JP5726431B2 - 標的検出装置及び標的検出方法 - Google Patents
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Description
しかしながら、前記ELISA法、及び前記イムノクロマトグラフィでは、被測定物の検出に特殊な機器を必要とする場合があった。また、液相の抗原と固相の擬似抗原との間で競合反応が起こるため、十分な検出感度が得られないという問題があった。また、前記ELISA法では、カドミウムの検出においては、抗原抗体反応に1時間〜2時間を要し、2次抗原を用いる場合には、更にそれ以上の時間を要するという問題があった。また、前記イムノクロマトグラフィでは、サンプルをスポットしてからサンプルがテストラインに達するまでに30分間〜1時間を要するという問題があった。
しかし、この提案では、測定セルの蓋がメッシュやスポンジであったため、粒子の収容状態が不均一になる場合や、測定毎に収容数が変わる場合があった。また、測定用セルから測定試料が漏れ出たり、測定用セルに気泡が混入する恐れがあった。更に、前記ELISA法よりも短時間で測定できるものの、粒子の測量や収容が手作業のため手間がかかるという問題があった。
また、前記測定セルは、粒子が多層で収容されるようになっているため、収容状態が不均一になる場合や、測定毎に収容数が変わる場合があることにより、測定信号が変化し、測定誤差が大きくなる、検出の再現性に劣るという問題があった。また、検出感度が低いという問題があった。
しかしながら、前記技術は、マイクロチップの下流側の排出口の流路幅をビーズ担体の粒子径より狭くしていることにより、収容エリア内の液体が下流側への流れにくいため測定に時間を有し、ビーズ担体を収容する際にビーズ担体が導入口から収容エリア外に押し戻され、収容状態が不均一になることや、測定毎に収容数が変わり、測定誤差が生じるという問題があった。また、収容ビーズの流れが悪くなり、収容に時間がかかるという問題があった。
また、前記技術は、ビーズが多層で収容されるようになっているため、収容状態が不均一になる場合や、測定毎に収容数が変わる場合があることにより、測定信号が変化し、測定誤差が大きくなる、検出の再現性に劣るという問題があった。また、検出感度が低いという問題があった。
しかしながら、前記収容領域は、ビーズが多層に収容されるようになっているため、収容状態が不均一になる場合や、測定毎に収容数が変わる場合があることにより、測定信号が変化し、測定誤差が大きくなる、検出の再現性に劣るという問題があった。また、検出感度が低いという問題があった。
<1> 被測定試料を透過した光の量を測定するのに使用される測定用部材であって、
前記被測定試料を流す被測定試料流路と、
前記被測定試料流路に形成され、基材粒子を収容する収容領域と、
前記収容領域に連通され、前記基材粒子を前記収容領域に流す基材粒子供給流路とを有し、
前記収容領域における、前記被測定試料の流れ方向に直交する方向の断面の短手方向の長さが、前記基材粒子が前記収容領域に単層で配置可能な長さであることを特徴とする測定用部材である。
該<1>の測定用部材においては、前記基材粒子が前記収容領域と前記基材粒子供給流路との間を往来することにより、前記基材粒子を前記収容領域に手作業で収容する手間が省かれ、かつ、手作業を要しないために気泡の混入や試料の漏れが効果的に抑制される。また、前記収容領域における、前記被測定試料の流れ方向に直交する方向の断面の短手方向の長さが、前記基材粒子が前記収容領域に単層で配置可能な長さであることにより、前記基材粒子供給流路から流された前記基材粒子は、前記収容領域に均一に収容され、かつ、測定毎の収容数のむらが少なくなる。
<2> 収容領域が、前記収容領域以外の被測定試料流路への基材粒子の流出を防ぐ流出防止手段により画成される前記<1>に記載の測定用部材である。
該<2>の測定用部材においては、前記収容領域が、前記流出防止手段により画成されていることにより、前記収容領域から前記収容領域以外の前記被測定試料流路への前記基材粒子の流出が防止される。
<3> 収容領域における、被測定試料の流れ方向と、被測定試料の流れ方向に直交する方向の断面の長手方向とから形成される面の面積(D)と、前記収容領域に収容された全ての基材粒子の表面積の合計面積(d)との比(d/D)が、3.14以上3.63以下である前記<1>から<2>のいずれかに記載の測定用部材である。
該<3>の測定用部材においては、収容領域における、被測定試料の流れ方向と、被測定試料の流れ方向に直交する方向の断面の長手方向とから形成される面の面積(D)と、前記収容領域に収容された全ての基材粒子の表面積の合計面積(d)との比(d/D)が特定範囲であることにより、高い感度で測定される。
<4> 収容領域における、被測定試料の流れ方向に直交する方向の断面の短手方向の長さが、基材粒子の体積平均粒子径の1.0倍以上2.0倍未満の長さである前記<1>から<3>のいずれかに記載の測定用部材である。
該<4>の測定用部材においては、前記収容領域における、前記被測定試料の流れ方向に直交する断面の短手方向の長さが、前記基材粒子の体積平均粒子径の1.0倍以上2.0倍未満の長さであることにより、前記基材粒子は前記収容領域に、より均一に収容され、かつ、測定毎の収容数のむらがより少なくなる。
<5> 基材粒子が、球形であり、基材粒子を基材粒子供給流路から収容領域に流す供給口の面積が、前記基材粒子の半球断面の面積の4/π倍から20/π倍である前記<1>から<4>のいずれかに記載の測定用部材である。
該<5>の測定用部材においては、前記基材粒子が、球形であり、前記基材粒子を前記基材粒子供給流路から前記収容領域に流す前記供給口の面積が、前記基材粒子の半球断面の面積の4/π倍から20/π倍であることにより、前記供給口を適当な数の前記基材粒子が通過することになり、測定毎の収容数のむらがより少なくなり、かつ、測定時の前記被測定試料流路から前記基材粒子供給流路への前記被測定試料の流れ込みが効果的に抑制される。
