CN110078832A - 一类基于ZZ domain的广谱二抗及其制备方法和应用 - Google Patents

一类基于ZZ domain的广谱二抗及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类基于ZZ domain的广谱二抗及其制备方法和应用，属于抗体技术领域。该广谱二抗，具备两种功能域，分别行使结合IgG抗体的功能和报告基团功能；其中，行使结合IgG抗体功能的域，为衍生于金黄色葡萄球菌Protein A的ZZ domain，且可以结合多种来源的IgG；行使报告基团的域，是具备催化功能的酶或具备发光功能的蛋白。具备两种功能域，分别行驶结合IgG抗体(一抗)和报告基团功能。本发明的广谱二抗为融合蛋白，融合表达后其IgG抗体的结合能力和报告基团功能的发挥均不受影响。该广谱二抗可以结合多种物种的IgG一抗，例如可以结合小鼠源、大鼠源、人源、兔源等IgG。

Description

一类基于ZZ domain的广谱二抗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物/医学/食品检测技术领域，具体涉及一种基于ZZ domain的广谱二抗。
背景技术
在临床检测和生命科学相关问题的研究当中，往往会涉及利用抗体对各种抗原和指标进行检测，如ELISA、FACS、Western Blot等。在这些检测中，由于一抗的来源不同，往往需要购置不同的二抗，例如需要分别购买抗小鼠、抗羊、抗兔等的多种二抗，这也直接导致了相关实验成本的增加。为了发展简便的，低成本的分析方法进行相关指标的测定，需要开发出一种广谱二抗来减少相关二抗的使用。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基于ZZ domain的广谱二抗，通过融合表达手段联合ZZ domain以及具备报告基团功能的蛋白开发出一类广谱二抗，使得相关抗原/指标的表征更加经济、便捷。本发明的另一目的是提供一种上述基于ZZ domain的广谱二抗的应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一类基于ZZ domain的广谱二抗，具备两种功能域，分别行使结合IgG抗体的功能和报告基团功能；其中，行使结合IgG抗体功能的域，为衍生于金黄色葡萄球菌Protein A的ZZ domain，且可以结合多种来源的IgG；行使报告基团的域，是具备催化功能的酶或具备发光功能的蛋白。
行使结合IgG抗体功能的域，为衍生于金黄色葡萄球菌Protein A的ZZ domain，ZZdomain主要结合位置为IgG抗体的恒定区CH2和CH3之间，可以结合多种来源的IgG，如小鼠源IgG，大鼠源IgG，兔源IgG，人源IgG，山羊源IgG等。
所述的具备催化功能的酶包括蔗糖酶，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶。
所述的具备发光功能的蛋白包括绿色荧光蛋白，黄色荧光蛋白。
所述的基于ZZ domain的广谱二抗，为融合蛋白，两种功能域通过柔性片段相连接。
所述的基于ZZ domain的广谱二抗，报告基团融合表达在蛋白的N端或C端。
一种制备所述的基于ZZ domain的广谱二抗的方法，步骤如下：
1)以含报告基团蛋白的基因或相关基因组为模板进行PCR扩增，获得报告基团基因片段；
2)以pET22b-ZZ为模板进行PCR扩增，得到ZZ domain基因片段；
3)采用融合PCR技术将报告基团融合在ZZ domain基因片段的C端或N端；
4)采用大肠杆菌表达融合基因片段；
5)采用亲和纯化方法纯化融合蛋白，获得广谱二抗。
所述的基于ZZ domain的广谱二抗在相关指标检测中的应用。
ZZ domain主要结合位置为IgG抗体的恒定区CH2和CH3之间。该基于zz domain的二抗，可以结合多种来源的IgG一抗，例如小鼠源IgG，大鼠源IgG，兔源IgG，人源IgG，山羊源IgG等，从而可以作为广谱二抗进行广泛地使用。
有益效果：与现有技术相比，本发明成功实现了此类广谱二抗在大肠杆菌中的可溶表达，证明了该广谱二抗在报告基团酶活性(或发光能力)和IgG抗体结合能力上不亚于游离的报告基团和ZZ domain。本发明所开发出的广谱二抗，可以结合多种来源的IgG,如小鼠源IgG，大鼠源IgG，兔源IgG，人源IgG，山羊源IgG等，从而减少相关二抗的使用，降低了实验室成本，丰富了抗抗体的选择，为其在生物、医学、食品等领域相关指标的检测打下了基础。
附图说明
图1是琼脂糖凝胶电泳图；(A)泳道1为分子量为5000的marker，泳道2为纯化后的ZZ基因片段，泳道3为纯化后的Suc2基因片；(B)泳道1为纯化后的ZZ-Suc2基因片段，泳道2为分子量为2000的marker；
图2是SDS-PAGE图；(A)泳道1为蔗糖酶破壁上清，泳道2为纯化后的蔗糖酶，泳道3为ZZ domain破壁上清，泳道4为纯化后的ZZ domain，泳道M为标准蛋白样品；(2)泳道1为融合蛋白ZZ-Suc2破壁上清，泳道2为纯化后的融合蛋白ZZ-Suc2，泳道M为标准蛋白样品；
图3是DNS法测ZZ-Suc2融合蛋白蔗糖分解能力结果图；
图4是ELISA法测ZZ-Suc2融合蛋白IgG抗体结合能力结果图；
图5是琼脂糖凝胶电泳；(A)泳道1为分子量为纯化后的ZZ基因片段，泳道2为分子量为2000的marker；(B)泳道1为分子量为5000的marker，泳道2为纯化后的EGFP基因片段；(C)泳道1为纯化后EGFP-ZZ融合基因，泳道2为分子量为2000的marker；
图6是SDS-PAGE图；(A)泳道1为纯化后的EGFP，泳道M为标准蛋白样品；(B)泳道1为纯化后的EGFP-ZZ，泳道M为标准蛋白样品；
