CN1807457A - 免疫球蛋白结合结构域与荧光蛋白融合蛋白质及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域。本发明提供了一种由免疫球蛋白结合结构域与荧光蛋白构成的融合蛋白质，及其基因工程表达和分离纯化方法。利用本发明表达和纯化的免疫球蛋白结合结构域与荧光蛋白构成的融合蛋白质可以用来在生物学、医学等领域进行诸如酶联免疫吸附分析、Western Blotting分析、斑点杂交检测、免疫组化分析、流式细胞检测等各种免疫检测和分析。本发明还提供了免疫球蛋白结合结构域－绿色荧光蛋白(ZZ－EGF)、免疫球蛋白结合结构域－红色荧光蛋白(ZZ－DsRed)两种融合荧光蛋白的实例。
Description
一、技术领域：
本发明属生物技术领域。
二、背景技术：
应用抗体进行免疫学检测是目前生物学、医学研究以及临床检测和诊断广为使用的常规方法。目前，常规的免疫学检测都是先用抗体识别抗原，然后再用第二级抗体(二抗)，即针对前一个抗体(一抗)的抗体进行反应。通常，在二抗上用化学的方法偶联了能够通过化学反应显色或者发光的蛋白质(如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶)，或者偶联了可以产生荧光的化合物(如FITC)，然后通过检测图象或者光密度改变达到检测的目的。其中，使用的二抗抗体，主要从动物中制备得到，而且针对不同来源的一抗，必须使用专门制备的、针对不同动物来源一抗抗体的二抗。获得的二抗必需进行分离纯化，然后再进行化学偶联，交联上能够发光或者能够通过化学反应发光、显色的化合物或者蛋白质。这种传统的方法不仅耗费时间长，成本也比较高，而且，越来越多的动物保护主义者对此提出反对。
Z结构域由58个氨基酸组成，是一个根据金黄色葡萄球菌蛋白A的B结构域人工合成的一个IgG抗体Fc片段结合蛋白。它缺失了天冬氨酸-甘氨酸二肽序列以及蛋氨酸残基，因此与天然金黄色葡萄球菌蛋白A相比，它可以抵抗羟胺和溴化氰的处理(Nilsson B等，Protein Eng.1：107-113，1987)。含有两个Z结构域的ZZ蛋白目前已经发展成了一种较常用的融合蛋自表达系统。ZZ蛋白能够保护目的蛋白在大肠杆菌细胞质中不被降解(
FJM等J.Biotechnology 109：31-43，2004)，并且利用ZZ的IgG结合特性可以通过一步IgG-琼脂糖亲和层析法很容易纯化融合蛋白。
三、发明内容：
本发明的目的是建立一种由金黄色葡萄球菌蛋白A衍生的ZZ和荧光蛋白组成的蛋白质，该融合蛋白质可以通过重组DNA技术方便、简易、廉价地大量生产获得；该融合蛋白质制备操作非常简单、不需要进行化学偶联，需要的时间短，消耗的成本低；并且该融合蛋白质很容易进行检测，不需要加入任何其它的辅助因子或者试剂。该融合蛋白质可以用于免疫检测，例如用于检测各种动物来源的免疫球蛋白、酶联免疫反应(ELISA)、免疫印迹分析、免疫荧光显微镜分析、流式细胞分析、免疫芯片分析等，因此具有广泛的生物学、医学研究以及临床检测和诊断应用前景。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