<6> 供給口が、収容領域における、測定時の被測定試料の流れ方向における上流側の端部に配置されている前記<5>に記載の測定用部材である。
該<6>の測定用部材においては、前記供給口が、前記収容領域における、測定時の前記被測定試料の流れ方向における上流側の端部に配置されていることにより、測定後に、前記収容領域から前記基材粒子供給流路に前記基材粒子を排出する作業が、迅速かつ完全に行われる。
<7> 測定時の被測定試料の流れ方向において収容領域よりも下流側の被測定試料流路に、前記被測定試料流路に流れを生じさせる通液手段を有し、
測定時の被測定試料の流れ方向において収容領域よりも上流側の被測定試料流路に、前記被測定試料流路の流量を調節する流量調節手段を有する前記<1>から<6>のいずれかに記載の測定用部材である。
該<7>の測定用部材においては、前記通液手段により前記被測定試料流路に流れを生じさせ、かつ、前記流量調節手段により、測定時の前記被測定試料の流れ方向において前記収容領域よりも上流側の前記被測定試料流路の流量を、測定時の前記被測定試料の流れ方向において前記収容領域よりも下流側の前記被測定試料流路の流量よりも少なくすることにより、前記収容領域と前記基材粒子供給流路との間の流れが円滑になり、前記収容領域における前記基材粒子の収容及び除去が自動かつ迅速に行われる。
<8> 前記<1>から<7>のいずれかに記載の測定用部材と、
被測定試料である標的を捕捉する標的捕捉体を担持させた基材粒子が収容された収容領域に光を照射する発光手段と、
前記発光手段から前記収容領域に照射された光のうち、前記収容領域を透過する透過光を受光し、受光した透過光の光量を測定する受光手段とを有することを特徴とする標的検出装置である。
該<8>の標的検出装置においては、前記測定用部材を用いることにより、前記基材粒子が前記収容領域に単層で配置されることで、多層で配置した場合と比較して、前記基材粒子の収容状態が均一になることから、測定毎の透過光量の変動が非常に少なくなり、測定誤差が少なく、検出の再現性が良く標的が検出される。また、前記基材粒子が前記収容領域に単層で配置されることで、多層で配置した場合と比較して、透過光量が多く、高い感度で標的が検出される。
<9> 前記<1>から<7>のいずれかに記載の測定用部材の収容領域に、被測定試料である標的を捕捉する標的捕捉体を担持させた基材粒子を収容する収容工程と、
前記標的を被測定試料流路に流し、前記標的に前記収容領域を通過させ標的捕捉体が標的を捕捉する捕捉工程と、
前記標的を検出する検出工程とを含むことを特徴とする標的検出方法である。
該<9>の標的検出方法においては、前記測定用部材を用いることにより、前記収容領域に前記基材粒子が単層で配置されることで、多層で配置した場合と比較して、前記基材粒子の収容状態が均一になることから、測定毎の透過光量の変動が非常に少なくなり、測定誤差が少なく、検出の再現性が良く標的が検出される。また、前記基材粒子が前記収容領域に単層で配置されることで、多層で配置した場合と比較して、透過光量が多く、高い感度で標的が検出される。
<10> 収容工程が、通液手段により被測定試料流路に測定時の被測定試料の流れ方向と順方向の流れを生じさせ、かつ、流量調節手段により、測定時の前記被測定試料の流れ方向において収容領域よりも上流側の前記被測定試料流路の流量を、測定時の前記被測定試料の流れ方向において前記収容領域よりも下流側の前記被測定試料流路の流量よりも少なくすることにより、基材粒子を基材粒子供給流路から前記収容領域に移動させ、前記収容領域に前記基材粒子を収容する工程である前記<9>に記載の標的検出方法である。
該<10>の標的検出方法においては、前記通液手段により前記被測定試料流路に測定時の前記被測定試料の流れ方向と順方向の流れを生じさせ、かつ、前記流量調節手段により前記被測定試料流路の流量を調節することにより、前記収容領域と前記基材粒子供給流路との間の流れが円滑になり、前記収容領域に前記基材粒子が自動かつ迅速に収容される。
<11> 通液手段により被測定試料流路に測定時の被測定試料の流れ方向と逆方向の流れを生じさせ、かつ、流量調節手段により、測定時の前記被測定試料の流れ方向において収容領域よりも上流側の前記被測定試料流路の流量を、測定時の被測定試料の流れ方向において前記収容領域よりも下流側の前記被測定試料流路の流量よりも少なくすることにより、基材粒子を前記収容領域から基材粒子供給流路に移動させ、前記収容領域から前記基材粒子を除去する除去工程を含む前記<9>から<10>のいずれかに記載の標的検出方法である。
該<11>の標的検出方法においては、前記通液手段により前記被測定試料流路に測定時の前記被測定試料の流れ方向と逆方向の流れを生じさせ、かつ、前記流量調節手段により前記被測定試料流路の流量を調節することにより、前記収容領域と前記基材粒子供給流路との間の流れが円滑になり、前記収容領域に前記基材粒子が自動かつ迅速に除去される。
<12> 標的及び標的捕捉体のいずれかが抗原、他方が抗体である前記<9>から<11>のいずれかに記載の標的検出方法である。
該<12>の標的検出方法においては、前記測定用部材を用いることにより、短時間で測定誤差が少なく、検出の再現性が良く、高い感度のイムノアッセイが行われる。
本発明の測定用部材は、被測定試料を透過した光の量を測定するのに使用される測定用部材であって、被測定試料流路と、収容領域と、基材粒子供給流路とを少なくとも有し、必要に応じて、その他の部を有する。
前記被測定試料流路は、被測定試料を流す流路である。
また、前記断面形状の短手方向の長さとしては、0.05mm〜1.00mmが好ましく、0.08mm〜0.50mmがより好ましく、0.10mm〜0.30mmが特に好ましい。前記断面形状の短手方向の長さが、0.05mm未満であると、前記収容領域への前記被測定試料の流れが悪くなることがあり、1.00mmを超えると、前記収容領域への前記被測定試料の流れが不安定になることがある。前記断面形状の短手方向の長さが、前記特に好ましい範囲内であると、前記収容領域への前記被測定試料の流れがより安定になる点で有利である。