图7是ELISA法测EGFP-ZZ融合蛋白IgG抗体结合能力结果图；
图8是多功能酶标仪测EGFP-ZZ融合蛋白EGFP发光效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但应当理解这些实施例并非限制本发明的范围。以下实施例中所使用到的各引物序列如下：
ZZ-Suc2-F1：5’-GGAATTCCATATGGCCCAGCATGATGAAGCC-3’，
ZZ-Suc2-R1：5’-GCTGCCGCCGCCGCCGCTACCACCACCACCGCTCTGCTGCTATTGGCATCC-3’，
ZZ-Suc2-F2：5’-GGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCAGCACAAACGAAACTAGCGATAGACC-3’，
ZZ-Suc2-R2：5’-CCGCTCGAGTTTTACTTCCCTTACTTGGAACTTG-3’，
EGFP-ZZ-F1：5’-GGAATTCCATATGGAAAATCTGTATTTTCAGGGCATGG-3’，
EGFP-ZZ-R1：5’-ACTGCCGCCGCTACCACCACTGCCGCCGCTACCACCTTTGTATAGTTCATCCATGCC-3’，
EGFP-ZZ-F2：5’-GGTGGTAGCGGCGGCAGTGGTGGTAGCGGCGGCAGTGCCCAGCATGATGAAGCC-3’，
EGFP-ZZ-R2：5’-CCGCTCGAGGCTGCTGCTATTGGCATCC-3’。
实施例1ZZ-Suc2的表达和表征
在此实施例中，报告基团为具备生物催化功能的蔗糖酶Suc2，且报告基团融合表达在蛋白的N端。ZZ domain和报告基团中间插入了柔性片段GGGGSGGGGS(G：甘氨酸，S：丝氨酸)。
1)ZZ-Suc2表达菌株构建
为构建融合蛋白ZZ-Suc2表达菌株，根据ZZ的碱基序列(其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)，用Primer Premier 5.0设计引物ZZ-Suc2-F1和ZZ-Suc2-R1，以pET22b-ZZ为模板进行扩增，扩增得到的片段通过胶回收试剂盒进行回收得到ZZ(图1-A，泳道2)。同时，根据Suc2的碱基序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，用Primer Premier 5.0设计引物ZZ-Suc2-F2和ZZ-Suc2-R2，以商业公司合成的质粒pET22b-Suc2为模板进行扩增，扩增得到的片段通过胶回收试剂盒进行回收得到Suc2(图1-A，泳道3)。取相同摩尔浓度的Suc2和ZZ基因片段混合，并以ZZ-Suc2-F1和ZZ-Suc2-R2为引物进行PCR扩增，扩增得到的片段通过胶回收试剂盒进行回收达到融合片段ZZ-Suc2(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)。回收得到的ZZ-Suc2基因片段用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切且回收后(图1-B，泳道2)，和用同样进行限制性内切酶双酶切处理的商业化载体pET22b进行连接，连接后的产物转化商业化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，转化后的大肠杆菌涂布氨苄青霉素的平板进行筛选，选择阳性菌落进行测序验证，验证正确的克隆即为融合蛋白ZZ-Suc2的表达菌株。
2)蛋白表达
Suc2，ZZ domain和融合蛋白ZZ-Suc2的发酵方式和纯化方法均采用常规方式且条件相同，故以融合蛋白ZZ-Suc2的发酵方式为例说明本实施例蛋白的发酵和纯化方法。
取20μL融合蛋白ZZ-Suc2甘油菌至3mL氨苄抗性的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L)，37℃，200rpm过夜培养，第二天按照4％的接种量转接TB发酵培养基(蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油4g/L，KH2PO4 23.1g/L，K2HPO4 125.4g/L)，待菌浓达到OD600为0.6-1.2之后，加入终浓度为0.4mM的诱导剂IPTG进行诱导，蛋白表达的条件为20℃，200rpm，表达时间为24h。
发酵完毕后，9000rpm离心5min收集菌体，弃置上清。菌体用破壁缓冲液(10mMTris，500mM NaCl，pH8.0)重悬后，用超声破碎仪进行破碎，破碎条件为：冰浴，运行2s，停3s，运行时长20min。破碎完毕后，9000rpm离心10min，重复三次，以彻底除去细胞碎片，得到澄清的破壁上清。破壁上清先在4℃环境下与镍柱孵育2-4h，然后先后用破壁缓冲液，含10mM咪唑的破壁缓冲液，含20mM咪唑的破壁缓冲液，含50mM咪唑的破壁缓冲液分别洗涤镍柱以去除杂蛋白。最终用含250mM咪唑的破壁缓冲液将融合蛋白ZZ-Suc2洗下。纯化后的蛋白经脱盐后后冻干，置于-20℃备用。
图2中的SDS-PAGE结果经Image J软件灰度分析表明，纯化后的蔗糖酶Suc2，ZZdomain以及融合蛋白ZZ-Suc2的纯度在90％以上。
3)融合蛋白ZZ-Suc2蔗糖水解能力评估
酶反应体系为：0.1M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH5.0，底物蔗糖终浓度为1.5％，纯酶终浓度为10nM。酶的反应条件为：40℃水浴反应5min。反应完成后，取400μL反应液加入到预装有300μL DNS试剂的离心管中，沸水浴5min，完毕后立即将试管至于冰水中冷却，适当稀释后分光光度计520nm波长检测吸光度。相应空白组的处理方式为先取400μL不含酶反应液加入到预装有300μL DNS试剂的离心管中，沸水浴5min，完毕后立即将试管至于冰水中冷却，加入和实验室相同浓度的酶，适当稀释后分光光度计520nm波长检测吸光度。
