CN111272945A - 一种d-氨基酸检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及到试剂盒的合成，具体为一种D‑氨基酸检测试剂盒及其检测方法。试剂盒中含D‑氨基酸酶、1,4‑苯二硼酸溶液和金纳米颗粒溶液；按体积比为1：1‑5：10‑20。本试剂盒简单易操作，可以实现绿色、无污染的D‑氨基酸检测，在分子生物学、生物分析化学、海洋科学以及肿瘤科学等研究领域有潜在的应用价值。

Description

一种D-氨基酸检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及到试剂盒的合成，具体为一种D-氨基酸检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
微生物腐蚀所导致的工程材料的腐蚀失效给国民经济造成严重的经济损失，并时刻威胁着人们的人身安全[1]。研究表明，海洋环境中的腐蚀微生物在生长代谢过程中可以合成并向周围环境中释放信号分子D-氨基酸，被释放到环境中的D-氨基酸在关键的代谢过程如稳定期细胞壁重塑及生物膜解体中起到重要的调控作用。另外，腐蚀过程中生物膜的形成、发展和解体同样受到微生物严格的遗传调控，且这种调控往往通过信号分子的响应实现[2]。因此，要想更深入的了解微生物腐蚀过程中微生物膜的变化规律及进一步探索微生物腐蚀机理，信号分子的分析研究尤为重要。
当前，D-氨基酸的检测分析方法主要有气相层析法、高效液相法、酶法，以及生物传感器检测法等[3]。气相层析法根据氨基酸气态试样中各组分在两相间的分配系数不同进行分析，然而，样品需要脱盐处理，衍生处理时还要求无水及高温条件，而且用一根色谱柱无法测定全部氨基酸，故此法在氨基酸分析检测中应用并不广泛；高效液相法根据各组分在两相间分配系数不同，经过反复的吸附-解吸过程对其进行分离检测，检测结果精准，但专业化程度及成本均较高；酶法简单、实用，但存在灵敏度低的问题；而生物传感器检测法多与电化学分析方法相关，往往需要电极表面材料的层层组装，操作难度大、且耗时。因此，创建一种简单、快速，且灵敏度高的D-氨基酸检测方法迫在眉睫。
参考文献：
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[3]M.Maria,G.Laura,M.Agueda,et al,Bi-enzymatic biosensor for on-site,fast and reliable electrochemical detection of relevant D-amino acids inbacterial samples，Sensors and Actuators B:Chemical 2017,242：95-101.
发明内容
本发明目的在于保护一种D-氨基酸检测试剂盒的构建方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种D-氨基酸检测试剂盒，试剂盒中含D-氨基酸酶、1,4-苯二硼酸溶液和金纳米颗粒溶液；按体积比为1：1-5：10-20。
所述D-氨基酸酶浓度为1.0-1.5μM；1,4-苯二硼酸溶液浓度为；0.1-0.5mM；金纳米颗粒溶液浓度为1.0-1.5nM。
所述金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒粒径为10-15nm。
一种利用权利要求1所述试剂盒检测D-氨基酸的方法：将待测D-氨基酸在D-氨基酸酶的催化作用，催化后利用1,4-苯二硼酸溶液使得金胶纳米颗粒聚集，实现对待测D-氨基酸的定量检测。
所述以聚集的金胶纳米颗粒作为信号媒介通过紫外光谱仪测定其吸光度，再根据标准曲线获得待测D-氨基酸的浓度。
进一步的说，将待检测D-氨基酸加入至D-氨基酸酶溶液中，37-50℃下反应45-60分钟；反应后产物加入至1,4-苯二硼酸溶液中室温反应30-60秒，反应后产物再加入至金纳米颗粒溶液室温反应15-30分钟，反应后通过紫外测定其650nm、525nm下的吸光度值，再根据浓度—吸光度值绘制的待测溶液的标准曲线计算获得待测D-氨基酸的浓度。
