KR20080016603A

KR20080016603A - 생화학 물질의 분석 방법

Info

Publication number: KR20080016603A
Application number: KR1020077028358A
Authority: KR
Inventors: 요시노부 고하라; 히데유끼 노다; 데루유끼 고바야시; 구니히로 수또
Original assignee: 히다치 가세고교 가부시끼가이샤
Priority date: 2005-05-20
Filing date: 2006-02-10
Publication date: 2008-02-21
Also published as: KR100967246B1; CN101180530B; JPWO2006123459A1; AU2006246598A1; AU2006246598B2; US8178305B2; EP1884766A1; WO2006123459A1; TW200722523A; CN101180530A; TWI368657B; JP4655088B2; EP1884766A4; US20090298094A1

Abstract

본 발명은, 미세 유로를 사용하며, 고상에 대상 물질을 포착하는 분자를 붙인 검출 디바이스에 있어서, 고감도로 정량적인 발광에 의한 분석 방법을 실현한다. 고상에 결합시킨 프로브를 갖는 액로상의 디바이스에, 검출 대상이 되는 생화학 물질을 포착하고, 발광을 위한 표지를 한 후, 발광 시약을 유입시켜 프로브 근방의 발광을 광학적으로 검출한다.

검출 디바이스, 발광 시약, 미세 유로, 프로브

Description

생화학 물질의 분석 방법 {METHOD OF ANALYZING BIOCHEMICAL}

본 발명은 생화학 물질의 분석 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생화학 물질을 특이적으로 포착하는 물질인 프로브를 고상에 고정시킨 분석 디바이스를 사용한 생화학 물질의 분석 장치에 관한 것이다.

종래, 생화학 물질의 고감도 검출에는 형광법이 이용되어 왔다. 이 방법은, 그 이전에 행해졌던 방사성 동위체를 이용하는 수법에 비해 취급이 용이하고, 방사능에 대한 안전 대책이 불필요하기 때문에 급속히 교체되었다. 형광법에는, 검출 대상이 되는 생화학 물질에 대하여 형광체를 직접 표지하는 방법과 간접 표지하는 방법이 있다. 형광 면역 검사를 예로 들면, 검출 대상이 되는 생화학 물질에 직접 형광체를 표지하고, 이 형광 표지된 생화학 물질을, 고상에 고정시킨 항체로 포착하여 검출하는 것이 전자이다. 소위 경합법도 이러한 분류에 포함된다. 후자로는, 동일한 생화학 물질에 대하여 친화성이 있는 항체를 형광 표지해두고, 2차적으로 반응시키는 샌드위치 분석법 등이 있다.

그의 한편으로 화학 발광법이 발달해왔다. 화학 발광의 경우에는, 여기광의 산란이 배경광으로서 계측되지 않기 때문에, 보다 고감도의 계측을 실현할 수 있다. 화학 발광의 경우에는, 검출 대상이 되는 생화학 물질에 직접적 또는 간접적 으로 효소를 표지하는 경우와, 형광체를 표지하는 경우가 있다. 전자의 경우에는, 효소로서 퍼옥시다제나 알칼리 포스파타제가 자주 사용된다. 소위 ELISA법은 이 분류에 들어간다. 대상으로 하는 생화학 물질을 포착하는 항체를 마이크로플레이트(microplate) 벽 등에 고정시켜 두고, 검출 대상 물질을 포함하는 용액을 첨가한다. 용액 중의 검출 대상 물질은 항체에 의해 벽면에 포착되고, 여분의 용액은 씻겨 버려진다. 거기에 검출 대상이 되는 물질에 대한 효소 표지 항체를 첨가하고, 이 효소 표지 항체가 검출 대상 물질에 결합하는 것을 기다려, 여분의 용액을 씻어버린다. 마지막으로 효소와 반응하는 발광 시약을 포함하는 용액을 넣고, 생성되는 발광을 검출한다. 형광체를 표지한 경우, 예를 들면 HPLC의 검출기로서 응용한 경우에는, HPLC로부터 유출되는 각 형광 표지된 분자에 대하여, 화학적 여기제를 혼합 반응시켜, 표지된 형광체가 화학 여기되어 발하는 화학 발광을 검출한다.

다항목의 검출 디바이스로서는, 프로브를 결합시킨 비드를 세관에 배열한 기술(이하, 비드 어레이라 함)이 있었다(예를 들면 특허 문헌 1). 또한, 미세 유로를 사용하여 고상에 대상 물질을 포착하는 분자를 결합시킨 검출 디바이스에 대한 보고가 있었다(예를 들면 특허 문헌 2)

특허 문헌 1: 일본 특허 공개 (평)11-243997호 공보

특허 문헌 2: 일본 특허 공개 (평)11-075812호 공보

화학 발광이나 생물 발광 등의 발광 검출법에 대해서는, 형광법과 비교하여 대상으로부터 얻어지는 단위 시간당 광자수는 적어지기 때문에, 고감도의 계측계를 이용하고, 또한 계측 시간을 늘리는 등의 고안이 필요해진다.

비드 어레이에 대해서는, 일반적으로 검출 대상 물질에 미리 형광 표지를 행하고, 그 형광 표지 물질의 비드 상의 프로브에의 포착을 형광 검출하였다. 반응 속도가 빠르다고 하는 장점이 있는 한편, 여기광 유래의 산란광이나 비드 재질로부터의 배경광이 생길 가능성이 있었다. 또한, 비드 어레이에 발광 검출을 적용한 경우에는, 단위 시간당 광자수가 적어지기 때문에 절대 감도를 확보할 필요가 있는 것과, 어떤 비드로부터의 발광이 이웃 비드 표면에서 반사되어 이웃 비드에서의 발광과 같이 계측되는 「크로스톡(crosstalk)」이 상정된다. 미세 유로를 사용하며, 고상에 대상 물질을 포착하는 분자를 붙인 검출 디바이스에 있어서도, 발광 유래의 산란광이나 반사광이 생길 가능성이 있다.

이상으로부터, 미세 유로를 사용하며, 고상에 대상 물질을 포착하는 분자를 결합시킨 검출 디바이스에 있어서, 용액의 흐름을 이용한, 고감도이며 정량적인 발광 검출법을 실현하는 것을 과제로 한다. 또한, 비드 어레이의 경우에는, 비드 사이에서의 발광의 크로스톡을 막는 것을 과제로 한다.

고상에 결합시킨 프로브와, 표지된 검출 대상 물질을 프로브에 포착하는 공정 또는 표지되지 않은 검출 대상 물질을 프로브에 포착시키면서 표지하는 공정과, 발광 시약을 액류에 의해 공급하는 공정과, 상기 발광 시약과 상기 표지가 반응한 부위 근방을 광학적으로 검출하는 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 생화학 물질의 분석 방법을 제공한다.

여기서, 고상은 적어도 일부에 프로브를 고정시키는 것이다. 고상으로서는 입자(비드), 유로의 벽면, 유로 내에 설치된 돌기나 끈 형태의 부재 등을 사용할 수 있다.

또한, 고상 재료로서는, 예를 들면 플라스틱, 금속, 무기 화합물이다. 플라스틱으로서는 폴리스티렌, 폴리메틸스티렌 등의 스티렌계 수지, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리시클로올레핀 등의 폴리올레핀계 수지, 폴리카르보네이트, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리에틸아크릴레이트 등의 폴리아크릴레이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸메타크릴레이트 등의 폴리메타크릴레이트 등의 (메트)아크릴레이트계 수지, 폴리플루오로올레핀 등의 불소계 수지, 디메틸실록산, 디에틸실록산 등의 실리콘계 수지를 들 수 있다. 금속으로서는, 예를 들면 철, 스테인레스, 구리 또는 이들의 합금을 들 수 있다. 무기 화합물로서는, 예를 들면 유리, 세라믹, 반도체 등을 들 수 있다. 고상 재료는 이들로 한정되지 않고, 또한 1종류의 재료로 구성될 수도 있고, 복수개의 재료로 구성될 수도 있다. 고상에의 프로브의 용이성, 낮은 백그라운드, 입수 용이성 때문에 폴리스티렌이 가장 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 비드의 경우, 비드 직경으로서는 0.1 ㎛ 내지 6 mm가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.5 ㎛ 내지 1 mm이고, 더욱 바람직하게는 0.75 ㎛ 내지 500 ㎛이며, 가장 바람직하게는 1.0 ㎛ 내지 100 ㎛이다. 또한, 비드를 넣은 배관은, 사용되는 비드의 크기에 따른 배관이며, 비드 직경의 2 배 미만인 것이 바람직하다.

발광 검출계에 있어서, 발광 기질의 송액 타이밍과 계측 타이밍을 맞추어 계측함으로써 높은 감도를 실현할 수 있다. 여기서는, 발광 기질이 고상, 예를 들면 비드 상의 효소에 도달한 시간부터 단시간 사이에 큰 발광 피크가 출현하는 현상을 이용한다. 이 피크 부분을 관측함으로써, 시그널과 노이즈를 높은 정밀도로 분리하며, 따라서 높은 감도로 계측하는 것이 가능해진다. 또한, 발광 시약을 흐르게 하면서 발광을 계측하는 방법에서는, 발광 시약이 항상 공급되는 상태여서 효소 근방의 발광 시약 농도가 감퇴하지 않기 때문에, 발광 강도의 감쇠를 억제하여 안정적으로 장시간 계측할 수 있다. 높은 피크 후의 시그널을 장시간 보충시킴으로써도 고감도이면서 안정한 계측을 행할 수 있다. 검출 대상 물질이 많이 포착되어 효소의 밀도가 높은 경우에도, 흐름에 의해서 발광 시약이 공급되어 발광 시약의 주변 농도의 저하를 억제할 수 있기 때문에, 고정밀도의 계측을 행하는 것이 가능하다. 또한, 광전자 증배관을 스캔하여 계측하는 계에 있어서, 슬릿을 설치하여 계측 대상 비드의 크기와 슬릿의 관계를 적절하게 설정함으로써 분해능이 높아져 고정밀도의 계측이 가능해진다. 비드의 시그널을 판별하기 위해서는, 복수개 비드의 식별이 필요하고, 이에 따라 공간 분해능이 어느 정도 필요하다. 측정 대역의 영향을 포함한 고찰로부터, 계측 시간 등에 따른 적절한 슬릿 폭 등의 제한이 있다. 또한, 계측 대상이 되는 비드들 사이에 공간을 유지하고, 큰 슬릿 폭을 채용하여 감도를 높이면서 비드의 식별을 행하는 수단도 있다.

