JP2016512597A - 検定の検出感度を向上させる方法とシステム - Google Patents
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Abstract
検定の検出感度を向上させるシステムと方法を開示している。システムは、試験用基板（例えばマイクロタイタープレート）のウェル内に挿入される上側プレートを備える。下側検出法の場合、コーティング（ポリマーコーティング、膜コーティングなど）が上側プレートの挿入部に塗布され、ベースプレートが透明ウインドウを有し、検出器がベースプレートの下方から撮影を行う。上側検出法の場合、ベースプレートのウェルにコーティングが塗布され、上側プレートが透明ウインドウを有し、検出器が上側プレートの上方から撮影を行う。フォワードフェーズ、リバースフェーズ検定のそれぞれについて、コーティング表面の上に検定分析機構（捕捉抗体機構、抗原機構など）をプリントできる。同システムを製造および使用する方法についても開示している。
Description
（関連出願の相互参照）
この開示は、２０１２年１１月９日出願の米国仮出願(61/724,439)および２０１２年１１月２１日出願の米国仮出願(61/729,120)の優先権を主張する。これらの出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
この開示は、２０１２年１１月９日出願の米国仮出願(61/724,439)および２０１２年１１月２１日出願の米国仮出願(61/729,120)の優先権を主張する。これらの出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
（技術分野）
本発明は、検定用基板の前処理技術に関し、より具体的に言うと、検出感度を向上させる方法とシステムに関する。
本発明は、検定用基板の前処理技術に関し、より具体的に言うと、検出感度を向上させる方法とシステムに関する。
検定用基板は、その表面の上で種々の化学的分析および／または生物学的分析を行うことが可能なものである。検定用基板の例は、マイクロアレイプレート、ガラスプレートおよびマイクロタイタープレートである。マイクロタイタープレートは、表面に複数の「ウェル」が形成された平坦なプレートである。各ウェルは、種々の材料を中に配置して生化学的分析を行うことが可能な小試験管として用いることができる。マイクロタイタープレートの利用例として、酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）がある。ＥＬＩＳＡは、最新の医用診断試験技術である。
一般に、ＥＬＩＳＡでは、マイクロタイタープレートのウェルの底部に捕捉抗体がプリントされる。捕捉抗体は、検定を行う対象である特定の抗原に対する特異性を有する。捕捉抗体を含むウェルに分析対象のサンプルが加えられ、捕捉抗体はサンプルに含まれる抗原を「捕捉」し、または静止させる。次に、検出用抗体がウェルに加えられ、抗体は抗原と結合し、および／または抗原と複合体を形成する。次に、更なる材料がウェルに加えられ、これにより検出可能なシグナルが検出用抗体により生成される。例えば、特定波長の光がウェルに照射されると、抗原／抗体が蛍光を発する。蛍光の強度を基に、サンプル中の抗原の量を推測できる。別の例では、検出用抗体に所定波長（例えば４００ｎｍから５００ｎｍ）の光を放出させる化合物をウェルに加えることができる。この光を電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラにより読み取って、放出された光の輝度を測定できる。
現在、タンパク質の固相二次元多重検定(solid-phase 2D multiplexed protein assay)において、種々の検出技術と基板前処理技術が用いられている。既知の検出技術の例は、蛍光、化学発光、比色分析などの検出である。基板前処理技術の例は、ガラス基板のニトロセルロース表面コーティングやプラスチック基板のプラズマ処理である。例えば、ある既知の技術では、ニトロセルロースコーティングをガラスプレートの表面に塗布して、生物学的材料（例えばタンパク質）をコーティングに結合させ、蛍光反応を実施し、プリントされた面からスライドを撮影する。
既在の技術では、基板表面間の結合が幾分弱い。ニトロセルロースでコーティングされたガラスの結合力は非常に高いが、生物学的構造による自然光の放出である自家蛍光により制限される。ニトロセルロースのコーティングからの干渉性発光(interfering emission)により、蛍光ベースの検出技術の正確度と有効性が低下する。一方、プラズマ処理されたプラスチックは、安価であり、表面特性が一定であり、さまざまな検出技術と併せて利用できる。しかし、プラズマ処理されたプラスチックの結合能力は低い。
