CN103558396B - 一种甲胎蛋白的定量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种甲胎蛋白的定量检测方法，该方法由以下步骤组成：（1）将甲胎蛋白抗体与醛化糖化酶溶液混合制备酶标抗体；将甲胎蛋白抗体负载到纳米金磁微粒上；（2）甲胎蛋白抗原样品和一系列不同浓度的甲胎蛋白抗原标准品加入到负载抗体的纳米金磁微粒的免疫反应界面中进行温育，然后用血糖仪测得葡萄糖浓度，从而得到甲胎蛋白浓度与葡萄糖浓度对应关系的线性方程，最后将甲胎蛋白抗原样品的葡萄糖浓度值代入线性方程中换算出甲胎蛋白抗原样品的甲胎蛋白浓度。本发明所述方法不仅灵敏度高，而且方便快捷、成本低。

Description

一种甲胎蛋白的定量检测方法
技术领域
本发明涉及借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料，具体涉及蛋白质的检测方法。
背景技术
人体甲胎蛋白（AFP）来源于胎儿的糖蛋白，分子量约为70KDa，成人的甲胎蛋白可由恶性肿瘤产生，特别是肝癌和胚胎细胞肿瘤，70-95%的原发性肝癌患者血清中AFP含量有明显升高，在肝炎和肝硬化的患者中甲胎蛋白也常有轻微的升高。因此，对AFP的临床分子诊断显得十分重要，尤其是灵敏度检测对及早发现肿瘤并制定治疗方案极为重要。目前，测定AFP免疫检测方法较多，最常用的血清检测方法有：酶免疫法（EIA）、放射免疫法（RIA）、化学发光法以及时间分辨免疫荧光分析法（TRFIA）。其中，酶标法为半定量试剂，在准确性、灵敏度上存在很大的局限性，并且对于酶的活性极易受标记反应以及温度、pH值及溶液中离子浓度等因素的影响、线性范围窄、费时等缺点；放射性免疫法操作带放射性以及标志物放置时间短，试剂有效期较短等缺点；化学发光法的优点是灵敏度高、线性范围宽、分析时间短，但该方法尚存在下述不足：1、化学发光的产生通常是瞬间完成的，发光峰值很快衰减，而且成本较高；2、温度和pH值对发光有很大影响，制约该方法的推广使用。
因此，寻求一种方便快捷且灵敏度高的定量检测甲胎蛋白的方法一直成为业界的努力方向。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种甲胎蛋白的定量检测方法，该方法不仅灵敏度高，而且方便快捷、成本低。
本发明解决上述问题的技术方案如下：
一种甲胎蛋白的定量检测方法，该方法由以下步骤组成：
（1）分别按下述方法制备酶标抗体和负载抗体的纳米金磁微粒：
（1.1）制备酶标抗体：取8μL糖化酶溶于0.2mL体积浓度为1.25%的戊二醛，室温结合3h后用除盐柱去除游离的戊二醛，得醛化糖化酶溶液；先将0.1mg甲胎蛋白抗体溶于13μL0.15mol/L NaCl，再与所得到的醛化糖化酶溶液混合后，加入1mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液，调节pH至9.0-9.5，4℃下结合12h后加入4μL0.2mol/L赖氨酸，终止反应后4℃放置2h；
（1.2）制备负载抗体的纳米金磁微粒：取粒径为50nm的纳米金磁微粒5mg，用去离子水洗三遍，加入NaOH调pH至9.0，然后依次加入0.2mg甲胎蛋白抗体和30mg牛血清白蛋白，4℃下反应6h，外加磁性条件下磁性分离，洗涤，得到负载抗体的纳米金磁微粒；
（2）分别按下述方法进行定量线性方程的建立和甲胎蛋白抗原样品的检测：