前記収容領域は、前記被測定試料流路に形成され、基材粒子を収容する領域である。前記収容領域を前記被測定試料流路に形成することで、計量を必要とせずに一定量の前記基材粒子を前記収容領域に収容することができる。
前記収容領域に収容される前記基材粒子としては、その形状、構造、大きさ、材質などについては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、光が透過可能な粒子であってもよく、光を乱反射させる粒子であってもよい。
また、前記基材粒子は、標的を捕捉する標的捕捉体などが担持されていてもよい。
前記基材粒子供給流路は、供給口により前記収容領域に連通され、前記基材粒子を前記収容領域に流す流路である。前記基材粒子供給流路から前記収容領域に前記基材粒子を流し、収容させることにより、手作業を必要とせずに簡便に前記基材粒子を前記収容領域に収容させることができる。
また、測定終了後には、前記収容領域に収容された前記基材粒子を、前記基材粒子供給流路に戻すことにより、前記測定用部材は繰り返しの使用が可能となる。
また、前記断面形状の短手方向の長さとしては、0.05mm〜1.00mmが好ましく、0.08mm〜0.50mmがより好ましく、0.10mm〜0.30mmが特に好ましい。
前記供給口は、前記基材粒子を前記基材粒子供給流路から前記収容領域に流すための開口である。前記供給口を通じて、前記基材粒子は、前記基材粒子供給流路と前記収容領域とを往来する。
なお、前記半球断面の面積は、π(R/2)2(Rは、前記基材粒子の体積平均粒子径)により計算される面積である。
前記その他の部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、流出防止手段、通液手段、流量調節手段、貯留部などが挙げられる。
前記流出防止手段としては、前記収容領域以外の前記被測定試料流路への前記基材粒子の流出を防止できるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記収容領域の、前記被測定試料の流れ方向の両端部に設けた、格子、複数の突起、流路幅を横断する突起などが挙げられる。なお、前記流出防止手段は、前記被測定試料の流れを遮ることなく、前記基材粒子の流出を防止する。
前記通液手段としては、前記被測定試料流路に流れを生じさせる手段であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポンプ、シリンジなどが挙げられる。
また、前記通液手段により、前記被測定試料流路に測定時の前記被測定試料の流れ方向と逆方向の流れを生じさせ、前記収容領域に収容された前記基材粒子を前記収容領域から前記基材粒子供給流路に移動させ、前記収容領域から前記基材粒子を除去することができる。
前記流量調節手段としては、前記被測定試料流路の流量を調節することができる手段であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記被測定試料流路の側壁にゴムなどの伸縮性膜を設置し、該伸縮性膜を伸ばして流路を狭くして流量を調節する手段などが挙げられる。前記伸縮性膜を伸ばす方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポンプを利用した空気圧、水圧などにより伸ばすことができる。
例えば、測定前に前記基材粒子を前記収容領域に収容する場合には、前記上流側被測定試料流路に前記流量調節手段を設置するとともに、前記下流側被測定試料流路に前記通液手段を設置して、前記通液手段により測定時の前記被測定試料の流れ方向と順方向の流れを生じさせ、かつ、前記流量調節手段により、前記上流側被測定試料流路の流量を、前記下流側被測定試料流路の流量よりも少なくすることにより、前記基材粒子供給流路から前記収容領域への流れが多くなり、収容を自動かつ迅速に行うことができる。
また、測定後に前記基材粒子から前記収容領域を除去する場合には、前記上流側被測定試料流路に前記流量調節手段を設置するとともに、前記下流側被測定試料流路に前記通液手段を設置して、前記通液手段により測定時の前記被測定試料の流れ方向と逆方向の流れを生じさせ、かつ、前記流量調節手段により前記上流側被測定試料流路の流量を、前記下流側被測定試料流路の流量よりも少なくすることにより、前記収容領域から前記基材粒子供給流路への流れが多くなり、除去を自動かつ迅速に行うことができる。
前記貯留部としては、前記被測定試料及び前記基材粒子のいずれかを貯留しておくことができるものであれば、その材質、形状、大きさ、構造などについては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記貯留部の設置位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記基材粒子供給流路の端部、前記上流側被測定試料流路の端部などが挙げられる。
−測定用部材の材料−
前記測定用部材の材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、紫外又は可視光感光性高分子、PDMS(ポリジメチルシロキサン)に代表される透明シリコンエラストマー、PMMA(ポリメチルメタクリレート)、COP(シクロオレフィンポリマー)等の熱可塑性樹脂、ガラス、金属、石英などが挙げられる。
前記PDMSは、シリコンエラストマーの一種である。透明性が極めて高く、光学的特性に優れており、広い波長領域、特に、可視光領域での吸収が極めて小さく、蛍光検出に適している。また、フォトリソグラフィ、鋳型法を用いることによりナノからミクロンオーダーの任意の微細構造を有する微細加工が容易である。更に、前記PDMS自体が、ガラス及びアクリル樹脂等のプラスチックに対する良好な吸着性及び剥離性を有しており、微細加工が施された前記PDMS部材にこれら素材からなる基板を貼り付けることにより、マイクロ流路やチャンバーを容易に形成することが可能である。
なお、前記材料を2種以上併用する場合、例えば、前記収容領域が光を透過させる材料で形成されていれば、その他の流路などは、光透過性のない材料で形成されていてもよい。
