してアッセイ結果の再現／検証を可能にしてもよい。例えば、第１の試料ウェル３４ａは第１の液体試料２ａを保持してもよく、第２の試料ウェル３４ｂは第２の液体試料２ｂなどを保持してもよい。試料ウェル３４は一方向に延びてもよい。さらに典型的には、試料ウェル３４は、２つの方向に延びてアレイを形成する。

例えば、第２の液体１３が満たされたピペット３０またはシリンジ（図示せず）などの好適な液体移送手段を使用して、各試料ウェル３４にある量の第２の液体１３を加えてもよい。分析物消光複合体９の形成を可能にする期間が経過した後、各試料ウェル３４に含まれる曝露された液体試料１６をそれぞれの基材４、または基材４の試験領域７に移送して、蛍光消光イムノアッセイ法を継続してもよい。

また、図１０を参照すると、液体試料２を消光物質１０に曝露する第３の方法が示されている。

容器３５は、消光物質１０によって処理または被覆されている第２の基材１４を保持する。液体試料２は、例えば、液体試料２が満たされたピペット２９またはシリンジ（図示せず）などの好適な液体移送手段を使用して容器３５に加えられる。液体試料２が第２の基材１４に接触し、第２の基材１４に結合していないか強く結合していない消光物質１０が液体試料２に放出されて、分析物消光複合体９を形成する。その後、例えば、所定の期間の後、曝露された液体試料１６を基材４、または基材４の試験領域７に移送／適用して、蛍光消光イムノアッセイ法を継続してもよい。

また、図１１を参照すると、液体試料２を消光物質１０に曝露する第４の方法が示されている。

容器１５は、消光物質１０の薄層３６によって被覆されている。液体試料２は、例えば、液体試料２が満たされたピペット２９またはシリンジ（図示せず）などの好適な液体移送手段を使用して容器１５に加えられる。液体試料２が層３６に接触し、容器１５の壁に結合していないか強く結合していない消光物質１０が液体試料２に放出されて、分析物消光複合体９を形成する。その後、例えば、所定の期間の後、曝露された液体試料１６を基材４、または基材４の試験領域７に移送／適用して、蛍光消光イムノアッセイ法を継続してもよい。

また、図１２Ａおよび１２Ｂを参照すると、側方流動イムノアッセイストリップ／装置３７を使用して蛍光消光イムノアッセイ法を行う方法が示されている。

この例では、基材４は、自家蛍光を示す材料、例えばニトロセルロースから形成された多孔性ストリップ３８の形態をとる。多孔性ストリップ３８は、試験領域７または各試験領域７を含む。ストリップ／装置３７はまた、多孔性ストリップ３８との流体連通を可能にするように配置された多孔性コンジュゲートパッド３９を含む。コンジュゲートパッド３９は、消光物質１０を含む。例えば、コンジュゲートパッド３９は、第２の液体１３の適用、それに続く乾燥または他の好適な手段によって処理されている。主な要件は、消光物質１０がコンジュゲートパッド３９に結合していないか強く結合しておらず、これにより、消光物質１０が接触時に液体試料２に取り込まれ得ることである。ストリップ／装置３７はまた、コンジュゲートパッド３９との流体連通を可能にするように配置された多孔性試料受容パッド４０と、コンジュゲートパッド３９に対して基材４の反対側の端部に、多孔性ストリップ３８との流体連通を可能にするように配置された多孔性ウィックパッド４１とを含む。

側方流動イムノアッセイストリップ／装置３７は、様々な生物学的試験キットである。側方流動イムノアッセイストリップ／装置３７を使用して、分析物１の存在について、例えば唾液、血液、尿、飲料水、食品／飲料製品などの液体試料２を試験してもよい。側方流動イムノアッセイストリップ／装置３７の例には、家庭用妊娠検査、家庭用排卵検査、他のホルモンに対する検査、特定の病原体に対する検査、特定の薬物に対する検査、および飲料水または食品／飲料製品中の不純物／汚染物質に対する検査が挙げられる。