由于重组DNA技术目前已经是一个相当成熟的技术，能够构建任何已知序列的基因、将其进行克隆在常用的表达质粒中，在目前常用的基因工程表达体系中进行表达和分离纯化。因此，本发明可以通过目前已经极为成熟的、常规的重组DNA技术，人工合成、或者经PCR获得ZZ基因和荧光蛋白基因，将这两个基因克隆在常用的表达质粒中，构成融合蛋白基因，然后在常用的基因工程表达体系中(例如细菌、酵母、昆虫细胞、昆虫、哺乳动物细胞等)进行基因工程重组表达，经过分离纯化获得ZZ-荧光蛋白融合蛋白质。ZZ-荧光蛋白融合蛋白质的分离纯化可以利用ZZ能够和免疫球蛋白IgG结合的性质、利用IgG亲和介质进行纯化；也可以在基因克隆时，在融合蛋白质的一端或者两端加上目前常用的亲和纯化标签(例如：大肠杆菌硫氧还蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白、组氨酸短肽标签、或者Flag标签等)进行分离纯化。该融合蛋白质可以直接应用于检测各种动物来源的免疫球蛋白IgG、用于酶联免疫反应(ELISA)、免疫印迹分析、免疫荧光显微镜分析、流式细胞分析、免疫芯片检测等。
由免疫球蛋白结合结构域ZZ与荧光蛋白构成的融合蛋白质的构成如下：
a.ZZ-荧光蛋白
b.荧光蛋白-ZZ
c.A-ZZ-荧光蛋白
d.A-ZZ-荧光蛋白-ZZ
e.ZZ-荧光蛋白-B
f.荧光蛋白-ZZ-B
g.A-ZZ-荧光蛋白-B
h.A-荧光蛋白-ZZ-B
其中A肽、B肽分别为目前常用的融合蛋白或短肽标签，如大肠杆菌硫氧还蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白、组氨酸短肽标签、Flag标签等。荧光蛋白是指能够产生荧光的蛋白质，如绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(DsRed-Express)等。
同已有的、天然来源的、经过化学修饰的检测用抗体相比，本发明的特色和创新之处在于：
(1)与传统的、在动物来源的天然抗体上偶联发光基团或者通过化学反应显色或者发光的蛋白质(如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶)的方法相比，该ZZ-荧光蛋白融合蛋白质生产过程简便、成本低、易于大量生产，而且一个蛋白质就能够识别不同动物来源的抗体，勿需制备针对不同动物来源的一抗的抗体，也勿须加入任何其它的辅助因子或者试剂进行反应而产生显色，能够直接利用荧光分光光度计、X-光片、荧光显微镜或流式细胞仪或者免疫芯片进行检测。
(2)本发明建立了利用重组DNA技术生产ZZ-荧光蛋白融合蛋白质的生产及纯化方法。
以上所用方法都是分子生物学中最常用的、成熟的分离纯化方法，方法简便、价廉，具有很好的适用性，推广方便，适于生产。。
四、附图说明：
图1 ZZ-EGFP和ZZ-DsRed的表达和纯化
a：ZZ-EGFP表达菌的非诱导对照(1)，IPTG诱导表达(2)，表达菌超声破碎上清(3)，超声沉淀(4)，Ni亲和层析穿过峰(5)，纯化的ZZ-EGFP(6)；
b：ZZ-DsRed表达菌的非诱导对照(1)，IPTG诱导表达(2)，表达菌超声破碎上清(3)，超声沉淀(4)，Ni亲和层析穿过峰(5)，纯化的ZZ-DsRed(6)。
图2 用HRP标记驴二抗IgG检测ZZ-EGFP和ZZ-DsRed与抗体的结合能力
a.酶联免疫吸附分析(ELISA)；
b.免疫印迹分析(Western Blot)。
图3 在斑点杂交法中用ZZ-EGFP和ZZ-DsRed检测两种抗体
1，3：兔抗GST抗体；2，4：鼠抗TNFα抗体。
图4 ZZ-EGFP，ZZ-DsRed和常规HRP/ECL法在检测两种蛋白中的比较
a：纯化的TNFα蛋白；b：纯化的GST蛋白。
图5 ZZ-EGFP和ZZ-DsRed在免疫荧光显微镜分析中的应用
a：用ZZ-EGFP作为二抗检测293T细胞中带有Flag标记的IRF3蛋白；
b：用ZZ-DsRed作为二抗检测HeLa细胞中带有Flag标记的IRF3蛋白。
两种蛋白的标记效果与商品化FITC标记二抗相同。
图6 在流式细胞分析技术中用ZZ-EGFP检测293T细胞表面整合素β3亚基
a：用商品化FITC标记的二抗进行流式细胞检测分析；
