WO2006123459A1 - 生化学物質の分析方法 - Google Patents

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luminescence
beads
probe
analysis method
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Yoshinobu Kohara
Hideyuki Noda
Teruyuki Kobayashi
Kunihiro Suto
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Hitachi Chemical Company, Ltd.
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    • G01N35/085—Flow Injection Analysis

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing biochemical substances.
  • the present invention also relates to a biochemical substance analyzer using an analysis device in which a probe, which is a substance that specifically captures a biochemical substance, is fixed to a solid phase.
  • Fluorescence methods include a method of directly labeling a biochemical substance to be detected and a method of indirect labeling.
  • the former is that the biochemical substance to be detected is directly labeled with a fluorophore, and this fluorescently labeled biochemical substance is captured and detected by an antibody immobilized on a solid phase. is there.
  • competition methods are also included in this category.
  • the latter includes a sandwich assembly in which antibodies that have affinity for the same biochemical substance are fluorescently labeled and then reacted secondarily.
  • chemiluminescence has been developed.
  • chemiluminescence since the scattering of excitation light is not measured as background light, more sensitive measurement can be realized.
  • chemiluminescence there are cases where an enzyme is directly or indirectly labeled on a biochemical substance to be detected, and a fluorescent substance is labeled.
  • peroxidase or alkaline phosphatase is often used as the enzyme.
  • Eliza method falls into this category.
  • An antibody that captures the target biochemical substance is immobilized on the microplate wall, etc., and a solution containing the detection target substance is added.
  • the substance to be detected in the solution is captured on the wall by the antibody, and the excess solution is washed away.
  • Add the enzyme-labeled antibody wait for the enzyme-labeled antibody to bind to the detection target substance, and wash away the excess solution.
  • a solution containing a luminescent reagent that reacts with the enzyme is added, and the resulting luminescence is detected.
  • the fluorescent substance is labeled, for example, in the case of an application as an HPLC detector, each fluorescently labeled molecule flowing out of the HPLC is mixed with a chemical excitation agent and labeled. The chemiluminescence emitted when the phosphor is chemically excited is detected.
  • a multi-item detection device there is a technique (hereinafter referred to as a bead array) in which beads to which probes are bound are arranged in a thin tube (for example, Patent Document 1). There is also a report on a detection device in which a molecule that captures a target substance is bound to a solid phase using a microphone port channel (for example, Patent Document 2).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 11-243997
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 11-075812 Disclosure of Invention
  • the number of photons per unit time that can be obtained from the target is reduced compared to the fluorescence method, so use a highly sensitive measurement system and reduce the measurement time. Ingenuity such as increasing is necessary.
  • fluorescent labeling is performed on the detection target substance, and the capture of the fluorescent labeling substance on the probe is detected by fluorescence. While there is a merit that the reaction speed is fast, scattered light derived from excitation light and background light from bead material may be generated.
  • luminescence detection is applied to a bead array, it is necessary to ensure absolute sensitivity because the number of photons per unit time decreases, and the luminescence from one bead is reflected on the surface of the next bead. It is assumed that “reflection” is measured like light emission from the beads.
  • Scattered light and reflected light derived from light emission may also be generated in detection devices that use a microphone port channel and have molecules that trap the target substance in the solid phase.
  • a probe bound to a solid phase a step of capturing a labeled detection target substance on the probe or a step of capturing and labeling an unlabeled detection target substance on the probe, a step of supplying a luminescent reagent by a liquid flow, And a step of optically detecting the vicinity of the site where the luminescent reagent and the label react with each other.
  • the solid phase means that the probe is fixed at least partially.
  • particles beads
  • channel walls protrusions installed in the channels, string-like members, and the like can be used.
  • plastics examples include plastics, metals, and inorganic compounds.
  • Plastics include styrene resins such as polystyrene and polymethylstyrene, polyolefin resins such as polypropylene, polyethylene and polycyclohexylene, polyacrylates such as polycarbonate, polymethylacrylate, and polyethylacrylate, and polymethylmethacrylate.
  • acrylic resins such as polymethacrylates such as poly (methacrylate) and poly (methacrylate)
  • fluororesins such as polyfluoroolefin
  • silicone resins such as dimethylsiloxane and jetylsiloxane.
  • Examples of the metal include iron, stainless steel, copper, and alloys thereof.
  • Examples of inorganic compounds include glass, ceramics, and semiconductors.
  • the material of the solid phase is not limited to these, and may be composed of a single material or a plurality of materials. Polystyrene is most preferred because of the ease of probe to the solid phase, low background, and availability.
  • the bead diameter is preferably 0.1 ⁇ ⁇ to 6 ⁇ , more preferably 0.5 // m to l mm, and further preferably 0.7 5 / im to It is preferably 500 ⁇ m, most preferably 1.0 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the pipe into which the beads are inserted is a pipe according to the bead size to be used and less than twice the diameter of the beads.
  • high sensitivity can be realized by measuring the timing of the luminescent substrate delivery and the timing of measurement.
  • a phenomenon is used in which a large luminescence peak appears in a short time from the time when the luminescent substrate reaches the solid phase, for example, the enzyme on the bead. By observing this peak, it is possible to separate the signal and noise with high accuracy and to measure with high sensitivity.
  • the luminescent reagent is always supplied, and the concentration of the luminescent reagent in the vicinity of the enzyme does not decrease. can do.
  • High-sensitivity and stable measurement can also be performed by adding signals after high peaks for a long time.
  • the luminescence detection system in the present invention includes a chemiluminescence detection system and a bioluminescence detection system.
  • Chemiluminescence is a phenomenon in which when a molecule excited by a chemical reaction returns to the ground state, it emits light as energy.
  • Bioluminescence refers to the use of a bioenzyme such as firefly or pacteria luciferase.
  • a phenomenon that emits light by a chemical reaction, such as oxidation, may fall into the category of chemiluminescence in a broad sense.
  • the chemiluminescence detection system includes chemiluminescence of peroxidase using luminol / hydrogen peroxide as a substrate, and amadan tilme, a dioxetane derivative. Chemiluminescence of alcohol phosphatase using oxyphosphorylphenyl dioxetane (AMP PD) as a substrate, persuccinic acid ester derivatives such as bis 1,2,4,6_ trichlorophoxalate (TCPO) / There is a detection system that uses chemiluminescence of alkaline phosphatase with a fluorescent dye size such as hydrogen peroxide / 8-anilin nonaphthalene sulfonic acid (AN S), and the bioluminescence detection system is, for example, ATP / Luciferi Bioluminescence detection system for firefly luciferase using magnesium ion as a substrate, Glucose-6-phosphate dehydrogenase generates NADH produced from glucose
  • the issue of preventing the reflection of light emission between beads is important for highly sensitive multi-item detection, regardless of the measurement optical settings.
  • One means for solving this problem is to place beads made of a light-shielding material between a plurality of beads to be measured.
  • Another solution is to make the refractive index of the solution containing the luminescent reagent close to the refractive index of the beads.
  • a solution containing a luminescent reagent is ideally prepared and has substantially the same refractive index as the bead material, no light is reflected from the surface of the beads, so light is reflected between the beads. Can be prevented.
  • Another means for solving this problem is to insert a polarizing plate between the measuring device and the bead array.
  • the light emitted from the bead surface emits light in a random direction from the luminescent substrate, so the power that is considered to be unpolarized is reflected by the difference in the reflectivity of the s-wave and p-wave for reflection reflected by the adjacent bead It is thought that it is polarized. For this reason, by adding a polarizing plate, it is possible to focus on the reflection component, and as a result, the contribution of reflection can be reduced.
  • the labeled detection target A step of capturing a quality or a step of capturing and labeling an unlabeled detection target substance by a probe, a step of supplying a reagent for a luminescence reaction to the flow path by a liquid flow, and a step of And a step of optically detecting the vicinity of the site where the reagent and the label react.
  • a capillary As an example of the analysis kit, a capillary, a first particle to which a probe is fixed and contained in the capillary, a second particle containing a light-shielding substance and contained in the capillary, And a reagent for a luminescence reaction.
  • a liquid feeding part for introducing and / or deriving a liquid into a narrow tube containing a solid phase with a probe fixed at least partially, and a first container for containing a sample
  • a second container for storing a reagent for a luminescence reaction, and a detection unit for optically detecting an arbitrary part of the solid phase, the first container and the second container This container is connected to the liquid feeding section.
  • a highly sensitive and quantitative light emission method can be realized in a detection device that detects light emission in multiple items.
  • a bead array when used, there is an effect of preventing reflection of light emission between the beads.
  • FIG. 1 is a flowchart of one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of an apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of a luminescence measurement example and a luminescent reagent feeding timing according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of an apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of a luminescence measurement example and a luminescent reagent feeding timing according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a schematic diagram of an apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a schematic diagram of the relationship between scanning and data in the optical system according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of the relationship between the slit width and the signal waveform according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a schematic diagram of an apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a schematic view of light emission reflection according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a schematic diagram of the reflection of light emission and the effect of light-shielding beads according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a schematic diagram of the effect of the reflection of light emission and the adjustment of the refractive index of the solution according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a graph of the reflectance obtained by adjusting the refractive index of the solution according to the embodiment of the present invention with dalycerol.
  • FIG. 15 is a schematic diagram of the reflection of light emission and the effect of a glycerol 70% solution according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 16 is a schematic diagram of an apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 17 is a schematic diagram of an experimental apparatus according to Examples 1 and 2 of the present invention.
  • FIG. 18 is a diagram showing the measurement results of Example 1 of the present invention.
  • FIG. 19 is a diagram showing the measurement results of Example 2 of the present invention.
  • FIG. 20 is a schematic diagram of an experimental apparatus according to Example 3 of the present invention.
  • FIG. 21 shows the measurement results of Example 3 of the present invention.
  • FIG. 1 is a flowchart showing an outline of the analysis method of the first embodiment. The details will be described in the following paragraphs.
  • a device having a flow path in which an antibody that captures the biochemical substance to be detected is immobilized on a solid phase is used. Introduce a sample solution containing the target substance for detection. Before the sample was introduced, nothing was captured by the antibody.
  • the step (B) there is a step of capturing the detection target substance in the introduced sample solution by the antibody on the solid phase. In this case, it is possible to continue feeding the sample solution, or to stop feeding and wait for the reaction to proceed.
  • step (C) there is a step of washing away the excess sample solution and washing the inside of the device.
  • the substance to be detected is substantially present only at the site captured by the antibody.
  • the next step (D) there is a step of introducing a solution containing an antibody labeled with an enzyme that emits light having affinity for the detection target substance into the device and reacting with the detection target substance. This step is a step of indirectly labeling the detection target substance.
  • the next step (E) there is a step of washing the inside of the device by washing away excess enzyme-labeled antibody that has not reacted with the detection target substance and has not been captured on the solid phase.
  • the enzyme that emits light later will be present only at the site where the substance to be detected is present, that is, at the site where the antibody that captures the biochemical substance to be detected is immobilized on the solid phase. As a result, no light is emitted from other places.
  • a luminescent reagent that reacts with an enzyme is allowed to flow inside the device and the luminescence from the vicinity of the antibody is measured. Since the enzyme that causes luminescence exists only when the detection target substance is captured, the luminescence in the vicinity of the solid phase to which the enzyme that captures the detection target substance is immobilized is derived from the presence of the detection target substance.
  • the amount of luminescence also reflects the amount of captured substance to be detected, or the amount or concentration of the substance to be detected in the sample solution.
  • the final step (G) there is a step of processing a measurement signal derived from the measured luminescence as a detection result. By this step, the amount of the detection target substance is estimated from the obtained emission intensity.
  • FIG. 2 shows the outline of the first embodiment as a schematic diagram in the vicinity of the solid phase on which the detection substance is fixed.
  • the overall picture of the liquid delivery device and the measuring device will be described in the following paragraphs.
  • a bead array is used as a device having a channel in which an antibody is immobilized on a solid phase.
  • Outline of bead array Figure 2 (1) is a partial enlargement of.
  • a capillary 1 0 1 is used as a narrow tube for forming the flow path.
  • the detection target in this embodiment is, for example, hypoprotein 1
  • anti- ⁇ protein protein 10 4 is immobilized on beads 10 2.
  • the inner diameter of the capillary is 150 microns, for example.
  • FIG. 2 (2) shows a schematic diagram in which a sample solution 10 9 containing ⁇ -foot protein 10 5 is introduced.
  • the sample solution here is 50 L, and the volume flow of the solution is 10 L / min.
  • Fig. 2 (4) shows a schematic diagram of washing the sample solution 109 with the washing buffer 110.
  • the washing buffer 110 for example, a phosphate buffer ( ⁇ 7.4) containing a salt was used, and washing was performed under the condition that 100 was allowed to flow for 30 seconds.
  • M E S (2- ( ⁇ -) was used as the washing buffer 110.
  • Morpholino ethane sulfo ic acid ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ T ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ — — ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) buffer, Tris_EDTA_borate buffer, borate buffer, etc. Any buffer can be used. Further, as the salt to be added, salts such as sodium chloride, potassium chloride, ammonium chloride, sodium acetate, potassium acetate, and ammonium acetate can be used. ⁇ - features not captured on beads 10 2 by this wash 10 5 is washed out of the bead array device.
  • FIG. 2 (5) shows a schematic diagram in which a solution 11 1 containing, for example, HRP (horse radish peroxidase) -labeled anti-protein protein antibody 10 is introduced into a bead array.
  • HRP is used as the label, but in the present invention, a labeling enzyme other than HRP or a labeling substance other than the enzyme can also be used.
  • Examples of the labeling enzyme used in the present invention include peroxidase, alkaline phosphatase, gnolecosoxidase,] 3 — D_galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, invenoleretase, adenosine triphosphate Examples include acid (hereinafter ATP) ase, luciferase, and equorin.
  • peroxidase alkaline phosphatase, gnolecosoxidase,] 3 — D_galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, invenoleretase, adenosine triphosphate
  • Examples include acid (hereinafter ATP) ase, luciferase, and equorin.
  • the concentration of HRP-labeled anti- ⁇ -fetoprotein antibody 106 is assumed to be 100 ng / ml, the volume of solution 11 1 is 50 ⁇ u L, and the volume flow rate is 10 per minute.
  • HRP-labeled anti- ⁇ -fetoprotein antibody 10 6 reacts with o-fetoprotein 10 5 captured by anti- ⁇ -fetoprotein antibody 10 4 on beads 10 2, resulting in beads 10 2 Caught on top.
  • Fig. 2 (6) shows a schematic diagram of washing HRP-labeled anti- ⁇ -fetoprotein antibody solution 1 1 1 with wash buffer 1 1 2.
  • a phosphate buffer containing a salt ( ⁇ 17.4) was used, and washing was performed under a condition that 100 ⁇ L was flowed for 30 seconds. By this washing, excess HRP-labeled anti- ⁇ protein protein 106 that was not captured on the beads 102 is washed out of the bead array device.
  • Fig. 2 (7) shows a schematic diagram of the measurement of luminescence 10 8 when solution 1 13 containing reagent 107 for luminescence reaction was passed through the bead array.
  • a reagent for luminescence reaction 10 7 when an enzyme is used for labeling, it contains a substance corresponding to the enzyme used.