典型的な側方流動イムノアッセイストリップ／装置３７では、試料受容パッド４０に液体試料２が導入され、次いで、毛細管作用（または「ウィッキング」）によって、側方流動イムノアッセイストリップ／装置３７に沿ってウィックパッド４１に向かって液体試料２が引き込まれる。液体試料２は、消光物質１０によって前処理されたコンジュゲート部分３９を通って輸送される。消光物質１０の少なくとも一部が、例えば溶解または懸濁によって液体試料２に取り込まれ、液体試料２中に存在する分析物１が消光物質１０と反応して、分析物消光複合体９を形成する。対照的に、特異的結合試薬１２（例えば抗体／抗原）の特異性は、消光物質１０が非分析物分子６と反応しないことを意味する。結合した分析物消光複合体９、ならびに未反応の消光物質１０およびあらゆる非分析物分子６も、試験領域７に到達するまで側方流動イムノアッセイストリップ／装置３７に沿って伝播し続ける。

試験領域７は、分析物消光複合体９に結合して固定化消光複合体１７を形成し、未反応の消光物質１０または非分析物分子６に結合しない固定化結合試薬８（例えば抗体／抗原）によって前処理される。固定化消光複合体１７は、試験領域７内の基材４材料の自家蛍光を消光するように作用する消光標識１１を含む。消光標識１１は、任意の好適な機構、例えば、エネルギー移動、電子移動によって、または単に基材４材料と相互作用し得る前に励起光１８を吸収もしくは散乱させることによって、基材４材料の自家蛍光を消光してもよい。アッセイを行う前の試験領域７の自家蛍光信号３と比較した場合、または試験領域７の外側の基材４の自家蛍光信号３と比較した場合の自家蛍光信号３の減少ΔＩ（励起光１８の固定強度に対する）に基づいて、試験領域７内の消光標識１１の濃度の変化を測定および定量してもよい。

分析物の濃度が試験領域７内の消光標識１１の濃度に比例するイムノアッセイが記載されているが、蛍光消光イムノアッセイを行う方法は、他のタイプのイムノアッセイ試験に等しく適用することができる。

蛍光消光法は、進行した側方流動イムノアッセイストリップ／装置３７上で行ってもよく、すなわち、液体試料２は、側方流動イムノアッセイストリップ／装置３７に沿って引き込まれるように予め設定された期間放置されている。あるいは、蛍光消光法は、試験領域７内の消光標識１１の濃度が増加するにつれて経時的な自家蛍光信号３のあらゆる減少を追跡する動態学的な、すなわち動的な時間分解測定値を得ることを含み得る。

いくつかの側方流動イムノアッセイストリップ／装置３７はまた、１つ以上の制御領域４２を含む。制御領域４２は、第２の固定化結合試薬４３を含む。第２の固定化結合試薬４３は、制御領域４２内のあらゆる未反応の消光物質１０に選択的に（または非選択的に）結合する抗体または抗原の形態をとる。これにより、液体試料２が多孔性ストリップ３８を通過したこと、および／またはコンジュゲートパッド３９からの消光物質１０の放出に誤差がなかったことの検証を提供し得る。制御領域４２内の未反応の標識粒子１０の濃度は、制御領域４２内の基材４の自家蛍光信号３の消光に基づいて同じ方法で決定することができる。一部の未反応の消光物質１０がウィックパッド４１に到達し得る。

また、図１３を参照すると、第１の蛍光消光イムノアッセイ装置４４が示されている。

第１の装置４４は、１つ以上の光検出器４６から離間された１つ以上の励起光源４５を含み、基材４の試験領域７が受容され得る間隙を画定する。曝露された液体試料１６は、（１または複数の）光源４５と（１または複数の）光検出器４６との間に試験領域７を配置する前または後に試験領域７に適用／輸送される。あるいは、例えば、第１の装置４４が側方流動イムノアッセイ装置３７である場合、（１または複数の）光源４５および（１または複数の）光検出器４６の位置は、基材４に対して固定されてもよい。光検出器４６または各光検出器４６は、基材４からの自家蛍光信号３を検出するように構成される。図１３に示す例では、（１または複数の）光検出器４６は、励起光１８を遮断するか少なくとも著しく減衰させるフィルタ４７を使用して自家蛍光信号３を検出するように構成される。好ましくは、フィルタ４７は、励起光１８を入射強度の１／１０以下に減衰させる。あるいは、第１の装置４４は、励起光１８の波長に対して本質的に不感な光検出器を使用してもよい。

（１または複数の）光検出器４６の出力は、基材４の試験領域７内の消光標識１１の蓄積に応答した基材４の自家蛍光信号３の消光、すなわち減少ΔＩに依存して分析物１の存在または濃度を決定するように構成された制御装置４８によって受け取られる。各消光標識１１は１つの分析物１に結合しているため、消光標識１１の濃度は分析物１の濃度と実質的に同じである（一部の結合していない消光標識１１は、測定時に試験領域７を通過中であり得、および／または曝露された液体試料１６が乾燥するにつれて結合することなく堆積し得る）。