b：用ZZ-EGFP作为二抗进行流式细胞检测分析。
五、具体实施方式：
实施例1：ZZ蛋白和绿色荧光蛋白(EGFP)的融合及其在免疫分析中的应用：
1.ZZ基因的克隆和表达质粒pET28a-ZZ的构建：
根据ZZ基因的序列、化学合成ZZ-5’(5’CATGAATTCGCGCAACACGATGAAGCC 3’)和ZZ-3’(5’CCCAAGCTTCTACCGAGCTCGAATTCGC 3’)两条引物，用ZZ-5’和ZZ-3’两条引物从pEZZ318质粒(安玛西亚公司)中PCR扩增得到ZZ基因编码序列，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后用于酶切和连接。PCR条件为：94℃ 5分钟；94℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共30个循环；72℃ 10分钟；4℃保存。
回收的ZZ PCR产物进行EcoR I和Hind III双酶切，质粒pET28a(Novagen)也进行EcoR I和Hind III双酶切。酶切并且经过回收纯化的ZZ片段和pET28a质粒片段，使用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌Top10菌株感受态细胞，用限制性内切酶酶切及PCR法筛选阳性克隆，得到重组质粒pET28-ZZ，并经过DNA序列测序分析，测序引物为常规T7终止子引物。在pET28a-ZZ质粒中，在ZZ结构域的N端插入了6个组氨酸，该6个组氨酸原来就存在于pET28a质粒中。
2.ZZ-EGFP基因的克隆及其表达载体的构建：
通过Sal I和EcoR I双酶切从pEGFP(Clontech)中得到EGFP的编码序列，用T4 DNA聚合酶补平之后、将其插入到依次经过Xho I酶切、碱性磷酸酶处理的、以及T4 DNA聚合酶补平的pET28a-ZZ中。连接产物转化到Top10感受态细胞之后，用针对EGFP编码序列的引物通过PCR筛选阳性克隆，并通过BamHI限制性酶切的方法检验EGFP基因插入的方向。DNA测序验证编码序列以及阅读框的正确性。
3.ZZ-EGFP在大肠杆菌中的表达和纯化：
将pZZ-EGFP表达质粒转化表达菌株BL21(DE3)，生长于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃生长16小时之后，将平板上所有克隆刮下接种于2升含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基。剧烈振荡培养2-3个小时直到培养液的OD600达到0.8，用1mM IPTG诱导目的蛋白的表达。4个小时之后，5000转/分钟，离心5分钟收集菌体，用冷的磷酸盐溶液洗涤沉淀并将其重新悬浮于40ml的结合缓冲液中(50mM磷酸钠，pH7.8，300mM氯化钠，40mM咪唑)。在冰浴保护下用超声波破碎菌体。在4℃，13000转/分钟，离心15分钟之后将超声破碎的细胞上清加载到一个2ml Ni-琼脂糖凝胶亲和层析柱上，上样前用结合缓冲液预平衡层析柱。用洗脱缓冲液(50mM磷酸钠，pH7.8，300mM氯化钠，250mM咪唑)洗脱ZZ-EGFP蛋白，将其对磷酸盐溶液透析后，采用Bradford法进行蛋白质定量分析。
4.酶联免疫吸附分析(ELISA)：
将100μl连续梯度稀释的ZZ-EGFP包被于96孔酶标板，置4℃过夜。用PBST洗涤4次，每次振荡洗涤15分钟。用5％脱脂牛奶于室温包被1小时之后用PBST洗涤4次。然后用100μl 1∶4000稀释的HRP标记的驴抗羊IgG抗体(Santa Cruz)在室温孵育1小时。PBST洗涤4次之后用TMB底物系统对HRP显色10分钟，终止反应后，以620nm为参照读取450nm的光吸收值。