化学発光検出の感度が向上し、さらに結合能力が向上した生化学的分析を実施可能なシステムと方法について開示している。既知の基板表面前処理技術のデメリット（例えば自家蛍光と低い結合能力）は、開示しているシステムと方法を用いて解消でき、あるいはその影響を低下させることができる。開示しているシステムと方法では、検出器は自家蛍光の干渉を受けずに（またはその影響が低下した状態で）化学発光を検出できる。さらに、幾つかの実施形態では、挿入部により、照明用光路と検出用光路との間の空気の量が低下し、その結果、表面張力効果に起因する液体と空気の境界面よって生じる光学収差が小さくなり、またはなくなる。
幾つかの態様で、開示されるシステムは、
所定の形状を有するウェルと、該ウェルの底部の下方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウとを有する検定プレートと、
前記検定プレートのウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部であって前記透明ウインドウの上方に位置する挿入部を有する上側プレートと、
前記上側プレートの挿入部の水平な底面の上にあるコーティングとを備え、
前記コーティング表面と前記透明ウインドウとの間にミリメートルオーダのギャップが形成され、前記透明ウインドウはギャップの直下に位置する。
所定の形状を有するウェルと、該ウェルの底部の下方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウとを有する検定プレートと、
前記検定プレートのウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部であって前記透明ウインドウの上方に位置する挿入部を有する上側プレートと、
前記上側プレートの挿入部の水平な底面の上にあるコーティングとを備え、
前記コーティング表面と前記透明ウインドウとの間にミリメートルオーダのギャップが形成され、前記透明ウインドウはギャップの直下に位置する。
幾つかの実施形態で、システムは、
所定の形状を有するウェルと、該ウェルの底部の下方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウとを有する検定プレートと、
前記検定プレートのウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有する上側プレートであって、該挿入部に広がる透明ウインドウを有しかつ該上側プレートの上方から撮影を行うことに適合した上側プレートと、
前記検定プレートのウェル底部の水平な上面の上にあるコーティングとを備え、
前記コーティング表面と前記挿入部の底面との間にミリメートルオーダのギャップが形成されている。
幾つかの実施形態では、前記コーティング表面の上に分析機構がプリントされている。幾つかの実施形態では、前記コーティングはポリマーコーティングである。幾つかの実施形態では、前記コーティングは膜コーティングである。幾つかの実施形態では、前記コーティング表面と前記透明ウインドウの上面との間のギャップは、約０．５ｍｍから約１ｍｍである。
所定の形状を有するウェルと、該ウェルの底部の下方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウとを有する検定プレートと、
前記検定プレートのウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有する上側プレートであって、該挿入部に広がる透明ウインドウを有しかつ該上側プレートの上方から撮影を行うことに適合した上側プレートと、
前記検定プレートのウェル底部の水平な上面の上にあるコーティングとを備え、
前記コーティング表面と前記挿入部の底面との間にミリメートルオーダのギャップが形成されている。
幾つかの実施形態では、前記コーティング表面の上に分析機構がプリントされている。幾つかの実施形態では、前記コーティングはポリマーコーティングである。幾つかの実施形態では、前記コーティングは膜コーティングである。幾つかの実施形態では、前記コーティング表面と前記透明ウインドウの上面との間のギャップは、約０．５ｍｍから約１ｍｍである。
