CN104076153A - 一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统及其应用 - Google Patents
一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104076153A CN104076153A CN201410203085.3A CN201410203085A CN104076153A CN 104076153 A CN104076153 A CN 104076153A CN 201410203085 A CN201410203085 A CN 201410203085A CN 104076153 A CN104076153 A CN 104076153A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- signal system
- invertase
- microorganism
- antibody
- active function
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56938—Staphylococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/10—Enterobacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/14—Streptococcus; Staphylococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
Abstract
本发明涉及生物化学物质的检测和分析领域,具体的说是一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统及其应用。信号系统为结合有特异性的功能分子的蔗糖酶。所述信号系统作为信号探针用于生物分析领域中对生物分子进行检测。本发明利用活性功能分子标记蔗糖酶生物分子,用其检测检测控制生物分子浓度的变化,能够快速检测对微生物和细胞。相对于传统的酶联免疫反应吸附的测量,利用便携式血糖仪分析系统来快速检测和分析生物分子具有显著的特异性,同时准确性高。利用活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统来快速检测和分析生物分子,具有稳定性好、灵敏度高,不容易失活,价格便宜等优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学物质的检测和分析领域,具体的说是一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统及其应用。
背景技术
在环境安全检测和人体健康的监控中,许多生物靶点分子的含量非常低。很多生物信号分子、有害微生物或肿瘤细胞在初期浓度非常低,需要对靶点物质进行信号放大才可以检测分析。目前,研究者们已经发现了集中几种信号放大的技术来检测低丰度靶点,包括银增加强反应、酪氨酸信号放大、酶金属矿化和滚环放大报告系统。银增强反应基于纳米金催化沉淀银,从而来检测核酸、蛋白质和微生物等有害物质(Wan,Y.,Wang,Y.,Wu,J.,Zhang,D.,2011b.Analytical Chemistry83(3),648-653;Taton,T.A.,Mirkin,C.A.,Letsinger,R.L.,2000.Science289(5485),1757-1760.)。相对银增强的技术来说,替代的方案用过氧化物酶来催化银的沉淀,这种方法叫酶矿化技术(R.,Powell,R.D.,Hainfeld,J.F.,Fritzsche,W.,2005.Nano Letters5(7),1475-1482)。最近出现一种超灵敏的技术,结合氢化酶标记的酶联免疫反应来控制纳米金生成过程,产生肉眼可见的信号(de la Rica,R.,Stevens,M.M.,2012.Nature Nanotechnology doi:10.1038/nnano.2012.186),来分析生物靶点物质。酪氨酸信号放大系统结合生物沉淀和荧光标记来增强标准免疫反应的灵敏度(Clutter,M.R.,Heffner,G.C.,Krutzik,P.O.,Sachen,K.L.,Nolan,G.P.,2010.Cytometry Part A77A(11),1020-1031)。滚环放大技术是一种恒温核酸扩增方法,在RCA反应中,DNA目标链可沿环形探针顶替扩增,实现高灵敏度的检测;同时环形探针的链接成环对DNA单碱基错配有很高的特异性,适合单核苷酸突变的分析检测。
聚合物信号标记也得到了广泛的应用和发展。比如,Chan等报道一种聚合物与半导体量子点杂合的信号标记物,再用亲和素修饰得到相应的标记物来标记肿瘤细胞(Chan,Y.-H.;Ye,F.;Gallina,M.E.;Zhang,X.;Jin,Y.;Wu,I.C.;Chiu,D.T.,Hybrid Semiconducting Polymer Dot-Quantum Dot with Narrow-Band Emission,Near-Infrared Fluorescence,and High Brightness.Journal of the American Chemical Society2012,134,7309-7312.)。