如图3所示，其显示的值为实验组减去相应空白组的差值，ZZ domain组、蔗糖酶Suc2组、融合蛋白ZZ-Suc2组所测吸收值差值的平均值为0.058，0.247和0.249，表明融合表达后其蔗糖分解能力并未受到抑制。
3)融合蛋白ZZ-Suc2IgG抗体结合能力评估
用100μL相同摩尔浓度的蛋白(30nM)过夜铺96孔板，次日37℃再孵育1h。铺板完毕后，96孔板用1％的BSA进行封闭，再分别用稀释1000倍的正常小鼠血清和辣根过氧化物酶(HRP)修饰的山羊抗小鼠IgG抗体处理。处理完成后，加入200μL TMB显色液(上海碧云天公司)，孵育10min后加入50μL 2M H2SO4终止反应，酶标仪450nm检测结果。空白组为BSA过夜铺板，其余操作相同。
检测结果如图4所示，空白组、蔗糖酶Suc2组、ZZ domain组、融合蛋白ZZ-Suc组所测吸收值的平均值分别为0.034，0.058，0.271,0.282，表明融合表达后IgG抗体结合能力并未受到抑制。
实施例2EGFP-ZZ的表达和表征
在此实施例中，报告基团为具备发荧光功能的EGFP，且报告基团融合表达在蛋白的C端。ZZ domain和报告基团中间插入了柔性片段GGSGGSGGSGGS(G：甘氨酸，S：丝氨酸)
1)EGFP-ZZ表达菌株构建
为构建融合蛋白EGFP-ZZ表达菌株，根据ZZ的碱基序列，用Primer Premier 5.0设计引物EGFP-ZZ-F2和EGFP-ZZ-R2，以pET22b-ZZ为模板进行扩增，扩增得到的片段通过胶回收试剂盒进行回收得到ZZ片段(图5-A，泳道1)。同时，根据EGFP的碱基序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，用Primer Premier 5.0设计引物EGFP-ZZ-F1和EGFP-ZZ-R1，以商业公司合成的质粒pET28a-EGFP为模板进行扩增，扩增得到的片段通过胶回收试剂盒进行回收得到EGFP片段(图5-B，泳道2)。取相同摩尔浓度的EGFP和ZZ基因片段混合，并以EGFP-ZZ-F1和EGFP-ZZ-R2为引物进行PCR扩增，扩增得到的片段通过胶回收试剂盒进行回收达到融合片段EGFP-ZZ(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)。回收得到的EGFP-ZZ基因片段用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切且回收后(图5-C，泳道1)，和用同样进行限制性内切酶双酶切处理的商业化载体pET22b进行连接，连接后的产物转化商业化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，转化后的大肠杆菌涂布氨苄青霉素的平板进行筛选，选择阳性菌落进行测序验证，验证正确的克隆即为融合蛋白EGFP-ZZ的表达菌株。
2)蛋白表达
与实施例1中的表达方法相同，结果如图6所示，SDS-PAGE结果经Image J软件灰度分析表明，纯化后EGFP以及融合蛋白ZZ-Suc2的纯度在90％以上。
3)融合蛋白EGFP-ZZ发光能力评估
将蛋白溶解于PBS至终浓度为1μM，将溶解后的蛋白加入至96孔板，利用多功能酶标仪在激发波长为488nm，吸收波长为597nm的情况下测定其荧光值。以游离的EGFP的荧光强度为1，结果如图7所示，融合蛋白EGFP-ZZ的相对荧光值为1.01，基本没有产生变化，表明融合ZZ domain之后，EGFP的发光功能并未受影响。
3)融合蛋白EGFP-ZZ抗体结合能力评估
用100μL相同摩尔浓度的蛋白(30nM)过夜铺96孔板，次日37℃再孵育1h。铺板完毕后，96孔板用1％的BSA进行封闭，再分别用稀释1000倍的正常小鼠血清和辣根过氧化物酶(HRP)修饰的山羊抗小鼠IgG抗体处理。处理完成后，加入200μL TMB显色液(上海碧云天公司)，孵育10min后加入50μL 2M H2SO4终止反应，酶标仪450nm检测结果。空白组为BSA过夜铺板，其余操作相同。
检测结果如图8所示，空白组、EGFP组、ZZ domain组、融合蛋白EGFP-ZZ组所测吸收值的平均值分别为0.045，0.065，0.199,0.191，表明融合表达后IgG抗体结合能力并未受到抑制。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一类基于ZZ domain的广谱二抗及其制备方法和应用
<141> 2019-04-18
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln
1 5 10 15
Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu
20 25 30
Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser
35 40 45
Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro
50 55 60
Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu
65 70 75 80
Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile
85 90 95
Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu
100 105 110
Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Asn Ser
115 120 125
Ser Ser Leu Glu His His His His His His
130 135
<210> 2
<211> 520
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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Trp Glu Asp Gln Pro Ile Ala Ile Ala Pro Lys Arg Asn Asp Ser Gly
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Ala Phe Ser Gly Ser Met Val Val Asp Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Phe
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Phe Asn Asp Thr Ile Asp Pro Arg Gln Arg Cys Val Ala Ile Trp Thr
100 105 110
Tyr Asn Thr Pro Glu Ser Glu Glu Gln Tyr Ile Ser Tyr Ser Leu Asp
115 120 125
Gly Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Gln Lys Asn Pro Val Leu Ala Ala
130 135 140
Asn Ser Thr Gln Phe Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp Tyr Glu Pro Ser
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180 185 190
Ala Asn Glu Gly Phe Leu Gly Tyr Gln Tyr Glu Cys Pro Gly Leu Ile
195 200 205
Glu Val Pro Thr Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Tyr Trp Val Met Phe
210 215 220
Ile Ser Ile Asn Pro Gly Ala Pro Ala Gly Gly Ser Phe Asn Gln Tyr
225 230 235 240
Phe Val Gly Ser Phe Asn Gly Thr His Phe Glu Ala Phe Asp Asn Gln
245 250 255
Ser Arg Val Val Asp Phe Gly Lys Asp Tyr Tyr Ala Leu Gln Thr Phe
260 265 270
Phe Asn Thr Asp Pro Thr Tyr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ala Trp Ala
275 280 285
Ser Asn Trp Glu Tyr Ser Ala Phe Val Pro Thr Asn Pro Trp Arg Ser
290 295 300
Ser Met Ser Leu Val Arg Lys Phe Ser Leu Asn Thr Glu Tyr Gln Ala
305 310 315 320
Asn Pro Glu Thr Glu Leu Ile Asn Leu Lys Ala Glu Pro Ile Leu Asn
325 330 335
Ile Ser Asn Ala Gly Pro Trp Ser Arg Phe Ala Thr Asn Thr Thr Leu
340 345 350
Thr Lys Ala Asn Ser Tyr Asn Val Asp Leu Ser Asn Ser Thr Gly Thr
355 360 365
Leu Glu Phe Glu Leu Val Tyr Ala Val Asn Thr Thr Gln Thr Ile Ser
370 375 380
Lys Ser Val Phe Ala Asp Leu Ser Leu Trp Phe Lys Gly Leu Glu Asp
385 390 395 400
Pro Glu Glu Tyr Leu Arg Met Gly Phe Glu Val Ser Ala Ser Ser Phe
405 410 415
Phe Leu Asp Arg Gly Asn Ser Lys Val Lys Phe Val Lys Glu Asn Pro
420 425 430
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435 440 445
Asn Asp Leu Ser Tyr Tyr Lys Val Tyr Gly Leu Leu Asp Gln Asn Ile
450 455 460
Leu Glu Leu Tyr Phe Asn Asp Gly Asp Val Val Ser Thr Asn Thr Tyr
465 470 475 480
Phe Met Thr Thr Gly Asn Ala Leu Gly Ser Val Asn Met Thr Thr Gly
485 490 495
Val Asp Asn Leu Phe Tyr Ile Asp Lys Phe Gln Val Arg Glu Val Lys
500 505 510