  • Substrates include, for example, luminol, dioxetane, peroxalate, gnolecose, / 3 — D-galactocinole, glucose mono-phosphate, noresigenin, ascorbate phosphate, adenosine triphosphate, luciferin or derivatives thereof, Calcium ions are listed.
  • Reagents for luminescent reactions include alkyl hydroxides such as hydrogen peroxide and tarpyl hydroxide. It may contain oxidants such as peracids and oxygen-added oxidants such as sodium and sobenzene.
  • the reagent for the luminescence reaction may further contain a luminescence sensitizer.
  • Photosensitizers include, for example, 4-odophenol, 4 bromophenol, 4-black mouth phenol, 4-phenyl phenol, phenolo reindo mononore, 2-black mouth 4 one phenolenore. , 4 _ (2'-Cheninole) phenol, 4— (2 '-benzothiazolyl) phenol, 4 1 [4'-(2 '-methyl) thiazolyl] phenol, 4 — [2'-(4 ' —Methyl) thiazolyl] phenol, 4 4 'one thiazolinol) phenol, 4— (2'_benzothiazolyl) phenol, 4— [4' one (2'— 3 pyridyl)) thiazole] phenol, Phenothiazine mono-N-propyl sulfonate, 3 _ (10—Phenothiazyl) _ n—Propyl sulfonate, 3— (10—Pheno
  • the reagent for the luminescence reaction includes luminol or a derivative thereof as a substrate, or an oxidizing agent such as lucigenin hydrogen peroxide, 4-iodophenol as a luminescence sensitizer, 4 — [4 ′-(2′-methyl) thiazolyl] phenol, 4— [2 ′ — (4′-methyl) thiazolinol] phenol, 4— (4′-thiazolinole) phenol, 4 -— [4 ′ — ( 2 '-(3'-pyridyl)) thianol] phenol, 4- (2'-cenyl) fu; '-(2'-methyl) thiazolyl] phenol or 4_ [2'-(4'-methyl) thiazolyl] phenol can be used.
  • an oxidizing agent such as lucigenin hydrogen peroxide, 4-iodophenol as a luminescence sensitizer
  • reagents for luminescence reaction can also be used.
  • a chemiluminescence detection system glucose oxidase as a labeling enzyme
  • glucose as a reagent for luminescence reaction
  • Peroxyester derivatives such as triclonal fenoxalate (TCP ⁇ ) / 8—Aryl nonaphthalene sulfonic acid (AN s) and other fluorescent dyes, or systems using glucose / isonorol z microperoxidase (m-P OD), alkaline phosphatase (ALP) as a labeling enzyme, and adamantyl methoxyphos as a reagent for luminescence reaction System using dioxetane derivatives such as holylphenyl dioxetane (AMP PD), / 3 — D-galactosidase as labeling enzyme, 0-nitrophenyl 1 ⁇ — ⁇ — as reagent for luminescence reaction Galactostosyl / galactose dehydrogenase AD + ⁇ ADH, or lactose noglucose oxidase (G OD) / isoluminol /
  • AD P tonoalcohol dehydrogenase
  • the volume flow rate of the solution 1 13 containing the reagent 10 7 for the luminescence reaction was 10 ⁇ L per minute, and the flow was continued for 10 minutes or more.
  • Luminescence occurs when the HRP on the HRP-labeled anti-protein antibody 10 06 reacts with the reagent 10 7 for the luminescence reaction, so that luminescence occurs only in the vicinity of the beads 102 To do.
  • HRP is an antibody immobilized on a bead to capture the detection target, The detection target captured by the antibody and bound to the bead via the HRP-labeled anti-protein protein antibody 10 captured by the detection target.
  • Luminescence occurs in the vicinity of the labeled HRP. As a result, it occurs near the surface of one bead 102.
  • the emitted light 10 8 is measured by the optical measuring instrument 1 1 4. Details of the optical measuring device 1 1 4 will be described later.
  • FIG. 3 shows an outline of the apparatus according to the first embodiment. Centered on bead array 1 2 1 described in Fig. 2, capillary 1 2 5 and capillary 1 2 2 are piped on both sides. One side of Beasley is Capillary 1
  • syringe 1.2 3 Connected to syringe 1.2 3 through 2 2.
  • the piston of the syringe 1 2 3 is pushed and pulled, and as a result, liquid can be fed into the bead array 1 2 1.
  • a cabinet 1 2 5 is piped, and beyond that is connected to a plurality of containers 1 2 7 via valves 1 2 6.
  • Each of these containers 1 2 7 contains the sample solution, washing buffer, HRP labeled antibody solution, etc., described in the previous explanation using FIG. 2, and also used as a waste reservoir. Is done. Access to each container 1 2 7 is achieved by operating valves 1 2 6.
  • the light emitted from the beads array 1 2 1 is measured through the optical fiber 1 3 1.
  • the stage is placed close to the luminous beads in the beads array 1 2 1 depending on the stage.
  • the opposite end of optical fiber 1 3 1 is connected to PMT 1 3 3 through connector 1 3 2 to ⁇ (photomultiplier tube).
  • ⁇ photomultiplier tube
  • FIG. 4 (A) is an example of the luminescence measurement result of the first embodiment
  • FIG. 4 (B) is a schematic diagram showing the timing and amount of luminescent reagent feeding at that time. Measurement starts at time 0, and no luminescence reagent is yet delivered at that time, so luminescence is not measured. The signal strength remains at the background level. It remains constant. The solution containing the luminescent reagent is delivered at a volumetric flow rate of 10 per minute at the start of the luminescent reagent introduction, and then the solution is continued. The signal intensity due to luminescence decreases soon after recording a high peak. The intensity of emitted light after the decrease is very slowly attenuated. The peak width of this first high peak is about 1 second or less.
  • this timing-specific peak is a phenomenon that is specifically observed for light emission.
  • the luminescence reagent is placed in the container and then set in the luminescence measuring device to measure luminescence, and this timing-specific peak cannot be observed.
  • This timing-specific peak can be detected by measuring the luminescence at the site where luminescence occurs while flowing the reagent for the luminescence reaction. By measuring this timing-specific peak, high S / N measurement can be performed instantaneously. As a result, it is possible to measure with a small amount of luminescent reagent. In addition, highly sensitive measurement is possible.
  • the luminescence reagent is always supplied, and the concentration of the luminescence reagent in the vicinity of the enzyme is not attenuated, so the attenuation of the luminescence intensity is suppressed and stable.
  • High-sensitivity and stable measurement can be performed by adding signals after high peaks for a long time. For example, the output from PMT 1 3 3 is acquired at a sampling interval of 1 millisecond, and the digital data is obtained. By adding up with Sokon 1 3 5 you can get a higher signal-to-noise ratio compared to sampling at a single point.
  • the signal-to-noise ratio is considered to increase in proportion to the sum of the sum of the points. Even when a large amount of detection target substance is captured and the density of the enzyme is high, the luminescent reagent is supplied by the flow and the decrease in the peripheral concentration of the luminescent reagent can be suppressed, so that highly accurate measurement can be performed. This phenomenon of occurrence of timing-specific peaks can be interpreted and understood as follows. At the first timing of the introduction of the luminescent reagent, the luminescent reagent that had not been around the enzyme on the beads until now has rushed to the periphery of the enzyme at once, so that luminescence appears greatly.
  • the concentration of the luminescent reagent around the enzyme is the same as the concentration of the introduced luminescent reagent solution, which is practically maximum.
  • the thin liquid film is thinner and the diffusion distance is shorter than when the solution is stopped without flowing.
  • the luminescent reagent is supplied one after another by the flow, it is possible to prevent the decrease of the balancing agent concentration due to the digestion of the luminescent reagent, which is advantageous for long-time measurement.
  • the luminescent reagent is poured, it is possible to stop the luminescent reagent solution delivery, and detection of luminescence can be realized. Even in this case, advantageous measurement can be realized by simultaneously introducing the luminescent reagent and measuring luminescence.
  • a bead array is used.
  • the present invention is not limited to using a bead array.
  • a device with a flow channel in which a probe that captures a biochemical substance to be detected is fixed to a solid phase a system that performs luminescence detection by measuring the vicinity of the fixed region of the probe is generally used. Applicable.
  • the protein synthetic assay is performed using antibody-immobilized beads, but the present invention is not limited to this.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • artificial nucleic acid having adenine, thymine, cytosine, guanine, uridine, inosine, or nucleic acid derivatives are generally used.
  • nucleic acid probe When using a nucleic acid probe, it can be adapted for detection of nucleic acid, and when a protein is used as a probe, it can also be used for antibody testing, antigen testing, etc.
  • food allergen testing, allergen specific It can be applied to IgE tests, infectious disease tests, chemical substance specific tests, and pollutant tests.
  • sugar-lectin reaction and receptors can be used as probes. It is. Probe design that takes advantage of DNA_protein interaction is possible, and it can be applied to enzyme-substrate reactions such as piotin-avidin reaction.
  • FIG. 5 shows an outline of the apparatus according to the second embodiment.
  • the bead array 1 4 1 shown in Fig. 5 has a shape in which multiple beads corresponding to the bead array 1 2 1 in Fig. 2 (four in this case) are connected, and each bead part has a large diameter. It is installed so that it comes under the fiber bundle 1 4 2. It is desirable that the diameter of one bundle of optical fibers 1 4 2 is equal to or larger than the area where the beads to be measured are arranged. At least in this configuration, beads corresponding to the measurement items in one bead array are used.
  • the outer diameter of the detection target bead on which the probe is immobilized (in the case of a plurality of beads, the length is the sum of the outer diameters of the plurality of beads) or larger than this. This makes it possible to reliably detect the beads to be measured.
  • the internal volume of the connecting parts 1 2 .2 a, b, c was about 10 W L each.
  • Each bead array corresponding to the bead array 1 2 1 1 2 1 a, b, c, d has different antibodies such as anti-protein protein antibody, anti-CA19-9 antibody, anti-CEA antibody, anti-PSA Includes beads with immobilized antibodies.
  • the optical fiber bundle 1 4 2 is connected to the PMT 1 3 3 through the connection connector 1 4 3 between the optical fiber bundle 1 and the PMT. The rest of the configuration is the same as the device settings in Fig. 2.
  • FIG. 6 (A) is a schematic diagram of an example of the luminescence measurement result of the second embodiment
  • FIG. 6 (B) is a schematic diagram of the timing and amount of luminescent reagent feeding at that time.
  • the sample solution contains, for example, ⁇ -fetoprotein, CA19-9, CEA, and PSA, and its purpose is to detect it.
  • the HRP-labeled antibody solution a solution containing HRP-labeled antibodies against four kinds of substances was used. Measurement starts at time 0, and no luminescence is measured since the luminescent reagent has not yet been delivered. The signal strength stays constant at the backround level.
  • Luminescence test The solution containing the luminescent reagent is delivered at a volumetric flow rate of IO JU L per minute at the start of drug introduction, and then the delivery is continued. As in the first embodiment, the peak of the signal intensity due to light emission is recorded. Thereafter, a total of four peaks are observed at intervals of about 1 minute. These peaks are considered to be luminescence in the vicinity of the beads to which the anti- (3 ⁇ 4 photoprotein antibody, anti-C-19 antibody, anti-CEA antibody, and anti-PSA antibody are immobilized.
  • the time required for the solution to reach each bead array can be predicted from the flow rate of the solution containing the luminescent reagent. In this way, by measuring while sending the luminescent reagent, it is possible to detect multiple items using a single detector and not move the photodetector. There is an effect that can be realized simply and inexpensively.
  • FIG. 7 shows an outline of the apparatus according to the third embodiment.
  • This system detects multiple items by scanning an optical system.
  • a liquid feeding system similar to that of the first embodiment is connected to a bead array 15 1 1 in which probe-fixed beads and probe-unfixed beads for a plurality of items are alternately arranged.
  • One side of the bead array 15 1 is connected to a syringe 1 2. 3 installed in a syringe pump 1 2 4 by a capillary 1 2 2.
  • a capillary-1 2 5 is piped and connected to the container 1 2 7 via a valve 1 2 6 at the end. Access to each container 1 2 7 is achieved by operating valve 1 2 6.
  • Light emission from a plurality of beads in the bead array 15 1 is separately measured by scanning by the optical system 1 56.
  • the optical system 1 5 6 moves relative to the bead array 1 51.
  • the objective lens 15 2 has a focal length of 9 mm and a numerical aperture of 0.46
  • the imaging lens 15 3 has a focal length of 180 mm, for example.
  • the magnification is the ratio of the focal length, which is 20 times.
  • the slit 1 5 4 is placed on the image plane of the optical system set by the objective lens 1 5 2 and the imaging lens 1 5 3. Taking a 100 micron bead in the bead array 1 51 as an example, this virtual image plane will appear as a 2 mm diameter.
  • the slit 1 5 4 cuts out the image of the bead, and the bead array 1 5 A direction that is substantially perpendicular to the longitudinal direction of 1 and has a rectangular shape with a longitudinal direction.
  • the slit width is described as a value obtained by multiplying the inverse ratio of the magnification, not the actual size of the slit width. For example, when the slit width is 20 microns, a bead image that is originally 100 microns is 5 minutes in the horizontal direction.
  • PMT 1 5 5 is placed immediately after slit 1 5 4 and receives all the light that has passed through slit 1 5 4.
  • the light receiving surface is
  • the PMT 1 5 5 is connected to a personal computer 1 5 8 as a data processing device via a line 1 5 7. With this setting, the light emitted from the bead array 1 5 1 collected by the optical system 1 5 6 is guided to the PMT 1 5 5 and a signal is output from the personal computer 1 5 8.
  • FIG. 8 shows an outline of the relationship between the scanning of the optical system and the obtained data in the third embodiment.
  • Fig. 8 (A) is a conceptual diagram showing the relationship between the virtual bead array and slit on the image plane. An example is shown in which the slit width is set to 10 microns for a bead diameter of 100 microns. The light emission corresponding to the part of the rectangular slit cut out from the bead image (the white part in the figure) is measured by the PMT.
  • Fig. 8 (B) is a diagram conceptually showing that the elapsed scan time corresponds to the bead placement position, and that the emission intensity corresponds to that position.
  • the optical system including the slit When the optical system including the slit is scanned in the longitudinal direction of the bead array, the light emitted from the beads of the bead array passes through the slit and is measured as a waveform with positional resolution. If the slit width is widened, the amount of transmitted light increases, so a high signal intensity can be obtained. However, since the light emission from each bead overlaps, accurate measurement is difficult. If the scanning speed is too high, the waveform will be lost due to the influence of the PMT measurement bandwidth.
  • the reciprocal of the PMT measurement band (which can be expressed in units of seconds) is equal to or longer than the scan time per bead. Even if the light emission is received by the PMT, the signal spreads over a time equivalent to or longer than the scanning of the beads, making it difficult to distinguish the beads. Therefore, the scan speed is one bead with the reciprocal of the measurement band. It is desirable to set the area so that it is sufficiently smaller than the per-scan time.
  • FIG. 9 schematically shows the relationship between the slit width and the signal waveform in the third embodiment.
  • the scan time is, for example, per bead
  • Fig. 9 (A) shows the case where the slit width is 50 micron (about 50% of the bead diameter). In this case, since the slit width is large to some extent, a large signal can be obtained. On the other hand, when the slit is scanning towards the end of the bead, it picks up the light emitted from the adjacent bead, and the light emitted from each bead tends to be difficult to distinguish accurately. .