본 발명에 있어서의 발광 검출계란 화학 발광 검출계와 생물 발광 검출계를 포함한다. 화학 발광이란 화학 반응에 의해서 여기된 분자가 기저 상태로 되돌아갈 때 에너지로서 빛을 방출하는 현상이고, 생물 발광이란 반디나 박테리아의 루시페라제 등의 생물 효소를 사용하여 발광 물질을 산화시키는 등의 화학 반응에 의해서 빛을 발하는 현상이며 광의로는 화학 발광의 범주에 들어가는 경우가 있다. 화학 발광 검출계로서는, 루미놀/과산화수소를 기질로 하는 퍼옥시다제의 화학 발광, 디옥세탄 유도체인 아다만틸메톡시포스포릴페닐디옥세탄(AMPPD)을 기질로 하는 알칼리 포스파타제의 화학 발광, 비스-2,4,6-트리클로로페닐옥살레이트(TCPO) 등의 과옥살산에스테르 유도체/과산화수소/8-아닐리노나프탈렌술폰산(ANS) 등의 형광 색소에 의한 알칼리 포스파타제의 화학 발광 등을 이용하는 검출계가 있고, 생물 발광 검출계로서는, 예를 들면 ATP/루시페린/마그네슘 이온을 기질로 하는 반디 루시페라제의 생물 발광 검출계, 글루코스-6-인산데히드로게나제가 글루코스-6-인산/NAD를 기질로 하여 생성되는 NADH를 박테리아의 루시페라제와 NADH-FMN-산화 환원 효소의 발광 반응으로 검출하는 계, 피루브산 키나제가 ADP와 포스포에놀피루브산을 기질로 하여 생성되는 ATP를, 반디의 루시페린-루시페라제의 발광 반응으로 검출하는 계 등이 있다.

비드 사이에서 발광의 크로스톡을 막는 과제는, 계측의 광학 설정에 관계없이 고감도인 다항목 검출에는 중요하다. 이 과제를 해결하는 수단의 하나는, 계측 대상이 되는 복수개의 비드 사이에 차광성을 갖는 재료의 비드를 설치하는 것이다. 또하나의 해결 수단은, 발광 시약을 포함하는 용액의 굴절률을 비드의 굴절률에 근접시키는 것이다. 발광 시약을 포함하는 용액이 이상적으로 제조되어 비드 재료와 실질적으로 동일한 굴절률을 갖는 경우에는, 비드 표면에서의 광의 반사는 일어나지 않기 때문에, 비드 사이에서의 광의 반사, 즉 크로스톡을 방지할 수 있다. 이러한 과제를 해결하는 다른 수단은, 계측 장치와 비드 어레이 사이에 편광판을 삽입하는 것이다. 비드 표면에서의 발광은 발광 기질이 랜덤한 방향을 향해 발광하기 때문에 편광되지 않는다고 생각되지만, 아웃 비드에서 반사되는 크로스톡에 대해서는, s파 및 p파의 반사율차로부터 편광된다고 생각된다. 이 때문에, 편광판을 넣음으로써 크로스톡 성분을 중점적으로 차단할 수 있어, 결과적으로 크로스톡의 기여분을 작게 할 수 있다.

분석 방법의 일례로서는, 적어도 일부에 프로브를 결합시킨 고상을 수용하는 유로에, 표지된 검출 대상 물질 또는 표지되지 않은 검출 대상 물질을 포함하는 액체를 공급하는 공정과, 상기 프로브에 상기 표지된 검출 대상 물질을 포착하는 공정 또는 표지되지 않은 검출 대상 물질을 프로브에 포착시키면서 표지하는 공정과, 상기 유로에 발광 반응을 위한 시약을 액류에 의해 공급하는 공정과, 상기 발광 반응을 위한 시약과 상기 표지가 반응한 부위 근방을 광학적으로 검출하는 공정을 갖는 것을 특징으로 한다.

분석 키트의 일례로서는, 세관과, 프로브를 고정시키면서 상기 세관에 수용되는 제1 입자와, 차광성 물질을 포함하면서 상기 세관에 수용되는 제2 입자와, 발광 반응을 위한 시약을 갖는 것을 특징으로 한다.

분석 장치의 일례로서는, 프로브를 적어도 일부에 고정시킨 고상을 수용하는 세관에 액체를 도입 및/또는 도출하기 위한 송액부와, 시료를 수용하기 위한 제1 용기와, 발광 반응을 위한 시약을 수용하기 위한 제2 용기와, 상기 고상의 임의의 부위를 광학적으로 검출하기 위한 검출부를 가지고, 상기 제1 용기와 상기 제2 용기는 상기 송액부에 연결되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 발광 검출을 다항목으로 행하는 검출 디바이스에 있어서, 고감도이며 정량적인 발광법을 실현할 수 있는 효과가 있다. 특히 비드 어레이를 이용하는 경우에는, 또한 비드 사이에서 발광의 크로스톡을 막는 효과가 있다.

또한, 발광 검출을 다항목으로 행하는 경우, 마이크로플레이트와 같은 개별적인 구멍마다 시약을 첨가한다고 하는 방식이 종래부터 행해져 왔다. 비드 어레이의 경우에는, 이들 계에 비해, 대상 물질을 포함한 용액이나 발광 기질 등을 차례로 흐르게 할 수 있기 때문에, 분리 주입 등의 수고가 필요하지 않고, 간편하면서 균일한 반응을 실현할 수 있다. 또한, 마이크로플레이트와 달리, 반응 영역이 항목마다 벽 등으로 격리되어 있지 않기 때문에, 적은 시약량으로 발광 검출을 행할 수 있다.

도 1은 본 발명의 1 실시 형태의 플로우 차트이다.

도 2는 본 발명의 1 실시 형태의 모식도이다.

도 3은 본 발명의 1 실시 형태의 장치 모식도이다.

도 4는 본 발명의 1 실시 형태의 발광 계측예와 발광 시약 송액 타이밍의 개략도이다.

도 5는 본 발명의 1 실시 형태의 장치 모식도이다.

도 6은 본 발명의 1 실시 형태의 발광 계측예와 발광 시약 송액 타이밍의 개략도이다.

도 7은 본 발명의 1 실시 형태의 장치 모식도이다.

도 8은 본 발명의 1 실시 형태의 광학계의 스캔과 데이터의 관계 모식도이다.

도 9는 본 발명의 1 실시 형태의 슬릿 폭과 신호 파형의 관계 모식도이다.

도 10은 본 발명의 1 실시 형태의 장치 모식도이다.

도 11은 본 발명의 1 실시 형태의 발광의 크로스톡 모식도이다.

도 12는 본 발명의 1 실시 형태의 발광의 크로스톡과 차광성 비드의 효과의 모식도이다.

도 13은 본 발명의 1 실시 형태의 발광의 크로스톡과 용액의 굴절률 조정의 효과의 모식도이다.

도 14는 본 발명의 1 실시 형태의 용액의 굴절률을 글리세롤로 조정한 후의 반사율의 그래프이다.

도 15는 본 발명의 1 실시 형태의 발광의 크로스톡과 글리세롤 70 ％ 용액의 효과의 모식도이다.

도 16은 본 발명의 1 실시 형태의 장치 모식도이다.

도 17은 본 발명의 실시예 1, 2의 실험 장치 모식도이다.

도 18은 본 발명의 실시예 1의 측정 결과를 나타내는 도면이다.

도 19는 본 발명의 실시예 2의 측정 결과를 나타내는 도면이다.

도 20은 본 발명의 실시예 3의 실험 장치 모식도이다.

도 21은 본 발명의 실시예 3의 측정 결과를 나타내는 도면이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

101: 모세관, 102: 항체를 붙인 비드, 103: 항체를 붙이지 않은 비드, 104: 항-α-페토프로테인 항체, 105: α-페토프로테인, 106: HRP 표지 항-α-페토프로테인 항체, 107: 발광 시약, 108: 발광, 109: α-페토프로테인을 포함하는 샘플 용액, 110: 세정 버퍼, 111: HRP 표지 항-α-페토프로테인 항체 (106)을 포함하는 용액, 112: 세정 버퍼, 113: 발광 시약을 포함하는 용액, 114: 광 계측기, 121: 비드 어레이, 121a: 비드 어레이, 121b: 비드 어레이, 121c: 비드 어레이, 121d: 비드 어레이, 122: 모세관, 122a: 접속부, 122b: 접속부, 122c: 접속부, 123: 실린지, 124: 실린지 펌프, 125: 모세관, 126: 밸브, 127: 용기, 131: 광 섬유, 132: PMT에 대한 접속 커넥터, 133: PMT, 134: 라인, 135: 퍼스널 컴퓨터, 136: 입자(비드) 스토퍼(stopper), 137: 접속부(내부 시일 커넥터), 141: 비드 어레이, 142: 광 섬유 번들, 143: PMT에 대한 접속 커넥터, 144: 검출 영역, 151: 비드 어레이, 152: 대물 렌즈, 153: 결상 렌즈, 154: 슬릿, 155: PMT, 156: 광학계, 157: 라인, 158: 퍼스널 컴퓨터, 201: 비드 어레이군, 202: 송액계, 203: 용액 유지부 및 접속 전환부, 204: 카메라 렌즈, 205: CCD 카메라, 206: 라인, 207: 퍼스널 컴퓨터, 208: 계측 부분, 211: 발광하는 비드, 212: 발광이 예상되지 않는 비드, 213: 모세관, 214: 발광 시약을 포함하는 수용액, 221: 차광성 비드, 231: 직접 광학계를 향하는 광선, 232: 이웃 비드를 향하는 광선, 233: 굴절률을 조정한 용액, 241: 편광판.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

