JPS6273164A - 酵素免疫測定法 - Google Patents
酵素免疫測定法Info
- Publication number
- JPS6273164A JPS6273164A JP21433685A JP21433685A JPS6273164A JP S6273164 A JPS6273164 A JP S6273164A JP 21433685 A JP21433685 A JP 21433685A JP 21433685 A JP21433685 A JP 21433685A JP S6273164 A JPS6273164 A JP S6273164A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reaction
- invertase
- solution
- enzyme
- lucigenin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は班規な酵素免疫測定法に関するものである。
抗原抗体反応全利用して、生体内の微墳の物質奮定伍す
る方法とじてを工、螢光免疫測定法（ＦＩＡ） 、放射
免疫測定法（ＲＩＡ） 、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）な
ど種々の方法が使用されていた。なかでも高感度で足置
できるＲＩＡが使用されていた。しかしながら、同位元
素標識化合物に不安定なものが多いこと１人体に対する
危険性および環境汚染の立場からその取り扱いが厳しく
廃棄が困難であることなど、問題点が多い。そこで最近
になって、安全性に問題がなく、実験室の制約もなく、
また４（１ｊ定に１更用δれる物質も比較的安定に保存
でさ、操作も比較的容易である訂Ａが注目された。とく
に、標識として使用される酵素の活性の麹−１定におい
て、ＲＩＡに匹敵する高感度の測定法、即ち螢光反応や
発元皮応？利用する方法が開発ざｒしるに到り、更に重
要視され、広く利用されはじめた。
る方法とじてを工、螢光免疫測定法（ＦＩＡ） 、放射
免疫測定法（ＲＩＡ） 、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）な
ど種々の方法が使用されていた。なかでも高感度で足置
できるＲＩＡが使用されていた。しかしながら、同位元
素標識化合物に不安定なものが多いこと１人体に対する
危険性および環境汚染の立場からその取り扱いが厳しく
廃棄が困難であることなど、問題点が多い。そこで最近
になって、安全性に問題がなく、実験室の制約もなく、
また４（１ｊ定に１更用δれる物質も比較的安定に保存
でさ、操作も比較的容易である訂Ａが注目された。とく
に、標識として使用される酵素の活性の麹−１定におい
て、ＲＩＡに匹敵する高感度の測定法、即ち螢光反応や
発元皮応？利用する方法が開発ざｒしるに到り、更に重
要視され、広く利用されはじめた。
従来利用されている王な酵素としては、ホースラデイシ
・パーオそシダーゼ、グルコース・オキシダーゼ、アル
カリン・ホスファターゼ、β−がラクトシダーゼなどが
あげられる。
・パーオそシダーゼ、グルコース・オキシダーゼ、アル
カリン・ホスファターゼ、β−がラクトシダーゼなどが
あげられる。
前記のように、ＥＩＡが広汎に利用されるようになると
、標識となる酵素について、入手が容易で且つ標識とし
て好−ましい性質？有する酵素の探紫が必要となつｔｏ 〔問題点を解決するための手段」 本発明者は、前記条件に適合する酵素につき鋭意研究・
と重ねた結果、インベルターゼ全利用する方法全見出し
、本発明全完成した。
、標識となる酵素について、入手が容易で且つ標識とし
て好−ましい性質？有する酵素の探紫が必要となつｔｏ 〔問題点を解決するための手段」 本発明者は、前記条件に適合する酵素につき鋭意研究・
と重ねた結果、インベルターゼ全利用する方法全見出し
、本発明全完成した。
本発明に係る酵素免役測定法の特徴とするところは、Ｗ
−ｉＪ酵素としてインベルターゼ金使用することである
。
−ｉＪ酵素としてインベルターゼ金使用することである
。
醇累免疫測定の手法自体は、既知の方法全適用してなｌ