  • Figure 9 (B) shows the case where the slit width is 10 microns (bead diameter 1).
  • Figure 9 (C) shows a slit width of 8,0 microns.
  • FIG. 10 shows an outline of the apparatus according to the fourth embodiment. 1st to 1st
  • the optical system uses a CCD camera, it is possible to measure a large number of bead arrays at once.
  • a bead array in which probe-fixed beads for a plurality of items and probe non-fixed beads or light-shielding beads are alternately arranged.
  • Bead array group consisting of bundles of bee arrays 2 0 1 2.
  • the liquid feed system is a part that has the function of feeding liquid to each bead array. As shown in Fig. 3, a system that uses a syringe and connects to each bead array or a system that uses a pump can be applied.
  • the solution holding part and connection switching part 20 3 are the part of the container in which the reaction solution or cleaning solution is placed and the part that has the function of switching to that solution. Connected systems are applicable.
  • Each of the liquid feeding system 20 2, the liquid holding unit, and the connection switching unit 20 3 has a function of flowing a solution containing a reagent for a luminescence reaction into each of the bead array groups 201.
  • This bead array group 2 0 1 is measured by a CCD camera 2 0 5 through a camera lens 2 0 4.
  • the force mellar lens 204 has an F value of 0.95 and a focal length of 50 mm, and the image magnification is set to the same magnification.
  • the 100 micron beads in the bead array are projected onto the light-receiving surface of the CCD camera 205 at a size of 100 microns.
  • the CCD camera 205 is connected to a data processing device BASCON 20 07 via a line 206, and the image obtained by the CCD camera 205 is processed and displayed by this personal computer 20 07. . Any CCD camera can be used here.
  • FIG. 11 is a diagram showing an example of reflection of light emitted from beads in the fourth embodiment.
  • Fig. 11 (A) is an enlarged schematic diagram of a part of the image
  • Fig. 11 (B) is a graph showing normalized emission intensity observed for each bead. The measurement time was temporarily 5 minutes.
  • Figure 11 (A) shows an example of 100 micron polystyrene (PS) beads. This is the case where beads 2 1 2 (No.1, 2, 4, 5), which are not expected to emit light, are arranged on both sides of the emitting beads 2 1 1 (No. 3).
  • Capillaries 2 1 3 contain beads 2 1 1 and 2 1 2, and an aqueous solution 2 1 4 containing a luminescent reagent flows in the space. The aqueous solution containing 2 14 luminescent reagent is fed from the left side in Fig. 11 (A).
  • Figure 1 shows a comparison of the light intensity with the emission intensity of the emitted bead 2 1 1 as 100.
  • FIG. 12 is a diagram showing an example in which light-shielding beads are sandwiched between reflections of light emission from the beads in the fourth embodiment.
  • Figure 12 (A) shows the configuration. Inserted between beads 2 1 1 that emit light-shielding beads 2 2 1 and beads 2 1 2 that do not emit light.
  • the light-shielding beads 2 2 1 beads prepared by mixing particles mixed with a light-shielding substance, for example, 100 micron Mn02 fine particles with polystyrene.
  • black, blue, red and other colored particles, colored latex, metal particles, mixed materials with light-shielding materials, or particles with light-shielding materials, or any other material that exhibits light-shielding properties Can also be used.
  • Fig. 1 2 (B) shows an enlarged schematic diagram of the image
  • Fig. 1 2 (C) shows a graph showing the normalized emission intensity observed for each bead. The measurement time was temporarily 5 minutes.
  • the emission intensity of the bead at No. 1 position is 2.8% to 0.9. /.
  • the emission intensity from the bead No. 5 is significantly reduced from 3.2% to 1.2%.
  • Light-shielding beads 2 2 1 emits light 2 1 1 has the effect of blocking the light emission and reducing the amount of reflection.
  • Luminol-based light emission used in this embodiment has an emission wavelength of about 420 nm, and there is no problem if it is a material that blocks the wavelength as the material property of the light-shielding beads. For example, blasted beads with ferrite, blasted beads mixed with black pigment, or beads with gold vapor deposition are considered.
  • a system with only one 100 micron bead but this is not necessarily the case.
  • light shielding of 30 micron or less A similar effect can be expected with a system in which several beads are placed.
  • FIG. 13 is a diagram schematically showing the effect of adjusting the refractive index of the solution regarding the reflection of light emitted from the beads in the fourth embodiment. Fig.
  • the light emitted from the emitting beads 2 1 1 includes a light beam 2 3 1 that goes directly to the optical system and a light beam 2 3 2 that goes to the next bead.
  • the refractive index of the aqueous solution 2 14 containing the reagent for the luminescence reaction is about 1.33
  • the refractive index of polystyrene, which is one material of beads is 1.58. Therefore, the light beam 2 3 2 toward the next bead is affected by scattering or refraction at the surface of the bead 2 1 2, so that it is reflected in the bead 2 1 2 that is directed toward the optical system and consequently does not emit light. Will be observed.
  • Figure 13 (B) is a schematic diagram when the refractive index is ideally adjusted.
  • the refractive index of the solution 2 3 3 can be adjusted to the same refractive index as that of polystyrene, the light beam 2 3 2 directed to the adjacent bead is not affected by scattering or refraction at the surface of the bead 2 1 2. Therefore, it is possible to suppress the reflection caused by scattering or refraction to zero. In other words, it is possible to reduce the reflection by making the solution have a refractive index close to that of the beads.
  • the choice of organic solvent is broadened, so the refractive index adjustment is easier.
  • the above polystyrene has a refractive index of 1.58, but when a bead material is used and a material with a low refractive index, for example, a glass with a refractive index of 1.47, the refractive index of the solution can be adjusted within a low range. This makes it easier to prevent reflections.
  • FIG. 14 is a graph verifying the effect of adjusting the refractive index of the solution with glycerol from the viewpoint of reflectivity, with respect to the reflection of light emitted from the beads in the fourth embodiment.
  • Glycerol is a substance that changes the refractive index of an aqueous solution relatively large and has little influence on the enzyme reaction.
  • the refractive index of an aqueous solution of daricerol increases from 1.33 to 1.47 as its weight concentration (% by weight) increases. Reflection was evaluated using the reflectance of light in the vertical direction as a representative, and the reflectance when the glycerol concentration was 0% was taken as 100%. The reflectance at that time was calculated as the reflectance ratio and plotted as a graph.
  • the reflectivity in aqueous solution is 0.74%.
  • the glyceride concentration is increased, the difference in refractive index becomes smaller and the reflectivity also decreases. For example, when 50% glycerol is added, the reflectance ratio drops to 50%, and a sufficient effect is obtained.
  • the difference in refractive index at this time is 0.18. If the glycerol concentration exceeds 80%, the viscosity will increase significantly, which may cause inconvenience in the actual feeding. That is, when the beads are polystyrene, the concentration of glycerol is preferably in the range of 50% to 80%.
  • the reflectivity for the aqueous solution is 0.25%, which is one third of that of polystyrene, and the reflectivity ratio is 49%, less than half, just by setting the glycerol concentration to 30%. That is, when the beads are glass, the concentration of glycerol is desirably 30% or more and 80% or less. In consideration of the general bead form used in the bead array, it is generally desirable that the concentration of glycerol be in the range of 30% to 80% based on the above conditions. Although the case of glycerol was shown this time, it is not limited to this as long as the solvent can change the refractive index.
  • the refractive index of the beads is nb
  • the refractive index of the solution is ns
  • the reflectance is represented by the reflectance k in the vertical direction of the interface
  • the relationship k (nb-ns) 2 / (nb + ns) 2 is obtained. is there.
  • the range of the glyce oral solution in the case of the glyce oral solution is 30% to 80%.
  • it is desirable that the difference between the refractive index of the bead and the refractive index of the solution is small, but from the following considerations, it is considered effective if it is about 0.2. It is done.
  • the refractive index ns of the solution at this time is 1.4 0 for beads and polystyrene and glass, respectively. And 1.3. Taking the difference from the refractive index of the beads gives 0.18 and 0.10. In general, the refractive index of the resin is higher than that of glass, and considering the use of resin beads other than polystyrene, it is sufficient if the difference in refractive index is about 0.2 or less. effective.
  • Fig. 15 shows an example of the reflection of luminescence from beads in the fourth embodiment when the solution containing the reagent for the luminescence reaction is adjusted so that the concentration of glycerol contained is 70%.
  • the refractive index of the solution 2 3 3 is 1.43.
  • Fig. 15 (A) shows an enlarged schematic diagram of the image
  • Fig. 15 (B) shows a graph showing the normalized emission intensity observed for each bead.
  • the measurement time was 5 minutes.
  • a bead array is used, but the present invention is not limited to the case where a bead array is used.
  • a probe that captures the biochemical substance to be detected is fixed to a solid phase, it is generally reflected in a system that detects luminescence by measuring the vicinity of the probe. Since this problem occurs, this embodiment is effective.
  • FIG. 16 shows an outline of the apparatus related to reduction of reflection using a polarizing plate in the fourth embodiment.
  • a polarizing plate 2 4 1 is inserted between a bead array group 2 0 1 and a CCD camera 2 0 5.
  • the luminescence from the bead array group 20 1 is considered to be unpolarized because the luminescent substrate emits light in a random direction, but the reflection of the s-wave and p-wave is reflected with respect to the reflection reflected by the adjacent bead. It is thought that the light is polarized due to the difference in reflectance.
  • Figure 17 shows a schematic diagram of the equipment used in the experiment. The reaction was performed according to the flow chart of FIG.
  • blank beads which were only blocked with Block Ace TM and were not fixed with anti- IgE antibody, were prepared separately.
  • the reaction was performed for 20 minutes.
  • PBS was washed in one direction at a flow rate of 100 L / min and washed for 4 minutes. Diluted with PBS 100 ng / L HRP labeled anti-I g E antibody (Beaty 1 manufactured by Goat Anti-Hum an Ig E_HR PC onjugate) 5 0; u L flow rate 1 The solution was sent back and forth (0.00 back and forth) at 0.0 x LZmin and allowed to react for 20 minutes. PBS was washed in one direction at a flow rate of 100 ⁇ L / min and washed for 4 minutes.
  • FIG. 18 shows the results of luminescence measurement using S.upperSignal®WestFetemo (manufactured by PIERC) as the luminescent substrate of HRP.
  • S.upperSignal®WestFetemo manufactured by PIERC
  • a peak derived from luminescence was obtained.
  • the value was 5.5, and the same experiment was conducted with 0 ng / mL IgE (without IgE), 2.3 .
  • Figure 17 shows a schematic diagram of the equipment used in the experiment. The reaction was performed according to the flow chart of FIG.
  • a cedar pollen extraction antigen-immobilized bead (hereinafter referred to as a blank bead), which was only blocked with Block Ace TM, was prepared separately.
  • the device was grooved with an inner dimension of 1 1 0 m X 1 1 0 ⁇ m in a 3.0 cm x 4.0 cm x 0.15 cm sized polyethylene acrylate.
  • the open part of the chip was laminated with a 50 m thick film of the same material.
  • the chip was arranged in the order of 10 blank beads, 1 cedar antigen-immobilized beads, and 10 plank beads.
  • a dam structure In order to prevent the beads from flowing out at the end of the chip, a dam structure is provided, and the other side is a tapered structure, with a fused silica capillary with an outer diameter of 3 75 ⁇ m and an inner diameter of 50 m ( The spill of beads was stopped by inserting GL Sciences. Each cavity was connected using an inner seal connector (GLS Science, applicable inner diameter 2 5 0-5 3 0 ⁇ m).
  • Block Ace TM was reciprocated (10 times) at a flow rate of 100 ⁇ L, and reacted for 10 minutes. (Blocking the flow path)
  • 100 ng / ml mouse monoclonal anti-Cryj 1 antibody prepared with PBS manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., AB—Cedar Po 1 1 en Allergen Cryjl, (0 2 6) (mo) (M), Affin) 50 ⁇ L was reciprocated (20 times) at a flow rate of 100 ⁇ L / min and reacted for 20 minutes. PBS was flushed in one direction at a flow rate of 100 L / min and washed for 4 minutes.
  • Example 3 A schematic diagram of the apparatus used in the experiment is shown in FIG. For 2 50 ⁇ m PS beads (Po 1 ysciecnce, particle size range 2 5 0— 3 0 0 ⁇ ⁇ ), 10 ⁇ g mL of HR ⁇ labeled anti-A 1 dos adjusted with PBS 1 ase antibody (Anti-Aldolase, Rabbit Muscle, Goat-Poly, HRP Model No. 20 0— 1 34 1, manufactured by ROCKLAND) was immobilized in a refrigerator overnight.
  • PBS 1 ase antibody Anti-Aldolase, Rabbit Muscle, Goat-Poly, HRP Model No. 20 0— 1 34 1, manufactured by ROCKLAND
  • Both ends were fixed with a 50 m diameter SU S 3 04 stainless steel wire (manufactured by Niraco Co., Ltd., No. 3 5 1 1 0 7).