酶标的分析检测一直以来都得到生化学家的关注和亲睐。比如辣根过氧化物用于酶联免疫反应、碱性磷酸酶用于生物化学组织染色,最近的氢化酶也用于超灵敏的分析和检测。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统及其应用。
为实现上述目的,本发明采用技术方案为:
一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统,信号系统为结合有特异性的功能分子的蔗糖酶。
所述特异性的功能分子为凝集素、微生物抗体、微生物适配体、抗生素、寡糖、适配体或D-型氨基酸。
所述凝集素为麦胚素、刀豆素、花生凝集素或大豆凝集素。
所述微生物抗体为大肠杆菌抗体、金黄色葡萄球菌抗体、爱德华迟缓细菌抗体、铜绿假单胞菌抗体或费氏弧菌抗体。
所述抗生素为万古霉素、多粘菌素、达托霉素或枯草杆菌肽。
所述寡糖为括棉籽糖、水苏糖、麦芽寡糖或大豆寡糖。
所述D-型氨基酸为D-丙氨酸或D-谷氨酸。
一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统的应用,所述信号系统作为信号探针用于生物分析领域中对生物分子进行检测。
所述所述信号系统作为信号探针定量和/定性的对微生物和细胞进行检测。
所述所述信号系统作为血糖仪分析系统中的信号探针定量和/定性的对微生物和细胞进行检测。
本发明所具有的优点:
本发明利用活性分子(微生物抗体、凝集素、微生物适配体、抗生素、寡糖)标记的蔗糖酶系统来快速检测和分析微生物细胞,用其检测检测控制生物分子浓度的变化,能够快速检测对微生物和细胞。同时将本发明信号系统应用于便携式血糖仪系统中,能够对微生物快速检测。其相对于传统的酶联免疫反应吸附的测量,利用信号标记系统来快速检测和分析生物分子具有显著的特异性,同时准确性高。利用活性功能小分子标记信号系统来快速检测和分析生物分子,具有稳定性好、灵敏度高,不容易失活,价格便宜等优势。
附图说明
图1为本发明实施例提供的基于适配体标记蔗糖酶快速便携式血糖仪诊断示意图(a),比较不同模式下检测信号(b):单独微生物存在(1),微生物加蔗糖(2),微生物-蔗糖标记适配体与蔗糖培育pH7.4(3)和微生物-蔗糖标记适配体与蔗糖培育pH4.5(4)。
图2为本发明实施例提供的微生物-适配体蔗糖酶复合物在不同p H条件培育信号变化(a)、微生物-适配体蔗糖酶复合物在不同温度条件培育信号变化(b)、微生物与适配体蔗糖酶复合物培育不同时间变化的信号变化(c)和微生物与适配体蔗糖酶复合物和蔗糖培育不同时间的信号变化(d)。
图3为本发明实施例提供的便携式血糖仪系统对金黄色葡萄球菌和迟 缓爱德华菌检测的线性关系(a),快速分析八种微生物的信号特异性(b)和细菌混合的信号变化影响(c)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1:
万古霉素功能化的蔗糖酶对微生物的检测功能:
万古霉素-蔗糖酶复合物的制备:0.1ml聚乙二醇(5%)和0.1ml HEPES缓冲液(1mol L-1)分别加入到5ml蔗糖酶溶液中。而后再将0.5ml万古霉素(5mg mL-1)接着加入,搅拌混合体系30min。然后,再将新鲜配置的0.1ml1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC(5mg mL-1)加入混合液中搅拌2小时。反应的混合物在透析袋(截留分子量300)中透析2天,移除未交联的分子。再加入50μL Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)(2.0wt%);即得到万古霉素-蔗糖酶复合物。
微生物标记检测:金黄色葡萄球用PBS缓冲液清洗两次。再与万古霉素-蔗糖酶复合物(5μg mL-1)室温下培育0.5小时。过量未结合的万古霉素-蔗糖酶复合物用PBS清洗两次,再加入0.5mol L-1蔗糖(pH4.5),培育0.5h,取40μL混合液,用1.1μL的NaOH(1M)调节p H到中性。得到的溶液取5μL用罗氏血糖仪检测(参见图1a)。这种方法首先在蔗糖酶最优化的p H(4.5)条件下催化蔗糖分解,然后用氢氧化钠调节到中性,用便携式血糖仪来检测微生物。大肠杆菌的检测线为4.5×103cfu ml-1,线性范围为4.5×104cfu ml-1—4.5×109cfu ml-1。
实施例2:
金黄色葡萄球菌适配体功能化的蔗糖酶对微生物的检测功能:
50μL氨基修饰金黄色葡萄球菌适配体(1mM)与25μL硼酸缓冲液(pH9.2)。然后加入25mg PPD,在室温下反应2h。然后加入5mL水and5mL正丁醇反应15min,有机溶液被移除。用超滤离心管(Amicon Ultra-10K)纯化活化的适配体。再加入8mg蔗糖酶,使其在室温下反应2天,用超滤离心管(Amicon Ultra-100K)纯化,获得适配体标记蔗糖酶。