前記測定用部材の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フォトリソグラフィ、電子ビームリソグラフィ等の電離放射線リソグラフィ、AFMリソグラフィ、物理的エッチング、化学的エッチング等により、前記被測定試料流路、前記収容領域、前記基材粒子供給流路等を形成する方法、微細加工用ドリル、ブロード等を用いて機械的切削加工により前記被測定試料流路、前記収容領域、前記基材粒子供給流路等を形成する方法などが挙げられる。また、前記フォトリソグラフィなどにより作製した所望の形状の流路などと反転する凸部構造を有する鋳型を用いて、転写することにより、間接的に流路などを形成することも可能である。
本発明の標的検出装置は、前記測定用部材と、発光手段と、受光手段とを少なくとも有し、更に必要に応じて、その他の手段を有する。
前記発光手段としては、少なくとも光源を備え、前記被測定試料である標的を捕捉する標的捕捉体を担持させた前記基材粒子が収容された前記収容領域に光を照射する手段であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記光源としては、例えば、レーザ、発光ダイオード、ハロゲンランプ、タングステンランプなどが挙げられる。また、前記発光手段は、前記光源を1つ有していてもよく、2つ以上有していてもよい。
前記単色光選択発光部によれば、前記発光手段から発光された複色光又は二以上の単色光を、一の単色光として前記収容領域に照射することができ、更にその単色光を他の単色光に変更することにより、例えば、前記収容領域内の前記基材粒子に付着した二以上の発色物質の透過光量を測定することができる。
前記基材粒子は、前記被測定試料である前記標的を捕捉する前記標的捕捉体が担持されている。
前記標的としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗体、抗原、アレルゲン、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害剤、ホスト化合物、ホルモン、ホルモンレセプター、タンパク質、細胞、細胞破砕物、核物質、ウイルス、代謝産物、神経伝達物質、ハプテン、薬物、核酸、カドミウム等の重金属、金属錯体、微生物、寄生虫、細菌、ビオチン、アビジン、レクチン、糖、生理活性物質、生理活性物質受容体、PCB等の環境化学物質、化学種又はこれらの誘導体、などが挙げられる。これらは、検出方法に応じて、標識がされていてもよい。
前記標的捕捉体としては、前記被測定試料である前記標的を捕捉することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記標的がそれぞれ、前記酵素である場合には、例えば該酵素の補酵素であり、前記補酵素である場合には、例えば、該補酵素を補酵素とする酵素であり、前記ホスト化合物である場合には、例えば、該ホスト化合物のゲスト化合物(包接される成分)であり、前記抗体である場合には、例えば、該抗体の抗原としてのタンパク質、カドミウム等の重金属、PCB等の環境化学物質、などであり、前記タンパク質である場合には、例えば、該タンパク質を抗原とする抗体であり、前記核酸である場合には、例えば、該核酸と相補的な核酸、チューブリン、キチン、などであり、前記ホルモンレセプターである場合には、例えば、該ホルモンレセプターに受容されるホルモンであり、前記レクチンである場合には、例えば、該レクチンに受容させる糖であり、前記生理活性物質受容体である場合には、例えば、該生理活性物質受容体に受容される生理活性物質などから形成されるものが挙げられる。
前記基材粒子に前記標的捕捉体を担持させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、物理吸着、化学吸着などが挙げられる。これらは、例えば、水素結合、分子間力(ファン・デル・ワールス力)、配位結合、イオン結合、共有結合などが挙げられる。
前記受光手段としては、前記発光手段から前記収容領域に照射された光のうち、前記収容領域を透過した透過光を受光し、受光した光量を測定可能なものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、測定手段、相対吸光度計算手段、固定手段などが挙げられる。
−測定手段−
前記測定手段としては、前記受光手段により受光した光量を、電気信号の信号強度として計測可能な手段であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記受光手段と接続されることにより、前記受光手段により受光した光量を、電気信号の信号強度として変換し、出力する手段が挙げられる。
前記相対吸光度計算手段としては、前記受光手段で測定された透過光の光量について、基準となる光量から相対吸光度を計算する手段であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記収容領域に光を照射し、前記基材粒子を収容した前記収容領域に前記被測定試料を供給した前記収容領域の透過光と、前記被測定試料を含まない基準試料を供給した前記収容領域の透過光とから相対吸光度を計算する相対吸光度計算手段が挙げられる。
前記固定手段は、前記測定用部材を固定する手段であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記測定用部材の一部を挟持部材により挟持して固定する手段が挙げられる。前記固定手段を用いることで、前記収容領域が動かなくなり、前記収容領域に確実に光を照射することができる。
本発明の標的検出方法は、収容工程と、捕捉工程と、検出工程とを少なくとも含み、必要に応じて、その他の工程を含む。