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Abstract

マイクロ流路を使用し固相に対象物質を捕捉する分子をつけた検出デバイスにおいて、高感度で定量的な発光による分析方法を実現する。固相に結合したプローブをもつ流路状のデバイスに、検出対象となる生化学物質を捕捉し、発光のための標識をした後、発光試薬を流入させて、プローブ近傍の発光を光学的に検出する。

Description

明 細 書 生化学物質の分析方法 技術分野
本発明は生化学物質の分析方法に関する。 また、 本発明は生化学物質を 特異的に捕捉する物質であるプローブを固相に固定した分析デバイスを用 いた生化学物質の分析装置に関する。 背景技術
従来、 生化学物質の高感度な検出には蛍光法が用いられてきた。 それ以 前に行われていた放射性同位体を用いる手法に比べて取り扱いが容易で、 放射能に対しての安全対策が不要であるため、 急速に置き換わった。 蛍光 法には、 検出の対象となる生化学物質に対して蛍光体を直接標識する方法 と間接標識する方法がある。 蛍光免疫検査を例に取ると、 検出対象となる 生化学物質に直接蛍光体を標識し、 この蛍光標識された生化学物質を、 固 相に固定した抗体で捕捉して検出するのが前者である。 いわゆる競合法も この分類に含まれる。 後者は、 同じ生化学物質に対して親和性のある抗体 を蛍光標識しておき、 2 次的に反応させるサンドイッチアツセィなどがあ る。
その一方で、 化学発光法が発達してきた。 化学発光の場合には、 励起光 の散乱が背景光として計測されることがなくなるため、 より高感度な計測 が実現できる。 化学発光の場合には、 検出の対象となる生化学物質に直接 的または間接的に酵素を標識する場合と、 蛍光体を標識する場合がある。 前者の場合には、 酵素と してペルォキシダーゼやアルカリホスファターゼ がよく使われる。 いわゆるエライザ法はこの分類に入る。 マイクロプレー ト壁等に対象とする生化学物質を捕捉する抗体を固定しておき、 検出対象 物質を含む溶液を添加する。 溶液中の検出対象物質は抗体により壁面に捕 捉され、 余分な溶液は洗い流される。 そこに検出対象となる物質に対する 酵素標識抗体を添加し、 この酵素標識抗体が検出対象物質に結合するのを 待って、 余分な溶液を洗い流す。 最後に酵素と反応する発光試薬を含む溶 液をいれ、 生じる発光を検出する。 蛍光体を標識した場合、 例えば HPLC の検出器と しての応用の場合には、 HPLC から流出してくる各蛍光標識さ れた分子に対して、 化学的励起剤を混合反応させ、 標識された蛍光体が化 学励起されて発する化学発光を検出する。
多項目の検出デバィスとしては、 プローブを結合させたビーズを細管に 並べた技術 （以下、 ビーズアレイという） がある （例えば特許文献 1 ) 。 また、 マイク口流路を使用し固相に対象物質を捕捉する分子を結合させた 検出デバイスについても報告がある （例えば特許文献 2 ) 。
特許文献 1 ： 特開平 11-243997号公報
特許文献 2 ： 特開平 11-075812号公報 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
化学発光や生物発光等の発光検出法に関しては、 蛍光法に比較して、 対 象から得ちれる単位時間当たりの光子数は少なくなるため、 高感度な計測 系を利用し、 また計測時間を増やすなどの工夫が必要となる。
ビーズアレイについては、 一般的に、 検出対象物質に蛍光標識を行い、 その蛍光標識物質のビーズ上のプローブへの捕捉を蛍光検出していた。 反 応速度が速いというメ リ ッ トがある一方、 励起光由来の散乱光やビーズ材 質からの背景光が生じる可能性があった。 また、 ビーズアレイへ発光検出 を適用した場合は、 単位時間当たりの光子数が少なくなるため絶対感度を 確保する必要があることと、 あるビーズからの発光が隣のビーズ表面で反 射されて隣のビーズからの発光のように計測される 「映り込み」 が想定さ れる。 マイク口流路を使用し固相に対象物質を捕捉する分子をつけた検出 デバイスにおいても、 発光由来の散乱光や反射光が生じる可能性がある。 以上より、 マイク口流路を使用し固相に対象物質を捕捉する分子を結合 させた検出デバイスにおいて、 溶液の流れを利用した、 高感度で定量的な 発光検出法を実現することを課題とする。 また、 ビーズアレイの場合にお いては、 ビーズ間での発光の映り込みを防ぐことを課題とする。 課題を解決するための手段
固相に結合したプローブと、 標識済みの検出対象物質をプローブに捕捉 する工程もしくは標識されていない検出対象物質をプローブに捕捉しかつ 標識する工程と、 発光試薬を液流により供給する工程と、 前記発光試薬と 前記標識が反応した部位の近傍を光学的に検出する工程とを有することを 特徴とする生化学物質の分析方法を提供する。
ここで、 固相とは、 少なく とも一部にプローブを固定されるものである。 固相としては、 粒子 （ビーズ） 、 流路の壁面、 流路内に設置された突起や 紐状の部材などを用いることができる。
また、 固相の材料と しては、 例えば、 プラスチック、 金属、 無機化合物 である。 プラスチックとしては、 ポリスチレン、 ポリメチルスチレンなど のスチレン系樹脂、 ポリプロピレン、 ポリエチレン、 ポリシクロォレフィ ンなどのポリオレフイン系樹脂、 ポリカーボネート、 ポリメチルァクリ レ ート、 ポリェチルアタ リ レー ト等のポリア.クリ レート、 ポリメチルメタク リ レート、 ポリェチルメタク リ レー ト等のポリメタク リ レート等の （メ タ） アク リル系樹脂、 ポリフルォロォレフインなどのフッ素系樹脂、 ジメ チルシロキサン、 ジェチルシロキサンなどのシリ コーン系樹脂が挙げられ る。 金属としては、 例えば、 鉄、 ステンレス、 銅、 またはこれらの合金が 挙げられる。 無機化合物と しては、 例えば、 ガラス、 セラミ ック、 半導体 などが挙げられる。 固相の材料はこれらに限定されず、 さらに 1種類の材 料から構成されていても、 複数の材料から構成されていてもよい。 固相へ のプローブの容易性、 バックグラウンドの低さ、 入手のし易さからポリス チレンが最も好ましい。
本発明に用いるビーズの場合、 ビーズ径と しては、 0 . 1 ^ ηι〜 6 ιηιη が好ましく、 更に好ましくは 0 . 5 // m〜 l mm で、 更に好ましくは 0 . 7 5 /i m〜 5 0 0 μ m で、 最も好ましくは 1. 0 μ m〜 1 0 0 μ m である。 また、 ビーズを入れる配管は、 用いるビーズめサイズに応じた配管で、 ビ 一ズ径の 2倍未満であることが望ましい。
発光検出系において、 発光基質の送液のタイ ミングと計測のタイミング を合わせて計測することで高い感度を実現できる。 ここでは、 発光基質が 固相、 例えばビーズ上の酵素に到達した時間から短時間の間に大きな発光 ピークが出現する現象を利用している。 このピーク部分を観測することに よ り、 シグナルとノイズを高い精度で分離し、 しいては高い感度で計測す ることが可能となる。 また、 発光試薬を流しながら発光を計測する方法で は、 発光試薬が常に供給される状態にあり、 酵素近傍の発光試薬濃度が減 衰しないため、 発光強度の減衰を抑えて安定に長時間計測することができ る。 高いピークの後のシグナルを長時間足し合わせることによっても高感 度で安定な計測を行うことができる。 検出対象物質が多く捕捉され酵素の 密度が高い場合にも、 流れによって発光試薬が供給され発光試薬の周辺濃 度の低下を抑えることができるため、 高精度の計測を行うことが可能であ る。 また、 光電子増倍管をスキャンさせて計測.する系において、 スリ ッ ト を設置し、 計測対象ビーズの大きさとスリ ツ トの関係を適切に設定するこ とで分解能が上がり高精度な計測が可能と.なる。 ビーズのシグナルを判別 するためには複数のビーズの識別が必要であり、 空間分解能がある程度必 要である。 測定帯域の影響を含めた考察から、 計測時間等に応じた適切な スリ ッ ト幅等の制限がある。 また、 計測対象となるビーズ同士の間にスぺ —スを保ち、 大きなスリ ッ ト幅を採用して感度を上げかつビーズの識別を 行う手段もある。
本発明における発光検出系とは、 化学発光検出系と生物発光検出系を含 む。 化学発光とは、 化学反応によって励起された分子が基底状態に戻る際、 エネルギーとして光を放出する現象であり、 生物発光とは、 ホタルやパク テリァのルシフェラーゼ等の生物酵素を使って発光物質を酸化させるなど の化学反応によって光を発する現象で広義には化学発光の範疇に入る場合 がある。 化学発光検出系と しては、 ルミ ノール/過酸化水素を基質とする ペルォキシダーゼの化学発光、 ジォキセタン誘導体であるアマダンチルメ トキシホスホリルフエニルジォキセタン （AMP P D) を基質とするアル カ リ フォスファターゼの化学発光、 ビス一 2 , 4， 6 _ ト リ クロ口フエ二 ルォキザレート （T C P O) 等の過シユウ酸エステル誘導体/過酸化水素 / 8—ァニリ ノナフタレンスルホン酸 （AN S ) 等の蛍光色素径によるァ ルカリフォスファターゼの化学発光などを用いる検出系があり、 生物発光 検出系と しては、 例えば、 AT P/ルシフェリ ン マグネシウムイオンを 基質とするホタルルシフェラーゼの生物発光検出系、 グルコース一 6—リ ン酸デヒ ドロゲナーゼが、 グルコース一 6—リン酸 ZNADを基質として 生成する N A D Hをバクテリアルシフェラーゼと N AD H— FMN—酸化 還元酵素の発光反応で検出する系、 ピルビン酸キナーゼが AD Pとホスホ エノールビルビン酸を基質として生成する AT Pを、 ホタルルシフエ リ ン —ルシフ ラーゼの発光反応で検出する系などがある。
ビーズ間での発光の映り込みを防ぐ課題は、 計測の光学設定に関らず、 高感度な多項目検出には重要である。 この課題を解決する手段の一つは、 計測対象となる複数のビーズの間に遮光性を有する材料のビーズを設置す ることである。 もう一つの解決手段は、 発光試薬を含む溶液の屈折率をビ ーズの屈折率に近づけることである。 発光試薬を含む溶液が理想的に調製 されビーズ材料と実質的に、同じ屈折率を持つ場合には、 ビーズ表面での光 の反射はおこらないため、 ビーズ間での光の反射、.つまり映り込みを防止 することができる。 この課題を解決する他の手段は、 計測装置とビーズァ レイの間に偏光板を挿入することである。 ビーズ表面での発光は発光基質 がランダムな方向を向いて発光するため、 偏光していないと考えられる力 隣のビーズで反射される映り込みに関しては、 s波および p 波の反射率の 違いから偏光していると考えられる。 このため、 偏光板を入れることによ つて、 映り込み成分を重点的に遮ることができ、 結果として映り込みの寄 与分を小さくできる。
分析方法の一例としては、 少なく とも一部にプローブを結合した固相を 収める流路に、 標識された検出対象物質又は標識されていない検出対象物 質を含む液体を供給する工程と、 前記プローブに前記標識済み検出対象物 質を捕捉させる工程若しくは標識されていない検出対象物質をプローブに 捕捉させかつ標識する工程と、 前記流路に発光反応のための試薬を液流に より供給する工程と、 前記発光反応のための試薬と前記標識が反応した部 位の近傍を光学的に検出する工程とを有することを特徴とする。
分析キッ トの一例と しては、 細管と、 プローブを固定され、 かつ前記細 管に収められる第 1の粒子と、 遮光性物質を含み、 かつ前記細管に収めら れる第 2の粒子と、 発光反応のための試薬とを有することを特徴とする。 分析装置の一例と しては、 プローブを少なく とも一部に固定した固相を 収めた細管へ液体を導入及び/又は導出するための送液部と、 試料を収め るための第 1の容器と、 発光反応のための試薬を収めるための第 2の容器 と、 前記固相の任意の部位を光学的に検出するための検出部とを有し、 前 記第 1の容器と前記第 2の容器とは前記送液部に連結することを特徴とす る。 発明の効果
本発明によれば、 発光検出を多項目で行なう検出デバイスにおいて、 高 感度で定量的な発光法を実現できる効果がある。 特にビーズァレイを用い る場合には、 さらにビーズ間での発光の映り込みを防ぐ効果がある。
また、 発光検出を多項目で行う場合、 マイクロプレートのような個別の 穴毎に試薬を添加するという方式が従来から行われてきた。 ビーズアレイ の場合には、 これらの系に比べて、 対象物質を含んだ溶液や発光基質など を順々に流すことができるため、 分注等の手間が要らず、 簡便かつ均一な 反応が実現できる。 また、 マクロプレートと異なり、 反応領域が項目毎に 壁等で隔てられていないため、 少ない試薬量で発光検出を行うことができ る。 図面の簡単な説明
図 1は本発明の一実施の形態のフローチヤ一ト図である。
図 2は本発明の一実施の形態の模式図である。 図 3は本発明の一実施の形態の装置模式図である。
図 4は本発明の一実施の形態の発光計測例と発光試薬送液タイミングの 概略図である。
図 5は本発明の一実施の形態の装置模式図である。
図 6は本発明の一実施の形態の発光計測例と発光試薬送液タイミングの 概略図である。
図 7は本発明の一実施の形態の装置模式図である。
図 8は本発明の一実施の形態の光学系のスキャンとデータの関係模式図 である。
図 9は本発明の一実施の形態のスリ ッ ト幅と信号波形の関係模式図であ る。
図 1 0は本発明の一実施の形態の装置模式図である。
図 1 1は本発明の一実施の形態の発光の映り込みの模式図である。
図 1 2は本発明の一実施の形態の発光の映り込みと遮光性ビーズの効果 の模式図である。
図 1 3は本発明の一実施の形態の発光の映り込みと溶液の屈折率調整の 効果の模式図である。
図 1 4は本発明の一実施の形態の溶液の屈折率をダリセロールで調整し た反射率のグラフ図である。
図 1 5は本発明の一実'施の形態の発光の映り込みとグリセロール 70% 溶液の効果の模式図である。
図 1 6は本発明の一実施の形態の装置模式図である。
図 1 7は本発明の実施例 1、 2の実験装置模式図である。
図 1 8は本発明の実施例 1の測定結果を示す図である。
図 1 9は本発明の実施例 2の測定結果を示す図である。
図 2 0は本発明の実施例 3の実験装置模式図である。