5.Western Blotting分析ZZ-EGFP：
连续梯度稀释的ZZ-EGFP在通过SDS-PAGE分离之后转移到PVDF膜上，5％脱脂奶粉包被1小时后，用1∶2000稀释的HRP标记驴抗羊IgG抗体(SantaCruz)与膜一起温育1小时。经PBST洗涤4次之后、用ECL系统(Cell Signaling)对HRP进行显色，并对X光片曝光。
6.用ZZ-EGFP进行点杂交检测：
根据文献报道的方法(Oprandy J.J.等，Am.J.Trop.Med.Hyg.，38：181-186，1988)进行点杂交免疫分析。将2μl连续梯度稀释的GST，TNFα以及两种不同的抗体，即兔多克隆抗GST IgG(Oncogene)、鼠多克隆抗TNFα IgG(Santa Cruz)点样于甲醇处理的PVDF膜上。GST和TNFα各点样两张膜，点样时PVDF膜保持湿润并置于一层用缓冲液预湿的滤纸上，下面依次是一层干滤纸，6层吸水纸，点样过程中最下层吸水纸务必保持干燥状态。点样后用5％脱脂奶粉包被PVDF膜1小时，PBST洗膜4次。对于GST和TNFα，分别用1∶500稀释的兔多克隆抗GST抗体和鼠多克隆抗TNFα抗体与膜一起温育1小时，PBST洗涤4次之后一份用1∶200稀释的ZZ-EGFP温育1小时，另一份分别用1∶2000稀释的HRP标记羊抗兔IgG抗体和羊抗鼠IgG抗体温育1小时，PBST洗涤4次。对于2种不同的抗体，在5％脱脂牛奶包被之后直接用1∶200稀释的ZZ-EGFP与膜温育1小时，PBST洗涤4次。ZZ-EGFP使用Typhoon 9410(安玛西亚)进行检测，激发波长488nm，检测波长520nm。HRP用ECL系统进行发光(Cell Signaling)并对X光片曝光。
7.ZZ-EGFP用于细胞免疫组化分析：
293T细胞培养于含10％胎牛血清(Hyclone)，青霉素和链霉素的DMEM培养基中(Invitrogen)。接种于玻璃载玻片培养室培养24小时之后，通过标准磷酸钙转染的方法用pRK5-Flag-IRF3转染细胞。转染48小时之后用4％多聚甲醛固定细胞，于0.2％Triton X-100中处理5分钟以增加细胞的通透性。细胞在经过3％BSA/TBS包被后，与1∶100稀释的鼠单克隆抗体anti-Flag抗体(Sigma)共孵育1小时，TBS洗涤4次之后，用1∶500稀释的ZZ-EGFP或1∶500稀释的FITC标记兔抗鼠IgG(Sigma)孵育1小时。对照细胞不经过Flag抗体处理而直接用1∶500稀释的ZZ-EGFP进行孵育。细胞核用DAPI复染。细胞图像通过CarlZeiss显微镜Axioplan 2观察，用AxioVision3.1软件获取及分析。
8.ZZ-EGFP用于流式细胞技术检测：
将ZZ-EGFP用于流式细胞分析技术检测细胞表面的整合素3亚基表达情况。使用仪器为Becton-Dickinson FACScan，以488nm激光器采集数据，通过软件CELLQUEST(Becton-Dickinson)分析数据。收获293T细胞，并用1mL预冷的PBS洗涤、2％BSA/PBS溶液封闭30分钟之后，用1∶100稀释的多克隆兔抗人整合素3亚基抗体继续孵育30分钟，用PBS洗涤三次之后，将细胞与1∶100稀释的FITC标记羊抗兔IgG抗体或者1∶100稀释的ZZ-EGFP继续孵育30分钟，用PBS溶液洗涤细胞三次，将细胞重悬于200μl PBS溶液，加入200μl 12％甲醛后，进行流式细胞仪分析。
实施例2：ZZ蛋白和红色荧光蛋白(DsRed-Express)的融合及其在免疫分析中的应用
1.ZZ-DsRed基因的克隆及其表达载体的构建：