この例では、励起光１８は励起光源４５によって提供されるが、代替例では、励起光１８は自然光などの周囲光であってよい。周囲光が励起光１８を提供する場合、基材４は、自家蛍光光５の波長範囲内の光を遮断するか実質的に減衰させる第２のフィルタ（図示せず）を通して周囲光に曝露されてもよい。周囲光を使用する実用性は、周囲光の強度および変動性、ならびに周囲光に対する基材４の自家蛍光反応の強度によって制限される場合がある。

（１または複数の）光源４５と（１または複数の）光検出器４６との間の光路には、限定するものではないが、スリットまたは他の開口、拡散器、レンズ、追加のフィルタ、ビームスプリッタなどを含む追加の光学部品が含まれてもよい。

第１の装置４４は、吸光度測定のための透過形状と同様に、基材４の対辺／対向面上に（１または複数の）光源４５および（１または複数の）光検出器４６を備えて構成される。ただし、他の構成も使用され得る。

例えば、また、図１４を参照すると、第２の蛍光消光イムノアッセイ装置４９が示されている。

第２の装置４９は第１の装置４４と同様であるが、第２の装置４９は、吸光度測定のための反射形状と同様に、基材４の同一側／同一面に面する（１または複数の）光源４５および（１または複数の）光検出器４６を備えて構成される点が異なる。

このように、第２の装置４９の（１または複数の）光源４５は、試料４の試験領域７を第１の角度θ_１で照明するように配置され、（１または複数の）光検出器４６は、基材４から反射および／または放射される光を受け取るように配置される。基材４から反射および／または放射された光は、一般に、広範囲の異なる角度に散乱される。その結果、（１または複数の）光検出器４６は、基材４から反射および／または放射される光を第１の角度θ_１に等しい必要のない第２の角度θ_２で受け取るように配向され得る。いくつかの例では、第１および第２の角度θ_１、θ_２は等しくてもよい。いくつかの例では、（１または複数の）光源４５および（１または複数の）光検出器４５は共焦点構成で配置されてもよい。基材４から反射および／または放射される光は、基材４の表面または基材４内のある深さから生じ得る。

（１または複数の）光源４５と（１または複数の）光検出器４６との間の光路には、限定するものではないが、スリットまたは他の開口、拡散器、レンズ、追加のフィルタ、ビームスプリッタなどを含む追加の光学部品が含まれてもよい。

また、図１５を参照すると、第３の蛍光消光イムノアッセイ装置５０が示されている。

第３の装置５０は、アレイに配置された多数の光検出器４６を含み、画像センサ５１を形成する。例えば、画像センサ５１はカメラの一部を形成してもよい。画像センサ５１は、基材４の１つ以上の試験領域７の全部または一部を撮像するように配置されてもよい。例えば、基材４、例えば側方流動試験ストリップ装置３７が第３の装置５０に受容されると、画像センサ５１は、１つ以上の試験領域７と基材４材料の周囲領域とを撮像するように配置されてもよい。例えば、側方流動試験ストリップ３７の形態の基材４は、１つ以上の対５２を含んでもよく、各対５２は、試験領域７および制御領域４２を含み、画像センサ５１は、１つ以上の対５２を同時に撮像するように配置されてもよい。画像センサ５１は、フィルタ４７を介して基材４を撮像するように配置されるため、得られる画像は、フィルタ４７を透過した自家蛍光光５に基づいている。

第３の装置５０の光路は、第１の装置４４と同様に配置されてもよく、（１または複数の）光源４５および画像センサ５１は、基材４の対辺／対向面上に配置される。あるいは、図１５に示すように、第３の装置５０の光路は、第２の装置４９と同様に配置されてもよく、（１または複数の）光源４５および画像センサ５１はいずれも基材４の同一側／同一面に面するように配置される。

（１または複数の）光源４５と（１または複数の）光検出器４６との間の光路には、限定するものではないが、スリットまたは他の開口、拡散器、レンズ、追加のフィルタ、ビームスプリッタなどを含む追加の光学部品が含まれてもよい。