図 2 1は本発明の実施例 3の測定結果を示す図である。 符号の説明 1 0 1 ： キヤビラリ一、 1 02 ： 抗体をつけ こビーズ、 1 03 :抗体をつ けないビーズ、 1 04 ：抗ひフエ トプロテイン抗体、 1 0 5 : αフエ トプ 口ティン、 1 06 ： HRP 標識抗 αフエ トプロテイン抗体、 1 0 7 ： 発光 試薬、 1 0 8 :発光、 1 09 ： αフエ トプロティンを含むサンプル溶液、 1 1 0 : 洗浄バッファー、 1 1 1 : HRP 標識抗 αフエ トプロティン抗体 1 06を含む溶液、 1 1 2 :洗浄バッファー、 1 1 3 :発光試薬を含む溶 液、 1 1 4 : 光計測器、 1 2 1 : ビーズアレイ、 1 2 1 a : ビーズアレイ、 1 2 1b : ビーズァレイ、 1 2 1 c : ビーズァレイ、 1 2 1 d： ビーズァレ ィ、 1 2 2 : キヤビラ リ.一、 1 22a :接続部、 1 22b :接続部、 1 22 c： 接続部、 1 23 ： シリ ンジ、 1 24 ： シリ ンジポンプ、 1 2 5 ： キヤ ピラリー、 1 26 :弁、 1 27 :容器、 1 3 1 ： 光ファイバ一、 1 3 2 : PMT への接続コネクター、 1 3 3 : PMT、 1 34 ： ライン、 1 3 5 ： ノ、。 ソコン、 1 3 6 :粒子 （ビーズ） ス トッパー、 1 3 7 :接続部 （ィンナー シールコネクタ） 、 14 1 : ビーズアレイ、 1 42 ： 光ファイバ一バンド ル、 1 4 3 : PMT への接続コネクター、 1 4.4 ：検出領域、 1 5 1 ： ビ ーズ了レイ、 1 52 :対物レンズ、 1 53 :結像レンズ、 1 54 ： ス リ ツ ト、 1 5 5 : PMT、 1 56 :光学系、 1 5 7 : ライン、 1 58 :ノ ソコン、 20 1 : ビーズァレイ群、 202 :送液系、 203 :溶液保持部および接 続切替部、 204 : カメラレンズ、 20 5 : CCD カメラ、 2 0 6 : ライ ン、 20 7 :ノ ソコ ン、 208 ： 計測部分、 2 1 1 ： 発光しているビーズ、 2 1 2 ： 発光が予想されないビーズ、 2 1 3 : キヤビラリ一、 2 1 4 :発 光試薬を含む水溶液、 22 1 :遮光性のビ一ズ、 23 1 : 直接光学系に向 かう光線、 2 3 2 ： 隣のビーズに向かう光線、 2 3 3 :屈折率を調整した 溶液、 24 1 :偏光板。 発明を実施するための最良の形態
図 1は第 1 の実施の形態の分析方法の概略を示すフローチヤ一トである。 内容の詳細については次段落以降に述べる。 最初の工程 (A)と して、 検出 対象とする生化学物質を捕捉する抗体を固相に固定した流路をもつデバィ スに対して、 検出対象物質をふくむサンプル溶液を導入する。 サンプル導 入以前は抗体には何も捕捉されていない。 次に工程 （B) と して、 導入さ れたサンプル溶液中の検出対象物質を固相上の抗体に捕捉する工程がある。 この場合サンプル溶液の送液を続けることも、 送液を停止し反応が進むの を待つことも可能である。 その次に工程 （C) として、 余分なサンプル溶 液を洗い流し、 デバイス内部を洗浄する工程がある。 デバイス内部を洗浄 することにより、 検出対象となる物質は実質的に抗体で捕捉された部位に しか存在しないようになる。 その次の工程 （D) と して、 検出対象物質に 親和性を持つ発光を起こす酵素で標識された抗体を含む溶液をデバイス内 部に導入し、 検出対象物質と反応させる工程がある。 この工程は検出対象 物質を間接的に標識する工程となっている。 その次の工程 （E) と して、 検出対象物質に反応せず固相に捕捉されなかった余分な酵素標識抗体を洗 い流し、 デバイス内部を洗浄する工程がある。 デバイス内部を洗浄するこ とにより、 後ほど発光を起こす酵素は実質的に検出対象物質が存在する部 位、 すなわち検出対象とする生化学物質を捕捉する抗体を固相に固定した 部位にのみ存在するようになり、 他の場所から発光は起こらないことにな る。 その次の工程 （F) として、 酵素と反応する発光試薬をデバイス内部 に流し、 抗体の近傍からの発光を計測する工程がある。 発光を起こす酵素 は検出対象物質が捕捉されたところにのみ存在するので、 検出対象物質を 捕捉する酵素を固定した固相の近傍の発光は、 検出対象物質の存在に由来 することになる。 発光量も検出対象となる物質の捕捉量、 しいてはサンプ ル溶液中の検出対象物質の量もしくは濃度を反映することになる。 最後の 工程 （G) として、 計測された発光由来の計測信号を検出結果と して処理 する工程がある。 この工程により、 得られた発光強度から検出対象物質の 量を推測することになる。
図 2は第 1 の実施の形態の概略を検出物質を固定した固相近辺の模式図 と して示したものである。 送液装置および計測装置の全体像については次 段落以降に述べる。 本実施の形態では、 抗体を固相に固定した流路を持つ デバイスと して、 ビーズアレイを使用した例を示す。 ビーズアレイの概略 を部分拡大したのが図 2(1)である。 流路を形 ;するための細管としてキヤ ピラリー 1 0 1を用いる。 キヤピラリー 1 0 1の内部に検出対象を捕捉す る抗体を結合させたビーズ 1 0 2と抗体を結合していないビーズ 1 0 3を 配列してある。 本実施の形態での検出対象は例えばひフエ トプロテイン 1
0 5であり、 例えば抗 αフエ トプロテイン抗体 1 0 4がビーズ 1 0 2に固 定されている。 キヤビラリ一の内径は例えば 150 ミクロン、 ビーズ 1 0 2，
1 0 3の径は例えば 1 0 0 ミクロンであり、 材質は例えばポリスチレンで ある。 図 2(2)に αフヱ トプロテイン 1 0 5を含むサンプル溶液 1 0 9を導 入した模式図を示す。 ここでのサンプル溶液は仮に 50 Lとし、 溶液の体 積流量を毎分 10 L とする。 ついで図 2 (3)にて αフエ トプロテイン 1 0
5がビーズ 1 0 2上の抗 αフエ トプロティン抗体に捕捉される様子をしめ す。 ビーズアレイでは、 狭い空間に強制的に溶液を流すことにより流れに 乱れが生じ、 結果として固液間の反応速度が高くなる。 この効果をより高 めるため、 サンプル溶液 1 0 9を流しながら αフエ トプロティンの捕捉が 行われる。 後に示すように送液は例えばシリンジポンプを用いており、 サ ンプル溶液を往復送液して反応させた。 送液の機構については、 液を送液 出来る機構であればどのようなものでも用いることができる。 他の送液機 構には、 ペリスタポンプなども用いることができる。 反応時間は例えば 2
0分間である。 図 2(4)にサンプル溶液 1 0 9を洗浄バッファ一 1 1 0で洗 浄する模式図を示す。 洗浄バッファー 1 1 0と しては例えば塩を含むリン 酸バッファー （ρΗ7.4) を使用し、 100 を 30 秒間で流す条件で洗浄 した。 ノく ッ フ ァ ーは他に も 、 炭酸ノく ッ フ ァ ー 、 M E S ( 2- (Ν-
Morpholino ethane sulfo ic acid) ノヽ ッファー、 卜 リ スヒ ドロキシア ミ ノ メタン （以後、 T r i s ) —エチレンジァミン四酢酸 （以後、 EDTA) バッファー、 T r i s _EDTA_ホウ酸バッファ一、 ホウ酸バッファー など、 通常用いられる緩衝液ならばいずれも用いることができる。 さらに、 添加する塩は、 塩化ナトリ ウム、 塩化カリ ウム、 塩化アンモニゥム、 酢酸 ナト リ ウム、 酢酸カリ ウム、 酢酸アンモニゥム等の塩を用いることができ る。 この洗浄により ビーズ 1 0 2上に捕捉されなかった αフエ トプロティ ン 1 0 5はビーズァレイデバイスの中から洗い流される。
図 2(5)に例えば HRP (西洋ヮサビペルォキシダーゼ） 標識抗ひフヱト プロティン抗体 1 0 6を含む溶液 1 1 1をビーズァレイに導入した模式図 を示す。 標識としては、 H R Pを用いているが、 本発明においては H R P 以外の標識酵素や、 酵素以外の標識物も用いることができる。 本発明にお いて用いられる標識酵素と しては、 例えば、 ペルォキシダーゼ、 アルカリ フォスファターゼ、 グノレコ一スォキシダーゼ、 ]3 — D _ガラク トシダーゼ グルコース一 6—リン酸デヒ ドロゲナーゼ、 ィンべノレターゼ、 アデノシン 三リン酸 （以後、 A T P ) ァーゼ、 ルシフェラーゼ、 ェクオリンなどが挙 げられる。
HRP標識抗 αフエ トプロティン抗体 1 0 6の濃度は仮に 100 ng/ml、 溶 液 1 1 1の体積は 50 ^u L とし、 体積流量を毎分 10 とする。 HRP標識 抗 αフエ トプロティン抗体 1 0 6はビーズ 1 0 2上の抗 αフエ トプロティ ン抗体 1 0 4によって捕捉された o フエ トプロテイン 1 0 5に対して反応 し、 結果としてビーズ 1 0 2上に捕捉される。 図 2(6)に HRP標識抗 α フ ェ トプロテイン抗体溶液 1 1 1を洗浄バッファー 1 1 2で洗浄する模式図 を示す。 洗浄バッファー 1 1 2と しては例えば塩を含むリン酸バッファー (ρ Η7.4) を使用し、 100 μ L を 30 秒間で流す条件で洗浄した。 この洗 浄により ビーズ 1 0 2上に捕捉されなかった余分な HRP 標識抗 αフエ ト プロテイン抗体 1 0 6はビーズアレイデバイスの中から洗い流される。 最後に図 2(7)に発光反応のための試薬 1 0 7を含む溶液 1 1 3をビーズ アレイに流し、 発光 1 0 8を計測した模式図を示す。 発光反応のための試 薬 1 0 7と しては、 標識に酵素を用いる場合は、 用いた酵素に対応する基 質を含むものである。 基質としては、 例えばルミノール、 ジォキセタン、 過シユウ酸エステル、 グノレコース、 /3 — D—ガラク トシノレ、 グルコース一 6—リン酸、 ノレシゲニン、 ァスコルビン酸リン酸エステル、 アデノシン三 リン酸、 ルシフェリン若しくはこれらの誘導体、 カルシウムイオン等が挙 げちれる。 また、 発光反応のための試薬は、 過酸化水素、 ターシャルプチ ルハイ ドロパーォキサイ ドなどのアルキルハイ ドロパーォキサイ ドを含む 過酸等の酸化剤、 ョー 、ソベンゼン等の酸素 加剤酸化剤を含むこともあ る。 発光反応のための試薬は、 さらに発光増感剤を含んでいてもよい。 発 光増感剤としては、 例えば、 4—ョードフエノール、 4一ブロモフエノー ル、 4—クロ 口フエノーノレ、 4—フエニルフエノール、 フエノーノレインド 一ノレ、 2—クロ口一 4一フエニノレフエノーノレ、 4 _ ( 2'—チェ二ノレ） フエ ノール、 4— ( 2 '—べンゾチアゾリル） フエノール、 4一 [ 4 '- ( 2 '- メチル） チアゾリル] フエノール、 4— [ 2 '- (4'—メチル） チアゾリ ル] フエノール、 4 4 '一チアゾリノレ）フエノール、 4— (2'_ベンゾチ ァゾリル）フエノ一ル、 4— [4 '一（2 '— 3 ピリ ジル)）チアゾール]フヱノ 一ノレ、 フエノチアジン一N—プロピルスルフォネー ト、 3 _ ( 1 0—フエ ノチアジル） _ n—プロ ピル—スルホン酸塩、 3— ( 1 0—フエノチアジ ノレ） 一プロピルスルホン酸塩、 p—ヒ ドロキシフエ二ノレプロ ピオン酸等の フエノール誘導体、 6 _ハイ ドロキシベンゾチアゾール、 4一 （4—ハイ ドロキシフヱニル） チアゾール等のチアゾール誘導体、 ジェチルァニリ ン 等が挙げられる。
例えば HR Pを標識酵素に用いる場合、 発光反応のための試薬には、 基 質と してルミノール若しくはその誘導体、 又はルシゲニンノ過酸化水素等 の酸化剤、 発光増感剤として 4ーョ一 ドフヱノール、 4— [4'一（2'—メチ ル）チアゾリル]フエノール、 4一 [2 '—（4 '―メチル）チアゾリノレ]フエノー ル、 4一（4'一チアゾリノレ）フエノール、 4—[4 '— (2 '—(3 '—ピリジル)） チアノール]フエノーノレ、 4—(2 '—チェニル）フ； ϋノール、 フエノチアジ ン一 Ν—プロピルスルフォネー ト、 フエノールイン ドフエノール等、 好ま しくは 4一 [ 4 '- ( 2'—メチル） チアゾリル] フエノール又は 4 _ [ 2' - (4'ーメチル） チアゾリル] フエノールを用いることができる。
本発明においては、 その他の標識物、 発光反応のための試薬の組み合わ せを用いることもできる。 例えば、 化学発光検出系と しては、 標識酵素と してグルコースォキシダーゼ、 発光反応のための試薬として、 グルコース
/ビス一 2， 4 , 6— トリクロ口フエ二ルォキザレ一ト （T C P〇） 等の 過シュゥ酸エステル誘導体 / 8—ァニリ ノナフタ レンスルホン酸 （AN s ) 等の蛍光色素、 又はグルコース/イソル ノール zマイクロペルォキ シダ一ゼ （m— P OD) を用いる系、 標識酵素としてアルカ リ フォスファ ターゼ （A L P) 、 発光反応のための試薬と してアマダンチルメ トキシホ スホリルフエニルジォキセタン （AMP P D) 等のジォキセタン誘導体を 用いる系、 標識酵素として /3 — D—ガラク トシダ一ゼ、 発光反応のための 試薬と して 0—二トロフエニル一 β — Ό—ガラク ト トシル /ガラク トース デヒ ドロゲナーゼ AD +ΖΝ ADH、 又はラク トースノグルコースォ キシダーゼ （G OD) /イ ソルミ ノール /m— P O D、 ラク トース ZG O D T C P OZAN Sを用いる系、 標識酵素としてグルコース一 6 —リ ン 酸デヒ ドロゲナーゼ、 発光反応のための試薬としてグルコース一 6—リ ン 酸 ZNAD ( P) +/N AD ( P ) Hを用いる系、 標識酵素としてインべ ルターゼ、 発光反応のための試薬としてサッカロース ルシゲニン ZO H —を用いる系などが挙げられ、 生物発光検出系と しては、 標識酵素として ホタルルシフェラーゼ、 発光反応のための試薬として AT PZルシフエリ ン マグネシウムイオンを用いる系、 標識酵素と して A L P、 発光反応の ための試薬としてルシフエリン一 O—ホスフェート /AT Pを用いる系、 標識酵素としてァセテ一トキナーゼ、 発光反応のための試薬としてァセチ ノレホスフェー トノアルコールデヒ ドロゲナーゼ （AD P) /ルシフヱ リ ン Zルシフェラーゼを用いる系、 標識酵素としてグルコース一 6—リ ン酸デ ヒ ドロゲナーゼ、 発光反応のための試薬としてグルコース一 6—リン酸/ NAD/バクテリアルシフェラーゼ ZN AD H— FMN—酸化還元酵素を 用いる系、 標識酵素としてピルビン酸キナーゼ、 発光反応のための試薬と して A D P /ホスホエノ一ルピノレビン酸 Zホタルルシフエ リ ン Zルシフエ ラーゼを用いる系などが挙げられる。
発光反応のための試薬 1 0 7を含む溶液 1 1 3の体積流量を毎分 10 μ L と し、 10分間以上流し続けた。 発光 1 0 8は HRP標識抗ひフヱ トプロ ティン抗体 1 0 6上の HRP が発光反応のための試薬 1 0 7と反応するこ とによって起こるため、 発光はビーズ 1 0 2の近傍でのみ発生する。 すな わち、 HRP は、 検出対象を捕捉するためのビーズ上に固定された抗体、 同抗体に捕捉された検出対象、 同検出対象に ί#捉する HRP 標識抗ひフヱ トプロティン抗体 1 0 6を介してビーズに結合しており、 発光は標識であ る HRP の近傍で起こる結果、 一のビーズ 102 の表面の近傍で発生するこ とになる。 この発光 1 0 8を光計測器 1 1 4によって計測する。 光計測装 置 1 1 4の詳細については後ほど述べる。
図 3は第 1 の実施の形態の装置概略を示したものである。 図 2.で説明し たビーズァレイ 1 2 1を中心と し、 その両側にキヤピラリー 1 2 5とキヤ ピラリー 1 2 2が配管されている。 ビーズァレイの片側はキヤピラリー 1