幾つかの実施形態では、前記挿入部は、該挿入部を有する上側プレートと前記検定プレートのウェルとの間で締まり嵌めを行うように構成されたアライメント機構を有する。幾つかの実施形態では、前記締まり嵌めは、前記挿入部の幅と前記ウェルの幅との差が約２００μｍ以下であるように行われる。幾つかの実施形態では、前記上側プレートの挿入部と前記検定プレートのウェルとの間のギャップが液体で充填され、該液体の上側レベルは前記コーティング表面よりも高い。幾つかの実施形態では、前記コーティング表面と前記挿入部の底面との間のギャップが液体で充填され、該液体の上側レベルは前記挿入部の底面よりも高い。
幾つかの実施形態で、前記システムは、前記上側プレート内に設けられたホールをさらに備え、前記ホールは、前記上側プレートの挿入部に広がり、前記検定プレートのウェルへのアクセスを可能にする。幾つかの実施形態で、前記検定プレートはマイクロタイタープレートである。幾つかの実施形態で、前記システムは、前記検定プレートの透明ウインドウを通じて前記ウェルの下方から撮影を行う検出器をさらに備えている。幾つかの実施形態で、前記上側プレートの透明ウインドウを通じて該上側プレートの上方から撮影を行う検出器をさらに備えている。
本開示の幾つかの態様で、装置は、
検定プレートのウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有する上側プレートを備え、
前記挿入部は、該挿入部を有する上側プレートと前記検定プレートのウェルとの間で締まり嵌めを行うように構成され、
前記挿入部の幅と前記ウェルの幅との差は約２００μｍ以下であり、
前記ウェルの内部に突出する挿入部は、前記ウェルの底部の上面と前記挿入部の底面との間にギャップを残すように構成されている。
検定プレートのウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有する上側プレートを備え、
前記挿入部は、該挿入部を有する上側プレートと前記検定プレートのウェルとの間で締まり嵌めを行うように構成され、
前記挿入部の幅と前記ウェルの幅との差は約２００μｍ以下であり、
前記ウェルの内部に突出する挿入部は、前記ウェルの底部の上面と前記挿入部の底面との間にギャップを残すように構成されている。
幾つかの実施形態で、前記挿入部は、該挿入部を有する上側プレートと前記検定プレートのウェルとの間で締まり嵌めを行うように構成されたアライメント機構を有する。幾つかの実施形態で、前記挿入部は、外側膜支持部と、内側膜支持部と、該外側膜支持部および内側膜支持部に取り付けられた環状膜とを有し、前記環状膜は、前記挿入部の中央にホールを残して前記検定プレートのウェルへのアクセスを可能にするようになっている。幾つかの実施形態で、前記挿入部の底部はコーティングを有し、該コーティングはポリマーコーティングまたは膜コーティングである。幾つかの実施形態で、前記コーティングの上に分析機構がプリントされている。
本開示の幾つかの態様で、システムを製造する方法は、
検定プレートのウェルの形状を決定するステップであって、前記検定プレートのウェルは、該ウェルの底部の下方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウを有するステップと、
前記検定プレートのウェルの内部に突出するように構成されかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有する上側プレートを成形するステップであって、前記挿入部は前記透明ウインドウを通じて撮影を行うことに適合したステップと、
前記上側プレートの挿入部の水平な底面の上にコーティングを塗布するステップとを含み、
前記コーティング表面と前記透明ウインドウとの間にミリメートルオーダのギャップが形成され、該透明ウインドウはギャップの直下に位置する。
検定プレートのウェルの形状を決定するステップであって、前記検定プレートのウェルは、該ウェルの底部の下方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウを有するステップと、
前記検定プレートのウェルの内部に突出するように構成されかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有する上側プレートを成形するステップであって、前記挿入部は前記透明ウインドウを通じて撮影を行うことに適合したステップと、
前記上側プレートの挿入部の水平な底面の上にコーティングを塗布するステップとを含み、
前記コーティング表面と前記透明ウインドウとの間にミリメートルオーダのギャップが形成され、該透明ウインドウはギャップの直下に位置する。