待检测D-氨基酸与D-氨基酸酶溶液混合体积比为1：4-1：10。
所述D-氨基酸为D-丙氨酸、D-色氨酸、D-丝氨酸、D-异亮氨酸、D-组氨酸、D-酪氨酸及D-酪氨酸和D-脯氨酸。
所述标准曲线中标准液浓度设置的梯度根据所测的目标D-氨基酸样品不同，设置相应的梯度变化范围以及浓度范围；例如，D-丙氨酸的标准样品浓度范围为10μM到105μM；D-色氨酸的标准样品浓度范围为50μM到105μM。
本发明所具有的优点：
本试剂盒以D-氨基酸作为目标分析物，结合D-氨基酸的酶催化作用及1,4-苯二硼酸所致的金胶纳米颗粒聚集作为信号媒介，实现对D-氨基酸的检测分析。
本发明试剂盒所具有的优势如下：1)该检测方法以试剂盒形式呈现，操作方便，更利于市场化应用；2)该试剂盒中只需要三个1.5mL的离心管，十分便于携带；3)该试剂盒中应用到的底物溶液简单易得，且价格并不昂贵；4)整个试剂盒涉及的操作过程温度温和，十分便于操作；5)整个试剂盒反应操作过程可在1小时内完成，十分快速；6)对于待测溶液用量微小，这对于样品量少的实际应用有显著利用优势；
总体而言，本试剂盒具有简单易操作、环境友好、反应条件温和可控、性能稳定等优点；进而其可在分子生物学、生物分析化学、海洋科学以及肿瘤科学等研究领域有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供了D-氨基酸检测试剂盒的构建方法的技术路线图。
图2为本发明实施例提的可见金纳米颗粒溶液的电镜图。
图3本发明实施例提供的不同浓度的D-氨基酸收集对应的吸光度值的光谱图。
图4为本发明实施例提供的不同浓度的D-氨基酸检测标准曲线图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明检测是以D-氨基酸作为目标分析物，结合D-氨基酸的酶催化作用及1,4-苯二硼酸所致的金胶纳米颗粒聚集作为信号媒介，实现对D-氨基酸的检测分析，在此基础上，本发明构建了一种新型的试剂盒。
以下以D-丙氨酸(D-Ala)为例，对本发明的检测过程详细描述：
实施例1
如图1所示，D-氨基酸检测试剂盒的操作步骤图：
第一步：取5μL目标D-氨基酸溶液加入到含20μL 1.0μM D-氨基酸酶溶液的管A中，在37℃下反应45分钟，得到D-氨基酸酶催化底物D-氨基酸的产物H2O2，收集反应后的溶液。
第二步：将第一步反应收集到的溶液加入到含0.1mM,100μL 1,4-苯二硼酸溶液的管B中，室温反应30秒，1,4-苯二硼酸可与第一步产物H2O2相互作用，使得1,4-苯二硼酸的硼酸盐键氧化为酚基团，并收集反应后的溶液。
第三步：将第二步反应收集到的溶液加入到含1.0nM金纳米颗粒溶液的管C中，室温反应15分钟，收集反应后的溶液。由于H2O2的作用，1,4-苯二硼酸所转化的酚基可抑制金纳米颗粒直接的相互聚集，进而影响金纳米颗粒溶液颜色的变化。
第四步：将第三步反应收集到的溶液，置于2mL石英比色皿中用于紫外可见光谱仪分别测定650nm、525nm下的吸光度。参数设置为：测试模式：光谱扫描；激发光谱范围：400-800nm。以样品获得的吸光度为纵坐标，样品的浓度对应的log值为横坐标，获得标准曲线，并通过拟合得到标准曲线对应的二元方程式。
以上所述金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒尺寸直径约14-20nm；其中，所述金纳米颗的制备可由现有方式制备获得，或是按照下述方式方法制备。
制备为：取用1％的柠檬酸三钠溶液和0.01％的氯金酸溶液配制金胶溶液，用0.22μm的多孔滤膜过滤除去杂质，将3.0mL柠檬酸三钠溶液滴加到100mL沸腾的氯金酸溶液中，持续搅拌30min后停止加热，使其自然冷却至室温。制备好的金胶溶液保存于4℃避光备用(参见图2)。
由图2透射电镜可见金纳米颗粒溶液的表征，其中金纳米颗粒尺寸直径约14nm。
实施例2
以下以D-丙氨酸(D-Ala)为例，对本发明的检测过程详细描述：