2 2を介してシリンジ 1.2 3に接続されている。 シリンジポンプ 1 2 4が 動作することでシリンジ 1 2 3のピス トンが押し引きされ、 結果としてビ ーズァレイ 1 2 1内部に送液を行うことができる。 ビーズァレイ 1 2 1の 逆端にはキヤビラリー 1 2 5が配管されその先には弁 1 2 6を介して複数 の容器 1 2 7に接続している。 この複数の容器 1 2 7の各々には、 図 2を 用いた前段の説明で記述した、 サンプル溶液、 洗浄バッファー、 HRP 標 識抗体溶液などが各々入っており、 また廃液溜めと しても利用される。 そ れぞれの容器 1 2 7に対するアクセスは弁 1 2 6を操作することによって 行われる。 ビーズァレイ 1 2 1での発光は光ファイバ一 1 3 1を通じて計 測される。 光ファイバ一 1 3 1の一方の端部は。 図中への記載を省略した ΧΥ ステージによってビーズァレイ 1 2 1中の発光ビーズに近接して設置 される。 また光ファイバ一 1 3 1 の逆端は ΡΜΤ (光電子増倍管） へのコ ネクター 1 3 2を通じて PMT 1 3 3に接続されている。 この設定により 光ファイバ一 1 3 1で集光されたビーズアレイ 1 2 1からの発光が ΡΜΤ 1 3 3に誘導され計測される。 PMT 1 3 3からの信号はライン 1 3 4を通 じてデータ処理装置であるバソコン 1 3 5に出力される。 このバソコン 1
3 5でデータ処理が行われる。
図 4 (A)は第 1 の実施の形態の発光計測結果の例であり、 図 4 (B)はその ときの発光試薬送液のタイミングおよび送液量についての概略図である。 時間 0から計測がスタートし、 その時点ではまだ発光試薬は送液されてい ないため、 発光は計測されない。 信号強度はバックグラウンドレベルのま ま一定に推移する。 発光試薬導入開始のタイミングで発光試薬を含む溶液 が毎分 10 しの体積流量で送液され、 以後送液を続ける。 発光による信号 強度はいつたん高いピークを記録したのちすぐ低下する。 低下した後の発 光強度は非常にゆつく り減衰していく。 この最初の高いピークのピーク幅 は 1秒程度もしくはそれ以下である。 このタイミング特異的なピークの出 現は発光について特異的に見られる現象である。 従来の方法では.、 発光試 薬を容器に入れてから発光計測装置にセッ トして発光を計測しており、 こ のタイミング特異的なピークは観察できていない。 発光反応のための試薬 を流しながら、 発光の起こっている部位での発光を計測することにより、 このタイミング特異的なピークを検出することができる。 このタイミング 特異的なピークを計測することで S/Nの高い計測を瞬時に行うことができ る。 また、 その結果どして少ない発光試薬量で計測できる。 さらに、 高感 度な測定も可能となる。 また、 発光反応のための試薬を流しながら発光を 計測する方法では、 発光試薬が常に供給される状態にあり、 酵素近傍の発 光試薬濃度が減衰しないため、 発光強度の減衰.を抑えて安定に長時間計測 することができる。 高いピークの後のシグナルを長時間足し合わせること によっても高感度で安定な計測を行うことができる。 例えば P M T 1 3 3 からの出力をサンプリング間隔 1 ミ リ秒で取得し、 そのデジタルデータを ノ、。ソコン 1 3 5で足し合わせることにより、 1点でのサンプリングを行つ た場合に比べて S N比の高い結果を得るこどができる。 シグナルの減衰が 少なく無視できる場合には、 足し合わせの点数の 2分の 1乗に比例して S N比が向上すると考えられる。 検出対象物質が多く捕捉され酵素の密度が 高い場合にも、 流れによって発光試薬が供給され発光試薬の周辺濃度の低 下を抑えることができるため、 高精度の計測を行うことが可能である。 このタイミング特異的なピークが出現する現象は次のように解釈し理解 できる。 発光試薬導入の最初のタイミングでは、 今までビーズ上の酵素の 周りになかった発光試薬が一気に酵素の周辺に押し寄せるため、 発光が大 きく現れる。 この瞬間には酵素の周りの発光試薬の濃度は、 導入した発光 試薬溶液の濃度と同じであり、 実質上最大である。 いったん反応が始まる と、 ビーズ表面近傍の薄い液膜の領域では発先試薬が消化され、 発光試薬 の濃度が低下する。 そのためいったんピークに達した発光強度は低下する。 その後は流れによって運ばれてきた発光試薬が先ほどの薄い液膜を拡散す る速度と表面で発光試薬が消化される速度がつりあう ところでほぼ一定の 発光強度が観測されると考えられる。 発光試薬を含む溶液を流す場合の方 力 S、 溶液を流さずに止めた場合に比べて、 この薄い液膜の厚みが薄く拡散 距離が短いので有利である。 また当然のことながら流れによって発光試薬 が次々に供給されるので、 発光試薬の消化による発光試薬のバルダ濃度の 低下も防ぐことができ、 長時間測定でも有利である。 もちろん、 いったん 発光試薬を流し入れた後に発光試薬溶液の送液を停止することも可能であ り、 発光の検出は実現できる。 この場合にも'発光試薬の導入と発光の計測 を同時に行うことで、 有利な計測が実現できる。
本実施の形態ではビーズァレイを用いたが、 ビーズァレイを用いた場合 に限定されるものではない。 検出対象とする生化学物質を捕捉するプロ一 ブを固相に固定した流路をもつデバイスにおいて、 発光検出をそのプロ一 ブの固定領域の近傍を計測することで行う系については一般的に適用可能 である。 また本実施の形態では抗体固定化ビーズを用いてタンパク質のサ ンドィッチアッセィを行ったが、 これに限られるものではない。
固定するプローブは、 デォキシリボ核酸 （D N A ) 、 リボ核酸 （R N A ) 、 ペプチド核酸 （P N A ) 、 また、 アデニン、 チミン、 シトシン、 グ ァニン、 ゥリジン、 イノシンを有する人工核酸、 あるいは核酸誘導体が一 般的であるが、 これらや、 ペプチド、 糖ペプチド、 タンパク質、 糖タンパ ク質、 多糖または化学合成ポリマーなど相補的な分子を捕足できるもので あれば好ましいが、 これに限定されるものではない。
核酸プローブを用いた時では核酸の検出への適応が可能であり、 更にタ ンパク質をプローブとした時は、 抗体検査、 抗原検査などにも用いること ができ、 例えば、 食品アレルゲン検査、 アレルゲン特異 IgE検査、 感染症 検査、 化学物質特定検査、 汚染物質検査などに適応が可能である。 さらに、 糖一レクチン反応や、 レセプターなどもプローブと して用いることが可能 である。 D N A _タンパク質の相互作用を利角したプローブ設計も可能で あり、 さらには酵素一基質の反応、 例えばピオチン一アビジン反応などに も適応がかのうである。
図 5は第 2の実施の形態の装置概略を示したものである。 図 3で説明し た装置に比べてビーズァレイと光ファイバ一が変更されている。 図 5で示 されるビーズァレイ 1 4 1 は、 図 2のビーズァレイ 1 2 1 に該当するもの を複数 （ここでは 4本） 接続した形状をとつており、 それぞれのビーズ部 分がすべて口径の大きな光ファイバ一バンドル 1 4 2の直下に来るように 設置されている。 光ファイバ一バンドル 1 4 2の口径は計測の対象とする ビーズが配置された領域と同等もしくはこれよりも大きい事が望ましく、 少なく ともこの構成においては、 1つのビーズアレイにおける測定項目に 対応するビーズの外径すなわちプローブが固定化された検出対象ビーズの 外径 （複数の場合には複数のビーズの外径を足し合わせた長さ） と同等も しくはこれよりも大きいものとする。 これにより、 計測対象とするビーズ を確実に検出することができる。 接続部分 1 2 .2 a、 b、 c の内体積は仮に それぞれ約 10 W L どした。 ビーズアレイ 1 2 1に相当するそれぞれのビ ーズァレイ 1 2 1 a、 b、 c、 d には、 それぞれ異なる抗体、 例えば抗ひフ エ トプロテイン抗体、 抗 CA19-9抗体、 抗 CEA抗体、 抗 PSA抗体を固定 したビーズが含まれている。 光ファイバ一バンドル 1 4 2は光ファイバ一 バンドルと PMTとの接続コネクタ一 1 4 3を通じて PMT 1 3 3に接続さ れる。 これ以外は図 2の装置設定と同じである。
図 6 (A)は第 2の実施の形態の発光計測結果例の模式図であり、 図 6 (B) はそのときの発光試薬送液のタイミングおよび送液量についての概略図で ある。 第 1の実施の形態と同様の反応を同様に行うが、 本実施の形態では サンプル溶液に例えば αフエ トプロテイン、 CA19-9、 CEA、 PSA が含ま れ、 それを検出することが目的である。 HRP標識抗体溶液は、 4種の物質 に対する HRP 標識抗体を含む溶液を用いた。 時間 0から計測がスタート し、 その時点ではまだ発光試薬は送液されていないため、 発光は計測され ない。 信号強度はバックダラゥンドレベルのまま一定に推移する。 発光試 薬導入開始のタイミングで発光試薬を含む溶液が毎分 IO JU Lの体積流量で 送液され、 以後送液を続ける。 第 1 の実施の形態と同様、 発光による信号 強度はいつたん高いピークを記録する。 その後約 1分間の間隔で合計 4つ のピークが観測される。 これらのピークはそれぞれ抗(¾フヱ トプロティン 抗体、 抗 C- 19抗体、 抗 CEA抗体、 抗 PSA抗体を固定したビーズ近傍の 発光であると考えられる。 ビーズァレイ 1 2 1に相当するビーズァレイ間 の配管の内体積を約 10 ^u L としたため、 発光試薬を含む溶液の流速から 当該溶液が各々のビーズァレイに到達する時間を予測することができ、 こ こでは到達する時間が各々のビーズァレイにっき約 1分間づっずれたと し て解釈できる。 このように発光試薬を送液しながら計測することにより、 一つの光検出器を用い、 その光検出器を移動させない装置設定で、 複数項 目の検出が簡便安価に実現できる効果がある。
図 7は第 3の実施の形態の装置概略を示したものである。 多項目の検出 を光学系のスキャニングで行う系である。 複数の項目に対するプローブ固 定ビーズとプローブ非固定ビーズを交互に並べたビーズアレイ 1 5 1に、 第 1 の実施の形態同様の送液系が接続されている。 ビーズアレイ 1 5 1の 片側はキヤピラリー 1 2 2によりシリンジポンプ 1 2 4に設置されたシリ ンジ 1 2 .3に接続されている。 ビーズアレイ 1 5 1の逆端にはキヤビラリ - 1 2 5が配管されその先には弁 1 2 6を介して容器 1 2 7に接続してい る。 それぞれの容器 1 2 7に対するアクセスは弁 1 2 6を操作することに よつて行われる。 ビーズァレイ 1 5 1中の複数ビーズからの発光は光学系 1 5 6がスキャンすることによって別々に計測される。 光学系 1 5 6はビ ーズァレイ 1 5 1に対して相対的に移動する。 対物レンズ 1 5 2は例えば 焦点距離 9 m m、 開口数 0.46 のものを使用し、 結像レンズ 1 5 3は例え ば焦点距離 180mm のものとする。 この場合倍率は焦点距離の比となり、 20 倍である。 スリ ッ ト 1 5 4は対物レンズ 1 5 2と結像レンズ 1 5 3で 設定される光学系の像面に設置される。 ビーズアレイ 1 5 1 中にある 100 ミ ク ロンのビーズを例にすると、 この仮想像面では 2mm 径に映る事にな る。 スリ ッ ト 1 5 4はビーズの像を切り取るものであり、 ビーズアレイ 1 5 1の長手方向に対して実質的に垂直な方向 長手方向を有する長方形の 形状を持つ。 以降ス リ ッ ト幅というときは、 ス リ ッ ト幅の実サイズではな く、 倍率の逆比を乗じた値として記述する。 例えばス リ ッ ト幅 20 ミクロ ンという場合は、 もともと 100 ミクロンであるビーズ像を横方向に 5分の
1分割するスリ ッ ト幅となる。 PMT 1 5 5はスリ ッ ト 1 5 4の直後に置か れ、 スリ ッ ト 1 5 4を通過してきた光を全量受光する。 ここでは受光面が
8 mm径の PMT を使用した例を示す。 PMT 1 5 5はライン 1 5 7によつ てデータ処理装置としてのパソコン 1 5 8に接続される。 この設定により 光学系 1 5 6で集光されたビーズァレイ 1 5 1からの発光が PMT 1 5 5 に誘導され、 パソコン 1 5 8で信号が出力される。
図 8は第 3の実施の形態における光学系のスキャンと得られるデータの 関係の概略を示したものである。 図 8 (A)は像面における仮想的なビーズ アレイとスリ ツ トの関係を表す概念図である。 ビーズ径 100 ミクロンに対 してスリ ッ ト幅を 10 ミクロンに設定した例を示す。. 長方形のスリ ッ トが ビーズの像から切り取る部分 （図で白い部分） に相当する発光が PMT に よって計測される。 図 8 (B)はスキャンの経過時間がビーズの配置位置に 対応することを概念的に示し、 その位置ど発光強度が対応することを示す 図である。 ス リ ッ トを含む光学系がビーズァレイの長手方向にスキヤンす ることによって、 ビーズァレイのビーズからの発光がスリ ッ トを通過する ことで位置分解能を持った波形として計測される。 スリ ツ ト幅を広くすれ ば透過する光の量が多くなるので、 高い信号強度が得られるが、 それぞれ のビーズからの発光同士が重なってしまうため、 正確な計測が難しい。 ま たあまりにスキャンする速度が速くなると、 PMT の測定帯域の影響が出 て波形がなまってしまう。 具体的には、 ビーズ一つ当たりにかかるスキヤ ン時間と比べて、 PMT の測定帯域の'逆数 （秒の単位で表すことができ る） が同等もしくは長い場合には、 ある特定のビーズからの発光を PMT で受光してもそのシグナルがビーズをスキャンするのと同等もしくはそれ 以上の時間にわたって広がってしまうため、 ビーズ同士を区別することが 難しぐなる。 よってスキャンのスピードは、 測定帯域の逆数がビーズ一つ 当たりのスキャン時間よりも十分小さくなる ίうな領域に設定するのが望 ましい。
図 9は第 3の実施の形態におけるスリ ッ ト幅と信号波形の関係について 模式的に示すものである。 スキャン時間と しては、 例えば 1 ビーズあたり
5秒とした。 第 3の実施の形態に示す装置の測定帯域は約 2.5Hz とすると、 帯域による波形のなまりの影響が少ない場合の例である。 発光反応のため の試薬をビーズァレイ中に流しながら、 同時にこのビーズァレイを光学系 によってスキャンし計測を行っている。 図 9 (A)はスリ ッ ト幅が 50 ミク口 ンの場合 （ビーズ直径の 5 0 %程度の場合） である。 この場合、 ス リ ッ ト 幅がある程度大きいので、 大きな信号が得られる。 その反面、 スリ ッ トが ビーズの端の方を走査している場合に隣のビーズからの発光をも拾ってし まうため、 それぞれのビーズからの発光が正確に見分けにく くなる傾向が ある。 図 9 (B)はスリ ッ ト幅を 10 ミクロンにした場合 （ビーズ直径の 1
0 %程度の場合） である。 それぞれのビーズからの発光を区別することは 可能となったが、 スリ ッ ト幅が小さくなつたため、 信号強度は小さくなつ てしまい感度が低下する傾向がある。 図 9 (C)はスリ ッ ト幅を 8,0 ミクロン