前記収容工程としては、前記被測定試料である前記標的を捕捉する前記標的捕捉体を担持させた基材粒子を前記収容領域に収容する工程であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記通液手段を前記下流側被測定試料流路に有し、かつ、前記流量調節手段を前記上流側被測定試料流路に有した状態で、前記通液手段により前記被測定試料流路に測定時の前記被測定試料の流れ方向と順方向の流れを生じさせ、かつ、前記流量調節手段により前記上流側被測定試料流路の流量を、前記下流側被測定試料流路の流量よりも少なくすることにより、前記収容領域に前記基材粒子を収容する工程が、前記基材粒子供給流路から前記収容領域に流れる流量を、前記上流側被測定試料流路から前記収容領域に流れる流量よりも多くし、収容を自動かつ迅速に行うことができる点で好ましい。
前記捕捉工程としては、前記標的を前記被測定試料流路に流し、前記標的に前記収容領域を通過させ前記標的捕捉体が前記標的を捕捉する工程であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記標的捕捉体が前記標的を捕捉する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、物理吸着、化学吸着などが挙げられる。これらは、例えば、水素結合、分子間力(ファン・デル・ワールス力)、配位結合、イオン結合、共有結合などが挙げられる。
前記検出工程としては、前記標的を検出する工程であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記収容領域に光を照射し、照射された光のうち、前記収容領域を透過した透過光を受光し、受光した透過光の光量を測定して標的を検出する工程が挙げられる。この場合、前記収容領域における、前記被測定試料の流れ方向に直交する方向の断面の短手方向の長さ方向と平行な方向に光を照射することが、感度が高い測定ができる点、及び検出の再現性が良い点で好ましい。
前記その他の工程としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、除去工程などが挙げられる。
前記除去工程としては、前記収容領域に収容された前記基材粒子を前記収容領域から除去し、前記基材粒子供給流路に戻す工程であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記通液手段を前記下流側被測定試料流路に有し、かつ、前記流量調節手段を前記上流側被測定試料流路に有した状態で、前記通液手段により前記被測定試料流路に測定時の前記被測定試料の流れ方向と逆方向の流れを生じさせ、かつ、前記流量調節手段により前記上流側被測定試料流路の流量を、前記下流側被測定試料流路の流量よりも少なくすることにより、前記基材粒子を前記収容領域に除去する工程が、前記収容領域から前記基材粒子供給流路への流量を、前記収容領域から前記上流側被測定試料流路への流量よりも多くし、除去を自動かつ迅速に行うことができる点で好ましい。
<測定用部材の作製>
PDMSを用いた公知のフォトリソグラフィ工程により、図6A及び図6Bに示す本発明の測定用部材を製造した。具体的には、シリコン基板にフィルム状レジスト(化薬マイクロケム(株)、SU−8フィルム)を積層し、各層ごとに露光した。露光後の基板を現像し表面処理した後、これを鋳型としてPDMSプレポリマー(主剤:硬化剤=10:1(質量比))を塗布し、オーブンで熱硬化(80℃、2時間)させた。硬化したPDMSを鋳型から剥離し、洗浄した後、酸素プラズマ処理してスライドガラス(28mm×76mm)と接合し、測定用部材を作成した。
基材粒子として体積平均粒子径103μmのポリメタクリル酸メチル製の粒子(以下、「PMMAビーズ」と略すことがある。)を用いた。用いた前記PMMAビーズは、ガンツパールGM−100S−A(ガンツ化成株式会社製)を、2種の異なる孔径の篩い(孔径106μm、及び100μm)を用いて篩い分けして、100μm〜106μmの粒度分布にしたものである。作製した測定用部材1の貯留部9に、水に懸濁させた前記PMMAビーズを入れた。使用した前記PMMAビーズの数は、収容領域3に収容できる前記PMMAビーズの数の4.0倍とした。
続いて、通液手段7(シリンジポンプ、商品名;KDS-120、Kd scientific社製))を作動させ、送液速度を400μL/分とし、被測定試料流路に測定時の被測定試料の流れ方向と順方向の流れを生じさせた。続いて、上流側被測定試料流路2aに設置した流量調節手段8(伸縮膜8a(素材;PDMS)及びポンプ8b(シリンジポンプ、商品名;KDS-120、Kd scientific社製))を用い、前記ポンプ8bの加圧により前記伸縮膜8aを伸ばして前記上流側被測定試料流路2aの流路を狭くすることにより、前記上流側被測定試料流路2aの流量を下流側被測定試料流路2bの流量よりも少なくした。この際、流路には水を通液させた。
上記操作により、基材粒子供給流路4から収容領域3への流れが生じ、前記収容領域3へ前記PMMAビーズが流れていき、前記収容領域3に前記PMMAビーズが収容された。図7に、前記PMMAビーズが前記収容領域3に収容されている途中の写真を示す。図3A及び図3Bに示す模式図と同様に、前記PMMAビーズは、前記収容領域3に単層に配置され、かつ均一に収容された。前記PMMAビーズを前記貯留部9に入れてから収容までにかかった作業時間は1分であった。
なお、前記収容領域3に収容された前記PMMAビーズの表面積の合計面積(d)は、14.4mm2であり、前記被測定試料の流れ方向に直交する方向の断面の長手方向とから形成される面の面積(D)と、前記収容領域に収容された全ての前記基材粒子の表面積の合計面積(d)との比(d/D)は3.60であった。
前記収容領域3に前記PMMAビーズを収容した状態のまま、貯留部10にメチレンブルー1重量%水溶液を入れた。
続いて、前記ポンプ8bによる前記伸縮膜8aへの加圧を止めることで、前記上流側被測定試料流路2aと前記下流側被測定試料流路2bの流量を同量にしてから、被測定試料流路にメチレンブルー溶液を送液速度400μL/分で流した。流し始めてから0.5分経過後の流路の写真を図8示す。メチレンブルー(図8では黒色)が、前記収容領域3から前記基材粒子供給流路4へほとんど流れ込んでいないことを確認した。これは、供給口5の適度な大きさ、過剰な前記PMMAビーズが前記供給口5を塞いだこと、及び前記基材粒子供給流路4に溜まった過剰な前記PMMAビーズが前記基材粒子供給流路4の流れ抵抗を大きくしたことによると考えられる。