自動蛍光消光と吸光度測定との組合せ
また、図１６を参照すると、蛍光消光と吸光度とを組み合わせたイムノアッセイ装置５３が示されている。

組合せ装置５３は、少なくとも１つの第１の光検出器４６ａと少なくとも１つの第２の光検出器４６ｂとを含むことを除いて、第１の装置４４と同様である。第１、第２および第３の装置４４、４９、５０に関連して上述したように、（１または複数の）光源４５は、基材４の自家蛍光を励起する波長Δλ_ｅｘの範囲内、すなわち１つ以上の励起波長Δλ_ｅｘの範囲内の光を放射する。上述したように、消光標識１１は、基材４の自家蛍光信号３を消光するように選択される。ただし、組合せ装置５３とともに使用するために、消光標識１１および／または励起波長Δλ_ｅｘはまた、消光標識１１が、励起波長Δλ_ｅｘの範囲と重なる吸収波長範囲Δ_λａｂｓの測定可能な吸光度を示すように選択される。

また、図１７を参照すると、自家蛍光信号３の消光ΔＩと、吸光度信号５５の増加ΔＩ_ａｂｓとが、試験領域７に対する位置の関数として概略的に示されている。

各第１の光検出器４６ａは、消光標識１１の濃度から生じる自家蛍光信号３の消光ΔＩの測定を可能にするように、基材から放射される自家蛍光光５を検出するように構成される。対照的に、各第２の光検出器４６ｂは、消光標識１の濃度から生じる吸光度信号５５の増加ΔＩ_ａｂｓの測定を可能にするように、基材４を透過した励起光１８を検出するように構成される。好ましくは、第１および第２の光検出器４６ａ、４６ｂは近接して配置される。例えば、第１および第２の光検出器４６ａ、４６ｂは、相互嵌合している。

例えば、図１６に示す例では、第１の光検出器４６ａは、基材４を透過する励起光１８を排除するか、少なくとも実質的に減衰させるフィルタ４７を使用して、自家蛍光光５を検出するように構成される。同様に、第２の光検出器４６ｂは、第２のフィルタ５４を使用して励起光１８を検出するように構成される。第２のフィルタ５４は、基材４から放射された自家蛍光光５を排除するか、少なくとも実質的に減衰させながら、励起光１８を減衰させることがないか、減衰を最小化しながら透過させるように構成される。第１および第２の光検出器４６ａ、４６ｂが相互嵌合すると、フィルタ４７、５４はそれに応じて相互嵌合する。

あるいは、第１の光検出器４６ａまたは各第１の光検出器４６ａは、自家蛍光光５に本質的に敏感であり、励起光１８に本質的に不感であり得、各第２の光検出器４６ｂは、励起光１８に本質的に敏感であり、自家蛍光光５に本質的に不感であり得る。そのような固有の感度は、それぞれ自家蛍光光５または励起光１８などに合わせて調整されたマイクロキャビティを含む異なる光学活性材料を含む光検出器４６ａ、４６ｂを使用することにより提供され得る。

制御装置４８は、（１または複数の）第１の光検出器４６ａから信号を受け取り、上述のように、すなわち、初期自家蛍光信号３を参照するか、試験領域７の外側の基材４の部分から得られた自家蛍光信号３を参照することにより、自家蛍光信号３の消光ΔＩを決定する。基材４の他の部分からの自家蛍光信号３は、試験領域７の外側にある追加の光検出器４６ａを使用するか、基材４および／または光検出器４６ａの並進によって得られ得る。

再び図２を参照すると、制御装置４８はまた、アッセイを開始する前に得られた基材４の初期吸光度を参照することにより（１または複数の）第２の光検出器４６ｂから受け取った信号を比較することによって、吸光度信号５５の増加ΔＩ_ａｂｓを決定する（工程Ｓ４ｂ）。あるいは、吸光度信号５５の増加ΔＩ_ａｂｓは、試験領域７の外側の基材４の部分から得られた吸光度信号５５を参照することにより（１または複数の）第２の光検出器４６ｂから受け取った信号を比較することによって決定されてもよい。基材４の他の部分からの吸光度信号５５は、試験領域７の外側にある追加の光検出器４６ａを使用するか、基材４および／または光検出器４６ａの並進によって得られ得る。

測定された各試験領域７について、制御装置は、試験領域７からの自家蛍光信号３の変化ΔＩと、試験領域７の吸光度信号５５の変化ΔＩ_ａｂｓとの組合せに依存して分析物１の存在または濃度を決定するように構成される。

このように、消光標識１１による自家蛍光信号３の消光および励起光１８の吸光度の両方を利用することによって、分析物１の濃度を改善された精度および感度で決定することができる。例えば、分析物１の濃度は、自家蛍光信号３に基づいて決定された第１の濃度値と吸光度信号５５に基づいて決定された第２の濃度値との平均として決定されてもよい。