（2.1）定量线性方程的建立：取甲胎蛋白抗原标准品，先按相同体积配制一系列不同浓度的抗原标准品溶液，再分别将每一抗原标准品溶液50μL加入到步骤（1.2)所得负载抗体的纳米金磁微粒的免疫反应界面中，先37℃温育30min，洗涤；将步骤(1.1)制备的酶标抗体配成80μg/ml悬液，在金磁纳米免疫反应界面中滴加50μL酶标抗体悬液，37℃温育30min，去离子水洗涤；然后，往所述免疫反应界面加入浓度为20mg/mL的液化淀粉溶液10μL，60℃下反应30min后用血糖仪测得葡萄糖的浓度；最后，采用平均斜率法以葡萄糖浓度对抗原标准品溶液浓度进行线性回归便得到葡萄糖浓度与甲胎蛋白浓度对应关系的线性方程；其中，所述的液化淀粉溶液是先将淀粉用PBS调成20mg/mL的淀粉溶液并煮沸，然后按淀粉溶液︰耐高温α-淀粉酶=500︰3的体积比加入耐高温α-淀粉酶得到；
（2.2）甲胎蛋白抗原样品的检测：将甲胎蛋白抗原样品加入到金磁纳米免疫反应界面中，采用与步骤（2.1）中所述检测甲胎蛋白抗原标准品中葡萄糖浓度的同样方法和反应条件，用血糖仪测得甲胎蛋白抗原样品中的葡萄糖浓度；然后，将甲胎蛋白抗原样品的葡萄糖浓度值代入步骤（2.1）所得到的线性方程中即可算出甲胎蛋白抗原样品的甲胎蛋白浓度。
上述方案中，所述的纳米金磁微粒为购于西安金磁纳米生物技术有限公司的液态产品，该产品中纳米金磁微粒的浓度为5mg/mL。
上述方案中，所述的血糖仪是市面上常见的便携式血糖仪，使用便携式血糖仪检测快、仪器试剂成本低。
本发明所述的方法利用糖化酶标记的抗体作为二抗探针，利用糖化酶水解淀粉产生葡萄糖这一过程，实现将甲胎蛋白的检测转化为葡萄糖的检测，夹心免疫反应在金磁纳米颗粒界面进行。
本发明所述的方法，其中，二抗探针为通过戊二醛交联的方法制备的酶标抗体，所述糖化酶是一种廉价的市售水解酶，与灵敏度较高的电化学发光方法相比，由于化学发光法中发光材料成本较高，因此本法成本较电化学发光法相比成本更低。
附图说明
图1是所述方法的检测过程原理示意图。
图2是纳米金磁微粒及利用其构建的免疫反应界面的透射电镜图像。
图3是纳米金磁微粒及利用其构建的免疫反应界面的紫外-可见光谱的条形图。
图4是检测不同浓度AFP的与检测到的葡萄糖浓度的线性关系图。
图5是本发明所述方法与电化学发光方法准确性的对比图。
具体实施方式
实施例1
1.制备负载抗体的纳米金磁微粒
取西安金磁纳米生物技术有限公司生产的GoldMag-CS纳米金磁微粒悬浮液（该产品浓度为5mg/mL，纳米金磁微粒的粒径为50nm）1mL，分离出纳米金磁微粒用去离子水洗三遍，加入NaOH调pH至9.0，然后依次加入0.2mg抗甲胎蛋白抗体(郑州博赛生物技术股份有限公司)、30mg牛血清白蛋白（BSA），4℃搅拌6小时后，外加磁性条件下磁性分离，洗涤，得到负载抗体的纳米金磁微粒。
参见图2，将所到的负载抗体的纳米金磁微粒在透射电镜下进行观察，可见在免疫磁性纳米颗粒周围有电子密度较低的阴影，说明制备抗体成功结合到纳米金磁颗粒上。
采用NanoDrop2000/2000c分光光度计的方法对构建过程进行表征（图3）。由图3可见抗体与纳米金磁微粒结合后溶液中抗体的浓度降低，表明抗体结合到纳米金磁颗粒上。
2.制备酶标抗体
取8μL糖化酶溶于0.2mL体积浓度为1.25%的戊二醛，室温结合3h后用除盐柱去除游离的戊二醛，得醛化糖化酶溶液；先将0.1mg甲胎蛋白抗体溶于13μL0.15mol/LNaCl，再与所得到的醛化糖化酶溶液混合后，加入1mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液，调节pH至9.0-9.5，4℃下结合12h后加入4μL0.2mol/L赖氨酸，终止反应后4℃放置2h；
3.制备液化淀粉溶液
淀粉的液化分为糊化和液化两个过程。淀粉糊化：准确称取一定量的淀粉加PBS调成20mg/mL的淀粉溶液，加热煮沸30分钟；淀粉液化：取1mL淀粉溶液加入6μL耐高温α-淀粉酶。
4.定量线性方程的建立：
（a）用去离子水将AFP抗原标准品(购于郑州博赛生物技术股份有限公司)稀释成0.01ng/ml，0.1ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，上述步骤1所得到的负载抗体的纳米金磁微粒的金磁纳米免疫反应界面中分别加入50μL不同浓度的AFP抗原溶液标准品，并在37℃下温育30min，反应完后用去离子水小心洗去未反应抗原。