続いて、流量調節手段8の操作は保持した状態で、通液手段7を作動させ、送液速度を400μL/分とし、測定時の被測定試料の流れ方向と逆方向に流れを生じさせた。この際、流路には水を通液させた。すると、前記収容領域3の前記PMMAビーズは迅速に前記収容領域3から除去され、基材粒子供給流路4へと移動した。前記通液手段7により流れを生じさせてから全ての前記PMMAビーズが前記基材粒子供給流路4に流れる時間は、1分であった。
<カドミウム濃度の測定>
実施例1で作製した測定用部材を用いて、抗原抗体反応によるカドミウムの濃度の測定を行った。
−基材粒子への擬似抗原の担持(担持粒子Aの作製)−
基材粒子として前記PMMAビーズを用いた。前記PMMAビーズに擬似抗原の担持を行った。前記PMMAビーズへの擬似抗原の担持は、以下の方法により行った。
まず、0.4gの前記PMMAビーズを900μLのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)に懸濁し懸濁液を得た。続いて、該懸濁液に100μLの10%BSA(ウシ血清アルブミン)(シグマアルドリッチ社製)を添加して2時間撹拌し後に、前記懸濁液を100mMホウ酸緩衝液(pH9.8)で4回洗浄した。次に、前記懸濁液に800μLの100mMホウ酸緩衝液(pH9.8)と165μLの1mg/mLイソチオシアネートブチルベンジル−EDTA(ホウ酸緩衝液に溶解)を添加して2時間撹拌した後に、前記懸濁液を50mM MES緩衝液(pH6.5)で4回洗浄した。洗浄後、CdCl2水溶液を最終濃度2mMになるように添加し、15分間撹拌した後に50mM MES緩衝液(pH6.5)で4回洗浄した。上記操作により、擬似抗原を担持したPMMAビーズ(以下「担持粒子A」と略すことがある。)を作製した。担持粒子Aの体積平均粒子径は103μmであった。
−−金コロイド標識抗体液の調製−−
被測定試料には、カドミウム−EDTAに特異的に結合するモノクローナル抗体として、ハイブリドーマNx2C3株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成16年2月26日付けで受託番号FERM P−19703として寄託されている)により産生されるモノクローナル抗体(以下、「Nx2C3抗体」という)を用いた。
定法に従って直径10nmから20nmの金コロイド粒子を調製し、定法に従ってNx2C3抗体を金コロイド標識し、金コロイド標識抗体液を調製した。
前記金コロイド標識抗体液、カドミウム−EDTA、50mM Tris 緩衝液(PH7.5)を混合し、カドミウム濃度の異なる被測定試料溶液を調製した。調製した被測定試料溶液のカドミウムの濃度は、0.01ppb、0.02ppb、0.1ppb、0.6ppb、1ppb、2ppb、6ppb、11ppb、22ppb、55ppb、112ppb、225ppb、1,124ppb、であった。また、カドミウム−EDTAを加えないブランクの被測定試料溶液も作製した。なお、これら溶液の抗体濃度は0.02ppbとした。
非特許文献(イムノアッセイによる絶縁油中のポリ塩化ビフェニルのスクリーニング/大村直也;Thomas R.Glass;佐々木和裕)に記載の携帯型の透過光量測定器(柴田科学社製、Imny)を、前記測定用部材が設置できるよう改造して用いた。光源には、金コロイドの吸収波長である530nmのLEDを用いた。照射された光は前記Nx2C3抗体を標識する金コロイドに吸収され、透過光は、検出セル背面に設置されたフォトダイオードによって光電変換されて電気信号(電圧V)として計測される。
前記透過光量測定器の発光手段から照射される光の光路上に、実施例1で作製した測定用部材を設置した。なお、発光手段から照射される光が収容領域3を透過し、かつ収容領域3における、被測定試料の流れ方向に直交する方向の断面の短手方向の長さ方向と平行な方向に光が照射されるように設置を行った。
前記透過光量測定器へ設置した前記測定用部材の貯留部9に、MES緩衝液に懸濁させた前記担持粒子Aを入れた。使用した前記担持粒子Aの数は、収容領域3に収容できる前記担持粒子Aの数の4.0倍とした。
続いて、通液手段7を作動させ、送液速度を400μL/分とし、被測定試料流路に測定時の被測定試料の流れ方向と順方向の流れを生じさせた。続いて、上流側被測定試料流路2aに設置した流量調節手段8(伸縮膜8a及びポンプ8b)を用い、前記ポンプ8bの加圧により前記伸縮膜8aを伸ばして前記上流側被測定試料流路2aの流路を狭くすることにより、前記上流側被測定試料流路2aの流量を下流側被測定試料流路2bの流量よりも少なくした。
上記操作により、基材粒子供給流路4から前記収容領域3への流れが生じ、前記収容領域3へ前記担持粒子Aが流れていき、前記収容領域3に前記担持粒子Aが収容された。前記担持粒子Aを前記貯留部9に入れてから収容までにかかった作業時間は1分であった。なお、気泡の混入は見られなかった。
なお、前記収容領域3に収容された前記担持粒子Aの表面積の合計面積(d)は、14.4mm2であった。
前記担持粒子Aが収容された前記収容領域3へ、前記透過光量測定器により光を照射し、透過光量を測定した。このときの信号値をネガティブコントロールとした。
貯留部10へ前記被測定試料溶液を流し込み、前記上流側被測定試料流路2aを経由して前記収容領域3へ通液した。通液は、前記通液手段7により行った。送液速度は400μL/分とし、前記被測定試料溶液の送液量は2mLとした。
2mLの前記被測定試料溶液を前記収容領域3に通液した後、前記収容領域3にPBS−BSA緩衝液1mLを送液速度400μL/分で通液し、前記収容領域3及び被測定試料流路に残った、前記担持粒子Aの抗原と反応しなかった前記被測定試料を除去した。そして、1mLを通液し終わったときの透過光量を測定した。このときの信号値をポジティブコントロールとした。なお、通液中に試料液が漏れ出ることはなかった。