1)按照实施例1记载的步骤获得D-氨基酸的标准溶液的吸光度，并通过吸光度与浓度之间关系获得标准曲线，并获得对应的方程；其中，D-氨基酸的标准溶液为空白样，10μM,101.5μM,102μM,102.5μM,103μM,103.5μM,104μM,104.5μM,105μM(其检测浓度范围为：10μM到105μM。)。
由D-氨基酸的标准溶液收集对应的吸光度值，得到光谱图(参见图3)，再以目标溶液的浓度作为横坐标，对应的吸光度值作为纵坐标，得到标准曲线图及对应的二元方程式(参见图4)，即二元方程式为Y＝-0.2337X+0.1653，X为目标D-氨基酸溶液的浓度log值，Y为目标溶液对应的650nm处与525nm处吸光度的比值减去空白溶液对应的650nm处与525nm处吸光度的比值(△A650nm/A525nm)。标准曲线中标准溶液最低检测浓度范围为10μM。
2)未知浓度目标D-氨基酸溶液的测定：
第一步：取5μL未知目标D-氨基酸溶液加入到含20μL 1.0μM D-氨基酸酶溶液的管A中，在37℃下反应45分钟，收集反应后的溶液。
第二步：将第一步反应收集到的溶液加入到含0.1mM,100μL 1,4-苯二硼酸溶液的管B中，室温反应30秒，收集反应后的溶液。
第三步：将第二步反应收集到的溶液加入到含1.0nM金纳米颗粒溶液的管C中，室温反应15分钟，收集反应后的溶液。
第四步：将第三步反应收集到的溶液，置于2mL石英比色皿中用于紫外可见光谱仪分别测定650nm、525nm下的吸光度。参数设置为：测试模式：光谱扫描；激发光谱范围：400-800nm。
由上述的吸光值带入标准曲线对应的二元方程式中，得到对应的浓度，即测定的D-氨基酸溶液的未知浓度(参见表1)
表1未知浓度的D-氨基酸的检测结果
Figure BDA0002395070160000041
由此可见，本检测方法及试剂盒的构建相比于之前D-氨基酸的检测方法简单易操作，且十分利于市场化应用。

Claims (8)

1.一种D-氨基酸检测试剂盒，其特征在于：试剂盒中含D-氨基酸酶、1,4-苯二硼酸溶液和金纳米颗粒溶液；按体积比为1：1-5：10-20。
2.按权利要求1所述的D-氨基酸检测试剂盒，其特征在于：所述D-氨基酸酶浓度为1.0-1.5μM；1,4-苯二硼酸溶液浓度为；0.1-0.5mM；金纳米颗粒溶液浓度为1.0-1.5nM。
3.按权利要求1或2所述的D-氨基酸检测试剂盒，其特征在于：所述金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒粒径为10-15nm。
4.一种利用权利要求1所述试剂盒检测D-氨基酸的方法，其特征在于：
将待测D-氨基酸在D-氨基酸酶的催化作用，催化后利用1,4-苯二硼酸溶液使得金胶纳米颗粒聚集，实现对待测D-氨基酸的定量检测。
5.按权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述以聚集的金胶纳米颗粒作为信号媒介通过紫外光谱仪测定其吸光度，再根据标准曲线获得待测D-氨基酸的浓度。
6.按权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于：将待检测D-氨基酸加入至D-氨基酸酶溶液中，37-50℃下反应45-60分钟；反应后产物加入至1,4-苯二硼酸溶液中室温反应30-60秒，反应后产物再加入至金纳米颗粒溶液室温反应15-30分钟，反应后通过紫外测定其650nm、525nm下的吸光度值，再根据浓度—吸光度值绘制的待测溶液的标准曲线，获得待测D-氨基酸的浓度。
7.按权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于：待检测D-氨基酸与D-氨基酸酶溶液混合体积比为1：4-1：10。
8.按权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述D-氨基酸为D-丙氨酸、D-色氨酸、D-丝氨酸、D-异亮氨酸、D-组氨酸、D-酪氨酸及D-酪氨酸和D-脯氨酸。
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