微生物标记检测:金黄色葡萄球菌用PBS缓冲液清洗两次。再与金黄色葡萄球菌适配体-蔗糖酶复合物(5μg mL-1)室温下培育0.5小时。过量未结合的金黄色葡萄球菌适配体-蔗糖酶复合物用PBS清洗两次,再加入0.5mol L-1蔗糖(pH4.5),培育0.5h,取40μL混合液,用1.1μL的NaOH(1M)调节p H到中性。得到的溶液取5μL用罗氏血糖仪检测(参见图1a)。这种方法首先在蔗糖酶最优化的p H(4.5)条件下催化蔗糖分解,然后用氢氧化钠调节到中性,用便携式血糖仪来检测微生物。检测线为3.0×103cfu ml-1,线性范围为3.0×104cfu ml-1—3.0×109cfu ml-1。
实施例3:
微生物抗体功能化的蔗糖酶对微生物的检测功能:
50μL大肠杆菌抗体(1mM)。然后加入5mg马来酸和琥珀酸功能化的乙二醇交联剂,在室温下反应2h。用超滤离心管(Amicon Ultra-10K)纯化活化的抗体。再加入8mg蔗糖酶,使其在室温下反应2天,用超滤离心管(Amicon Ultra-100K)纯化,获得抗体标记蔗糖酶。
微生物标记检测:大肠杆菌用PBS缓冲液清洗两次。再与大肠杆菌抗体-蔗糖酶复合物(5μg mL-1)室温下培育0.5小时。过量未结合的大肠杆菌抗体-蔗糖酶复合物用PBS清洗两次,再加入0.5mol L-1蔗糖(pH4.5),培育0.5h,取40μL混合液,用1.1μL的NaOH(1M)调节p H到中性。得到的溶液取5μL用罗氏血糖仪检测(参见图1a)。这种方法首先在蔗糖酶最优化的p H(4.5)条件下催化蔗糖分解,然后用氢氧化钠调节到中性,用便携式血糖仪来检测微生物。大肠杆菌的检测线为2.7×103cfu ml-1,线性范围为2.7×104cfu ml-1—2.7×109cfu ml-1。
实施例4:
微生物凝集素功能化的蔗糖酶对微生物的检测功能:
50μL凝集素(1mM)。然后加入5mg马来酸和琥珀酸功能化的乙二醇交联剂,在室温下反应2h。用超滤离心管(Amicon Ultra-10K)纯化活化的抗体。再加入8mg蔗糖酶,使其在室温下反应2天,用超滤离心管(Amicon Ultra-100K)纯化,获得凝集素标记蔗糖酶。
微生物标记检测:大肠杆菌用PBS缓冲液清洗两次。再与凝集素-蔗糖酶复合物(5μg mL-1)室温下培育0.5小时。过量未结合的凝集素-蔗糖酶复合物用PBS清洗两次,再加入0.5mol L-1蔗糖(pH4.5),培育0.5h,取40μL混合液,用1.1μL的NaOH(1M)调节p H到中性。得到的溶液取5μL用罗氏血糖仪检测(参见图1a)。这种方法首先在蔗糖酶最优化的p H(4.5)条件下催化蔗糖分解,然后用氢氧化钠调节到中性,用便携式血糖仪来检测微生物。检测线为3.6×103cfu ml-1,线性范围为3.6×104cfu ml-1—3.6×109cfu ml-1。
实施例5:
微生物抗体功能化的蔗糖酶对微生物的检测功能:
50μL金黄色葡萄球菌抗体(1mM)。然后加入5mg马来酸和琥珀酸功能化的乙二醇交联剂,在室温下反应2h。用超滤离心管(Amicon Ultra-10K)纯化活化的抗体。再加入8mg蔗糖酶,使其在室温下反应2天,用超滤离心管(Amicon Ultra-100K)纯化,获得金黄色葡萄球菌抗体标记蔗糖酶。
微生物标记检测:金黄色葡萄球菌用PBS缓冲液清洗两次。再与金黄色葡萄球菌抗体-蔗糖酶复合物(5μg mL-1)室温下培育0.5小时。过量未结合的金黄色葡萄球菌抗体-蔗糖酶复合物用PBS清洗两次,再加入0.5mol L-1蔗糖(pH4.5),培育0.5h,取40μL混合液,用1.1μL的NaOH(1M)调节p H到中性。得到的溶液取5μL用罗氏血糖仪检测(参见图1a)。 这种方法首先在蔗糖酶最优化的p H(4.5)条件下催化蔗糖分解,然后用氢氧化钠调节到中性,用便携式血糖仪来检测微生物。检测线为1.5×103cfu ml-1,线性范围为1.5×104cfu ml-1—1.5×109cfu ml-1。
实施例6:
微生物抗体功能化的蔗糖酶对微生物的检测功能:
50μL爱德华迟缓细菌抗体(1mM)。然后加入5mg马来酸和琥珀酸功能化的乙二醇交联剂,在室温下反应2h。用超滤离心管(Amicon Ultra-10K)纯化活化的抗体。再加入8mg蔗糖酶,使其在室温下反应2天,用超滤离心管(Amicon Ultra-100K)纯化,获得爱德华迟缓细菌抗体标记蔗糖酶。
微生物标记检测:爱德华迟缓细菌用PBS缓冲液清洗两次。再与爱德华迟缓细菌抗体-蔗糖酶复合物(5μg mL-1)室温下培育0.5小时。过量未结合的爱德华迟缓细菌抗体-蔗糖酶复合物用PBS清洗两次,再加入0.5mol L-1蔗糖(pH4.5),培育0.5h,取40μL混合液,用1.1μL的NaOH(1M)调节p H到中性。得到的溶液取5μL用罗氏血糖仪检测(参见图1a)。这种方法首先在蔗糖酶最优化的p H(4.5)条件下催化蔗糖分解,然后用氢氧化钠调节到中性,用便携式血糖仪来检测微生物。检测线为2.0×103cfu ml-1,线性范围为2.0×104cfu ml-1—2.0×108cfu ml-1。
实施例7:
微生物抗体功能化的蔗糖酶对微生物的检测功能:
50μL铜绿假单胞菌细菌抗体(1mM)。然后加入5mg马来酸和琥珀酸功能化的乙二醇交联剂,在室温下反应2h。用超滤离心管(Amicon Ultra-10K)纯化活化的抗体。再加入8mg蔗糖酶,使其在室温下反应2天,用超滤离心管(Amicon Ultra-100K)纯化,获得铜绿假单胞菌抗体标记蔗糖酶。