さらに、消光標識１１による自家蛍光信号３の消光および励起光１８の吸光度の両方を利用することによって、決定された分析物濃度の品質および信頼性の評価を得てもよい。例えば、自家蛍光信号３に基づいて決定された第１の濃度値と吸光度信号５５に基づいて決定された第２の濃度値との差に基づいて品質評価を得てもよい。大きな偏差は、アッセイ結果に欠陥があるかアッセイ結果が信頼できないことを示している可能性がある。

組合せ装置５３については、第１の装置４と同様に、（１または複数の）光源４５および光検出器４６ａ、４６ｂが基材の対辺／対向面上に配置されるため、透過形状の吸光度信号５５が得られる例を参照して説明してきた。しかし、代替の組合せ装置（図示せず）を第２の装置４９と同様に構成して、代わりに反射形状の吸光度信号５５が得られるようにしてもよい。さらに他の代替の組合せ装置（図示せず）が、第３の装置５０と同様の方法で画像センサ５１を使用するように構成されてもよい。

側方流動消光アッセイ装置
また、図１８を参照すると、第１の蛍光消光イムノアッセイ装置４４は、内蔵型使い捨て側方流動試験装置５６に統合されてもよい。

側方流動試験装置５６は、液体試料２を受容するための多孔性試料受容パッド４０を含む。側方流動試験装置５６はまた、試料受容パッド４０との流体連通を可能にするように配置された多孔性コンジュゲートパッド３９を含む。コンジュゲートパッド３９は、分析物１に選択的に結合して分析物消光複合体９を形成する消光物質１０を含む。側方流動試験装置５６はまた、コンジュゲートパッド３９との流体連通を可能にするように配置された多孔性ストリップ／パッド３８の形態の基材４を含む。多孔性ストリップ３８は、分析物消光複合体９に選択的に結合するための固定化結合試薬８によって処理された少なくとも１つの試験領域７を含む。多孔性ストリップの形態の基材４は、自家蛍光を示す材料から形成される。側方流動試験装置５６はまた、多孔性ストリップ３８との流体連通を可能にするように配置されたウィックパッド４１を含む。

側方流動試験装置５６はまた、少なくとも１つの光検出器４６を含み、各光検出器４６は、対応する試験領域７または制御領域４２の自家蛍光信号３を検出するように構成される。側方流動試験装置５６はまた、試験領域７もしくは制御領域４２または各試験領域７もしくは各制御領域４２に対応する１または複数の自家蛍光信号３の減少ΔＩに依存して分析物１の存在または濃度を決定するように構成された制御装置４８を含む。試料受容パッド４０に適用された液体試料２は、ウィッキングまたは毛細管流機構により、コンジュゲートパッド３９および多孔性ストリップ３８を通って流れ方向５７にウィックパッド４１に向かって引き込まれる。側方流動試験装置５６はまた、多孔性ストリップ４材料の自家蛍光を励起するように構成された１つ以上の光源４５を含んでもよい。

消光物質１０は、多孔性ストリップ３８材料の自家蛍光を消光する消光標識１１を含んでもよい。消光標識１１は、抗体または抗原に結合していてもよい。固定化結合剤８は、抗体または抗原を含んでもよい。消光標識１１は、エネルギー移動により、電子移動により、および／または多孔性ストリップ３８材料の１つ以上の励起波長の光を吸収することにより、多孔性ストリップ３８材料の自家蛍光を消光してもよい。消光標識１１は、金ナノ粒子の形態をとってもよい。

使い捨て側方流動試験装置５６は、試料受容パッド４０、コンジュゲートパッド３９、多孔性ストリップ３８およびウィックパッド４１が基部５８に受容されるようにパッケージ化される。蓋５９が基部５８に取り付けられて、試料受容パッド４０、コンジュゲートパッド３９、多孔性ストリップ３８およびウィックパッド４１を固定し、液体試料２、照明、観察、測定などを受けるために露出を必要としない部分を覆う。蓋５９は、試料受容パッド４０の一部を露出させて液体試料受容領域６１を画定する試料受容窓６０を含む。蓋および基部５８、５９は、例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレンまたは同様の材料などのポリマーから作製される。