一つる。例えば、辿］足対象のり質（抗原）ｒインベル
ターゼで６識し、対応する抗体との反応ケ検体中の抗原
と競合させ、次に予め固相化された先の抗体に対応する
第２抗体と反尾・嘔せで、１ん相上の酵素？定筋すあ方
法（競合法）；測定対象とする抗原ケ、予め固相化され
た対応する抗体と反応させ、次いで該酵素で標ａきれた
（抗原に）対応する抗体と反応させて、固相上の酵素で
定量する方法（サンドイツチ法）などがあげられるが、
これら以外の従来便用嘔れる方法に適用することができ
る。前記２法のうち、前者に低分子の物質例えばサイロ
キシン、トリヨードサイロニン、エストリオール、プロ
ゲステロン、コルチゾールなどへの適用に工く、後者レ
エ例えばインシュリン、ＨＰＬ、ＨＣＧ、α−フェトプ
ロティン、カルチノエンブリオ抗原、フェリチン、β−
ミクログロブリン、ＨＢｓＡｇ、ＩｇＧ、 ＩｇＭ、
ＩｇＡ、 ＸｇＦ、などの高分子の物質の定量に好適で
ある。物質の酵素による標識は、従来他の酵素で使用さ
れている常法例えば活性エステル法などに工っで行なわ
れる〔酵素免疫測定法（昭和５７年、医学書院発行）等
参照〕。
一つる。例えば、辿］足対象のり質（抗原）ｒインベル
ターゼで６識し、対応する抗体との反応ケ検体中の抗原
と競合させ、次に予め固相化された先の抗体に対応する
第２抗体と反尾・嘔せで、１ん相上の酵素？定筋すあ方
法（競合法）；測定対象とする抗原ケ、予め固相化され
た対応する抗体と反応させ、次いで該酵素で標ａきれた
（抗原に）対応する抗体と反応させて、固相上の酵素で
定量する方法（サンドイツチ法）などがあげられるが、
これら以外の従来便用嘔れる方法に適用することができ
る。前記２法のうち、前者に低分子の物質例えばサイロ
キシン、トリヨードサイロニン、エストリオール、プロ
ゲステロン、コルチゾールなどへの適用に工く、後者レ
エ例えばインシュリン、ＨＰＬ、ＨＣＧ、α−フェトプ
ロティン、カルチノエンブリオ抗原、フェリチン、β−
ミクログロブリン、ＨＢｓＡｇ、ＩｇＧ、 ＩｇＭ、
ＩｇＡ、 ＸｇＦ、などの高分子の物質の定量に好適で
ある。物質の酵素による標識は、従来他の酵素で使用さ
れている常法例えば活性エステル法などに工っで行なわ
れる〔酵素免疫測定法（昭和５７年、医学書院発行）等
参照〕。
標識酵素としてのインベルターゼの定量は、該酵素に対
する通常の測定と同様、シュクロースｒ基ｆ１として酵
素反応を行なわしめ、遊離されるヘキソースを定量する
。定量方法としては、ヘキソキナーゼやグルコース・６
−リン酸デヒドロゲナーゼを組合せて測定する常法もあ
るが、下記のように、シュクロースのび累分解によって
生ずる還元糖ｔ、ルシゲニンと組合せて、発光法に工っ
で測定するのが面接的であり簡便である。
する通常の測定と同様、シュクロースｒ基ｆ１として酵
素反応を行なわしめ、遊離されるヘキソースを定量する
。定量方法としては、ヘキソキナーゼやグルコース・６
−リン酸デヒドロゲナーゼを組合せて測定する常法もあ
るが、下記のように、シュクロースのび累分解によって
生ずる還元糖ｔ、ルシゲニンと組合せて、発光法に工っ
で測定するのが面接的であり簡便である。
酵素反応
インベルターゼ
シュクロース
水
グルコース ＋ フラクトース
発光反応
ルシフエニン
〔実施例〕
次に試験法お↓び実施例？ろシすて本兄明の方法を史に
具体的に説明するが、本発明Ｑ工これによって限定され
るものではない。
具体的に説明するが、本発明Ｑ工これによって限定され
るものではない。
インベルターゼ活性測定法：
インベルターゼ？含む検ｉ［２０μ！、基質シュクロー
ス溶ｉ（０，３ｔａ濃度でｐＨ５，０の０．２５Ｍ酢酸
緩衝液に浴かし几溶液）２５μｔお工び０．２５１．／
ｌ酢酸緩衝？ｌｉ（μｍ５．０）５０μｔ？カルチヤチ
ユーブにとり、４℃で一夜放直し反応させる。反応後、
Ｄ、５）ノリン酸瑳衝液（ＰＨ７，０）１００μｔを加
え、沸騰水浴中に２分間浸して酵素反応を停止させる。
ス溶ｉ（０，３ｔａ濃度でｐＨ５，０の０．２５Ｍ酢酸
緩衝液に浴かし几溶液）２５μｔお工び０．２５１．／
ｌ酢酸緩衝？ｌｉ（μｍ５．０）５０μｔ？カルチヤチ
ユーブにとり、４℃で一夜放直し反応させる。反応後、
Ｄ、５）ノリン酸瑳衝液（ＰＨ７，０）１００μｔを加