(ビーズ直径の 8 ひ0 /0程度の場合） と大きく し、 かつ、 複数のビーズの配 列において発光の検出対象とするビーズを一つおきに配置したケースであ る。 以上より、 計測に使用しない少なく とも 1つのビーズ 計測するビ一 ズの間に入れることで、 被検出ビーズ間の距離を増し、 ビーズ間の分離を 明確にすることができる。 また、 このようなビーズの配置と併せてさらに スリ ツ ト幅が大きくすること.によって、 信号強度を増すこともできる。 す なわち、 結果として高感度高分解能な計側を実現できる効果がある。 . 図 1 0は第 4の実施の形態の装置概略を示したものである。 第 1から第
3の実施の形態とは異なり、 CCD カメ ラを使用した光学系であるため、 一度の多数の.ビーズァレイに対しての計測を行うことができる。 ここでは 複数の項目に対するプローブ固定ビーズと、 プローブ非固定ビーズ若しく は遮光性ビーズを交互に並べたビーズァレイを用いることができる。 ビー ズァレイを束にしたビーズァレイ群 2 0 1を中心にその両側に送液系 2 0 2、 溶液保持部（図示せず)および接続切替部 0 3を接続する。 送液系と はそれぞれのビーズァレイに送液する機能を持つ部分で、 図 3のようにシ リ ンジを利用しビーズァレイ毎に接続する系やポンプを利用した系が適用 できる。 溶液保持部および接続切替部 2 0 3は反応溶液や洗浄溶液などを いれる容器の部分とそこ溶液への切り替え機能を持つ部分で、 図 3のよう に容器を並列に配し、 それぞれに弁を接続する系などが適用できる。 送液 系 2 0 2、 液保持部および接続切替部 2 0 3 とも発光反応のための試薬を 含む溶液をビーズアレイ群 2 0 1中のそれぞれに流し込む機能を有してい る。 このビーズァレイ群 2 0 1をカメラレンズ 2 0 4を介して CCD カメ ラ 2 0 5で計測する。 力メラレンズ 2 0 4は例えば F 値が 0.95、 焦点距 離 50mm のものを使用し、 像倍率を等倍に設定したものである。 ビーズ ァレイ中の 100 ミクロンのビーズは CCDカメラ 2 0 5の受光面に 100 ミ ク ロンの大きさで投影される。 CCD カメラ 2 0 5はライン 2 0 6を介し てデータ処理装置であるバソコン 2 0 7に接続され、 CCD カメラ 2 0 5 で得られた画像は、 このパソコン 2 0 7でデータ処理され表示される。 こ こで使用した C C Dカメラは、 いかなる物でも用いることができる。
図 1 1は第 4の実施の形態におけるビーズからの発光の映り込みの例を 示した図である。 図 1 1 (A)は画像の一部の拡大模式図、 図 1 1 (B)はビー ズごとに観測される発光強度を規格化して示すグラフである。 測定時間は 仮に 5分間とした。 図 1 1(A)に映っているのは 100 ミクロンのポリスチレ ン （PS) ビーズの例である。 発光しているビーズ 2 1 1 (No.3) の両側 に発光が予想されないビーズ 2 1 2 (No.1,2,4,5) が配置されている場合 である。 キヤピラリー 2 1 3の中にビーズ 2 1 1 と 2 1 2が含まれ、 その 空間には発光試薬を含む水溶液 2 1 4が流れている。 2 1 4発光試薬を含 む水溶液はこの図 1 1 (A)では左側から送液されている。 発光しているビ ーズ 2 1 1の発光強度を 100 と して規格して光の強度を比較したのが図 1
1 (B)である。 このグラフから分かるとおり、 発光しないはずのビーズか らも約 3 %程度の強度で光が計測されていることが分かる。 これは正確な 測定の際には望ましくない。 特に得られる発光強度に大きな違いが予想さ れるような多項目検出をこのように配列された'ビーズで行う場合には、 小 さな発光しかしない項目に関しては大きな誤差が生じる。 発光が予想され ないビーズからも光が計測される要因として、 最も影響が大きいものは、 発光するビーズ 2 1 1からの発光が予想されないビーズ 2 1 2を照射し、 散乱および屈折の具合で計測されてしまう、 映り込み現象である。
図 1 2は第 4の実施の形態におけるビーズからの発光の映り込みについ て、 遮光性のビーズを間に挟んだ場合の例を示した図である。 図 1 2 (A) にその構成を示す。 遮光性のビーズ 2 2 1を発 するビーズ 2 1 1 と発光 しないビーズ 2 1 2の間に挿入している。 ここでは遮光性のビーズ 2 2 1 として、 遮光性物質を混合した粒子、 例えば 100 ミク ロンの Mn02 微粒 子をポリスチレンに混合して作製したビーズを利用した。 他に、 黒、 青、 赤などの着色粒子や着色ラテックス、 金属粒子、 遮光性を示す物質を混合 あるいは他の材質の物質で包含した粒子など、 遮光性を示すものならばど のような材質の物でも用いることができる。 最も好ましいのは、 光の透過 性が著しく低い黒色の粒子であり、 材質にはよらない。 つまり、 ポリスチ レンで黒色の粒子を包含すれば、 遮光性を維持しつつ最も良い固定化のた めの表面を提供することができる。 図 1 2 (B)は画像の拡大模式図を、 図 1 2 (C)にビーズごとに観測ざれる発光強度を規格化して示すグラフを示 す。 測定時間は仮に 5分間とした。 この遮光性ビーズ 2 2 1を挟むことに より、 No.l の位置のビーズの発光強度が 2.8%から 0.9。/。に、 No.5 の位置 のビーズからの発光強度が 3.2%から 1.2%にそれぞれ大幅に低減する。 遮 光性のビーズ 2 2 1が発光するビーズ 2 1 1の発光を遮り映り込み量を減 少させる効果がある。
本実施の形態で使用しているルミノール系の発光では発光波長が約 420 nm であり、 遮光性ビーズの材料特性と してその波長を遮る材料であれば 問題ない。 フェライ トをませたブラスティ ックビーズ、 黒色顔料を混ぜた ブラスティ ックビーズや金を蒸着したビーズなどが考えられる。 またここ では 100 ミクロンのビーズ一つのみを挟んだ系について考察しているが、 かならずしもそれに限らず、 例えば 30 ミクロンもしくはそれ以下の遮光 性ビーズをいくつか入れておく、 という系でも同様の効果が期待できる。 図 1 3は第 4の実施の形態におけるビーズからの発光の映り込みについ て、 溶液の屈折率を調整した場合の効果を模式的に示した図である。 図 1 3 (A)は屈折率の調整をしない場合の模式図である。 発光するビーズ 2 1 1からの発光には、 直接光学系の方向に向かう光線 2 3 1 と隣のビーズに 向かう光線 2 3 2がある。 例えば発光反応のための試薬を含む水溶液 2 1 4の屈折率は 1.33 付近とすると、 ビーズの一材質であるポリスチレンを 例にすると、 その屈折率は 1.58 である。 そのため隣のビーズへ向かう光 線 2 3 2はビーズ 2 1 2の表面で散乱もしくは屈折の影響を受け、 そのた め光学系の方向に向かい結果として発光しないビーズ 2 1 2への映り込み と して観測されることになる。 図 1 3 (B)は理想的に屈折率調整を行った 場合の模式図である。 溶液 2 3 3の屈折率をポリスチレンと同じ屈折率と して調製できた場合、 隣のビーズへ向かう光線 2 3 2はビーズ 2 1 2の表 面で散乱もしくは屈折の影響を受けることがなくなる。 よって散乱もしく は屈折によって生じる映り込みをゼロに抑える.ことが可能である。 すなわ ち、 溶液をビーズの屈折率に近い屈折率とする構成とし、 映り込みを減少 させることができる。 酵素を利用しない化学励起を利用した化学発光の場 合、 有機溶媒の選択の幅が広がるため、 屈折率の調整はより簡便である。 また、 上記のポリスチレンは屈折率が 1.58 であるが、 ビーズの材質をも つと屈折率の低い物質、 例えば屈折率 1.47 のガラスとするときには、 溶 液の屈折率を低い範囲で調整することができ、 より容易に映り込みを防ぐ ことができる。
図 1 4は第 4の実施の形態におけるビーズからの発光の映り込みについ て、 溶液の屈折率をグリセロールで調整した場合の効果について反射率の 観点から検証したグラフである。 水溶液の屈折率を比較的大きく変化させ、 なおかつ酵素反応への影響が少ない物質と してグリセロールがある。 ダリ セロール水溶液の屈折率はその対重量濃度 （重量％) を増やすにしたがつ て 1.33から 1.47 まで増大する。 映り込みを垂直方向の光の反射率で代表 させて評価し、 またグリセロール濃度が 0 %の時の反射率を 100%とした ときの反射率を反射率比と してそれぞれ計算し、 グラフ化した。 ビーズが ポリスチレン （PS) の場合、 水溶液での反射率は 0.74%である。 グリセ口 ール濃度を上げていく と屈折率の差が小さくなるため反射率も減少する。 例えばグリセロールを 50%入れると反射率比が 50%に下がり、 十分な効 果が得られる。 このときの屈折率の差は 0.18 である。 グリセロール濃度 が 80%を超えると粘度が大幅に増大していくため、 実際の送液には不都 合が生じる可能性がある。 すなわち、 ビーズがポリスチレンの場合には、 グリセロールの濃度は 5 0 %以上 8 0%以下の範囲とすることが望ましい。 ビーズがガラスの場合には、 水溶液に対する反射率が 0.25%とポリスチレ ンの 3 分の 1であり、 またグリセロール濃度を 30%とするだけで反射率 比も 49%と半分以下になる。 すなわち、 ビーズがガラスの場合には、 グ リセロールの濃度は 3 0 %以上 8 0 %以下とすることが望ましい。 ビーズ ァレイに用いられる一般的なビーズの態様を考慮すれば、 一般的には上記 の条件よりグリセロールの濃度は 3 0%以上 8 0 %以下の範囲としておく ことが望ましい。 今回はグリセロールの場合を示したが、 屈折率を変化さ せるような溶媒であれば、 これに限定されるものではない。
ビーズの屈折率を n b、 溶液の屈折率を n s とし反射率を界面の垂直方 向の反射率 kで代表させると、 k = (n b - n s ) 2 / (n b + n s ) 2と いう関係がある。 グリセ口ール溶液のときのグリセ口ールの範囲は上記の 通り 3 0%以上 8 0 %以下とすることが望ましい。 他の溶液の場合にもビ 一ズの屈折率と.溶液の屈折率の差は小さいことが望ましいが、 以降の考察 から実効的には 0. 2程度であれば十分に効果があると考えられる。 上記 反射率の式を溶液の屈折率 n s を解と してとく と、 n s = n b * [ ( l + k) / ( 1 - k) +{. ( 1 + k) 2/ ( 1 - k) 2— 1}]となる。 ビーズの材 質がポリスチレンのときは n b = l . 5 8、 ガラスの時は 1. 4 7とすれ ばよい。 発光試薬として何も屈折率調製をしない場合の反射率を k 0と し て考え、 反射率が半分になれば十分な効果があることを考えると、 kとし て 0. 5 X k 0の値を代入して考えればよい。 このときの溶液の屈折率 n sは、 ビーズがポリスチレンおよびガラスのそれぞれに対して、 1. 4 0 および 1 . 3 7と計算される。 ビーズの屈折率との差をとると 0 . 1 8お よび 0 . 1 0となる。 一般的に樹脂の屈折率の方がガラスの屈折率よりも 高く、 またポリスチレン以外の樹脂のビーズを採用することを考え、 屈折 率の差が 0 . 2程度もしくはそれ以下にしておけば十分な効果がある。 図 1 5は第 4の実施の形態におけるビーズからの発光の映り込みについ て、 発光反応のための試薬を含む溶液を含有グリセロールの濃度が 70% となるように調整した場合の例を示した図である。 このときの溶液 2 3 3 の屈折率は 1.43 である。 それ以外の構成は図 1 1 と同じであり、 ビーズ は屈折率が 1.58 のポリスチレンを用いている。 図 1 5 (A)は画像の拡大模 式図を、 図 1 5(B)にビーズごとに観測される発光強度を規格化して示すグ ラフを示す。 測定時間は 5分間とした。 発光反応のための試薬の溶液をグ リセ口ール 70%のものに調整することにより、 発光しないビーズ 2 1 2 の発光強度を発光に寄与しているビーズ 2 1 1の発光量の 0.7%から 1.0% に抑えることができる。 これは屈折率調整をしない場合に比べて約 4分の 1の値であり、 大幅に低減する。 溶液の屈折率をビーズのものに近づける ことにより、 発光が予想されないビーズ 2 1 2の映り込み量を減少させる 効果がある、 と考えられる。
本実施の形態ではビーズアレイを用いたが、 ビーズアレイを用いた場合 に限定されるものではない。 検出対象とする生化学物質を捕捉するプロ一 ブを固相に固定した流路をもつデバイスにおいて、 発光検出をそのプロ一 ブがある近傍を計測することで行う系では、 一般的に映り込みの問題が起 こるため、 本実施の形態は有効である。
図 1 6は第 4の実施の形態のうち偏光板を利用した映り込みの低減に関 する装置概略を示したものである。 図 10 で示した装置構成に加えて、 ビ ーズアレイ群 2 0 1 と CCD カメラ 2 0 5の間に偏光板 2 4 1を入れた装 置である。 ビーズァレイ群 2 0 1からの発光は発光基質がランダムな方向 を向いて発光するため、 偏光していないと考えられるが、 隣のビーズで反 射される映り込みに関しては、 s 波および p 波の反射率の違いから偏光し ていると考えられる。 このため、 偏光板 2 4 1を入れることによって、 映 り込みの寄年分を小さくできる。 この方法は: 図 1 2から図 1 5までに記 述した遮光性微粒子を使う系や溶液の屈折率調整を行う系に比べて 非常 に簡単な構成かつ安価に映り込みの減少化が行えるという利点がある。
実施例
実施例 1
実験に用いた装置の概略図を図 1 7に示す。 また、 反応は図 1のフロー チャートに従って行った。
9 3 μ mのポリスチレンビーズ （ J S R (株） 製、 ポリスチレン製標準 粒子 D YNO S PH E R E S、 型番 S S— 9 2 2 P ) 懸濁液 1 0滴 （約 1 m L ) を 1 . 5 m Lのエツペン ドルフチューブに取り、 卓上小型遠心機 (ミ リポア社チビタン、 製造トミー精ェ） にてビーズと上清を分離し、 ピ ペッ トにて上清を除去した後、 炭酸緩衝液 （N a H C 03 3. 0 g N a 2 C O 3 1. 5 g、 水 1 L p H 9. 6 ) で調整した 1 0 g Zm L 抗 IgE抗体 （B e t h y 1社製、 G o a t A n t i — H u m a n I g E— a f f i n i t y P u r i f i e d 型番 A 8 0 - 1 0 8 A) 1 m Lを添加して一晩放置し、 固定化した。 その後、 上清を除去し、 炭酸緩衝 液を添加して攪拌し、 再び卓上遠心機にて上清とビーズを分離して、 上清 を除去した。 この洗浄操作を 3 , 4回行った。 ブロックエース TM (発売 元 大日本製薬 （株） 、 製造元 雪印乳業 （株） ） にて 1時間ブロッキン グを行った。