도 1은 제1 실시 형태의 분석 방법의 개략을 나타내는 플로우 차트이다. 상세한 내용에 대해서는 다음 단락 이후에 서술한다. 최초 공정(A)로서, 검출 대상 이 되는 생화학 물질을 포착하는 항체를 고상에 고정시킨 유로를 갖는 디바이스에 대하여, 검출 대상 물질을 포함하는 샘플 용액을 도입한다. 샘플 도입 이전에는 항체에 아무것도 포착되지 않았다. 다음에 공정(B)로서, 도입된 샘플 용액 중의 검출 대상 물질을 고상 상의 항체에 포착하는 공정이 있다. 이 경우 샘플 용액의 송액을 계속하는 것도, 송액을 정지시켜 반응이 진행되는 것을 기다리는 것도 가능하다. 그 다음에 공정(C)로서, 여분의 샘플 용액을 씻어버려 디바이스 내부를 세정하는 공정이 있다. 디바이스 내부를 세정함으로써, 검출 대상이 되는 물질은 실질적으로 항체로 포착된 부위밖에 존재하지 않게 된다. 그 다음 공정(D)로서, 검출 대상 물질에 친화성을 갖는 발광을 일으키는 효소로 표지된 항체를 포함하는 용액을 디바이스 내부에 도입하여, 검출 대상 물질과 반응시키는 공정이 있다. 이 공정은 검출 대상 물질을 간접적으로 표지하는 공정이다. 그 다음 공정(E)로서, 검출 대상 물질에 반응하지 않고 고상에 포착되지 않은 여분의 효소 표지 항체를 씻어버려, 디바이스 내부를 세정하는 공정이 있다. 디바이스 내부를 세정함으로써, 나중에 발광을 일으키는 효소는 실질적으로 검출 대상 물질이 존재하는 부위, 즉 검출 대상이 되는 생화학 물질을 포착하는 항체를 고상에 고정시킨 부위에만 존재하게 되어, 다른 장소에서 발광은 일어나지 않게 된다. 그 다음 공정(F)로서, 효소와 반응하는 발광 시약을 디바이스 내부에 흐르게 하여, 항체 근방에서의 발광을 계측하는 공정이 있다. 발광을 일으키는 효소는 검출 대상 물질이 포착된 부분에만 존재하기 때문에, 검출 대상 물질을 포착하는 효소를 고정시킨 고상 근방의 발광은 검출 대상 물질의 존재에서 유래하게 된다. 발광량도 검출 대상이 되는 물 질의 포착량, 나아가서 샘플 용액 중의 검출 대상 물질량 또는 농도를 반영하게 된다. 최후의 공정(G)로서, 계측된 발광 유래의 계측 신호를 검출 결과로서 처리하는 공정이 있다. 이 공정에 의해, 얻어진 발광 강도로부터 검출 대상 물질량을 추측하게 된다.

도 2는 제1 실시 형태의 개략을 검출 물질을 고정시킨 고상 근방의 모식도로서 나타낸 것이다. 송액 장치 및 계측 장치의 전체상에 대해서는 다음 단락 이후에 서술한다. 본 실시 형태에서는, 항체를 고상에 고정시킨 유로를 갖는 디바이스로서, 비드 어레이를 사용한 예를 나타낸다. 비드 어레이의 개략을 부분 확대한 것이 도 2(1)이다. 유로를 형성하기 위한 세관으로서 모세관 (101)을 이용한다. 모세관 (101) 내부에, 검출 대상을 포착하는 항체를 결합시킨 비드 (102)와 항체를 결합시키지 않은 비드 (103)을 배열한다. 본 실시 형태에서의 검출 대상은 예를 들면 α-페토프로테인(105)이고, 예를 들면 항-α-페토프로테인 항체 (104)가 비드 (102)에 고정되어 있다. 모세관의 내경은 예를 들면 150 마이크로미터, 비드 (102), (103)의 직경은 예를 들면 100 마이크로미터이고, 재질은 예를 들면 폴리스티렌이다. 도 2(2)에 α-페토프로테인 (105)를 포함하는 샘플 용액 (109)를 도입한 모식도를 나타낸다. 여기서의 샘플 용액은 임시로 50 μL로 하고, 용액의 부피 유량을 매분 10 μL로 한다. 이어서, 도 2(3)에서 α-페토프로테인 (105)이 비드 (102) 상의 항-α-페토프로테인 항체에 포착되는 모습을 나타낸다. 비드 어레이에서는, 좁은 공간에 강제적으로 용액을 흐르게 함으로써 흐름에 난류가 생기고, 결과로서 고액간의 반응 속도가 높아진다. 이러한 효과를 보다 높이기 위해서, 샘플 용액 (109)를 흐르게 하면서 α-페토프로테인의 포착이 행해진다. 후에 나타낸 바와 같이 송액은 예를 들면 실린지 펌프를 이용하고, 샘플 용액을 왕복 송액하여 반응시켰다. 송액의 기구에 대해서는, 액을 송액 가능한 기구라면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 다른 송액 기구에는, 페리스탈틱 펌프(peristaltic pump) 등도 사용할 수 있다. 반응 시간은 예를 들면 20 분간이다. 도 2(4)에 샘플 용액 (109)를 세정 버퍼 (110)으로 세정하는 모식도를 나타낸다. 세정 버퍼 (110)으로서는 예를 들면 염을 포함하는 인산 버퍼(pH 7.4)를 사용하고, 100 μL를 30 초간 흐르게 하는 조건에서 세정하였다. 버퍼는 그 외에도, 탄산 버퍼, MES(2-(N-모르폴리노)에탄술폰산) 버퍼, 트리스히드록시아미노메탄(이후, Tris)-에틸렌디아민테트라아세트산(이후, EDTA) 버퍼, Tris-EDTA-붕산 버퍼, 붕산 버퍼 등, 통상 사용되는 완충액이면 모두 사용할 수 있다. 또한, 첨가하는 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 아세트산암모늄 등의 염을 사용할 수 있다. 이 세정에 의해 비드 (102) 상에 포착되지 않은 α-페토프로테인 (105)를 비드 어레이 디바이스 중에서 씻어버릴 수 있다.

도 2(5)에 예를 들면 HRP(서양 와사비 퍼옥시다제) 표지 항-α-페토프로테인 항체 (106)을 포함하는 용액 (111)을 비드 어레이에 도입한 모식도를 나타낸다. 표지로서는, HRP를 이용하지만, 본 발명에 있어서는 HRP 이외의 표지 효소나 효소 이외의 표지물도 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 표지 효소로서는, 예를 들면 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 글루코스옥시다제, β-D-갈락토시다제, 글루코스-6-인산데히드로게나제, 인버타제, 아데노신 삼인산(이후, ATP)아제, 루시페라 제, 에쿼린 등을 들 수 있다.

HRP 표지 항-α-페토프로테인 항체 (106)의 농도는 임시로 100 ng/ml, 용액 (111)의 부피는 50 μL로 하고, 부피 유량을 매분 10 μL로 한다. HRP 표지 항-α-페토프로테인 항체 (106)은 비드 (102) 상의 항-α-페토프로테인 항체 (104)에 의해서 포착된 α-페토프로테인 (105)에 대하여 반응하고, 결과로서 비드 (102) 상에 포착된다. 도 2(6)에 HRP 표지 항-α-페토프로테인 항체 용액 (111)을 세정 버퍼 (112)로 세정하는 모식도를 나타낸다. 세정 버퍼 (112)로서는 예를 들면 염을 포함하는 인산 버퍼(pH 7.4)를 사용하고, 100 μL를 30 초간 흐르게 하는 조건에서 세정하였다. 이 세정에 의해 비드 (102) 상에 포착되지 않은 여분의 HRP 표지 항-α-페토프로테인 항체 (106)을 비드 어레이 디바이스 중에서 씻어버릴 수 있다.

마지막으로 도 2(7)에 발광 반응을 위한 시약 (107)을 포함하는 용액 (113)을 비드 어레이에 흐르게 하여, 발광 (108)을 계측한 모식도를 나타낸다. 발광 반응을 위한 시약 (107)로서는, 표지에 효소를 이용하는 경우에는, 사용된 효소에 대응하는 기질을 포함하는 것이다. 기질로서는, 예를 들면 루미놀, 디옥세탄, 과옥살산에스테르, 글루코스, β-D-갈락토실, 글루코스-6-인산, 루시게닌, 아스코르브산 인산에스테르, 아데노신 삼인산, 루시페린 또는 이들의 유도체, 또는 칼슘 이온을 들 수 있다. 또한, 발광 반응을 위한 시약은 과산화수소, tert-부틸히드로퍼옥시드 등의 알킬히드로퍼옥시드를 포함하는 과산 등의 산화제, 요오도소벤젠 등의 산소 첨가제 산화제를 포함하는 경우도 있다. 발광 반응을 위한 시약은 발광 증감제를 더 포함할 수도 있다. 발광 증감제로서는, 예를 들면 4-요오도페놀, 4-브로 모페놀, 4-클로로페놀, 4-페닐페놀, 페놀인돌, 2-클로로-4-페닐페놀, 4-(2'-티에닐)페놀, 4-(2'-벤조티아졸릴)페놀, 4-[4'-(2'-메틸)티아졸릴]페놀, 4-[2'-(4'-메틸)티아졸릴]페놀, 4-(4'-티아졸릴)페놀, 4-[4'-(2'-(3'-피리딜))티아졸]페놀, 페노티아진-N-프로필술포네이트, 3-(10-페노티아질)-n-프로필-술폰산염, 3-(10-페노티아질)-프로필술폰산염, p-히드록시페닐프로피온산 등의 페놀 유도체, 6-히드록시벤조티아졸, 4-(4-히드록시페닐)티아졸 등의 티아졸 유도체, 디에틸아닐린 등을 들 수 있다.

예를 들면 HRP를 표지 효소로 이용하는 경우, 발광 반응을 위한 시약에는, 기질로서 루미놀 또는 그의 유도체, 산화제로서 루시게닌/과산화수소 등, 발광 증감제로서 4-요오도페놀, 4-[4'-(2'-메틸)티아졸릴]페놀, 4-[2'-(4'-메틸)티아졸릴]페놀, 4-(4'-티아졸릴)페놀, 4-[4'-(2'-(3'-피리딜))티아졸]페놀, 4-(2'-티에닐)페놀, 페노티아진-N-프로필술포네이트, 페놀인도페놀 등, 바람직하게는 4-[4'-(2'-메틸)티아졸릴]페놀 또는 4-[2'-(4'-메틸)티아졸릴]페놀을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 그 밖의 표지물, 발광 반응을 위한 시약의 조합을 이용할 수도 있다. 예를 들면, 화학 발광 검출계로서는 표지 효소로서 글루코스옥시다아제, 발광 반응을 위한 시약으로서 글루코스/비스-2,4,6-트리클로로페닐옥살레이트(TCPO) 등의 과옥살산에스테르 유도체/8-아닐리노나프탈렌술폰산(ANS) 등의 형광 색소, 또는 글루코스/이소루미놀/마이크로퍼옥시다제(m-POD)를 이용하는 계, 표지 효소로서 알칼리 포스파타제(ALP), 발광 반응을 위한 시약으로서 아다만틸메톡시포스포릴페닐디옥세탄(AMPPD) 등의 디옥세탄 유도체를 이용하는 계, 표지 효소로서 β-D-갈락토시다제, 발광 반응을 위한 시약으로서 o-니트로페닐-β-D-갈락토실/갈락토스데히드로게나제/NAD+/NADH, 또는 락토스/글루코스옥시다제(GOD)/이소루미놀/m-POD, 락토스/GOD/TCPO/ANS를 이용하는 계, 표지 효소로서 글루코스-6-인산데히드로게나제, 발광 반응을 위한 시약으로서 글루코스-6-인산/NAD(P)+/NAD(P)H를 이용하는 계, 표지 효소로서 인버타제, 발광 반응을 위한 시약으로서 사카로스/루시게닌/OH-를 이용하는 계 등을 들 수 있고, 생물 발광 검출계로서는, 표지 효소로서 반디 루시페라제, 발광 반응을 위한 시약으로서 ATP/루시페린/마그네슘 이온을 이용하는 계, 표지 효소로서 ALP, 발광 반응을 위한 시약으로서 루시페린-O-포스페이트/ATP를 이용하는 계, 표지 효소로서 아세테이트 키나제, 발광 반응을 위한 시약으로서 아세틸포스페이트/알코올데히드로게나제(ADP)/루시페린/루시페라제를 이용하는 계, 표지 효소로서 글루코스-6-인산데히드로게나제, 발광 반응을 위한 시약으로서 글루코스-6-인산/NAD/박테리아 루시페라제/NADH-FMN-산화 환원 효소를 이용하는 계, 표지 효소로서 피루브산 키나제, 발광 반응을 위한 시약으로서 ADP/포스포에놀피루브산/반디 루시페린/루시페라제를 이용하는 계 등을 들 수 있다.