図１８に示す例では、基部５８は、一対の光源４５が受容される凹部６２を含む。各光源４５は、上述のように構成されてもよい。光源４５は、発光ダイオード（ＬＥＤ）、好ましくは有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）の形態をとってもよい。蓋５９は、一対の光検出器４６が受容される凹部６３を含む。励起光１８を遮断するためにフィルタ４７が使用される場合、フィルタ４７は、好ましくは、対応する光検出器４６に積層されるか、組み込まれる。光検出器４６は、フォトダイオード、好ましくは有機フォトダイオード（ＯＰＤ）の形態をとってもよい。一対の光源４５および光検出器４６が、多孔性ストリップ３８の試験領域７の対辺に配置される。光源４５および光検出器４６の第２の対が、多孔性ストリップ３８の制御領域４２の対辺に配置される。

スリット部材６４は、多孔性ストリップ３８から光源４５を分離して、１００μｍ〜１．５ｍｍ、さらに好ましくは３００μｍ〜５００μｍの範囲の幅を有する狭いスリット６５を画定する。スリット部材６４は、多孔性ストリップ３８の幅を横切って延びるスリット６５を画定する。例えば、多孔性ストリップ３８が第１の方向ｘに延び、第３の方向ｚに厚さを有する場合、スリット６５は第２の方向ｙに延びる。追加のスリット部材６４は、多孔性ストリップ３８から光検出器４６を分離するスリット６５を画定する。スリット６５は、水分が凹部６２、６３に入るのを防ぐために、透明材料の薄層（図示せず）によって覆われてもよい。材料が、波長λの光の７５％超、８５％超、９０％超または９５％超を透過させる場合、特定の波長λに対して透明であると考えられ得る。各光源４５と対応するスリット６５との間に拡散器（図示せず）が含まれてもよい。光検出器４６にフィルタ４７を積層するか組み込む代わりに、透明材料の薄層（図示せず）の代わりにフィルタ４７を設けて、凹部６３に湿気が入るのを防いでもよい。

液体試料２は、例えば、スポイト２９、シリンジ（図示せず）または同様の器具を使用して、試料受容窓６０を通して試料受容パッド４０に導入される。液体試料２は、試料受容パッド４０、コンジュゲートパッド３９、多孔性ストリップ３８およびウィックパッド４１の多孔性の毛細管作用またはウィッキング作用により、ウィックパッド４１に向かって流れ方向５７に輸送される。試料受容パッド４０は、典型的には、繊維状セルロースフィルタ材料から作製される。

上述したように、コンジュゲートパッド３９は消光物質１０によって前処理される。コンジュゲートパッド３９は、典型的には、繊維状ガラス、セルロースまたは表面改質ポリエステル材料から作製される。

液体試料２、１６のフローフロントが、基材４を提供する多孔性ストリップ３８内に移動すると、分析物消光複合体９および非結合消光物質１０がウィックパッド４１に向かって運ばれる。多孔性ストリップ３８は、１つ以上の試験領域７と、対応する光源４５と光検出器４６との対によって監視される制御領域４２とを含む。各試験領域７は、分析物消光複合体９に特異的に結合し、未反応の消光物質１０または非分析物分子６に結合しない固定化結合試薬８によって前処理される。分析物消光複合体９が試験領域７に結合すると、試験領域７内の消光標識１１の濃度が増加する。この濃度の増加は、自家蛍光信号３の減少を測定することによって監視されてもよい。試験領域７の自家蛍光信号３は、液体試料２が加えられてから設定期間が終了すると測定されてもよい。あるいは、試験領域７の吸光度は、アッセイが進行するにつれて、連続的に、または規則的な間隔で測定されてもよい。陰性試験と単に正しく機能しなかった試験とを区別するために、試験領域７に加えて、間に制御領域４２が設けられることが多い。制御領域４２は、非結合消光物質１０に特異的または非特異的に結合する第２の固定化結合試薬４３によって前処理される。このように、側方流動試験装置５６が正しく機能し、液体試料２がコンジュゲートパッド３９および試験領域７を通過した場合、制御領域４２は自家蛍光信号３の減少を示す。制御領域４２の自家蛍光信号３は、試験領域７の場合と同様に、光源４５と光検出器４６との第２の対によって測定され得る。多孔性ストリップ３８は、典型的には、繊維状ニトロセルロース、または自家蛍光を示す他の好適な繊維材料から作製される。

分析物の濃度が試験領域７内の消光標識１１の濃度に比例するイムノアッセイが記載されているが、蛍光消光イムノアッセイを行う方法は、他のタイプのイムノアッセイ試験に等しく適用することができる。

ウィックパッド４１は、多孔性ストリップ３８を通過した液体試料２を吸収し、液体試料２の貫流を維持するのに役立つ。ウィックパッド４１は、典型的には、繊維状セルロースフィルタ材料から作製される。