え、沸騰水浴中に２分間浸して酵素反応を停止させる。
反応チューブケ氷浴水で冷却し友後、反応混液１００μ
ｔ２とり、ルシゲニン試薬（０，００１２肇ルシゲニン
−０，１２Ｍ水酸化ナトリウム浴液）５００μｔ２加え
、化学発光測定する〔・９ソ力−ド社オートコピライト
６５ｏＯによる〕。
ｔ２とり、ルシゲニン試薬（０，００１２肇ルシゲニン
−０，１２Ｍ水酸化ナトリウム浴液）５００μｔ２加え
、化学発光測定する〔・９ソ力−ド社オートコピライト
６５ｏＯによる〕。
インベルターゼ活性の検量線：
第１図に、インベルターゼ活性の検量線を示した。イン
ベルターゼ活性全横軸に、発光強度？縦軸にとってプロ
ットし之。インベルターゼ活性４０〜１０μＵまでは発
光強度と酵素活性との間に＠練性ケ示した。
ベルターゼ活性全横軸に、発光強度？縦軸にとってプロ
ットし之。インベルターゼ活性４０〜１０μＵまでは発
光強度と酵素活性との間に＠練性ケ示した。
また、各点における精度ゲ第１表に示す。ｎ＝６でのＣ
，Ｖ、値は低濃度酵素放では約１ｏ係でばらつきが太き
い。
，Ｖ、値は低濃度酵素放では約１ｏ係でばらつきが太き
い。
検出限界を工、以下のように算出してａ７ａコｏｔ（ａ
７Ｘ１０ ｍｏｔ）であった。
７Ｘ１０ ｍｏｔ）であった。
即ち、使用したインベルターゼの比活性は４２５ ｔＪ
／ｍｑであり、インベルターゼの分子量は２７０、［＋
００であるからインベルターゼ１ｍ９＝′５．７ｎ ｍ
ｏｔであって、インベルターゼ１ ｎ ｒｎｏｌに対す
る比活性は４２５／３．７＝１１４ Ｕである。故に検
量線の１μＵｉ検出限界とすれば、１μＵ−Ｑ、００８
７ ｆ ｒｎｏｔ、即ちａ ７ ａ ｍｏｔである。
／ｍｑであり、インベルターゼの分子量は２７０、［＋
００であるからインベルターゼ１ｍ９＝′５．７ｎ ｍ
ｏｔであって、インベルターゼ１ ｎ ｒｎｏｌに対す
る比活性は４２５／３．７＝１１４ Ｕである。故に検
量線の１μＵｉ検出限界とすれば、１μＵ−Ｑ、００８
７ ｆ ｒｎｏｔ、即ちａ ７ ａ ｍｏｔである。
第１表 精度（ｎ＝６）
実施例１ １７α−ヒドロキシプロゲステロン（以下１
７α−０ＨＰと略す）のインベルターゼ？使用し友ＥＩ
Ａ 。
７α−０ＨＰと略す）のインベルターゼ？使用し友ＥＩ
Ａ 。
１、１７α−０ＨＰ−インベルターゼ結合体の調製イン
ベルターゼ１０■（４２５Ｕ／■）お工び１７α−０Ｈ
Ｐ ４−カルゲキシメチルチオエーテル４ｍ？？用い活
性エステル法で調製し／ζ。
ベルターゼ１０■（４２５Ｕ／■）お工び１７α−０Ｈ
Ｐ ４−カルゲキシメチルチオエーテル４ｍ？？用い活
性エステル法で調製し／ζ。
１７α−０ＦＩＰ−インベルターゼ結合体に、トヨパー
ルＨＶ／ ５５ （ｔ５ｘ５０ｃｒｒＬ）ｋ便用したゲ
ルクロマトグラフィー（０，０５Ｍリン酸緩衝敵−７，
０）で精製し、免疫活性および酵素活性の最適画分（１
両分１ ｍｌでフラクション３０）を採取し、適宜希釈
してイムノアッセイの標識体とした。
ルＨＶ／ ５５ （ｔ５ｘ５０ｃｒｒＬ）ｋ便用したゲ
ルクロマトグラフィー（０，０５Ｍリン酸緩衝敵−７，
０）で精製し、免疫活性および酵素活性の最適画分（１
両分１ ｍｌでフラクション３０）を採取し、適宜希釈
してイムノアッセイの標識体とした。
２、１７α−０ＨＰのＥＩＡ
以下の手順に工り行なわれた。
１）抗１７α−０ＨＰ抗血清（家兎） （２５０００倍
希釈）１００μＬ ２） １７α−０ＨＰ（Ｄ〜５００ｐ）／１００μｔ）
１００μｔ ６） １７α−０ＨＰ−インベルターゼ結合体（フラク
ションろ０１１６００倍希釈）１００μｔ４）リン酸緩
衝版（０，０１Ｍ、ｐ１４７．０．０．１％牛血清アル
グミン含有）２００μｔ ５）第２抗体（抗水兎抗血清（ヤギ））コーティングビ
ーズ（以下ＤＡＳＰビーズと略す）１ケ ６）１）〜５）全４℃で一夜インキユベートする。
希釈）１００μＬ ２） １７α−０ＨＰ（Ｄ〜５００ｐ）／１００μｔ）
１００μｔ ６） １７α−０ＨＰ−インベルターゼ結合体（フラク
ションろ０１１６００倍希釈）１００μｔ４）リン酸緩
衝版（０，０１Ｍ、ｐ１４７．０．０．１％牛血清アル
グミン含有）２００μｔ ５）第２抗体（抗水兎抗血清（ヤギ））コーティングビ