通过Sal I和EcoR I双酶切从pDsRed-Express(Clontech)中得到DsRed-Express的编码序列，用T4 DNA聚合酶补平之后将其插入到依次经过XhoI酶切、碱性磷酸酶处理的、以及T4 DNA聚合酶补平的pET28a-ZZ中。连接产物转化到Top10感受态细胞之后，用针对DsRed-Express编码序列的引物通过PCR筛选阳性克隆，并通过BamH I限制性酶切的方法检验DsRed-Express基因插入的方向。DNA测序验证编码序列以及阅读框的正确性。
2.ZZ-DsRed在大肠杆菌中的表达和纯化：
将pZZ-DsRed表达质粒转化表达菌株BL21(DE3)，生长于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃生长16小时之后，将平板上所有克隆刮下接种于2升含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基。剧烈振荡培养2-3个小时直到培养液的OD600达到0.8，用1mM IPTG诱导目的蛋白的表达。4个小时之后，5000转/分钟，离心5分钟收集菌体，用冷的磷酸盐溶液洗涤沉淀并将其重新悬浮于40ml的结合缓冲液中(50mM磷酸钠，pH7.8，300mM氯化钠，40mM咪唑)。在冰浴保护下用超声波破碎菌体。在4℃，13000转/分钟，离心15分钟之后将超声破碎的细胞上清加载到一个2ml Ni-琼脂糖凝胶亲和层析柱上，上样前用结合缓冲液预平衡层析柱。用洗脱缓冲液(50mM磷酸钠，pH7.8，300mM氯化钠，250mM咪唑)洗脱ZZ-DsRed蛋白，将其对磷酸盐溶液透析后，采用Bradford法进行蛋白质定量分析。
3.酶联免疫吸附分析(ELISA)：
将100μl连续梯度稀释的ZZ-DsRed包被于96孔酶标板，置4℃过夜。用PBST洗涤4次，每次振荡洗涤15分钟。用5％脱脂牛奶于室温包被1小时之后用PBST洗涤4次。然后用100μl 1∶4000稀释的HRP标记的驴抗羊IgG抗体(Santa Cruz)在室温孵育1小时。PBST洗涤4次之后用TMB底物系统对HRP显色10分钟，终止反应后，以620nm为参照读取450nm的光吸收值。
4.Western Blotting分析ZZ-DsRed：
连续梯度稀释的ZZ-DsRed在通过SDS-PAGE分离之后转移到PVDF膜上，5％脱脂奶粉包被1小时后，用1∶2000稀释的HRP标记驴抗羊IgG抗体(SantaCruz)与膜一起温育1小时。经PBST洗涤4次之后、用ECL系统(Cell Signaling)对HRP进行显色，并对X光片曝光。
5.用ZZ-DsRed进行点杂交检测：
根据文献报道的方法(Oprandy J.J.等，Am.J.Trop.Med.Hyg.，38：181-186，1988)进行点杂交免疫分析。将2μl连续梯度稀释的GST，TNFα以及两种不同的抗体，即兔多克隆抗GST IgG(Oncogene)、鼠多克隆抗TNFα IgG(SantaCruz)点样于甲醇处理的PVDF膜上。GST和TNFα各点样两张膜，点样时PVDF膜保持湿润并置于一层用缓冲液预湿的滤纸上，下面依次是一层干滤纸，6层吸水纸，点样过程中最下层吸水纸务必保持干燥状态。点样后用5％脱脂奶粉包被PVDF膜1小时，PBST洗膜4次。对于GST和TNFα，分别用1∶500稀释的兔多克隆抗GST抗体和鼠多克隆抗TNFα抗体与膜一起温育1小时，PBST洗涤4次之后，一份用1∶200稀释的ZZ-DsRed温育1小时，另一份分别用1∶2000稀释的HRP标记羊抗兔IgG抗体和羊抗鼠IgG抗体温育1小时，PBST洗涤4次。对于点样的2种不同的抗体，在5％脱脂牛奶包被之后直接用1∶200稀释的ZZ-DsRed与膜温育1小时，PBST洗涤4次。ZZ-DsRed使用Typhoon 9410(安玛西亚公司)进行检测，激发波长488nm，检测波长520nm。HRP用ECL系统进行发光(Cell Signaling)并对X光片曝光。