修正
上述の実施形態に多くの修正を加えることができることを理解されたい。このような修正は、蛍光消光イムノアッセイ法および／または分析試験装置の設計、製造および使用において既に知られており、本明細書中に既に記載されている特徴の代わりにまたはそれに加えて使用することができる同等の特徴および他の特徴を含むことができる。一実施形態の特徴は、別の実施形態の特徴によって置き換えられるか補足されてもよい。

内蔵型使い捨て側方流動試験装置５６に統合された第１の蛍光消光イムノアッセイ装置４４の例を図１８に示す。あるいは、内蔵型側方流動試験装置５６と同様の方法で、内蔵型使い捨て型側方流動試験装置（図示せず）に第２または第３の蛍光消光イムノアッセイ装置４９、５０のいずれかを統合してもよい。

使い捨て側方流動試験装置の他の例（図示せず）には、統合された蛍光消光および吸光度イムノアッセイ装置の組合せ５３が含まれ得る。例えば、図１８に示す例は、光検出器４６を第１および第２の相互嵌合した光検出器４６ａ、４６ｂに置き換えるように修正されてもよい。そのような例は、透過形状で（第１の装置４４および組合せ装置５３と同様）、反射形状で（第２の装置４９と同様）、または透過形状もしくは反射形状のいずれかで画像センサ５１を使用して（第３の装置５０と同様）、吸光度測定を得るように構成されてもよい。

本出願では、特徴の特定の組合せに対して特許請求の範囲が策定されているが、本開示の範囲には、本明細書に明示的または暗示的に開示されたあらゆる新規の特徴もしくは特徴のあらゆる新規の組合せ、またはそのあらゆる一般化も含まれることを理解されたい。出願人はここに、本出願またはそこから派生するあらゆるさらなる出願の審査中に、そのような特徴および／またはそのような特徴の組合せに対して新しい請求項を策定し得ることを通知する。

Claims (25)