Leu Glu His His His His His His
515 520
<210> 3
<211> 659
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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100 105 110
Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Asn Ser
115 120 125
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asn Glu Thr
130 135 140
Ser Asp Arg Pro Leu Val His Phe Thr Pro Asn Lys Gly Trp Met Asn
145 150 155 160
Asp Pro Asn Gly Leu Trp Tyr Asp Glu Lys Asp Ala Lys Trp His Leu
165 170 175
Tyr Phe Gln Tyr Asn Pro Asn Asp Thr Val Trp Gly Thr Pro Leu Phe
180 185 190
Trp Gly His Ala Thr Ser Asp Asp Leu Thr Asn Trp Glu Asp Gln Pro
195 200 205
Ile Ala Ile Ala Pro Lys Arg Asn Asp Ser Gly Ala Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Met Val Val Asp Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Phe Phe Asn Asp Thr Ile
225 230 235 240
Asp Pro Arg Gln Arg Cys Val Ala Ile Trp Thr Tyr Asn Thr Pro Glu
245 250 255
Ser Glu Glu Gln Tyr Ile Ser Tyr Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Thr Phe
260 265 270
Thr Glu Tyr Gln Lys Asn Pro Val Leu Ala Ala Asn Ser Thr Gln Phe
275 280 285
Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp Tyr Glu Pro Ser Gln Lys Trp Ile Met
290 295 300
Thr Ala Ala Lys Ser Gln Asp Tyr Lys Ile Glu Ile Tyr Ser Ser Asp
305 310 315 320
Asp Leu Lys Ser Trp Lys Leu Glu Ser Ala Phe Ala Asn Glu Gly Phe
325 330 335
Leu Gly Tyr Gln Tyr Glu Cys Pro Gly Leu Ile Glu Val Pro Thr Glu
340 345 350
Gln Asp Pro Ser Lys Ser Tyr Trp Val Met Phe Ile Ser Ile Asn Pro
355 360 365
Gly Ala Pro Ala Gly Gly Ser Phe Asn Gln Tyr Phe Val Gly Ser Phe
370 375 380
Asn Gly Thr His Phe Glu Ala Phe Asp Asn Gln Ser Arg Val Val Asp
385 390 395 400
Phe Gly Lys Asp Tyr Tyr Ala Leu Gln Thr Phe Phe Asn Thr Asp Thr
405 410 415
Thr Tyr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ala Trp Ala Ser Asn Trp Glu Tyr
420 425 430
Ser Ala Phe Val Pro Thr Asn Pro Trp Arg Ser Ser Met Ser Leu Val
435 440 445
Arg Lys Phe Ser Leu Asn Thr Glu Tyr Gln Ala Asn Pro Glu Thr Glu
450 455 460
Leu Ile Asn Leu Lys Ala Glu Pro Ile Leu Asn Ile Ser Asn Ala Gly
465 470 475 480
Pro Trp Ser Arg Phe Ala Thr Asn Thr Thr Leu Thr Lys Ala Asn Ser
485 490 495
Tyr Asn Val Asp Leu Ser Asn Ser Thr Gly Thr Leu Glu Phe Glu Ser
500 505 510
Val Tyr Ala Val Asn Thr Thr Gln Thr Ile Ser Lys Ser Val Phe Ala
515 520 525
Asp Leu Ser Leu Trp Phe Lys Gly Leu Glu Asp Pro Glu Glu Tyr Leu
530 535 540
Arg Met Gly Phe Glu Val Ser Ala Ser Ser Phe Phe Leu Asp Arg Gly
545 550 555 560
Asn Ser Lys Val Lys Phe Val Lys Glu Asn Pro Tyr Phe Thr Asn Arg