ブロックエース TM にてブロッキング処理のみを行った、 抗 I g E抗体 を固定していないビーズ （以後、 ブランクビーズ） を別途作製した。
外径 3 7 5 μ m、 内径 1 5 0 μ πιのフューズドシリカキヤビラリ （G L サイエンス社製） を 1 0 c mにカッ トし、 中心部分を燃焼法により表面の ポリイ ミ ドを剥離させて観察窓を設け、 その部分にブランクビーズ 1 0個、 抗 I g E抗体固定化ビーズ 1個、 ブランク ビーズ 1 0個の順番に並べた。 ' 両端ほ 5 0 μ m径の S U S 3 0 4ステンレスワイヤー （ （株） ニラコ製、 型番 7 5 1 1 0 7 ) で固定した。 このデバイスを用いて図 1 7の装置を用 いて反応、 検出を行った。 各キヤビラ リの接 はィンナシールコネクタ
(G Lサイエンス製、 適用内径 2 5 0— 5 3 0 μ m) を用いて行った 始め、 5 0 μ Lのブロックエース ΤΜ を流速 l O O L/m i nで往復 送液 （ 1 0往復） をして、 1 0分間反応させた。 （流路のブロッキング） 次に、 リン酸緩衝液 （和光純薬工業 （株） 製、 リン酸緩衝液生理食塩粉 末 （ 1 L中 N a H2 P 04 0. 3 5 g、 N a 2H P 04 1. 2 8 g、 N a C 1 8 g ) 、 pH7.4、 以後 P B Sと略す） で希釈した 1 n g /m L
1 g E (B e t h y 1社製、 Human IgE Calibrator 型番 R C 8 0— 1 0 8 ) 5 0 μ Lを流速 1 0 0 L/m i nで往復送液 （ 2 0往復） をして、
2 0分間反応させた。
P B Sを流速 1 0 0 L/m i nで一方向に押し流し、 4分間洗浄した。 P B Sで希釈した 1 0 0 0 n g/ L HR P標識抗. I g E抗体 （B e t h y 1社製、 G o a t A n t i -H um a n I g E _HR P C o n j u g a t e ) 5 0 ;u Lを流速 1 0.0 x LZm i nで往復送液 （ 2 0往 復） して、 2 0分間反応させた。 P B Sを流速.1 0 0 μ L/m i nで一方 向に押し流し、 4分間洗浄した。
図 1 8では、 HR Pの発光基質として S.u p e r S i g n a l ® W e s t F e m t o (P I E R C E社製） を用いた発光計測の結果を示す。 発 光反応のための試薬として、 上記発光基質を添加すると （ 3 2 0 s e c付 近） 、 発光に由来するピークが得られた。 1 0 0秒間を積算したとき、 そ の値は 5. 5であり、 同様の実験を 0 n g /mL I g Eの場合 （ I g E なしの場合） の値は、 2. 3であった。
実施例 2
実験に用いた装置の概略図を図 1 7に示す。 また、 反応は図 1のフロー チャートに従って行った。
9 3 μ mのポリ スチレンビーズ （ J S R (株） 製、 ポリスチレン製標準 粒子 DYNO S P HE R E S、 型番 S S— 9 2 2 P ) 懸濁液 1 0滴 （約 1 m L ) を 1 . 5 m Lのエツペン ドルフチューブに取り、 卓上小型遠心機
(ミ リポア社チビタン、 製造トミー精ェ） にてビーズと上清を分離し、 ピ ぺッ トにて上清を除去した後、 スギ花粉抽出物を P B Sにて 5 0 g /m Lに調整した溶液を 1 m L添加して一晩放置し、 スギ花粉抽出抗原を固定 ィ匕した。 その後、 上清を除去し、 炭酸緩衝液を添加して攪拌し、 再び卓上 遠心機にて上清と分離して、 上淸を除去した。 この操作を 3 , 4回行った。 ブロ ックエース TM (発売元 大日本製薬 （株） 、 製造元 雪印乳業
(株） ） を 1 mL添加して 1時間ブロッキングを行った。
ブロックエース TM にてブロッキング処理のみを行った、 スギ花粉抽出 抗原を固定していないビーズ （以後、 ブランクビーズ） を別途作製した。 デバイスには、 3. 0 c m X 4. 0 c m X 0. 1 5 c mサイズのポリメ チルメダクリ レートに内寸 1 1 0 m X 1 1 0 ^ mの溝加工したチップを 甩いた。 チップの開放部分を同じ材質の厚さ 5 0 mのフィルムでラミネ —トして塞いだ。 チップにブランクビーズ 1 0個、 スギ抗原固定化ビーズ 1個、 プランクビーズ 1 0個の順番に並べた。 チップの末端にはビーズの 流出を防ぐために、 ダム構造を設けており、 反対側はテーパー構造となつ ており、 外径 3 7 5 μ m, 内径 5 0 mのフューズドシリカキヤビラリ一 (G Lサイエンス社製） を差し込むことでビーズの流出を止めた。 各キヤ ビラリの接続はインナシールコネクタ （G Lサイエンス製、 適用内径 2 5 0 - 5 3 0 μ m) を用いて行った。
始め、 5 0 / Lのブロックエース TMを流速 1 0 0 μ Lノ m i nで往復 送液 （ 1 0回） をして、 1 0分間反応させた。 （流路のブロッキング）
P B Sで調整した 1 0 0 n g /m L マウスモノク ロ一ナル抗 C r y j 1抗体 （ （株） 林原生物化学研究所 製、 AB— C e d a r P o 1 1 e n A l l e r g e n C r y j l 、 ( 0 2 6 ) (m o ) (M) 、 A f f i n) 5 0 μ Lを流速 1 0 0 μ L/m i nで往復送液 （ 2 0回） をして、 2 0分間反応させた。 P B Sを流速 1 0 0 L/m i nで一方向に押し流 し、 4分間洗浄した。 P B Sで調整した 1 0 0 0 n g Zm L HR P標識 抗マウス I g G抗体 （D a k o製 A n t i —M o u s e I m m u n o g l o b u l i n sノ HR P 型番 P 0 4 4 7 ) 5 0； u Lを流速 1 0 0 μ L/m i nで往復送液して、 2 0分間反応させた。 P B Sを流速 1 0 0 LZm i nで一方向に押し流し、 4分間洗浄 た。
図 1 9では、 発光反^のための試薬と して S u p e r S i g n a l ® We s t F e m t o (P I ER C E社製） を用いて送液開始すると （ 50 0 s e c付近） 、 ピークが得られた。 1 0 0秒間積算すると、 その値は 1 6. 2であった。
実施例 3 . , 実験に用いた装置の概略図を図 2 0に示す。 2 5 0 μ mの P S ビーズ ( P o 1 y s c i e c n c e製、.粒子径範囲 2 5 0— 3 0 0 μ πι) に対し て、 P B Sで調整した 1 0 μ g mLのHR Ρ標識抗 A 1 d o 1 a s e抗 体 （ROCKLAND社製 A n t i — A l d o l a s e , R a b b i t Mu s c l e , G o a t - P o l y, H R P 型番 2 0 0— 1 34 1 ) を 終夜冷蔵庫内で固定化を行った。
上記ビーズを、 黒色ビーズ （D u k e S c i e n c e製 粒子径 5 Ό μ m、 型番 BK 0 5 0 T) を数個ずつで両側を挟み込み、 さらに両側には何 も固定していない 2 5 0 μ m P Sビーズを外径.4 5 0 μ m、 内径 3 2 0 μ mのフューズドシリカ （G Lサイエンス社製） 中に並べた。
両端は 5 0 m径の S U S 3 04ステンレスワイヤ一 （ （株） ニラコ製、 ¾番 7 5 1 1 0 7) で固定した。
発光反応のための試薬には、 HR Pの発光基質 S u p e r S i g n a 1 ® We s t F e m t o (P I ERC E社製） を用レヽ、 シリンジポンプ中 に発光基質をセッ トし、 ビーズアレイに送液した。 送液開始して、 5分間 の積算した結果をビーズァレイデバイス上のラインプロフアイルを取得し、 ピクセルに対する強度を示したグラフを図 2 1に示す。
比較として、 ブランクビーズを HR P標識抗 A 1 d 0 1 a s e抗体固定 化ビーズで挟み込んだものを示す。 .
結果、 検出対象のビーズを遮光ビーズで挟んだ場合では、 隣への光の漏 れを防ぐことができた。

Claims

請 求 の 範
1 . 少なく とも一部にプローブを結合した固相を収める流路に、 標識さ れた検出対象物質又は標識されていない検出対象物質を含む液体を供給す る工程と、
前記プローブに前記標識された検出対象物質を捕捉させる工程若しくは標 識されていない検出対象物質をプローブに捕捉させかつ標識する工程と、 前記流路に発光反応のための試薬を液流により供給する工程と、
前記発光反応のための試薬と前記標識が反応した部位の近傍を光学的に検 出する工程とを有することを特徴とする生化学物質の分析方法。
2 . 前記プローブに前記標識された検出対象物質を捕捉させる工程若し くは標識されていない検出対象物質をプローブに捕捉させかつ標識するェ 程において、 標識された検出対象物質又は標識されていない検出対象物質 を含む液体を往復送液により供給することを特徴とする請求項 1に記載の 分析方法。
3 . 前記標識は酵素であり、 前記発光反応のための試薬は用いた酵素に 対応する基質を含むことを特徴とする請求項 1に記載の分析方法。
4 . 前記酵素が、 ペルォキシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 グル コースォキシダーゼ、 β一 D—ガラク トシダーゼ、 グルコース一 6 —リ ン 酸デヒ ドロゲナ一ゼ、 インベルターゼ、 アデノシン三リン酸 （以後、 A T P ) ァーゼ、 ルシフェラーゼ又はェクオリンであって、 前記基質が、 ノレミ ノーノレ、 ジォキセタン、 過シユウ酸エステノレ、 グノレコース、 β — Όーガラ ク トシル、 グルコース一 6 _リ ン酸、 ノレシゲニン、 ァスコルビン酸リ ン酸 エステル、 アデノシン三リ ン酸、 ノレシフェ リ ン若しぐはこれらの誘導体、 又はカルシウムイオンである請求項 3に記載の分析方法。
5 . 前記発光反応のための試薬は、 さらに酸化剤又は酸素添加剤を含む ことを特徴とする請求項 4に記載の分析方法。
6 . 前記酵素がペルォキシダーゼであり、 前記基質はルミ ノール若しく はルミソール誘導体であって、 前記発光反応のための試薬はさらに酸化剤 又は酸素添加剤を含むことを特徴とする請求 3に記載の分析方法。
7 . 前記酸化剤が、 過酸化水素又はアルキルハイ ド口パーオキサイ ドを 含む過酸である請求項 6に記載の分析方法。
8 . 前記発光反応のための試薬は、 さらに発光增感剤を含むことを特徴 とする請求項 3に記載の分析方法。.
9 . 前記固相は粒子であり、 前記近傍は前記粒子の近傍であることを特 徴とする請求項 1に記載の分析方法。
1 0 . 前記検出する工程と、 前記発光反応のための試薬を液流により供 給する工程とを同時に行うことを特徴とする請求項 1に記載の分析方法。
1 1 . 前記固相は複数の粒子であり、 前記複数の粒子は、 遮光性粒子と 前記プローブを固定した検出対象粒子とからなり、 前記検出対象粒子は他 - の前記検出対象粒子ど間に少なく とも 1..つの前記遮光性粒子とを配列され ることを特徴とする請求項 1に記載の分析方法。 .
1 2 . 前記流路に供給される前記発光反応のための試薬を含む溶液の屈 折率は、 前記粒子の屈折率との差が 0.2 程度以下であることを特徴とする 請求項 9に記載の分析方法。
1 3 . 前記流路に供給される前記発光反応のための試薬を含む溶液は、 グリセロ一ルを含むことを特徴とする請求項 9に記載の分析方法。
1 4 . 前記流路に供給される前記発光反応のための試薬を含む溶液は、 グリセロールを 3 0 %以上 8 0 %以下の濃度の範囲で含むことを特徴とす る請求項 9に記載の分析方法。
1 5 . 前記検出する工程では、 偏光板を介して光学的に検出するこ.とを 特徴とする請求項 1に記載の分析方法。
1 6 . 前記検出する工程では、 スリ ッ トを含む光学系と前記固相とを、 前記流路の長手方向で相対的に移動させ、 光学的に検出することを特徴と する請求項 1に記載の分析方法。
1 7 . 細管と、
プローブを固定され、 かつ前記細管に収められる第 1 の粒子と、
遮光性物質を含み、 かつ前記細管に収められる第 2の粒子と、 発光反応のための試薬とを有することを特徴'とする分析キッ ト。
1 8 . 前記第 2の粒子は、 前記発光反応で生じる発光の波長についての 遮光性を有することを特徴とする請求項 1 7に記載の分析キッ ト。
1 9 . 前記発光反応のための試薬は、 ノレミノール、 ジォキセタン、 過シ 5 ユウ酸エステノレ、 グノレコース、 ）3— D—ガラク トシノレ、 グルコース一 6— リ ン酸、 ルシゲニン、 ァスコルビン酸リ ン酸エステル、 アデノシン三リ ン 酸 （A T P ) 、 ルシフェリ ン若しくはこれらの誘導体、 又はカルシウムィ - オンを含むことを特徴とする請求項 1 7に記載の分析キッ ト。
2 0 . 前記発光反応のための試薬は、 さらに酸化剤又は酸素添加剤を含 10 むことを特徴とする請求項 1 9に記載の分析キッ ト。
2 1 . 前記発光反応のための試薬は、 ノレミノール若しくはその誘導体と、 酸化剤若しくは酸素添加剤とを含むことを特徴とする請求項 1 7に記載の 分析キッ ト。
2 2 . 前記酸化剤が、 過酸化水素又はアルキルハイ ドロパーォキサイ ド 15 を含む過酸である請求項 2 1に記載の分析キッ ト。
2 3 . 前記発光反応のための試薬は、 さらに発光増感剤を含むことを特 徴とする請求項 1 7に記載の分析キッ ト。 ―
2 4 . プローブを少なく とも一部に固定した固相を収めた細管へ液体を 導入及び/又は導出するための送液部と、
20 試料を収めるための第 1の容器と、
発光反応のための試薬を収めるための第 2の容器と、
前記固相の任意の部位を光学的に検出するための検出部とを有し、 前記第 1の容器と前記第 2の容器とは前記送液部に連結することを特徴 とする分析装置。
25 2 5 . 前記固相は粒子であり、 前記検出部は測定対象の前記粒子の近傍 に一方の端部を配置された光ファイバ一であることを特徴とする請求項 2 4に記載の分析装置。
2 6 . 前記送液部は、 複数の前記細管を各々連結させる接続部を有する ことを特徴とする請求項 2 4に記載の分析装置。
2 7 . 前記検出部は、 前記細管に対して相 的に移動することを特徴と する請求項 2 4に記載の分析装置。
2 8 . 前記固相は複数の粒子であり、 前記複数の粒子は、 前記プローブ を固定した複数の第 1粒子と前記複数の第 1粒子の各々の間に配置されか つ前記プローブが固定されない複数の第 2粒子とからなることを特徴とす る請求項 2 4に記載の分析装置。
2 9 . 前記細管と前記検出部との間の位置に、 偏光板を有することを特 徴とする請求項 2 4に記載の分析装置。
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