1. 基材の自家蛍光信号の消光に依存して液体試料中の分析物の存在または濃度を決定することを含む、蛍光消光イムノアッセイ法。
2. 前記基材が、本質的に蛍光性である材料から形成される、請求項１に記載の蛍光消光イムノアッセイ法。
3. 前記基材が、添加されたフルオロフォアまたはリン光物質を含まない、請求項１または請求項２に記載の蛍光消光イムノアッセイ法。
4. 前記基材が多孔性である、請求項１から３のいずれか一項に記載の蛍光消光イムノアッセイ法。
5. 前記基材が、セルロース、ニトロセルロース、リグニン、コラーゲン、コットンおよびシルクのうちの１つ以上を含む繊維から形成される、請求項１から４のいずれか一項に記載の蛍光消光イムノアッセイ法。
6. 前記蛍光消光イムノアッセイ法が、側方流動イムノアッセイ装置を使用して行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の蛍光消光イムノアッセイ法。
7. 前記基材の前記自家蛍光信号の消光と、前記基材の自家蛍光信号の消光を引き起こす消光物質の吸光度との組合せに依存して、前記分析物の存在または濃度を決定することをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の蛍光消光イムノアッセイ法。
8. 前記基材が、分析物消光複合体に選択的に結合するための固定化結合試薬によって処理された少なくとも１つの試験領域を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の蛍光消光イムノアッセイ法であって、前記蛍光消光イムノアッセイ法が、
   前記分析物に選択的に結合して分析物消光複合体を形成するために、前記液体試料を消光物質に曝露することと、
   前記曝露された液体試料を前記基材に適用することと、
   各試験領域について、対応する自家蛍光信号の減少に依存して前記分析物の存在または濃度を決定することと
   を含む、蛍光消光イムノアッセイ法。
9. 前記消光物質が金ナノ粒子を含む、請求項８に記載の蛍光消光イムノアッセイ法。
10. 前記基材の自家蛍光が１つ以上の励起波長によって励起され、前記消光物質が、１つ以上の励起波長と重なる第１の波長範囲内で吸収し、
    前記分析物の存在または濃度が、各試験領域について、
    前記第１の波長範囲の光による照明に応答した前記試験領域からの前記自家蛍光信号の変化と、
    前記第１の波長範囲内の、前記試験領域の吸光度の変化と
    の組合せに依存して決定される、請求項８または請求項９に記載の蛍光消光イムノアッセイ法。
11. 請求項８から１０のいずれか一項に記載の蛍光消光イムノアッセイ法であって、前記蛍光消光イムノアッセイ法が、
    前記少なくとも１つの試験領域を含む多孔性ストリップの形態の基材と、
    前記多孔性ストリップとの流体連通を可能にするように配置された多孔性コンジュゲートパッドと
    を備える側方流動イムノアッセイ装置を使用して行われ、前記コンジュゲートパッドが前記消光物質を含む、蛍光消光イムノアッセイ法。
12. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の蛍光消光イムノアッセイ法を行うように構成された装置。
13. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の蛍光消光イムノアッセイ法を行うように適合されたキット。
14. 液体試料中の分析物の存在または濃度を決定するように構成された蛍光消光イムノアッセイ装置であって、前記蛍光消光イムノアッセイ装置が、
    自家蛍光を示す基材と、
    前記基材の自家蛍光信号を検出するように構成された１つ以上の光検出器と、
    前記基材の前記自家蛍光信号の消光に依存して前記分析物の存在または濃度を決定するように構成された制御装置と
    を備える、蛍光消光イムノアッセイ装置。
15. 前記基材が、本質的に蛍光性である材料から形成される、請求項１４に記載の装置。
16. 前記基材が、添加されたフルオロフォアまたはリン光物質を含まない、請求項１４または請求項１５に記載の装置。
17. 前記基材が多孔性である、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の装置。
18. 前記基材が、セルロース、ニトロセルロース、リグニン、コラーゲン、コットンおよびシルクのうちの１つ以上を含む繊維から形成される、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の装置。
19. 前記装置が側方流動イムノアッセイ装置である、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の装置。
20. 請求項１４から１９のいずれか一項に記載の装置であって、前記１つ以上の光検出器が、
    前記基材の自家蛍光信号を検出するように構成された少なくとも１つの第１の光検出器と、
    前記基材の自家蛍光信号の消光を引き起こす消光物質の吸光度を検出するように構成された少なくとも１つの第２の光検出器と
    を備え、
    前記制御装置が、前記基材の前記自家蛍光信号の消光と前記消光物質の前記吸光度との組合せに依存して前記分析物の存在または濃度を決定するようにさらに構成される、装置。
21. 請求項１４から２０のいずれか一項に記載の装置であって、前記装置が、
    前記液体試料を受容するための多孔性試料受容パッドと、
    前記試料受容パッドとの流体連通を可能にするように配置された多孔性コンジュゲートパッドであって、前記コンジュゲートパッドは、前記分析物に選択的に結合して分析物消光複合体を形成する消光物質を含む、多孔性コンジュゲートパッドと、
    前記コンジュゲートパッドとの流体連通を可能にするように配置された多孔性試験パッドの形態の前記基材であって、前記試験パッドは、分析物消光複合体に選択的に結合するための固定化結合剤によって処理された少なくとも１つの試験領域を含み、前記試験パッドは自家蛍光を示す材料から形成される、前記基材と、
    前記試験パッドとの流体連通を可能にするように配置されたウィックパッドと
    を備え、
    各光検出器が、対応する試験領域の自家蛍光信号を検出するように構成され、
    前記制御装置が、各試験領域について、対応する自家蛍光信号の減少に依存して前記分析物の存在または濃度を決定するように構成され、
    前記試料受容パッドに適用された前記液体試料が、ウィッキング機構により、前記コンジュゲートパッドおよび前記試験パッドを介して前記ウィックパッドに向かって引き込まれる、装置。
22. 前記基材の自家蛍光を励起するように構成された１つ以上の発光体をさらに備える、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の装置。
23. 前記消光物質が金ナノ粒子を含む、請求項２１または請求項２２に記載の装置。
24. 請求項２１から２３のいずれか一項に記載の装置であって、前記１つ以上の光検出器が少なくとも第１および第２の光検出器を備え、前記基材の自家蛍光が１つ以上の励起波長によって励起され、前記消光物質が、１つ以上の励起波長と重なる第１の波長範囲内で吸収し、
    前記制御装置が、各試験領域について、
    前記第１の光検出器を使用して測定された、前記第１の波長範囲の光による照明に応答した各試験領域からの前記自家蛍光信号の変化と、
    前記第２の光検出器を使用して測定された、前記第１の波長範囲内の、前記試験領域の吸光度の変化と
    の組合せに依存して、前記分析物の存在または濃度を決定するように構成される、装置。
25. 前記第１および第２の光検出器が相互嵌合している、請求項２４に記載の装置。

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