발광 반응을 위한 시약 (107)을 포함하는 용액 (113)의 부피 유량을 매분 10 μL로 하고, 10 분 이상 계속 흐르게 하였다. 발광 (108)은 HRP 표지 항-α-페토프로테인 항체 (106) 상의 HRP가 발광 반응을 위한 시약 (107)과 반응함으로써 일어나기 때문에, 발광은 비드 (102) 근방에서만 발생한다. 즉, HRP는 검출 대상을 포착하기 위한 비드 상에 고정된 항체, 동일 항체에 포착된 검출 대상, 동일 검출 대상에 포착되는 HRP 표지 항-α-페토프로테인 항체 (106)을 통해 비드에 결합되 고, 발광은 표지인 HRP 근방에서 발생하는 결과, 하나의 비드 (102) 표면 근방에서 발생하게 된다. 이러한 발광 (108)을 광 계측기 (114)에 의해서 계측한다. 광 계측 장치 (114)에 대한 상세한 설명은 나중에 서술한다.

도 3은 제1 실시 형태의 장치 개략을 나타낸 것이다. 도 2에서 설명한 비드 어레이 (121)을 중심으로 하여, 그의 양측에 모세관 (125)와 모세관 (122)가 배관되어 있다. 비드 어레이의 한쪽은 모세관 (122)를 통해 실린지 (123)에 접속되어 있다. 실린지 펌프 (124)가 작동함으로써 실린지 (123)의 피스톤이 밀고 당겨지고, 결과로서 비드 어레이 (121) 내부로 송액을 행할 수 있다. 비드 어레이 (121)의 반대편 단부에 모세관 (125)가 배관되고, 그 앞에는 밸브 (126)을 개재하여 복수개의 용기 (127)에 접속되어 있다. 이 복수개의 용기 (127) 각각에는, 도 2를 이용한 전단의 설명에서 기술한 샘플 용액, 세정 버퍼, HRP 표지 항체 용액 등이 각각 들어 있고, 또한 폐액 저장소로서도 이용된다. 각각의 용기 (127)에 대한 접근은 밸브 (126)을 조작함으로써 행해진다. 비드 어레이 (121)에서의 발광은 광 섬유 (131)을 통해 계측된다. 광 섬유 (131)의 한쪽 단부는, 도면 중의 기재를 생략한 XY 스테이지에 의해서 비드 어레이 (121) 중의 발광 비드에 근접하여 설치된다. 또한, 광 섬유 (131)의 반대편 단부는 PMT(광전자 증배관)에 대한 커넥터 (132)를 통해 PMT (133)에 접속되어 있다. 이러한 설정에 의해 광 섬유 (131)에서 집광된 비드 어레이 (121)로부터의 발광이 PMT (133)으로 유도되어 계측된다. PMT (133)으로부터의 신호는 라인 (134)를 통해 데이터 처리 장치인 퍼스널 컴퓨터 (135)에 출력된다. 이 퍼스널 컴퓨터 (135)에서 데이터 처리가 행해진다.

도 4(A)는 제1 실시 형태의 발광 계측 결과의 예이고, 도 4(B)는 그 때의 발광 시약 송액의 타이밍 및 송액량에 관한 개략도이다. 시간 O부터 계측이 개시되고, 그 시점에서는 아직 발광 시약은 송액되지 않았기 때문에, 발광은 계측되지 않는다. 신호 강도는 백그라운드 수준 그대로 일정하게 추이된다. 발광 시약 도입 개시의 타이밍에서 발광 시약을 포함하는 용액이 매분 10 μL의 부피 유량으로 송액되고, 이후 송액을 계속한다. 발광에 의한 신호 강도는 일단 높은 피크를 기록한 후, 곧 저하된다. 저하된 후의 발광 강도는 매우 천천히 감쇠되어 간다. 이러한 최초의 높은 피크의 피크 폭은 1 초 정도 또는 그 이하이다. 이러한 타이밍 특이적인 피크의 출현은 발광에 대하여 특이적으로 보이는 현상이다. 종래 방법에서는, 발광 시약을 용기에 넣고 나서 발광 계측 장치에 장착하여 발광을 계측하는데, 이러한 타이밍 특이적인 피크는 관찰되지 않았다. 발광 반응을 위한 시약을 흐르게 하면서, 발광이 발생하는 부위에서의 발광을 계측함으로써, 이러한 타이밍 특이적인 피크를 검출할 수 있다. 이 타이밍 특이적인 피크를 계측함으로써 S/N(시그널 대 노이즈의 비)이 높은 계측을 순간에 행할 수 있다. 또한, 그 결과로서 적은 발광 시약량으로 계측할 수 있다. 또한, 고감도인 측정도 가능해진다. 또한, 발광 반응을 위한 시약을 흐르게 하면서 발광을 계측하는 방법에서는, 발광 시약이 항상 공급되는 상태여서, 효소 근방의 발광 시약 농도가 감쇠되지 않기 때문에, 발광 강도의 감쇠를 억제하여 안정적으로 장시간 계측할 수 있다. 높은 피크 후의 시그널을 장시간 보충시킴으로써도 고감도이며 안정한 계측을 행할 수 있다. 예를 들면 PMT (133)으로부터의 출력을 샘플링 간격 1 밀리초로 취득하고, 그 디지털 데 이터를 퍼스널 컴퓨터 (135)에서 적산함으로써, 1점에서 샘플링을 행한 경우에 비해 SN비가 높은 결과를 얻을 수 있다. 시그널의 감쇠가 적어 무시할 수 있는 경우에는, 보충점 개수의 2분의 1승에 비례하여 SN비가 향상된다고 생각된다. 검출 대상 물질이 많이 포착되어 효소의 밀도가 높은 경우에도, 흐름에 의해서 발광 시약이 공급되어 발광 시약 주변 농도의 저하를 억제할 수 있기 때문에, 고정밀도의 계측을 행하는 것이 가능하다.

이 타이밍 특이적인 피크가 출현하는 현상은 다음과 같이 해석하여 이해할 수 있다. 발광 시약 도입 최초의 타이밍에서는, 지금까지 비드 상의 효소 주위에 없었던 발광 시약이 단숨에 효소 주변으로 몰려들기 때문에, 발광이 크게 나타난다. 이 순간에는 효소 주위의 발광 시약의 농도는 도입한 발광 시약 용액의 농도와 동일하고, 실질상 최대이다. 일단 반응이 시작되면, 비드 표면 근방의 얇은 액막의 영역에서는 발광 시약이 소비되어 발광 시약의 농도가 저하된다. 그 때문에 일단 피크에 도달한 발광 강도는 저하된다. 그 후에는 흐름에 의해서 운반되어 온 발광 시약이 좀전의 얇은 액막에 확산되는 속도와 표면에서 발광 시약이 소비되는 속도가 균형을 이루는 부분에서 거의 일정한 발광 강도가 관측된다고 생각된다. 발광 시약을 포함하는 용액을 흐르게 하는 경우가, 용액을 흐르게 하지 않고 중지시킨 경우에 비해, 이 얇은 액막의 두께가 얇아서 확산 거리가 짧기 때문에 유리하다. 또한, 당연한 일이지만 흐름에 의해서 발광 시약이 잇달아 공급되기 때문에, 발광 시약의 소비에 의한 발광 시약의 벌크 농도의 저하도 막을 수 있고, 장시간 측정에도 유리하다. 물론, 일단 발광 시약이 유입된 후에 발광 시약 용액의 송액 을 정지시키는 것도 가능하고, 발광의 검출을 실현할 수 있다. 이 경우에도 발광 시약의 도입과 발광의 계측을 동시에 행함으로써 유리한 계측을 실현할 수 있다.

본 실시 형태에서는 비드 어레이를 이용하였지만, 비드 어레이를 이용한 경우로 한정되는 것은 아니다. 검출 대상이 되는 생화학 물질을 포착하는 프로브를 고상에 고정시킨 유로를 갖는 디바이스에 있어서, 상기 프로브의 고정 영역 근방을 계측함으로써 발광 검출을 행하는 계에 대해서는 일반적으로 적용 가능하다. 또한, 본 실시 형태에서는 항체 고정화 비드를 이용하여 단백질의 샌드위치 분석을 행하였지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

고정시키는 프로브는 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 펩티드핵산(PNA), 또한 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 우리딘, 이노신을 갖는 인공 핵산, 또는 핵산 유도체가 일반적이지만, 이들이나 펩티드, 당 펩티드, 단백질, 당 단백질, 다당 또는 화학 합성 중합체 등 상보적인 분자를 포착할 수 있는 것이면 바람직하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

핵산 프로브를 이용할 때에는 핵산 검출에 대한 적응이 가능하고, 또한 단백질을 프로브로 하였을 때에는 항체 검사, 항원 검사 등에도 사용할 수 있으며, 예를 들면 식품 알레르겐 검사, 알레르겐 특이 IgE 검사, 감염증 검사, 화학 물질 특정 검사, 오염 물질 검사 등에 적응이 가능하다. 또한, 당-렉틴 반응이나, 수용체 등도 프로브로서 이용하는 것이 가능하다. DNA-단백질의 상호 작용을 이용한 프로브 설계도 가능하고, 또한 효소-기질의 반응, 예를 들면 비오틴-아비딘 반응 등에도 적응이 가능하다.