他の実施形態で、システムを製造する方法は、
検定プレートのウェルの形状を決定するステップと、
前記検定プレートのウェルの内部に突出するように構成されかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有する上側プレートを成形するステップであって、前記上側プレートは該上側プレートの上方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウを有するステップと、
前記検定プレートのウェルの水平な上面の上にコーティングを塗布するステップとを含み、
前記コーティング表面と前記挿入部の底面との間にミリメートルオーダのギャップが形成される。
幾つかの実施形態で、前記方法は、前記コーティングの上に分析機構をプリントするステップをさらに含む。幾つかの実施形態で、前記コーティングはポリマーコーティングである。幾つかの実施形態で、前記コーティングは膜コーティングである。幾つかの実施形態で、前記挿入部はアライメント機構を有し、前記方法は、前記挿入部を有する上側プレートと前記検定プレートのウェルとを並べて確実に嵌まり締めを行うステップをさらに含む。幾つかの実施形態で、前記挿入部は、該挿入部の幅と前記ウェルの幅との差が約２００μｍ以下であるように前記ウェル内で並べられる。幾つかの実施形態で、前記上側プレートは、該上側プレートの挿入部を貫通して延び、前記検定プレートのウェルへのアクセスを可能にするホールを有する。幾つかの実施形態で、前記検定プレートはマイクロタイタープレートである。幾つかの実施形態で、前記挿入部は、外側膜支持部と、内側膜支持部と、該外側膜支持部および内側膜支持部に取り付けられた環状膜を有し、該環状膜は、前記挿入部の中央にホールを残して前記検定プレートのウェルへのアクセスを可能にするようになっている。
検定プレートのウェルの形状を決定するステップと、
前記検定プレートのウェルの内部に突出するように構成されかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有する上側プレートを成形するステップであって、前記上側プレートは該上側プレートの上方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウを有するステップと、
前記検定プレートのウェルの水平な上面の上にコーティングを塗布するステップとを含み、
前記コーティング表面と前記挿入部の底面との間にミリメートルオーダのギャップが形成される。
幾つかの実施形態で、前記方法は、前記コーティングの上に分析機構をプリントするステップをさらに含む。幾つかの実施形態で、前記コーティングはポリマーコーティングである。幾つかの実施形態で、前記コーティングは膜コーティングである。幾つかの実施形態で、前記挿入部はアライメント機構を有し、前記方法は、前記挿入部を有する上側プレートと前記検定プレートのウェルとを並べて確実に嵌まり締めを行うステップをさらに含む。幾つかの実施形態で、前記挿入部は、該挿入部の幅と前記ウェルの幅との差が約２００μｍ以下であるように前記ウェル内で並べられる。幾つかの実施形態で、前記上側プレートは、該上側プレートの挿入部を貫通して延び、前記検定プレートのウェルへのアクセスを可能にするホールを有する。幾つかの実施形態で、前記検定プレートはマイクロタイタープレートである。幾つかの実施形態で、前記挿入部は、外側膜支持部と、内側膜支持部と、該外側膜支持部および内側膜支持部に取り付けられた環状膜を有し、該環状膜は、前記挿入部の中央にホールを残して前記検定プレートのウェルへのアクセスを可能にするようになっている。
本発明の他の態様で、方法は、
検定プレートのウェルに上側プレートを適合させるステップであって、前記ウェルは、所定の形状を有しかつ該ウェルの底部の下方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウを有し、前記上側プレートは、前記ウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有し、該挿入部は前記透明ウインドウの上方に位置し、前記挿入部の底面と前記透明ウインドウの間にミリメートルオーダのギャップが形成され、前記挿入部の水平な底面がコーティングされ、該透明ウインドウはギャップの直下に位置し、前記コーティングの上に分析機構がプリントされるステップと、