（b）将步骤2合成的酶标抗体配成80μg/ml悬液，在金磁纳米免疫反应界面中滴加50μL酶标抗体悬液，37℃温育30min，去离子水小心洗涤。
（c）在金磁纳米免疫反应界面中加入10μL液化淀粉，60℃反应30min；用便携式血糖仪检测水解产生的葡萄糖的浓度。
（d）将步骤（c）所得到的葡萄糖浓度与对应抗原标准品溶液的浓度一组数据，采用平均斜率法以葡萄糖浓度对抗原标准品溶液浓度进行线性回归分析，便得到葡萄糖浓度与抗原标准品溶液浓度对应关系的线性方程△Cglucose=0.07496CAFP+0.90611，即如图4所示的标准曲线。
5.甲胎蛋白抗原浓度的检测
将南方医院捐赠的甲胎蛋白抗原血清加入到金磁纳米免疫反应界面中，采用与步骤4中所述检测甲胎蛋白抗原标准品中葡萄糖浓度的同样方法和反应条件，用便携式血糖仪测得甲胎蛋白抗原样品中的葡萄糖浓度；然后，将甲胎蛋白抗原样品的葡萄糖浓度值代入步骤4所得到的线性方程中即可算出甲胎蛋白抗原样品的甲胎蛋白浓度。上述检测原理如图1所示。
实施例2（检测低限）
一、实验材料
1.抗原：将低浓度标准品（5ng/mL）用去离子水稀释成0.005ng/mL；
抗体：甲胎蛋白单克隆一抗及二抗均购于郑州博赛生物技术股份有限公司。
2.酶标抗体：按实施例1步骤2所述方法制得。
3.底物
3.1、样品：按实施例1制得的液化淀粉。
3.2、对照品
对照品1：未经任何处理的淀粉溶液，20mg/mL。
对照品2：糊化淀粉：准确称取一定量的淀粉加PBS调成20mg/mL的淀粉溶液，加热煮沸30min。
二、实验方法
用与实施例1相同的检测方法对空白和浓度为0.005ng/mL的AFP标准品重复测定10次，按照检测低限=G+3S，G为空白组的信号响应均值，S为标准差。
表1两组浓度AFP响应量及计算结果
LLD＝G＋3S，以G＝0，则LLD＝3S，3S为0.18，假定这段范围内AFP浓度与响应量之间呈线性关系，因此，0.18相当于：0.005/0.31×0.18＝0.0029ng/mL。
在本例中，检测低限为2.9pg/mL。
实施例3（不同底物效果研究实验）
一、实验材料
1.抗原和抗体：AFP抗原标准品、甲胎蛋白单克隆一抗及二抗均购置郑州博赛生物技术股份有限公司。
2.酶标抗体：按实施例1所述方法制得。
3.底物
3.1、样品：按实施例1制得的液化淀粉。
3.2、对照品
对照品1：未经任何处理的淀粉溶液，20mg/mL。
对照品2：糊化淀粉：准确称取一定量的淀粉加PBS调成20mg/mL的淀粉溶液，加热煮沸30min。
二、实验方法
1．实验分3组，每组中实验除加入的底物不同外，其余操作相同。
2.实验过程
2.1定量标准曲线制备：将AFP抗原溶液标准品稀释成0.01ng/ml，0.1ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，在金磁纳米免疫反应界面中分别加入50μL不同浓度的AFP抗原溶液标准品，并在37℃下温育30min，反应完后用去离子水小心洗去未反应抗原。
2.2将合成的酶标抗体配成80μg/ml悬液，在纳米金磁微粒免疫反应界面中滴加50μL酶标抗体悬液，37℃温育30min，去离子水小心洗涤。
2.3将本例中制备的样品和对照品10μL依次加入纳米金磁微粒免疫反应界面中，60℃反应30min；用血糖仪检测水解产生的葡萄糖的浓度。
将步骤（c）所得到葡萄糖浓度与对应抗原标准品溶液的浓度一组数据，采用平均斜率法以葡萄糖浓度对抗原标准品溶液浓度进行线性回归分析，便得到葡萄糖浓度与抗原标准品溶液浓度对应关系的直线方程，即标准曲线；采用10个空白标本进行检测，计算平均值和标准差s，以作为检测限。