도 5는 제2 실시 형태의 장치 개략을 나타낸 것이다. 도 3에서 설명한 장치에 비해 비드 어레이와 광 섬유가 변경되어 있다. 도 5에서 표시되는 비드 어레이 (141)은, 도 2의 비드 어레이 (121)에 해당하는 것을 복수개(여기서는 4개) 접속시킨 형상을 이루고, 각각의 비드 부분이 모두 직경이 큰 광 섬유 번들 (142)의 바로 아래에 오도록 설치되어 있다. 광 섬유 번들 (142)의 직경은 계측 대상이 되는 비드가 배치된 영역과 동등하거나 또는 이보다 큰 것이 바람직하고, 적어도 이 구성에 있어서는 1개의 비드 어레이에 있어서의 측정 항목에 대응하는 비드의 외경, 즉 프로브가 고정화된 검출 대상 비드의 외경(복수개의 경우에는 복수개의 비드 외경을 더한 길이)과 동등하거나 또는 이보다 큰 것으로 한다. 이에 의해, 계측 대상이 되는 비드를 확실하게 검출할 수 있다. 접속 부분 (122a), (122b), (122c)의 내부 부피는 임시로 각각 약 10 μL로 하였다. 비드 어레이 (121)에 상당하는 각각의 비드 어레이 (121a), (121b), (121c), (121d)에는, 각각 다른 항체, 예를 들면 항-α-페토프로테인 항체, 항-CA19-9 항체, 항-CEA항체, 항-PSA 항체를 고정시킨 비드가 포함되어 있다. 광 섬유 번들 (142)는 광 섬유 번들과 PMT와의 접속 커넥터 (143)을 통해 PMT (133)에 접속된다. 이 외에는 도 2의 장치 설정과 동일하다.

도 6(A)는 제2 실시 형태의 발광 계측 결과예의 모식도이고, 도 6(B)는 그 때의 발광 시약 송액의 타이밍 및 송액량에 대한 개략도이다. 제1 실시 형태와 동일한 반응을 동일하게 행하지만, 본 실시 형태에서는 샘플 용액에, 예를 들면 α-페토프로테인, CA19-9, CEA, PSA를 포함시키고, 그것을 검출하는 것이 목적이다. HRP 표지 항체 용액은 4종의 물질에 대한 HRP 표지 항체를 포함하는 용액을 이용하였다. 시간 0부터 계측이 개시되고, 그 시점에서는 아직 발광 시약은 송액되지 않았기 때문에, 발광은 계측되지 않는다. 신호 강도는 백그라운드 수준 그대로 일정하게 추이된다. 발광 시약 도입 개시의 타이밍에 발광 시약을 포함하는 용액을 매분 10 μL의 부피 유량으로 송액하고, 이후 송액을 계속한다. 제1 실시 형태와 동일하게, 발광에 의한 신호 강도는 일단 높은 피크를 기록한다. 그 후, 약 1 분 간격으로 총 4개의 피크가 관측된다. 이들 피크는 각각 항-α-페토프로테인 항체, 항-C-19 항체, 항-CEA 항체, 항-PSA 항체를 고정시킨 비드 근방의 발광이라고 생각된다. 비드 어레이 (121)에 상당하는 비드 어레이 사이 배관의 내부 부피를 약 10 μL로 하였기 때문에, 발광 시약을 포함하는 용액의 유속으로부터 상기 용액이 각각의 비드 어레이에 도달하는 시간을 예측할 수 있고, 여기서는 도달하는 시간이 각각의 비드 어레이에 대하여 약 1 분간씩 변이된 것으로서 해석할 수 있다. 이와 같이 발광 시약을 송액하면서 계측함으로써, 하나의 광 검출기를 이용하여, 그 광 검출기를 이동시키지 않는 장치 설정으로, 복수개 항목의 검출을 간편하게 저가로 실현할 수 있는 효과가 있다.

도 7은 제3 실시 형태의 장치 개략을 나타낸 것이다. 다항목 검출을 광학계 스캐닝으로 행하는 계이다. 복수개 항목에 대한 프로브 고정 비드와 프로브 비고정 비드를 교대로 배열한 비드 어레이 (151)에, 제1 실시 형태와 동일한 송액계가 접속되어 있다. 비드 어레이 (151)의 한쪽은 모세관 (122)에 의해, 실린지 펌프 (124)에 설치된 실린지 (123)에 접속되어 있다. 비드 어레이 (151)의 반대쪽 단부 에는 모세관 (125)가 배관되고, 그 앞에는 밸브 (126)을 개재하여 용기 (127)에 접속되어 있다. 각각의 용기 (127)에 대한 접근은 밸브 (126)을 조작함으로써 행해진다. 비드 어레이 (151) 중의 복수개 비드로부터의 발광은 광학계 (156)을 스캔함으로써 별도로 계측된다. 광학계 (156)은 비드 어레이 (151)에 대하여 상대적으로 이동한다. 대물 렌즈 (152)는 예를 들면 초점 거리 9 mm, 개구수 0.46의 것을 사용하고, 결상 렌즈 (153)은 예를 들면 초점 거리 180 mm의 것으로 한다. 이 경우 배율은 초점 거리의 비가 되고, 20배이다. 슬릿 (154)는 대물 렌즈 (152)와 결상 렌즈 (153)으로 설정되는 광학계의 상면에 설치된다. 비드 어레이 (151) 중에 있는 100 마이크로미터의 비드를 예로 들면, 이 가상 상면에서는 2 mm 직경으로 비치게 된다. 슬릿 (154)는 비드상을 절취하는 것이며, 비드 어레이 (151)의 길이 방향에 대하여 실질적으로 수직인 방향으로 길이 방향을 갖는 직사각형의 형상을 갖는다. 이후, 슬릿 폭이라 할 때는, 슬릿 폭의 실제 크기가 아니라, 배율의 역비를 곱한 값으로서 기술한다. 예를 들면 슬릿 폭 20 마이크로미터의 경우에는, 원래 100 마이크로미터인 비드상을 가로 방향으로 5 분의 1 분할하는 슬릿 폭이 된다. PMT (155)는 슬릿 (154) 직후에 놓여지고, 슬릿 (154)를 통과해 온 빛을 전량 수광한다. 여기서는 수광면으로 8 mm 직경의 PMT를 사용한 예를 나타낸다. PMT (155)는 라인 (157)에 의해서 데이터 처리 장치로서의 퍼스널 컴퓨터 (158)에 접속된다. 이 설정에 의해 광학계 (156)에서 집광된 비드 어레이 (151)로부터의 발광이 PMT (155)로 유도되고, 퍼스널 컴퓨터 (158)에서 신호가 출력된다.

도 8은 제3 실시 형태에 있어서의 광학계의 스캔과 얻어지는 데이터의 관계 의 개략을 나타낸 것이다. 도 8(A)는 상면에서의 가상적인 비드 어레이와 슬릿의 관계를 나타내는 개념도이다. 비드 직경 100 마이크로미터에 대하여 슬릿 폭을 10 마이크로미터로 설정한 예를 나타낸다. 직사각형의 슬릿이 비드상으로부터 절취하는 부분(도면에서 흰색 부분)에 상당하는 발광이 PMT에 의해서 계측된다. 도 8(B)는 스캔의 경과 시간이 비드의 배치 위치에 대응하는 것을 개념적으로 나타내고, 비드의 위치와 발광 강도가 대응하는 것을 나타내는 도면이다. 슬릿을 포함하는 광학계가 비드 어레이를 길이 방향으로 스캔함으로써, 비드 어레이의 비드로부터의 발광이 슬릿을 통과함으로써 위치 분해능을 갖는 파형으로서 계측된다. 슬릿 폭을 넓게 하면 투과하는 빛의 양이 많아지기 때문에, 높은 신호 강도가 얻어지지만, 각각의 비드로부터의 발광끼리 중첩되어 버리기 때문에, 정확한 계측이 어렵다. 또한, 스캔하는 속도가 너무 빨라지면, PMT의 측정 대역의 영향에 의해 파형이 완만해져 버린다. 구체적으로는, 비드 1개당 스캔 시간과 비교하여, PMT의 측정 대역의 역수(초의 단위로 표시할 수 있음)가 동등하거나 또는 긴 경우에는, 어떤 특정 비드로부터의 발광을 PMT에서 수광하더라도 그 시그널이 비드를 스캔하는 것과 동등하거나 또는 그 이상의 시간에 걸쳐 확장되어 버리기 때문에, 비드끼리 구별하는 것이 어려워진다. 따라서, 스캔 속도는, 측정 대역의 역수가 비드 1개당 스캔 시간보다 충분히 작아지는 것과 같은 영역으로 설정하는 것이 바람직하다.

도 9는 제3 실시 형태에 있어서의 슬릿 폭과 신호 파형의 관계에 대하여 모식적으로 나타내는 것이다. 스캔 시간으로서는, 예를 들면 1 비드당 5 초로 하였다. 제3 실시 형태에 나타내는 장치의 측정 대역을 약 2.5 Hz로 하면, 대역에 의 해 파형이 둔해지는 영향이 적은 경우의 예이다. 발광 반응을 위한 시약을 비드 어레이 중에 흐르게 하면서, 동시에 이 비드 어레이를 광학계에 의해서 스캔하여 계측을 행하였다. 도 9(A)는 슬릿 폭이 50 마이크로미터인 경우(비드 직경의 50 ％ 정도의 경우)이다. 이 경우, 슬릿 폭이 어느 정도 크기 때문에, 큰 신호가 얻어진다. 그 반면, 슬릿이 비드의 말단쪽을 스캔하는 경우에 이웃 비드로부터의 발광도 모아버리기 때문에, 각각의 비드로부터의 발광을 정확하게 분별하기 어려워지는 경향이 있다. 도 9(B)는 슬릿 폭을 10 마이크로미터로 한 경우(비드 직경의 10 ％ 정도의 경우)이다. 각각의 비드로부터의 발광을 구별하는 것은 가능해졌지만, 슬릿 폭이 작아졌기 때문에, 신호 강도가 작아져 버려 감도가 저하되는 경향이 있다. 도 9(C)는 슬릿 폭을 80 마이크로미터(비드 직경의 80 ％ 정도의 경우)로 크게 하고, 또한 복수개의 비드 배열에 있어서 발광의 검출 대상으로 하는 비드를 교대로 배치한 경우이다. 이상으로부터, 계측에 사용되지 않은 1개 이상의 비드를 계측하는 비드 사이에 넣음으로써, 피검출 비드 사이의 거리를 증가시키고, 비드 사이의 분리를 명확하게 할 수 있다. 또한, 이러한 비드의 배치와 함께 슬릿 폭을 크게 함으로써, 신호 강도를 증가시킬 수도 있다. 즉, 결과로서 고감도 고분해능의 계측을 실현할 수 있는 효과가 있다.