ーズ（以下ＤＡＳＰビーズと略す）１ケ ６）１）〜５）全４℃で一夜インキユベートする。
７） ＤＡＳＰビーズを生理食塩水１．５ｍεでろ面
洗浄。
洗浄。
８） α３ Ｍシュクロース浴液（前出）２００μｔお
工び０．２５Ｍ酢酸緩衝ｉｃ前出）ろ００μｔ？！−加
える。
工び０．２５Ｍ酢酸緩衝ｉｃ前出）ろ００μｔ？！−加
える。
９）４℃で一夜インキユペートする（酵素反応）。
１０）０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）ｉス０）１００μｔ
？加え、沸騰水浴中で４分間加熱し、酵素反応を停止す
り。
？加え、沸騰水浴中で４分間加熱し、酵素反応を停止す
り。
１１）反応′ｒｉ、１００μｍ１とり、ルシゲニン試薬
（前出）５００μＬ？加える。化学発光？測定する（前
出）。
（前出）５００μＬ？加える。化学発光？測定する（前
出）。
第２図は検量線である。図中横軸は２）における１７α
−０ＨＰの量を示し、縦軸９工１７α−０ＨＰの添加に
伴なう発元強反の相対値？示す。Ｂｏは１７α−０ＨＰ
無添加のときの、Ｂは重加したときの発光５虫度である
。
−０ＨＰの量を示し、縦軸９工１７α−０ＨＰの添加に
伴なう発元強反の相対値？示す。Ｂｏは１７α−０ＨＰ
無添加のときの、Ｂは重加したときの発光５虫度である
。
本発明に係るインベルターゼ標識ＥＩＡ＋！、酵素が入
手し易く安価であり、方法全体として低コストであるば
かりでなく、適用しうる検出反応の１方法として、ルシ
ゲニンによる発光反応全併用すると迅速で高感度で測定
できる。
手し易く安価であり、方法全体として低コストであるば
かりでなく、適用しうる検出反応の１方法として、ルシ
ゲニンによる発光反応全併用すると迅速で高感度で測定
できる。
第１図はインベルターゼの検量線であり、第２図は１７
α−ヒドロキシプロゲステロンのインベルターゼ標識Ｅ
ＩＡによる検量線である。
α−ヒドロキシプロゲステロンのインベルターゼ標識Ｅ
ＩＡによる検量線である。
Claims (1)
- 標識酵素としてインベルターゼを使用することを特徴と
する酵素免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21433685A JPS6273164A (ja) | 1985-09-27 | 1985-09-27 | 酵素免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21433685A JPS6273164A (ja) | 1985-09-27 | 1985-09-27 | 酵素免疫測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6273164A true JPS6273164A (ja) | 1987-04-03 |
Family
ID=16654071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21433685A Pending JPS6273164A (ja) | 1985-09-27 | 1985-09-27 | 酵素免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6273164A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104076153A (zh) * | 2014-05-14 | 2014-10-01 | 中国科学院海洋研究所 | 一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统及其应用 |
-
1985
- 1985-09-27 JP JP21433685A patent/JPS6273164A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104076153A (zh) * | 2014-05-14 | 2014-10-01 | 中国科学院海洋研究所 | 一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2708475B2 (ja) | コロイド状非金属粒子によるイムノアッセイ法 | |