前記一連の測定におけるポジティブコントロール(P)とネガティブコントロール(N)とから、その測定における吸光度Lx(Lx=log10(N/P))を求めた。
そして、カドミウム濃度が0ppbの被測定試料溶液による測定結果の吸光度(L0)を基準(1.0)として、各カドミウム濃度の被測定試料溶液による測定結果の吸光度を標準化(Lx/L0)した。そして、Lx/L0を標準化吸光度とした。
標準化吸光度とカドミウム濃度との関係を図9に示す。
<カドミウム濃度の測定>
比較実験として、特許文献3(特開2006−215013号公報)の実験例3に記載の測定用セルを用いて、抗原抗体反応によるカドミウム濃度の測定を行った。
前記測定用セルは、ポリスチレン素材で構成されており、セル内の大きさが内径2mm×高さ5.5mmの筒状のセルであった。前記測定用セルは、使用する基材粒子の大きさに比べ、セルの内径が大きいため、基材粒子は、セル内において、多層、即ち、立体的に配置される。
基材粒子として、前記実施例2で作製した担持粒子Aを使用した。
前記実施例2の被測定試料溶液の調製において、カドミウム濃度を、0ppb、0.05ppb、0.5ppb、5ppb、50ppbとした以外は、前記実施例2の被測定試料溶液の調製方法と同様にして、被測定試料溶液を調製した。
前記測定用セルに担持粒子Aを手で収容し、続いて、前記担持粒子Aが漏れ出ないように、開口に綿状ポリプロピレンを詰め込んだ。収容に要した作業時間は3分であった。
実施例2で用いた透過光量測定器を使用し、前記測定用セルを光路上に配置した。
続いて、PBS−BSA緩衝液1mLを前記測定用セルに通液した。通液中に前記測定用セルに光を照射し、透過光量を測定した。このときの信号値をネガティブコントロールとした。なお、前記測定用セルには、気泡がわずかに見られた。
続いて、被測定試料溶液を前記測定用セルに通液した。送液速度は0.2mL/分とし、被測定試料溶液の送液量は2mLとした。
2mLの被測定試料溶液を前記測定用セルに通液した後、PBS−BSA緩衝液1mLを更に通液し、前記測定用セルに残った、反応しなかった被測定試料を除去した。そして、2mLを通液し終わったときの透過光量を測定した。このときの信号値をポジティブコントロールとした。
前記一連の測定におけるポジティブコントロール(P)とネガティブコントロール(N)とから、その測定における吸光度Lx(Lx=log10(N/P))を求めた。
そして、カドミウム濃度が0ppbの被測定試料溶液による測定結果の吸光度(L0)を基準(1.0)として、各カドミウム濃度の被測定試料溶液による測定結果の吸光度を標準化(Lx/L0)した。そして、Lx/L0を標準化吸光度とした。
<PCB濃度の測定>
比較実験として、特許文献3(特開2006−215013号公報)の実験例2に記載の測定用セルを用いて、抗原抗体反応によるPCB濃度の測定を行った。
前記測定用セルは、ポリスチレン素材で構成されており、セル内の大きさが内径2mm×高さ5.5mmの筒状のセルであった。前記測定用セルは、使用する基材粒子の大きさに比べ、セルの内径が大きいため、基材粒子は、セル内において、多層、即ち、立体的に配置される。
基材粒子として前記PMMAビーズを用いた。前記PMMAビーズに擬似抗原の担持を行った。前記PMMAビーズへの擬似抗原の担持は、以下の方法により行った。
まず、ジクロロフェノール誘導体とBSA(牛血清アルブミン)との複合体(抗原複合体:下記化合物X)0.1gを1mLのジメチルスルホキシドに溶解し、その溶液をメタノールにより100倍に希釈した(溶液A)。一方、BSA(牛血清アルブミン)(商品名;アルブミンウシ血清由来(A−9647)、シグマアルドリッチ社製)0.1gを10mLの蒸留水に溶解して10%のBSA蒸留水溶液とした(溶液B)。そして、溶液A1.6mL、溶液B1.0mL及び蒸留水7.4mLを混合して、この10mL混合液Cを一晩(4時間以上)撹拌した。次に、0.4gの前記PMMAビーズを0.1mLの混合液Cと0.9mLのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)に加えて2時間撹拌し、更に溶液Bを0.1mL加えて2時間撹拌した。これにより、擬似抗原を担持したPMMAビーズ(以下「担持粒子B」と略すことがある。)を作製した。
試験管に被測定試料であるPCB(KC600、商品名;カネクロール KC−600、GLサイエンス社製)、pH7.5のPBS−BSA緩衝液、1次抗体(マウス抗PCB抗体)(商品名;RDI−PCBabm−35、Fitzgerald Industries International, Inc.社製)、及び2次抗体(金コロイド標識ヤギ抗マウス抗体)(商品名;AffiniPure Goat Anti−Mouse IgG(H+L)(no.155−005−003)、Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.社製)を順次混ぜ合わせ、それぞれ免疫反応させた。1次抗体濃度は、500pMとし、2次抗体濃度は、6nMとした。そして、5種類のPCB濃度(0ppb、0.5ppb、2ppb、5ppb及び10ppb)の被測定試料溶液を調製した。
前記測定用セルに担持粒子Bを手作業により収容した。続いて、前記担持粒子Bが漏れないように、開口に綿状ポリプロピレンを詰め込んだ。収容に要した作業時間は3分であった。
実施例2で用いた透過光量測定器を使用し、前記測定用セルを光路上に配置した。
続いて、PBS−BSA緩衝液(PBS溶液に1g/Lの割合でBSAを溶解し、0.1g/Lの割合でアジ化ナトリウムを溶解した溶液)1mLを前記測定用セルに通液した。通液中に前記測定用セルに光を照射し、透過光量を測定した。このときの信号値をネガティブコントロールとした。なお、前記測定用セルには、気泡がわずかに見られた。
続いて、被測定試料溶液を前記測定用セルに通液した。送液速度は0.2mL/分とし、被測定試料溶液の送液量は2mLとした。