도 10은 제4 실시 형태의 장치 개략을 나타낸 것이다. 제1 내지 제3 실시 형태와는 달리, CCD 카메라를 사용한 광학계이기 때문에, 한번에 다수개의 비드 어레이에 대한 계측을 행할 수 있다. 여기서는 복수개의 항목에 대한 프로브 고정 비드와, 프로브 비고정 비드 또는 차광성 비드를 교대로 배열한 비드 어레이를 사 용할 수 있다. 비드 어레이를 다발로 만든 비드 어레이군 (201)을 중심으로 그의 양측에 송액계 (202), 용액 유지부(도시하지 않음) 및 접속 전환부 (203)을 접속시킨다. 송액계는 각각의 비드 어레이에 송액하는 기능을 갖는 부분이며, 도 3과 같이 실린지를 이용하여 비드 어레이마다 접속하는 계나, 펌프를 이용한 계를 적용할 수 있다. 용액 유지부 및 접속 전환부 (203)은 반응 용액이나 세정 용액 등을 넣은 용기의 부분과 거기 용액으로의 전환 기능을 갖는 부분이며, 도 3과 같이 용기를 병렬로 배치하고, 각각에 밸브를 접속시키는 계 등을 적용할 수 있다. 송액계 (202), 용액 유지부 및 접속 전환부 (203) 모두 발광 반응을 위한 시약을 포함하는 용액을 비드 어레이군 (201) 중의 각각에 유입시키는 기능을 갖는다. 이 비드 어레이군 (201)을 카메라 렌즈 (204)를 통해 CCD 카메라 (205)에서 계측한다 . 카메라 렌즈 (204)는 예를 들면 F값이 0.95, 초점 거리 50 mm의 것을 사용하고, 상 배율을 등배로 설정한 것이다. 비드 어레이 중의 100 마이크로미터의 비드는 CCD 카메라 (205)의 수광면에 100 마이크로미터의 크기로 투영된다. CCD 카메라 (205)는 라인 (206)을 통해 데이터 처리 장치인 퍼스널 컴퓨터 (207)에 접속되고, CCD 카메라 (205)에서 얻어진 화상은 이 퍼스널 컴퓨터 (207)에서 데이터 처리되어 표시된다. 여기서 사용한 CCD 카메라는 어떤 것도 사용할 수 있다.

도 11은 제4 실시 형태에 있어서 비드로부터의 발광의 크로스톡의 예를 나타낸 도면이다. 도 11(A)는 화상의 일부 확대 모식도, 도 11(B)는 비드마다 관측되는 발광 강도를 규격화하여 나타낸 그래프이다. 측정 시간은 임시로 5 분간으로 하였다. 도 11(A)에 나타낸 것은 100 마이크로미터의 폴리스티렌(PS) 비드의 예이 다. 발광되는 비드 (211)(N0.3)의 양측에 발광이 예상되지 않는 비드 (212)(N0.1, 2, 4, 5)가 배치되어 있는 경우이다. 모세관 (213) 중에 비드 (211)과 (212)가 포함되고, 그 공간에는 발광 시약을 포함하는 수용액 (214)가 흐르고 있다. 발광 시약을 포함하는 수용액(214)는 이 도 11(A)에서는 좌측으로부터 송액된다. 발광되는 비드 (211)의 발광 강도를 100으로서 규격하여 광의 강도를 비교한 것이 도 11(B)이다. 이 그래프로부터 알 수 있는 바와 같이, 발광되지 않아야 되는 비드로부터도 약 3 ％ 정도의 강도로 빛이 계측되는 것을 알 수 있다. 이것은 정확한 측정시에는 바람직하지 않다. 특히 얻어지는 발광 강도에 큰 차이가 예상되는 다항목 검출을 이와 같이 배열된 비드로 행하는 경우에는, 작은 발광조차 하지 않는 항목에 대해서는 큰 오차가 생긴다. 발광이 예상되지 않는 비드로부터도 빛이 계측되는 요인으로서, 가장 영향이 큰 것은, 발광하는 비드 (211)로부터의 발광이 예상되지 않는 비드 (212)를 조사하여, 산란 및 굴절의 상태로 계측되는 크로스톡 현상이다.

도 12는 제4 실시 형태에 있어서 비드로부터의 발광 크로스톡에 대하여, 차광성 비드를 사이에 끼운 경우의 예를 나타낸 도면이다. 도 12(A)에 그의 구성을 나타낸다. 차광성 비드 (221)을 발광하는 비드 (211)과 발광하지 않는 비드 (212) 사이에 삽입하고 있다. 여기서는 차광성 비드 (221)로서, 차광성 물질을 혼합한 입자, 예를 들면 100 마이크로미터의 MnO₂ 미립자를 폴리스티렌에 혼합하여 제조한 비드를 이용하였다. 그 외에, 흑색, 청색, 적색 등의 착색 입자나 착색 라텍스, 금속 입자, 차광성을 나타내는 물질을 혼합하거나 또는 다른 재질의 물질로 포함한 입자 등, 차광성을 나타내는 것이면 어떠한 재질의 물질이라도 사용할 수 있다. 가장 바람직한 것은, 투광성이 현저히 낮은 흑색의 입자이고, 재질에는 의존하지 않는다. 즉, 폴리스티렌이며 흑색 입자를 포함하면, 차광성을 유지하면서 가장 양호한 고정화를 위한 표면을 제공할 수 있다. 도 12(B)는 화상의 확대 모식도를, 도 12(C)는 비드마다 관측되는 발광 강도를 규격화하여 나타낸 그래프를 나타낸다. 측정 시간은 임시로 5 분간으로 하였다. 이 차광성 비드 (221)을 사이에 끼움으로써, N0.1 위치의 비드 발광 강도가 2.8 ％로부터 0.9 ％로, N0.5 위치의 비드로부터의 발광 강도가 3.2 ％로부터 1.2 ％로 각각 대폭 감소된다. 차광성 비드 (221)가 발광하는 비드 (211)이 발광을 차단하여 크로스톡량을 감소시키는 효과가 있다.

본 실시 형태에서 사용되는 루미놀계 발광에서는 발광 파장이 약 420 nm이고, 차광성 비드의 재료 특성으로서 그 파장을 차단하는 재료라면 문제없다. 페라이트를 혼합한 플라스틱 비드, 흑색 안료를 섞은 플라스틱 비드나 금을 증착시킨 비드 등을 생각할 수 있다. 또한, 여기서는 100 마이크로미터의 비드 하나만을 사이에 끼운 계에 대하여 고찰하였지만, 반드시 그것으로 한정되지 않고, 예를 들면 30 마이크로미터 또는 그 이하의 차광성 비드를 얼마간 넣어둔 계에서도 동일한 효과를 기대할 수 있다.

도 13은 제4 실시 형태에 있어서의 비드로부터의 발광의 크로스톡에 대하여, 용액의 굴절률을 조정한 경우의 효과를 모식적으로 나타낸 도면이다. 도 13(A)는 굴절률의 조정을 하지 않는 경우의 모식도이다. 발광하는 비드 (211)로부터의 발 광에는, 직접 광학계 방향으로 향하는 광선 (231)과 이웃 비드를 향하는 광선 (232)가 있다. 예를 들면 발광 반응을 위한 시약을 포함하는 수용액 (214)의 굴절률은 1.33 부근으로 하고, 비드의 한 재질인 폴리스티렌을 예로 하면, 그의 굴절률은 1.58이다. 그 때문에 이웃 비드를 향하는 광선 (232)는 비드 (212)의 표면에서 산란 또는 굴절의 영향을 받고, 그 때문에 광학계 방향으로 향하여, 결과로서 발광하지 않는 비드 (212)에의 크로스톡으로서 관측되게 된다. 도 13(B)는 이상적으로 굴절률 조정을 행한 경우의 모식도이다. 용액 (233)의 굴절률을 폴리스티렌과 동일한 굴절률로서 조정할 수 있는 경우, 이웃 비드를 향하는 광선 (232)는 비드 (212)의 표면에서 산란 또는 굴절의 영향을 받지 않게 된다. 따라서 산란 또는 굴절에 의해서 생기는 크로스톡을 0으로 억제하는 것이 가능하다. 즉, 용액을 비드의 굴절률에 가까운 굴절률로 하는 구성으로 하여, 크로스톡을 감소시킬 수 있다. 효소를 이용하지 않고 화학 여기를 이용한 화학 발광의 경우, 유기 용매의 선택폭이 넓어지기 때문에, 굴절률의 조정은 보다 간편하다. 또한, 상기 폴리스티렌은 굴절률이 1.58이지만, 비드의 재질을 더 굴절률이 낮은 물질, 예를 들면 굴절률 1.47의 유리로 할 때에는, 용액의 굴절률을 낮은 범위에서 조정할 수 있어, 보다 용이하게 크로스톡을 막을 수 있다.

도 14는 제4 실시 형태에 있어서의 비드로부터의 발광의 크로스톡에 대하여, 용액의 굴절률을 글리세롤로 조정한 경우의 효과에 대하여 반사율의 관점에서 검증한 그래프이다. 수용액의 굴절률을 비교적 크게 변화시키고, 또한 효소 반응에 대한 영향이 적은 물질로서 글리세롤이 있다. 글리세롤 수용액의 굴절률은 그의 중 량에 대한 농도(중량％)를 증가시킴에 따라서 1.33으로부터 l.47까지 증대된다. 크로스톡을 수직 방향의 빛의 반사율로 대표시켜 평가하고, 또한 글리세롤 농도가 0 ％일 때의 반사율을 100 ％로 하였을 때의 반사율을 반사율비로서 각각 계산하여 그래프화하였다. 비드가 폴리스티렌(PS)인 경우, 수용액에서의 반사율은 0.74 ％이다. 글리세롤 농도를 높여가면 굴절률차가 작아지기 때문에 반사율도 감소된다. 예를 들면 글리세롤을 50 ％ 넣으면 반사율비가 50 ％로 내려가, 충분한 효과가 얻어진다. 이 때의 굴절률차는 0.18이다. 글리세롤 농도가 80 ％를 초과하면 점도가 대폭 증대되어 가기 때문에, 실제 송액에 문제가 생길 가능성이 있다. 즉, 비드가 폴리스티렌인 경우에는, 글리세롤의 농도는 50 ％ 이상 80 ％ 이하의 범위로 하는 것이 바람직하다. 비드가 유리인 경우에는, 수용액에 대한 반사율이 0.25 ％로 폴리스티렌의 3분의 1이고, 또한 글리세롤 농도를 30 ％로 하는 것만으로 반사율비도 49 ％로 반 이하가 된다. 즉, 비드가 유리인 경우에는, 글리세롤의 농도는 30 ％ 이상 80 ％ 이하로 하는 것이 바람직하다. 비드 어레이에 이용되는 일반적인 비드의 양태를 고려하면, 일반적으로는 상기 조건으로부터 글리세롤의 농도는 30 ％ 이상 80 ％ 이하의 범위로 해두는 것을 바람직하다. 이번에는 글리세롤의 경우를 나타내었지만, 굴절률을 변화시키는 용매이면, 이것으로 한정되지 않는다.