6.ZZ-DsRed用于细胞免疫组化分析：
293T细胞培养于含10％胎牛血清(Hyclone)，青霉素和链霉素的DMEM培养基中(Invitrogen)。接种于玻璃载玻片培养室培养24小时之后通过标准磷酸钙转染的方法用pRK5-Flag-IRF3转染细胞。转染48小时之后用4％多聚甲醛固定细胞，于0.2％Triton X-100中处理5分钟以增加细胞的通透性。细胞在经过3％BSA/TBS包被后，与1∶100稀释的鼠单克隆抗体anti-Flag抗体(Sigma)共孵育1小时，TBS洗涤4次之后，用1∶500稀释的ZZ-DsRed或1∶500稀释的FITC标记兔抗鼠IgG(Sigma)孵育1小时。对照细胞不经过Flag抗体处理而直接用1∶500稀释的ZZ-DsRed进行孵育。细胞核用DAPI复染。细胞图像通过Carl Zeiss显微镜Axioplan 2观察，用AxioVision3.1软件获取及分析。
在实施例1中，我们成功构建了质粒pZZ-EGFP，并在大肠杆菌中表达了荧光融合蛋白ZZ-EGFP。为了简化并提高融合蛋白的纯化效率，利用pET28a载体本身的特点、在ZZ-EGFP的N端引入了含有6个组氨酸的表达标签，这样ZZ-EGFP可以很容易通过一步Ni2+螯合亲和层析进行纯化。融合蛋白的表达受T7启动子控制并受IPTG诱导调控。含有表达质粒pZZ-EGFP的BL21(DE3)在经过1mMIPTG诱导4个小时之后，菌体呈现鲜艳的绿色。根据SDS-PAGE分析，如图1a所示，在IPTG的诱导下，ZZ-EGFP得到成功表达，其表观分子量为42.7kDa，ZZ-EGFP大约占细胞总蛋白的29％，并且细胞在经过超声波破碎之后，大部分的ZZ-EGFP保持可溶性状态。在40mM咪唑存在下融合蛋白能够较好的结合于Ni-琼脂糖层析柱，并能被250mM咪唑完全洗脱下来。从1升LB培养基中，我们纯化得到了35mg ZZ-EGFP，纯度约为83％。根据分析，融合蛋白的荧光特性与EGFP相近，最大激发波长为490nm，最大发射波长为512nm。
为了检验融合蛋白的抗体结合活性，我们首先观察了ZZ-EGFP在IgG-琼脂糖亲和介质(安玛西亚公司)上的结合行为。将300μg纯化的ZZ-EGFP与50μl IgG亲和介质共同温育之后，几乎所有的绿色ZZ-EGFP都结合到介质上。这表明，在将其融合到EGFP之后，ZZ结构域仍然保留了结合IgG的活性，同时也说明可以利用IgG亲和层析对ZZ-EGFP进行纯化。随后我们通过ELISA的方法进一步观察了ZZ-EGFP对IgG的结合行为。将连续梯度稀释的ZZ-EGFP吸附于96孔酶标板，用HRP标记的抗IgG抗体进行检测。如图2a所示，用HRP标记的驴抗羊IgG可以检测到少至4ng/ml的ZZ-EGFP。并且作为阴性对照，多达66000ng/ml的大肠杆菌总蛋白没有给出检测信号。结果表明，ZZ-EGFP能够特异性地结合IgG抗体，在进一步用Western blotting分析时，我们得到了类似的结果，经过系列梯度稀释的ZZ-EGFP经过SDS-PAGE电泳并转移到PVDF膜上之后也可以被HRP标记的抗IgG抗体检测到，如图2b所示。对于驴抗羊IgG抗体，其检测ZZ-EGFP的极限为60ng。