表1是不同底物检测AFP抗原效果的比较，由表1可以得出，只有将淀粉经过液化处理后才能通过血糖仪检测到葡萄糖的浓度。
表2不同底物检测AFP抗原的效果比较
-：葡萄糖浓度太低，未检测到
实施例4（准确性实验）
采用实施例1的方法对20个南方医院捐赠的甲胎蛋白抗原血清样品进行检测，临床检测方法为电化学发光，且20个样品的抗原浓度均匀分布在本方法的线性范围内。过程如下：
1、纳米金磁微粒免疫反应界面的构建
同实施例1所示步骤1。
2、酶标抗体的制备
同实施例1所示步骤2。
3、淀粉的液化
同实施例1所示步骤3。
4、本方法检测电化学发光方法检测的20个实际样品
同实施例1所示步骤5。
5、两种方法的线性回归
根据检测到的葡萄糖浓度计算出本方法检测的抗原浓度，将本方法检测的抗原浓度与电化学发光方法的抗原浓度为一组数据，采用平均斜率法以电化学发光方法的抗原浓度对本方法抗原浓度进行线性回归分析，便得到两种方法的直线方程，见图5，相关系数R=0.9984，说明两种方法的相关性好。

Claims (2)

1.一种非诊断目的的甲胎蛋白的定量检测方法，该方法由以下步骤组成：
(1)分别按下述方法制备酶标抗体和负载抗体的纳米金磁微粒：
(1.1)制备酶标抗体：取8μL糖化酶溶于0.2mL体积浓度为1.25％的戊二醛，室温结合3h后用除盐柱去除游离的戊二醛，得醛化糖化酶溶液；先将0.1mg甲胎蛋白抗体溶于13μL 0.15mol/L NaCl，再与所得到的醛化糖化酶溶液混合后，加入1mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液，调节pH至9.0-9.5，4℃下结合12h后加入4μL 0.2mol/L赖氨酸，终止反应后4℃放置2h；
(1.2)制备负载抗体的纳米金磁微粒：取粒径为50nm的纳米金磁微粒5mg，用去离子水洗三遍，加入NaOH调pH至9.0，然后依次加入0.2mg甲胎蛋白抗体和30mg牛血清白蛋白，4℃下反应6h，外加磁性条件下磁性分离，洗涤，得到负载抗体的纳米金磁微粒；
(2)分别按下述方法进行定量线性方程的建立和甲胎蛋白抗原样品的检测：
(2.1)定量线性方程的建立：取甲胎蛋白抗原标准品，先按相同体积配制一系列不同浓度的抗原标准品溶液，再分别将每一抗原标准品溶液50μL加入到步骤(1.2)所得负载抗体的纳米金磁微粒的免疫反应界面中，先37℃温育30min，洗涤；将步骤(1.1)制备的酶标抗体配成80μg/ml悬液，在金磁纳米免疫反应界面中滴加50μL酶标抗体悬液，37℃温育30min，去离子水洗涤；然后，往所述免疫反应界面加入浓度为20mg/mL的液化淀粉溶液10μL，60℃下反应30min后用血糖仪测得葡萄糖的浓度；最后，采用平均斜率法以葡萄糖浓度对抗原标准品溶液浓度进行线性回归便得到葡萄糖浓度与甲胎蛋白浓度对应关系的线性方程；其中，所述的液化淀粉溶液是先将淀粉用PBS调成20mg/mL的淀粉溶液并煮沸，然后按淀粉溶液︰耐高温α-淀粉酶＝500︰3的体积比加入耐高温α-淀粉酶得到；
(2.2)甲胎蛋白抗原样品的检测：将甲胎蛋白抗原样品加入到金磁纳米免疫反应界面中，采用与步骤(2.1)中所述检测甲胎蛋白抗原标准品中葡萄糖浓度的同样方法和反应条件，用血糖仪测得甲胎蛋白抗原样品中的葡萄糖浓度；然后，将甲胎蛋白抗原样品的葡萄糖浓度值代入步骤(2.1)所得到的线性方程中即可算出甲胎蛋白抗原样品的甲胎蛋白浓度。
2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的甲胎蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述的血糖仪为便携式血糖仪。
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