비드의 굴절률을 nb, 용액의 굴절률을 ns라 하고 반사율을 계면의 수직 방향의 반사율 k로 대표시키면, k=(nb-ns)²/(nb+ns)²라는 관계가 있다. 글리세롤 용액일 때의 글리세롤의 범위는 상기와 같이 30 ％ 이상 80 ％ 이하로 하는 것이 바람 직하다. 다른 용액의 경우에도 비드의 굴절률과 용액의 굴절률차는 작은 것이 바람직하지만, 이후의 고찰로부터 실효적으로는 0.2 정도면 충분히 효과가 있다고 생각된다. 상기 반사율의 식을 용액 굴절률 ns를 해(解)로 하여 풀면, ns=nb*[(1+k)/(1-k)+{(1+k)²/(1-k)²-1}]이 된다. 비드의 재질이 폴리스티렌일 때는 nb=1.58, 유리일 때는 1.47로 하면 된다. 발광 시약으로서 어떠한 굴절률 조정도 하지 않은 경우의 반사율을 kO으로 생각하고, 반사율이 반이 되면 충분한 효과가 있는 것을 생각하면, k로서 0.5×k0의 값을 대입하여 생각할 수 있다. 이때의 용액 굴절률 ns는, 비드가 폴리스티렌 및 유리인 각각에 대하여 1.40 및 1.37로 계산된다. 비드 굴절률과의 차를 취하면 0.18 및 0.10이 된다. 일반적으로 수지의 굴절률쪽이 유리의 굴절률보다 높고, 또한 폴리스티렌 이외의 수지의 비드를 채용하는 것을 생각하여, 굴절률차가 0.2 정도 또는 그 이하로 해두면 충분한 효과가 있다.

도 15는 제4 실시 형태에 있어서의 비드로부터의 발광의 크로스톡에 대하여, 발광 반응을 위한 시약을 포함하는 용액이 함유하는 글리세롤의 농도가 70 ％가 되도록 조정한 경우의 예를 나타낸 도면이다. 이 때의 용액 (233)의 굴절률은 1.43이다. 그 외의 구성은 도 11과 동일하고, 비드는 굴절률이 1.58인 폴리스티렌을 이용하였다. 도 15(A)는 화상의 확대 모식도를, 도 15(B)는 비드마다 관측되는 발광 강도를 규격화하여 나타낸 그래프를 나타낸다. 측정 시간은 5 분간으로 하였다. 발광 반응을 위한 시약의 용액을 글리세롤 70 ％의 것으로 조정함으로써, 발 광하지 않는 비드 (212)의 발광 강도를 발광에 기여하는 비드 (211) 발광량의 0.7 ％로부터 1.0 ％로 억제할 수 있다. 이것은 굴절률 조정을 하지 않는 경우에 비해 약 4 분의 1의 값이며, 대폭 감소된다. 용액의 굴절률을 비드의 것에 근접하게 함으로써, 발광이 예상되지 않는 비드 (212)의 크로스톡량을 감소시키는 효과가 있다고 생각된다.

본 실시 형태에서는 비드 어레이를 이용하였지만, 비드 어레이를 이용한 경우로 한정되는 것은 아니다. 검출 대상이 되는 생화학 물질을 포착하는 프로브를 고상에 고정시킨 유로를 갖는 디바이스에 있어서, 발광 검출을 그 프로브가 있는 근방을 계측함으로써 행하는 계에서는, 일반적으로 크로스톡의 문제가 발생하기 때문에, 본 실시 형태는 효과적이다.

도 16은 제4 실시 형태 중 편광판을 이용한 크로스톡의 감소에 관련된 장치 개략을 나타낸 것이다. 도 10에서 나타낸 장치 구성에 부가적으로, 비드 어레이군 (201)과 CCD 카메라 (205) 사이에 편광판 (241)을 넣은 장치이다. 비드 어레이군 (201)에서의 발광은 발광 기질이 랜덤한 방향을 향하여 발광하기 때문에 편광되지 않는다고 생각되지만, 이웃 비드에서 반사되는 크로스톡에 대해서는, s파 및 p파의 반사율 차이로부터 편광된다고 생각된다. 이 때문에, 편광판 (241)을 넣음으로써, 크로스톡의 기여분을 작게 할 수 있다. 이 방법은, 도 12로부터 도 15까지 기술한 차광성 미립자를 사용하는 계나 용액의 굴절률 조정을 행하는 계에 비해 매우 간단한 구성이면서 저가로 크로스톡의 감소화를 행할 수 있다고 하는 이점이 있다.

실시예 1

실험에 이용한 장치의 개략도를 도 17에 나타낸다. 또한, 반응은 도 1의 플로우 차트에 따라서 행하였다.

93 ㎛의 폴리스티렌 비드(JSR(주) 제조, 폴리스티렌제 표준 입자 다이노스피어스(DYNOSPHERES), 형번 SS-922P) 현탁액 10 방울(약 1 mL)을 1.5 mL의 에펜도르프 튜브에 취하고, 탁상 소형 원심기(밀리포어사 치비탄, 토미 세이꼬 제조)에서 비드와 상청을 분리하고, 피펫으로 상청을 제거한 후, 탄산 완충액(NaHCO₃3.0 g, Na₂CO₃1.5 g, 물 1 L, pH 9.6)으로 조정한 10 μg/mL 항-IgE-항체(베틸사(Bethyl) 제조, 염소 항인체 IgE-친화성 정제 형번 A80-108A) 1 mL를 첨가하고, 밤새 방치하여 고정화시켰다. 그 후, 상청을 제거하고, 탄산 완충액을 첨가하여 교반하고, 다시 탁상 원심기로써 상청과 비드를 분리하여 상청을 제거하였다. 이 세정 조작을 3, 4회 행하였다. 블록 에이스^TM(Block Ace; 발매원 다이닛본 세이야꾸(주), 제조원 유끼지루시 뉴교(주))으로 1 시간 블로킹을 행하였다.

블록 에이스^TM으로 블로킹 처리만을 행하고, 항-IgE-항체를 고정시키지 않은 비드(이후, 블랭크 비드)를 별도로 제조하였다.

외경 375 ㎛, 내경 150 ㎛의 발연 실리카 모세관(GL 사이언스사 제조)을 10 cm로 자르고, 중심 부분을 연소법에 의해 표면의 폴리이미드를 박리시켜 관찰창을 설치하고, 그 부분에 블랭크 비드 10개, 항-IgE-항체 고정화 비드 1개, 블랭크 비 드 10개의 순서대로 배열하였다. 양쪽 말단은 50 ㎛ 직경의 SUS304 스테인레스 와이어((주)닐라코 제조, 형번 751107)로 고정시켰다. 이 디바이스를 이용하고 도 17의 장치를 이용하여 반응, 검출을 행하였다. 각 모세관의 접속은 내부 시일 커넥터(GL 사이언스 제조, 적용 내경 250 내지 530 ㎛)를 이용하여 행하였다.

먼저, 50 μL의 블록 에이스^TM을 유속 100 μL/분으로 왕복 송액(10 왕복)을 하여 10 분간 반응시켰다 (유로의 블로킹).

다음에, 인산 완충액(와코 준야쿠 고교(주) 제조, 인산 완충액 생리 식염 분말(1 L 중 NaH₂PO₄ 0.35 g, Na₂HPO₄ 1.28 g, NaCl 8 g), pH 7.4, 이후 PBS라 함)으로 희석한 1 ng/mL IgE(베틸사 제조, 인체 IgE 교정기 형번 RC80-108) 50 μL를 유속 100 μL/분으로 왕복 송액(20 왕복)을 하여 20 분간 반응시켰다.

PBS를 유속 100 μL/분으로 한 방향으로 흐르게 하여 4 분간 세정하였다. PBS로 희석한 1000 ng/mL HRP 표지 항-IgE-항체(베틸사 제조, 염소 항인체 IgE-HRP 접합체) 50 μL를 유속 100 μL/분으로 왕복 송액(20 왕복)하여 20 분간 반응시켰다. PBS를 유속 100 μL/분으로 한 방향으로 흐르게 하여 4 분간 세정하였다.

도 18에서는, HRP의 발광 기질로서 슈퍼시그널(등록 상표; SuperSignal) 웨스트펨토(WestFemto) (피어스사(PIERCE) 제조)를 이용한 발광 계측의 결과를 나타낸다. 발광 반응을 위한 시약으로서, 상기 발광 기질을 첨가하면(320 초 부근), 발광에서 유래하는 피크가 얻어졌다. 100 초간을 적산하였을 때, 그 값은 5.5이고, 동일한 실험을 0 ng/mL IgE인 경우(IgE 무첨가의 경우)의 값은 2.3이었다.

실시예 2

93 ㎛의 폴리스티렌 비드(JSR(주) 제조, 폴리스티렌제 표준 입자 다이노스피어스, 형번 SS-922) 현탁액 10 방울(약 1 mL)을 1.5 mL의 에펜도르프 튜브에 취하고, 탁상 소형 원심기(밀리포어사 치비탄, 토미 세이꼬 제조)에서 비드와 상청을 분리하고, 피펫으로 상청을 제거한 후, 삼나무 화분 추출물을 PBS로 50 μg/mL로 조정한 용액을 1 mL 첨가하여 밤새 방치하고, 삼나무 화분 추출 항원을 고정화시켰다. 그 후, 상청을 제거하고, 탄산 완충액을 첨가하여 교반하고, 다시 탁상 원심기로써 상청과 분리하여 상청을 제거하였다. 이 조작을 3, 4회 행하였다. 블록 에이스^TM(발매원 다이니폰 세이야꾸(주), 제조원 유끼지루시 뉴교(주))을 1 mL 첨가하여 1 시간 블로킹을 행하였다.