微生物标记检测:铜绿假单胞菌用PBS缓冲液清洗两次。再与铜绿假单胞菌细菌抗体-蔗糖酶复合物(5μg mL-1)室温下培育0.5小时。过量未结合的铜绿假单胞菌细菌抗体-蔗糖酶复合物用PBS清洗两次,再加入0.5mol L-1蔗糖(pH4.5),培育0.5h,取40μL混合液,用1.1μL的NaOH(1M)调节p H到中性。得到的溶液取5μL用罗氏血糖仪检测(参见图1a)。这种方法首先在蔗糖酶最优化的p H(4.5)条件下催化蔗糖分解,然后用氢氧化钠调节到中性,用便携式血糖仪来检测微生物。检测线为5.5×103cfu ml-1,线性范围为5.5×105cfu ml-1—5.5×109cfu ml-1。
实施例8:
微生物抗体功能化的蔗糖酶对微生物的检测功能:
50μL费氏弧菌细菌抗体(1mM)。然后加入5mg马来酸和琥珀酸功能化的乙二醇交联剂,在室温下反应2h。用超滤离心管(Amicon Ultra-10K)纯化活化的抗体。再加入8mg蔗糖酶,使其在室温下反应2天, 用超滤离心管(Amicon Ultra-100K)纯化,获得费氏弧菌抗体标记蔗糖酶。
微生物标记检测:费氏弧菌用PBS缓冲液清洗两次。再与费氏弧菌细菌抗体-蔗糖酶复合物(5μg mL-1)室温下培育0.5小时。过量未结合的费氏弧菌细菌抗体-蔗糖酶复合物用PBS清洗两次,再加入0.5mol L-1蔗糖(pH4.5),培育0.5h,取40μL混合液,用1.1μL的NaOH(1M)调节p H到中性。得到的溶液取5μL用罗氏血糖仪检测(参见图1a)。这种方法首先在蔗糖酶最优化的p H(4.5)条件下催化蔗糖分解,然后用氢氧化钠调节到中性,用便携式血糖仪来检测微生物。检测线为6.5×103cfu ml-1,线性范围为6.5×104cfu ml-1—6.5×109cfu ml-1。
实施例9:
大肠杆菌适配体功能化的蔗糖酶对微生物的检测功能:
50μL氨基修饰大肠杆菌适配体(1mM)与25μL硼酸缓冲液(pH9.2)。然后加入25mg PPD,在室温下反应2h。然后加入5mL水and5mL正丁醇反应15min,有机溶液被移除。用超滤离心管(Amicon Ultra-10K)纯化活化的适配体。再加入8mg蔗糖酶,使其在室温下反应2天,用超滤离心管(Amicon Ultra-100K)纯化,获得适配体标记蔗糖酶。
微生物标记检测:大肠杆菌用PBS缓冲液清洗两次。再与大肠杆菌适配体-蔗糖酶复合物(5μg mL-1)室温下培育0.5小时。过量未结合的大肠杆菌适配体-蔗糖酶复合物用PBS清洗两次,再加入0.5mol L-1蔗糖(pH4.5),培育0.5h,取40μL混合液,用1.1μL的NaOH(1M)调节p H到中性。得到的溶液取5μL用罗氏血糖仪检测(参见图1a)。这种方法首先在蔗糖酶最优化的p H(4.5)条件下催化蔗糖分解,然后用氢氧化钠调节到中性,用便携式血糖仪来检测微生物。检测线为7.2×102cfu ml-1,线性范围为7.2×104cfu ml-1—7.2×107cfu ml-1。
实施例10:
爱德华迟缓细菌适配体功能化的蔗糖酶对微生物的检测功能:
50μL氨基修饰爱德华迟缓细菌适配体(1mM)与25μL硼酸缓冲液(pH9.2)。然后加入25mg PPD,在室温下反应2h。然后加入5mL水and5mL正丁醇反应15min,有机溶液被移除。用超滤离心管(Amicon Ultra-10K)纯化活化的适配体。再加入8mg蔗糖酶,使其在室温下反应2天,用超滤离心管(Amicon Ultra-100K)纯化,获得适配体标记蔗糖酶。
微生物标记检测:爱德华迟缓细菌用PBS缓冲液清洗两次。再与爱德华迟缓细菌适配体-蔗糖酶复合物(5μg mL-1)室温下培育0.5小时。过量未结合的爱德华迟缓细菌适配体-蔗糖酶复合物用PBS清洗两次,再加入0.5mol L-1蔗糖(pH4.5),培育0.5h,取40μL混合液,用1.1μL的NaOH(1M)调节p H到中性。得到的溶液取5μL用罗氏血糖仪检测(参见图1a)。这种方法首先在蔗糖酶最优化的p H(4.5)条件下催化蔗糖分解,然后用氢氧化钠调节到中性,用便携式血糖仪来检测微生物。检测线为6.5×103cfu ml-1,线性范围为6.5×104cfu ml-1—6.5×107cfu ml-1。
Claims (10)
1.一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统,其特征在于:信号系统为结合有特异性的功能分子的蔗糖酶。
2.按权利要求1所述的基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统,其特征在于:所述特异性的功能分子为凝集素、微生物抗体、微生物适配体、抗生素、寡糖、适配体或D-型氨基酸。
3.按权利要求2所述的基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统,其特征在于:所述凝集素为麦胚素、刀豆素、花生凝集素或大豆凝集素。
4.按权利要求2所述的基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统,其特征在于:所述微生物抗体为大肠杆菌抗体、金黄色葡萄球菌抗体、爱德华迟缓细菌抗体、铜绿假单胞菌抗体或费氏弧菌抗体。
5.按权利要求2所述的基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统,其特征在于:所述抗生素为万古霉素、多粘菌素、达托霉素或枯草杆菌肽。