565 570 575
Met Ser Val Asn Asn Gln Pro Phe Lys Ser Glu Asn Asp Leu Ser Tyr
580 585 590
Tyr Lys Val Tyr Gly Leu Leu Asp Gln Asn Ile Leu Glu Leu Tyr Phe
595 600 605
Asn Asp Gly Asp Val Val Ser Thr Asn Thr Tyr Phe Met Thr Thr Gly
610 615 620
Asn Ala Leu Gly Ser Val Asn Met Thr Thr Gly Val Asp Asn Leu Phe
625 630 635 640
Tyr Ile Asp Lys Phe Gln Val Arg Glu Val Lys Leu Glu His His His
645 650 655
His His His
<210> 4
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Met Gly Lys Gly Glu Glu Leu
1 5 10 15
Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn
20 25 30
Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr
35 40 45
Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val
50 55 60
Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Ala Phe
65 70 75 80
Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala
85 90 95
Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp
100 105 110
Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu
115 120 125
Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn
130 135 140
Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr
145 150 155 160
Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile
165 170 175
Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln
180 185 190
Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His
195 200 205
Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg
210 215 220
Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His
225 230 235 240
Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys His His His His His His
245 250
<210> 5
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Met Gly Lys Gly Glu Glu Leu
1 5 10 15
Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn
20 25 30
Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr
35 40 45
Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val
50 55 60
Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Ala Phe
65 70 75 80
Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala
85 90 95
Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp
100 105 110
Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu
115 120 125
Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn
130 135 140
Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr
145 150 155 160
Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile
165 170 175
Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln
180 185 190
Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His
195 200 205
Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg
210 215 220
Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His
225 230 235 240
Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Met Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp Asn Lys Phe Asn
260 265 270
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
275 280 285
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290 295 300
Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
305 310 315 320
Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
325 330 335
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn
340 345 350
Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu
355 360 365
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp
370 375 380
Ala Asn Ser Ser Ser His His His His His His
385 390 395
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggaattccat atggcccagc atgatgaagc c 31
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctgccgccg ccgccgctac caccaccacc gctctgctgc tattggcatc c 51
<210> 8
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtggtggtg gtagcggcgg cggcggcagc acaaacgaaa ctagcgatag acc 53
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccgctcgagt tttacttccc ttacttggaa cttg 34
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggaattccat atggaaaatc tgtattttca gggcatgg 38
<210> 11
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actgccgccg ctaccaccac tgccgccgct accacctttg tatagttcat ccatgcc 57
<210> 12
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtggtagcg gcggcagtgg tggtagcggc ggcagtgccc agcatgatga agcc 54
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccgctcgagg ctgctgctat tggcatcc 28

Claims (9)

1.一类基于ZZ domain的广谱二抗，其特征在于，具备两种功能域，分别行使结合IgG抗体的功能和报告基团功能；其中，行使结合IgG抗体功能的域，为衍生于金黄色葡萄球菌Protein A的ZZ domain，且可以结合多种来源的IgG；行使报告基团的域，是具备催化功能的酶或具备发光功能的蛋白。
2.根据权利要求1所述的基于ZZ domain的广谱二抗，其特征在于，所述多种来源的IgG包括小鼠源IgG，大鼠源IgG，兔源IgG，人源IgG，山羊源IgG。
3.根据权利要求1所述的基于ZZ domain的广谱二抗，其特征在于，所述的具备催化功能的酶包括蔗糖酶，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶。
4.根据权利要求1所述的基于ZZ domain的广谱二抗，其特征在于，所述的具备发光功能的蛋白包括绿色荧光蛋白，黄色荧光蛋白。
5.根据权利要求1所述的基于ZZ domain的广谱二抗，其特征在于，为融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的基于ZZ domain的广谱二抗，其特征在于，报告基团融合表达在蛋白的N端或C端。
7.根据权利要求1所述的基于ZZ domain的广谱二抗，其特征在于，两种功能域通过柔性片段相连接。
8.一种制备权利要求1-7任一项所述的基于ZZ domain的广谱二抗的方法，其特征在于，步骤如下：
1)以含报告基团蛋白的基因或相关基因组为模板进行PCR扩增，获得报告基团基因片段；
2)以pET22b-ZZ为模板进行PCR扩增，得到ZZ domain基因片段；
3)采用融合PCR技术将报告基团融合在ZZ domain基因片段的C端或N端；
4)采用大肠杆菌表达融合基因片段；
5)采用亲和纯化方法纯化融合蛋白，获得广谱二抗。
9.权利要求1-7任一项所述的基于ZZ domain的广谱二抗在相关指标检测中的应用。
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