블록 에이스^TM으로 블로킹 처리만을 행하고, 삼나무 화분 추출 항원을 고정시키지 않은 비드(이후, 블랭크 비드)를 별도로 제조하였다.

디바이스로는 3.0 cm×4.0 cm×0.15 cm 크기의 폴리메틸메타크릴레이트에 내부 치수 110 ㎛×110 ㎛의 홈을 가공한 칩을 이용하였다. 칩의 개방 부분을 동일한 재질의 두께 50 ㎛의 필름으로 라미네이팅하여 막았다. 칩에 블랭크 비드 10개, 삼나무 항원 고정화 비드 1개, 블랭크 비드 10개의 순서대로 배열하였다. 칩의 말단에는 비드의 유출을 막기 위해서, 댐 구조를 설치하고, 반대측은 테이퍼 구 조가 되며, 외경 375 ㎛, 내경 50 ㎛의 발연 실리카 모세관(GL 사이언스사 제조)을 삽입함으로써 비드의 유출을 중지시켰다. 각 모세관의 접속은 내부 시일 커넥터(GL 사이언스 제조, 적용 내경 250 내지 530 ㎛)를 이용하여 행하였다.

먼저, 50 μL의 블록 에이스^TM을 유속 100 μL/분으로 왕복 송액(10회)를 하여 10 분간 반응시켰다 (유로의 블로킹).

PBS로 조정한 100 ng/mL 마우스 모노크로날 항-Cryj1 항체((주)하야시바라 세이부쯔 가가꾸 겡뀨쇼 제조, AB-삼나무 화분 항원 Cryj1, (026)(mo)(M), Affin) 50 μL를 유속 100 μL/분으로 왕복 송액(20회)하여 20 분간 반응시켰다. PBS를 유속 100 μL/분으로 한 방향으로 흐르게 하여 4 분간 세정하였다. PBS로 조정한 1000 ng/mL HRP 표지 항 마우스 IgG 항체(다코사(Dako) 제조 항마우스 면역글로불린/HRP, 형번 P0447) 50 μL를 유속 100 μL/분으로 왕복 송액(20회)하여 20 분간 반응시켰다. PBS를 유속 100 μL/분으로 한 방향으로 흐르게 하여 4 분간 세정하였다.

도 19에서는, 발광 반응을 위한 시약으로서 슈퍼시그널(등록 상표) 웨스트펨토(피어스사 제조)를 송액 개시하자(500 초 부근), 피크가 얻어졌다. 100 초간 적산하면, 그 값은 16.2였다.

실시예 3

실험에 이용한 장치의 개략도를 도 20에 나타낸다. 250 ㎛의 PS 비드(폴리사이언스사(Polysciecnce) 제조, 입경 범위 250 내지 300 ㎛)에 대하여, PBS로 조 정한 10 μg/mL의 HRP 표지 항-알돌라제 항체(록클랜드사(ROCKLAND) 제조 항-알돌라제, 토끼 근육, Goat-Poly, HRP, 형번 200-1341)를 밤새 냉장고내에서 고정화를 행하였다.

상기 비드의 양측에, 흑색 비드(듀크사이언스사(DukeScience) 제조, 입경 50 ㎛, 형번 BK050T)를 수개씩 끼우고, 또한 양측에 아무것도 고정시키지 않은 250 ㎛ PS 비드를 외경 450 ㎛, 내경 320 ㎛의 발연 실리카(GL 사이언스사 제조) 중에 배열하였다.

양쪽 말단은 50 ㎛ 직경의 SUS304 스테인레스 와이어((주)닐라코 제조, 형번 751107)로 고정시켰다.

발광 반응을 위한 시약으로는, HRP의 발광 기질 슈퍼시그널(등록 상표) 웨스트펨토(피어스사 제조)를 이용하고, 실린지 펌프 중에 발광 기질을 세팅하고, 비드 어레이에 송액하였다. 송액 개시하고 5 분간의 적산 결과를 비드 어레이 디바이스 상의 라인 프로파일로 취득하고, 픽셀에 대한 강도를 나타낸 그래프를 도 21에 나타낸다.

비교로서, 블랭크 비드를 HRP 표지 항-알돌라제 항체 고정화 비드 사이에 끼운 것을 나타낸다.

그 결과, 검출 대상인 비드를 차광 비드 사이에 끼운 경우에는, 이웃 비드로의 빛의 누설을 막을 수 있었다.

Claims

적어도 일부에 프로브를 결합시킨 고상을 수용하는 유로에, 표지된 검출 대상 물질 또는 표지되지 않은 검출 대상 물질을 포함하는 액체를 공급하는 공정과,

상기 프로브에 상기 표지된 검출 대상 물질을 포착시키는 공정 또는 표지되지 않은 검출 대상 물질을 프로브에 포착시키면서 표지하는 공정과,

상기 유로에 발광 반응을 위한 시약을 액류에 의해 공급하는 공정과,

상기 발광 반응을 위한 시약과 상기 표지가 반응한 부위 근방을 광학적으로 검출하는 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 생화학 물질의 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 프로브에 상기 표지된 검출 대상 물질을 포착시키는 공정 또는 표지되지 않은 검출 대상 물질을 프로브에 포착시키면서 표지하는 공정에 있어서, 표지된 검출 대상 물질 또는 표지되지 않은 검출 대상 물질을 포함하는 액체를 왕복 송액에 의해 공급하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 표지가 효소이고, 상기 발광 반응을 위한 시약이 이용되는 효소에 대응하는 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
제3항에 있어서, 상기 효소가 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 글루코스옥시다제, β-D-갈락토시다제, 글루코스-6-인산데히드로게나제, 인버타제, 아데노신삼 인산(이후, ATP)아제, 루시페라제, 에쿼린이며, 상기 기질이 루미놀, 디옥세탄, 과옥살산에스테르, 글루코스, β-D-갈락토실, 글루코스-6-인산, 루시게닌, 아스코르브산 인산에스테르, 아데노신 삼인산, 루시페린 또는 이들의 유도체, 또는 칼슘 이온인 분석 방법.
제4항에 있어서, 상기 발광 반응을 위한 시약이 산화제 또는 산소 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
제3항에 있어서, 상기 효소가 퍼옥시다제이고, 상기 기질이 루미놀 또는 루미놀 유도체이며, 상기 발광 반응을 위한 시약이 산화제 또는 산소 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
제6항에 있어서, 상기 산화제가 과산화수소, 또는 알킬히드로퍼옥시드를 포함하는 과산인 분석 방법.
제3항에 있어서, 상기 발광 반응을 위한 시약이 발광 증감제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 고상이 입자이고, 상기 근방이 상기 입자 근방인 것을 특징으로 하는 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 검출하는 공정과, 상기 발광 반응을 위한 시약을 액류에 의해 공급하는 공정을 동시에 행하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 고상이 복수개의 입자이고, 상기 복수개의 입자가 차광성 입자와 상기 프로브를 고정시킨 검출 대상 입자로 이루어지고, 상기 검출 대상 입자와 다른 검출 대상 입자 사이에 1개 이상의 상기 차광성 입자를 배열시키는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
제9항에 있어서, 상기 유로에 공급되는 상기 발광 반응을 위한 시약을 포함하는 용액의 굴절률이, 상기 입자의 굴절률과의 차가 0.2 정도 이하인 것을 특징으로 하는 분석 방법.
제9항에 있어서, 상기 유로에 공급되는 상기 발광 반응을 위한 시약을 포함하는 용액이 글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
제9항에 있어서, 상기 유로에 공급되는 상기 발광 반응을 위한 시약을 포함하는 용액이 글리세롤을 30 ％ 이상 80 ％ 이하의 농도의 범위에서 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 검출하는 공정에서, 편광판을 개재하여 광학적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 검출하는 공정에서, 슬릿을 포함하는 광학계와 상기 고상을 상기 유로의 길이 방향으로 상대적으로 이동시켜 광학적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
세관과,

프로브를 고정시키면서 상기 세관에 수용되는 제1 입자와,

차광성 물질을 포함하면서 상기 세관에 수용되는 제2 입자와,

발광 반응을 위한 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
제17항에 있어서, 상기 제2 입자가 상기 발광 반응으로 생기는 발광 파장에 대한 차광성을 갖는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
제17항에 있어서, 상기 발광 반응을 위한 시약이 루미놀, 디옥세탄, 과옥살산에스테르, 글루코스, β-D-갈락토실, 글루코스-6-인산, 루시게닌, 아스코르브산 인산에스테르, 아데노신삼인산(ATP), 루시페린 또는 이들의 유도체, 또는 칼슘 이온인 분석 키트.
제19항에 있어서, 상기 발광 반응을 위한 시약이 산화제 또는 산소 첨가제를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
제17항에 있어서, 상기 발광 반응을 위한 시약이 루미놀 또는 그의 유도체와, 산화제 또는 산소 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
제21항에 있어서, 상기 산화제가 과산화수소, 또는 알킬히드로퍼옥시드를 포함하는 과산인 분석 키트.
제17항에 있어서, 상기 발광 반응을 위한 시약이 발광 증감제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
프로브를 적어도 일부에 고정시킨 고상을 수용하는 세관에 액체를 도입 또는 도출하기 위한 송액부와,

시료를 수용하기 위한 제1 용기와,

발광 반응을 위한 시약을 수용하기 위한 제2 용기와,

상기 고상의 임의의 부위를 광학적으로 검출하기 위한 검출부를 포함하고,

상기 제1 용기와 상기 제2 용기는 상기 송액부에 연결되는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
제24항에 있어서, 상기 고상이 입자이고, 상기 검출부가 측정 대상인 상기 입자 근방에 한쪽 단부를 배치시킨 광 섬유인 것을 특징으로 하는 분석 장치.
제24항에 있어서, 상기 송액부가 복수개의 상기 세관을 각각 연결시키는 접속부를 갖는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
제24항에 있어서, 상기 검출부가 상기 세관에 대하여 상대적으로 이동하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
제24항에 있어서, 상기 고상이 복수개의 입자이고, 상기 복수개의 입자가 상기 프로브를 고정시킨 복수개의 제1 입자와 상기 복수개의 제1 입자 각각의 사이에 배치되면서 또한 상기 프로브가 고정되지 않은 복수개의 제2 입자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
제24항에 있어서, 상기 세관과 상기 검출부 사이의 위치에 편광판을 갖는 것을 특징으로 하는 분석 장치.