6.按权利要求2所述的基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统,其特征在于:所述寡糖为括棉籽糖、水苏糖、麦芽寡糖或大豆寡糖。
7.按权利要求2所述的基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统,其特征在于:所述D-型氨基酸为D-丙氨酸或D-谷氨酸。
8.一种权利要求1所述的基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统的应用,其特征在于:所述信号系统作为信号探针用于生物分析领域中对生物分子进行检测。
9.按权利要求8所述的基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统的应用,其特征在于:所述信号系统作为信号探针定量和/定性的对微生物和细胞进行检测。
10.按权利要求8所述的基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统的应用,其特征在于:所述信号系统作为血糖仪分析系统中的信号探针定量和/定性的对微生物和细胞进行检测。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410203085.3A CN104076153A (zh) | 2014-05-14 | 2014-05-14 | 一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410203085.3A CN104076153A (zh) | 2014-05-14 | 2014-05-14 | 一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104076153A true CN104076153A (zh) | 2014-10-01 |
Family
ID=51597554
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410203085.3A Pending CN104076153A (zh) | 2014-05-14 | 2014-05-14 | 一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104076153A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110078832A (zh) * | 2019-04-18 | 2019-08-02 | 江南大学 | 一类基于ZZ domain的广谱二抗及其制备方法和应用 |
CN110128540A (zh) * | 2019-04-18 | 2019-08-16 | 江南大学 | 一种基于便携式血糖仪的广谱二抗 |
CN111272945A (zh) * | 2020-02-28 | 2020-06-12 | 中国科学院海洋研究所 | 一种d-氨基酸检测试剂盒及其检测方法 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1985004903A1 (en) * | 1984-04-23 | 1985-11-07 | United States Of America, Represented By The Unite | Isolation of proteins of htlv-iii, serological detection of antibodies to htlv-iii in sera of patients with aids and pre-aids conditions, and detection of htlv-iii infection by immuno-assays using htlv-iii and its proteins |
JPS6273164A (ja) * | 1985-09-27 | 1987-04-03 | Sankyo Co Ltd | 酵素免疫測定法 |
WO2005054860A1 (en) * | 2003-12-01 | 2005-06-16 | Dako Denmark A/S | Methods and compositions for immuno-histochemical detection |
CN101180530A (zh) * | 2005-05-20 | 2008-05-14 | 日立化成工业株式会社 | 生物化学物质的分析方法 |
CN102384974A (zh) * | 2011-07-22 | 2012-03-21 | 中国科学院海洋研究所 | 一种过渡金属氧化物的应用 |
CN103025885A (zh) * | 2010-05-26 | 2013-04-03 | 伊利诺伊大学评议会 | 用于检测和定量宽范围分析物的个人葡萄糖计 |
CN103760343A (zh) * | 2014-01-16 | 2014-04-30 | 山东省城市供排水水质监测中心 | 一种基于便携式血糖仪的水中微囊藻毒素的快速检测方法 |