设计ZZ-EGFP融合蛋白的目的是要将其应用于基于荧光的免疫分析，为了验证ZZ-EGFP融合蛋白既可以与抗体结合、又能够比较容易地进行检测，我们进行了点杂交免疫分析。两种不同的抗体，鼠多克隆抗TNFαIgG，兔多克隆抗GST IgG在经过系列梯度稀释之后点样于甲醇处理的PVDF膜上，并直接用ZZEGFP进行检测。如图3所示，鼠多克隆抗TNFαIgG显示了较强的结合活性，少至0.4ng的该抗体就可以被ZZ-EGFP检测到。其次是兔多克隆抗GST IgG。这表明，作为一个具有双功能的分子ZZ-EGFP不仅能够和IgG专一性结合，并且还能够很容易地进行检测，不需要加入任何其它的辅助因子或者试剂。因此ZZ-EGFP显示了较好的在免疫分析中应用的潜力。
为了验证ZZ-EGFP在Western blotting中的应用，我们使用了在大肠杆菌中表达并纯化的GST和TNFα蛋白，在经过系列梯度稀释之后点样于PVDF膜上，各两份，分别用兔抗GST抗体和鼠抗TNFα抗体进行孵育，然后一份用ZZ-EGFP处理，另一份分别用HRP标记的羊抗兔IgG抗体和羊抗鼠IgG抗体温育。如图4所示，使用ZZ-EGFP能够检测到少至9.4ng的TNFα和125ng的GST蛋白。这表明，鼠抗TNFαIgG，ZZ-EGFP拥有和传统HRP标记二抗相当的检测效果。
ZZ-EGFP潜在的最大的应用领域是免疫荧光显微镜分析。为了观察其应用的可行性，我们用pRK5-Flag-IRF3转化293T细胞。该质粒编码一种带有Flag标签的干扰素调控因子(IRF3)，该蛋白组成型表达于各种组织和细胞中，在没有被病毒感染时IRF3蛋白主要停留在细胞质中，一旦发生病毒感染并诱导产生C末端Ser的磷酸化，IRF3将会转运到细胞核中并与其它一些蛋白质形成复合物，结合到IFNα和IFNβ基因的启动子上。细胞在经过抗Flag抗体孵育之后用ZZ-EGFP检测，阴性对照为不经过Flag抗体处理而直接用ZZ-EGFP孵育的细胞，阳性对照为用FITC标记的抗IgG抗体代替ZZ-EGFP。如图5所示，根据ZZ-EGFP显示的结果，IRF3蛋白在细胞中定位于细胞质。这和阳性对照的结果一致。并且，未经Flag抗体温育的阴性对照在经过ZZ-EGFP温育后没有显示出非特异性的背景信号。这表明，ZZ-EGFP在应用于免疫荧光显微镜分析时，能够特异性的显示目标蛋白的表达和定位，给出令人满意的结果。
此外，ZZ-EGFP还可以很好地用于流式细胞分析技术中对细胞进行免疫分析检测，图6显示出ZZ-EGFP能和FITC标记的商业化二抗一样，有效地用于检测293T细胞表面整合素β3亚基。
同样我们在实例2中，也同样成功构建了质粒pZZ-DsRed，并成功地大肠杆菌中表达了荧光融合蛋白ZZ-DsRed，表达了ZZ-DsRed的菌体呈现鲜亮的红色。根据SDS-PAGE分析，如图1b所示，在IPTG的诱导下，ZZ-DsRed的表观分子量为42.7kDa。IPTG诱导后，ZZ-DsRed大约占细胞总蛋白的29％，在细胞超声破碎之后，大部分的ZZ-DsRed保持可溶性状态。在40mM咪唑存在下融合蛋白能够较好的结合于Ni-琼脂糖层析柱，并能被250mM咪唑完全洗脱下来。从1升LB培养基中我们纯化得到了35mgZZ-DsRed，纯度约为75％。融合蛋白的荧光特性与DsRed-Express相近，最大激发波长为457nm，最大发射波长为586nm。
ZZ结构域融合到DsRed之后，仍然保留了结合IgG的活性。将300μg纯化的ZZ-DsRed与50μl IgG亲和介质共同温育之后，几乎所有的红色ZZ-DsRed都结合到介质上。ELISA检测也进一步显示出ZZ-DsRed对不同IgG的结合行为：如图2a所示，用HRP标记的驴抗羊IgG可以检测到少至4ng/ml的ZZ-DsRed，作为阴性对照，多达66000ng/ml的大肠杆菌总蛋白没有给出检测信号。ZZ-DsRed能够特异性地结合IgG抗体。进一步的Western blotting分析也表现出了类似的结果，如图2b所示，驴抗羊IgG抗体能够检测到ZZ-DsRed的极限为60ng。