2mLの被測定試料溶液を前記測定用セルに通液した後、PBS−BSA緩衝液1mLを更に通液し、前記測定用セルに残った、反応しなかった被測定試料を除去した。そして、2mLを通液し終わったときの透過光量を測定した。このときの信号値をポジティブコントロールとした。
前記一連の測定におけるポジティブコントロール(P)とネガティブコントロール(N)とから、その測定における吸光度Lx(Lx=log10(N/P))を求めた。
そして、PCB濃度が0ppbの被測定試料溶液による測定結果の吸光度(L0)を基準(1.0)として、各PCB濃度の被測定試料溶液による測定結果の吸光度を標準化(Lx/L0)した。そして、Lx/L0を標準化吸光度とした。
2a 被測定試料流路(上流側被測定試料流路)
2b 被測定試料流路(下流側被測定試料流路)
3 収容領域
4 基材粒子供給流路
5 供給口
6 流出防止手段
7 通液手段(ポンプ)
8 流量調節手段
8a 伸縮膜
8b ポンプ
9 貯留部
10 貯留部
11 基材粒子
Claims (11)
- 測定用部材の収容領域に、被測定試料である標的を捕捉する標的捕捉体を担持させた基材粒子を収容する収容工程と、
前記標的を被測定試料流路に流し、前記標的に前記収容領域を通過させ前記標的捕捉体が前記標的を捕捉する捕捉工程と、
前記標的を検出する検出工程と、を含む標的検出方法であって、
前記測定用部材が、前記被測定試料を透過した光の量を測定するのに使用され、
前記被測定試料を流す前記被測定試料流路と、
前記被測定試料流路に形成され、前記基材粒子を収容する収容領域と、
前記収容領域に連通され、前記基材粒子を前記収容領域に流す基材粒子供給流路と、
前記基材粒子を前記基材粒子供給流路から前記収容領域に流す供給口と、を有し、
前記供給口を通じて、前記基材粒子が、前記基材粒子供給流路と前記収容領域とを往来し、
前記収容領域における、前記被測定試料の流れ方向に直交する方向の断面の短手方向の長さが、前記基材粒子が前記収容領域に単層で配置可能な長さであり、
前記収容工程において使用する前記基材粒子の数が、前記収容領域に収容される前記基材粒子の数の2.0倍以上4.0倍以下であることを特徴とする標的検出方法。 - 収容工程が、通液手段により被測定試料流路に測定時の被測定試料の流れ方向と順方向の流れを生じさせ、かつ、流量調節手段により、測定時の前記被測定試料の流れ方向において収容領域よりも上流側の前記被測定試料流路の流量を、測定時の前記被測定試料の流れ方向において前記収容領域よりも下流側の前記被測定試料流路の流量よりも少なくすることにより、基材粒子を基材粒子供給流路から前記収容領域に移動させ、前記収容領域に前記基材粒子を収容する工程である請求項1に記載の標的検出方法。
- 通液手段により被測定試料流路に測定時の被測定試料の流れ方向と逆方向の流れを生じさせ、かつ、流量調節手段により、測定時の前記被測定試料の流れ方向において収容領域よりも上流側の前記被測定試料流路の流量を、測定時の被測定試料の流れ方向において前記収容領域よりも下流側の前記被測定試料流路の流量よりも少なくすることにより、基材粒子を前記収容領域から基材粒子供給流路に移動させ、前記収容領域から前記基材粒子を除去する除去工程を含む請求項1から2のいずれかに記載の標的検出方法。
- 標的及び標的捕捉体のいずれかが抗原、他方が抗体である請求項1から3のいずれかに記載の標的検出方法。
- 収容領域が、前記収容領域以外の被測定試料流路への基材粒子の流出を防ぐ流出防止手段により画成される請求項1から4のいずれかに記載の標的検出方法。
- 収容領域における、被測定試料の流れ方向と、被測定試料の流れ方向に直交する方向の断面の長手方向とから形成される面の面積(D)と、前記収容領域に収容された全ての基材粒子の表面積の合計面積(d)との比(d/D)が、3.14以上3.63以下である請求項1から5のいずれかに記載の標的検出方法。
- 収容領域における、被測定試料の流れ方向に直交する方向の断面の短手方向の長さが、基材粒子の体積平均粒子径の1.0倍以上2.0倍未満の長さである請求項1から6のいずれかに記載の標的検出方法。
- 基材粒子が、球形であり、基材粒子を基材粒子供給流路から収容領域に流す供給口の面積が、前記基材粒子の半球断面の面積の4/π倍から20/π倍である請求項1から7のいずれかに記載の標的検出方法。
- 供給口が、収容領域における、測定時の被測定試料の流れ方向における上流側の端部に配置されている請求項1から8のいずれかに記載の標的検出方法。
- 測定時の被測定試料の流れ方向において収容領域よりも下流側の被測定試料流路に、前記被測定試料流路に流れを生じさせる通液手段を有し、
測定時の被測定試料の流れ方向において収容領域よりも上流側の被測定試料流路に、前記被測定試料流路の流量を調節する流量調節手段を有する請求項1から9のいずれかに記載の標的検出方法。 - 被測定試料を透過した光の量を測定するのに使用され、
前記被測定試料を流す被測定試料流路と、
前記被測定試料流路に形成され、基材粒子を収容する収容領域と、
前記収容領域に連通され、前記基材粒子を前記収容領域に流す基材粒子供給流路と、
前記基材粒子を前記基材粒子供給流路から前記収容領域に流す供給口と、を有し、
前記供給口を通じて、前記基材粒子が、前記基材粒子供給流路と前記収容領域とを往来し、
前記収容領域における、前記被測定試料の流れ方向に直交する方向の断面の短手方向の長さが、前記基材粒子が前記収容領域に単層で配置可能な長さである測定用部材と、
前記被測定試料である標的を捕捉する標的捕捉体を担持させた前記基材粒子が収容された収容領域に光を照射する発光手段と、
前記発光手段から前記収容領域に照射された光のうち、前記収容領域を透過する透過光を受光し、受光した透過光の光量を測定する受光手段と、を有し、
前記収容領域において使用する前記基材粒子の数が、前記収容領域に収容される前記基材粒子の数の2.0倍以上4.0倍以下であることを特徴とする標的検出装置。
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