-
2014
- 2014-05-14 CN CN201410203085.3A patent/CN104076153A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1985004903A1 (en) * | 1984-04-23 | 1985-11-07 | United States Of America, Represented By The Unite | Isolation of proteins of htlv-iii, serological detection of antibodies to htlv-iii in sera of patients with aids and pre-aids conditions, and detection of htlv-iii infection by immuno-assays using htlv-iii and its proteins |
JPS6273164A (ja) * | 1985-09-27 | 1987-04-03 | Sankyo Co Ltd | 酵素免疫測定法 |
WO2005054860A1 (en) * | 2003-12-01 | 2005-06-16 | Dako Denmark A/S | Methods and compositions for immuno-histochemical detection |
CN101180530A (zh) * | 2005-05-20 | 2008-05-14 | 日立化成工业株式会社 | 生物化学物质的分析方法 |
CN103025885A (zh) * | 2010-05-26 | 2013-04-03 | 伊利诺伊大学评议会 | 用于检测和定量宽范围分析物的个人葡萄糖计 |
CN102384974A (zh) * | 2011-07-22 | 2012-03-21 | 中国科学院海洋研究所 | 一种过渡金属氧化物的应用 |
CN103760343A (zh) * | 2014-01-16 | 2014-04-30 | 山东省城市供排水水质监测中心 | 一种基于便携式血糖仪的水中微囊藻毒素的快速检测方法 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110078832A (zh) * | 2019-04-18 | 2019-08-02 | 江南大学 | 一类基于ZZ domain的广谱二抗及其制备方法和应用 |
CN110128540A (zh) * | 2019-04-18 | 2019-08-16 | 江南大学 | 一种基于便携式血糖仪的广谱二抗 |
CN111272945A (zh) * | 2020-02-28 | 2020-06-12 | 中国科学院海洋研究所 | 一种d-氨基酸检测试剂盒及其检测方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zhou et al. | Fiber optic surface plasmon resonance sensor for detection of E. coli O157: H7 based on antimicrobial peptides and AgNPs-rGO | |
Jung et al. | Hydrogel based biosensors for in vitro diagnostics of biochemicals, proteins, and genes | |
Tang et al. | Detection methods for Pseudomonas aeruginosa: history and future perspective | |
Bu et al. | Ultrasensitive detection of pathogenic bacteria by CRISPR/Cas12a coupling with a primer exchange reaction | |
Gill et al. | Nanomaterial-based optical and electrochemical techniques for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a review | |
Xu et al. | Nucleic acid biosensor synthesis of an all-in-one universal blocking linker recombinase polymerase amplification with a peptide nucleic acid-based lateral flow device for ultrasensitive detection of food pathogens | |
Baeumner et al. | Detection of Viable Oocysts of Cryptosporidium p arvum Following Nucleic Acid Sequence Based Amplification | |