斑点杂交免疫分析结果显示，如图3所示，少至0.4ng的鼠多克隆抗TNFαIgG该抗体就可以被ZZ-DsRed检测到，对于兔多克隆抗GST IgG，ZZ-DsRed检测到的极限为4ng。ZZ-DsRed不仅能够和IgG结合，并且还能够很容易地进行检测，不需要加入任何其它的辅助因子或者试剂。
图4显示，当应用ZZ-DsRed进行Western blotting分析时，ZZ-DsRed能够检测到少至2.8ng的TNFα和250ng的GST蛋白；相应地，使用传统的HRP能够检测到的TNF和GST蛋白分别为少于2.8ng和31.25ng。这表明，ZZ-DsRed拥有和传统HRP标记二抗相当的检测效果。
与图5a的结果相似，图5b显示ZZ-DsRed在应用于免疫荧光显微镜分析时，能够特异性地显示目标蛋白的表达和定位，给出令人满意的结果。
因此我们有理由相信，ZZ-EGFP和ZZ-DsRed可以在免疫分析领域得到广泛的应用，这将大大降低实验研究和临床检测的成本。
Claims (12)
1.一种由免疫球蛋白结合结构域与荧光蛋白构成的融合蛋白质，其特征是在该类融合蛋白质分子中，具有免疫球蛋白结合能力的结构域和能够产生荧光的荧光蛋白融合，其N端或C端还可以分别融合具有帮助蛋白质纯化作用的融合蛋白或短肽标签、或者N端和C端同时融合有具有帮助蛋白质纯化作用的融合蛋白或短肽标签，其结构组成为：
a.ZZ-荧光蛋白
b.荧光蛋白-ZZ
c.A-ZZ-荧光蛋白
d.A-ZZ-荧光蛋白-ZZ
e.ZZ-荧光蛋白-B
f.荧光蛋白-ZZ-B
g.A-ZZ-荧光蛋白-B
h.A-荧光蛋白-ZZ-B
其中A肽、B肽分别为目前常用的融合蛋白或短肽标签，如大肠杆菌硫氧还蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白、组氨酸短肽标签、Flag标签；荧光蛋白是指能够产生荧光的蛋白质，如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种由免疫球蛋白结合结构域与荧光蛋白构成的融合蛋白质的生产方法，其特征是合成或者克隆融合蛋白质基因、构建融合蛋白质表达质粒，在常见的基因工程表达体系中进行表达。
3.根据权利要求1所述的一种由免疫球蛋白结合结构域与荧光蛋白构成的融合蛋白质的纯化方法，其特征是利用融合蛋白质上融合表达的、常用的融合蛋白或短肽标签进行亲和层析或者利用免疫球蛋白亲和层析进行分离纯化。
4.根据权利要求1所述的一种由免疫球蛋白结合结构域与荧光蛋白构成的融合蛋白质在诸如酶联免疫吸附分析、Western Blotting分析、斑点杂交检测、免疫组化分析、流式细胞分析检测、免疫芯片检测中的应用。
5.一种荧光蛋白质，其特征是由组氨酸标签His-tag、免疫球蛋白结合结构域ZZ与绿色荧光蛋白构成。
6.根据权利要求5所述的荧光蛋白质的生产方法，其特征是利用重组DNA技术在大肠杆菌中进行表达生产。
7.根据权利要求5所述的荧光蛋白质的纯化方法，其特征是利用Ni-亲和层析或者免疫球蛋白IgG亲和层析进行分离纯化，获得重组荧光蛋白质。
8.根据权利要求5所述的荧光蛋白质在各种免疫检测分析中的应用。
9.一种荧光蛋白质，其特征是由组氨酸标签His-tag、免疫球蛋白结合结构域ZZ与红色荧光蛋白构成。
10.权利要求9所述的荧光蛋白质的生产方法，其特征是利用重组DNA技术在大肠杆菌中进行表达生产。
11.权利要求9所述的荧光蛋白质的纯化方法，其特征是利用Ni-亲和层析或者免疫球蛋白IgG亲和层析进行分离纯化，获得重组荧光蛋白质。
12.权利要求9所述的荧光蛋白质在各种免疫检测分析中的应用。
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