| JP2599192B2 (ja) | 結合アッセイ装置 | |
| JPH0239747B2 (ja) | ||
| Katz et al. | Radioimmunoassay of angiotensin I: comparison of two renin activity methods and use for other measurements of the renin system | |
| JPS58117456A (ja) | 特定の結合活性を持つ蛋白質とこれに対応して結合する物質との反応の一つの成分を検出及び定量する試薬セツト | |
| JPS6255103B2 (ja) | ||
| Yu et al. | A time-resolved fluorescence lateral flow immunochromatographic assay based on oriented immobilized antibodies for the ultrasensitive detection of C-peptides in human serum | |
| US5434054A (en) | Devices for determining hydrolase activity through its hydrolytic release of an immobilized indicator enzyme | |
| JPS58111754A (ja) | クレアチニンの免疫学的測定法及びそのための試薬 | |
| US6555388B1 (en) | Binding protein capture assay | |
| EP0166583B1 (en) | Compositions for enzyme immunoassay of prostaglandins | |
| CN1924580B (zh) | 定量检测三碘甲状腺原氨酸用化学发光分析试剂盒 | |
| JPS6273164A (ja) | 酵素免疫測定法 | |
| US4113433A (en) | Radioimmunoassay of hormones and metabolites in blood serum and plasma | |
| JPS62165151A (ja) | 標識ヒダントイン接合体並びにその分析要素及び免疫分析での使用 | |
| JPS61186855A (ja) | チロキシンを形成するグロブリンの結合能力を測定する方法 | |
| CN108303554A (zh) | 一种抗苗勒氏管激素的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒 | |
| Boitieux et al. | A computerised enzyme immunosensor: application for the determination of antigens | |
| EP1307741A1 (en) | Method for diagnosing thyroid conditions and for monitoring thyroxine therapy | |
| JP3175822B2 (ja) | ハプテンの免疫学的測定法 | |
| Dhar et al. | Determination of dehydroepiandrosterone sulfate in plasma by a one-step enzyme immunoassay with a microtitre plate. | |
| JPH06105252B2 (ja) | 遊離型サイロキシンの酵素免疫測定法 | |
| JPH0510952A (ja) | 固定化担体の製造方法 | |
| RU2090892C1 (ru) | Способ определения биологически активных веществ | |
| Zhen et al. | Determination of free triiodothyronine by chemiluminescent enzyme immunoassay |