CN103424448B (zh) | 一种电化学适配体传感器检测痕量赭曲霉毒素a的方法 | |
Perry‐O’Keefe et al. | Filter‐based PNA in situ hybridization for rapid detection, identification and enumeration of specific micro‐organisms | |
Zhang et al. | Low-cost and highly efficient DNA biosensor for heavy metal ion using specific DNAzyme-modified microplate and portable glucometer-based detection mode | |
Yang et al. | A novel smartphone-based colorimetric aptasensor for on-site detection of Escherichia coli O157: H7 in milk | |
JP6005053B2 (ja) | 微生物の検出および定量方法 | |
Tsai et al. | Fluorescent double-stranded DNA-templated copper nanoprobes for rapid diagnosis of tuberculosis | |
CN104076153A (zh) | 一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统及其应用 | |
Bahavarnia et al. | DNA based biosensing of Acinetobacter baumannii using nanoparticles aggregation method | |
Wang et al. | A broad-range method to detect genomic DNA of multiple pathogenic bacteria based on the aggregation strategy of gold nanorods | |
Jiang et al. | Amperometric genosensor for culture independent bacterial count | |
Cao et al. | An ultrasensitive biosensor for virulence ompA gene of Cronobacter sakazakii based on boron doped carbon quantum dots-AuNPs nanozyme and exonuclease III-assisted target-recycling strategy | |
Han et al. | Localized surface plasmon-enhanced electrochemiluminescence biosensor for rapid, label-free, and single-step detection of broad-spectrum bacteria using urchin-like Au and Ag nanoparticles | |
Wu et al. | Combination of DNA walker and Pb2+-specific DNAzyme-based signal amplification with a signal-off electrochemical DNA sensor for Staphylococcus aureus detection | |
Kumaragurubaran et al. | Nanocatalyst coupled with a latent-ratiometric electrochemical switch for label-free zero-tolerance rapid detection of live Salmonella in whole blood samples | |
Jiang et al. | Simple and rapid detection Aspergillus fumigatus by loop‐mediated isothermal amplification coupled with lateral flow biosensor assay | |
DE69840571D1 (de) | Diagnostische mikrobiologische testvorrichtung und verfahren | |
EP3781701B1 (en) | Detection of bacteria | |
Xu et al. | Sandwich capture ultrasensitive sensor based on biohybrid interface for the detection of Cronobacter sakazakii |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141001 |