生化学的分析を行うステップであって、前記挿入部の底面と前記ウェルの底部の透明ウインドウとの間のギャップを液体で充填し、該液体の上側レベルが前記挿入部の底面より高くなるようにしたサブステップと、前記検出プレートの透明ウインドウを通じて該検出プレートのウェルの下方からシグナルを検出するサブステップとを含むステップとを含む。
検定プレートのウェルに上側プレートを適合させるステップであって、前記ウェルは、所定の形状を有しかつ該ウェルの底部の下方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウを有し、前記上側プレートは、前記ウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有し、該挿入部は前記透明ウインドウの上方に位置し、前記挿入部の底面と前記透明ウインドウの間にミリメートルオーダのギャップが形成され、前記挿入部の水平な底面がコーティングされ、該透明ウインドウはギャップの直下に位置し、前記コーティングの上に分析機構がプリントされるステップと、
生化学的分析を行うステップであって、前記挿入部の底面と前記ウェルの底部の透明ウインドウとの間のギャップを液体で充填し、該液体の上側レベルが前記挿入部の底面より高くなるようにしたサブステップと、前記検出プレートの透明ウインドウを通じて該検出プレートのウェルの下方からシグナルを検出するサブステップとを含むステップとを含む。
幾つかの実施形態で、前記コーティングはポリマーコーティングまたは膜コーティングである。幾つかの実施形態で、前記生化学的分析は酵素結合免疫吸着剤検定法である。
他の実施形態で、方法は、
検定プレートのウェルに上側プレートを適合させるステップであって、前記ウェルは所定の形状を有し、前記上側プレートは、前記ウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有し、該挿入部に広がる透明ウインドウを有し、前記ウェルの撮影が前記上側プレートの上方から行われるように配置され、前記試験用プレートのウェル底部の水平な上面がコーティングされ、前記コーティングの上に分析機構がプリントされ、前記コーティング表面と前記挿入部の底面との間にミリメートルオーダのギャップが形成されるステップと、
生化学的分析を行うステップであって、前記コーティング面と前記挿入部の底面との間のギャップを液体で充填し、該液体の上側レベルが前記挿入部の底面より高くなるようにしたサブステップと、前記上側プレートの透明ウインドウを通じて該上側プレートの上方からシグナルを検出するサブステップとを含むステップとを含む。
幾つかの実施形態で、前記コーティングはポリマーコーティングまたは膜コーティングである。幾つかの実施形態で、前記生化学的分析は酵素結合免疫吸着剤検定法である。
他の実施形態で、方法は、
検定プレートのウェルに上側プレートを適合させるステップであって、前記ウェルは所定の形状を有し、前記上側プレートは、前記ウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有し、該挿入部に広がる透明ウインドウを有し、前記ウェルの撮影が前記上側プレートの上方から行われるように配置され、前記試験用プレートのウェル底部の水平な上面がコーティングされ、前記コーティングの上に分析機構がプリントされ、前記コーティング表面と前記挿入部の底面との間にミリメートルオーダのギャップが形成されるステップと、
生化学的分析を行うステップであって、前記コーティング面と前記挿入部の底面との間のギャップを液体で充填し、該液体の上側レベルが前記挿入部の底面より高くなるようにしたサブステップと、前記上側プレートの透明ウインドウを通じて該上側プレートの上方からシグナルを検出するサブステップとを含むステップとを含む。
幾つかの実施形態で、前記コーティングはポリマーコーティングまたは膜コーティングである。幾つかの実施形態で、前記生化学的分析は酵素結合免疫吸着剤検定法である。
幾つかの態様において、化学発光検出の感度が向上し、さらに結合能力が向上した生化学的分析を実施可能なシステムと方法について開示している。既知の基板表面前処理技術のデメリット（例えば自家蛍光と低い結合能力）は、開示しているシステムと方法を用いて解消でき、あるいはその影響を低下させることができる。開示しているシステムと方法では、検出器は自家蛍光の干渉を受けずに（またはその影響が低下した状態で）化学発光を検出できる。さらに、幾つかの実施形態では、挿入部を用いることにより、照明用光路と検出用光路との間の空気の量が低下し、その結果、表面張力効果に起因する液体と空気の境界面よって生じる光学収差が小さくなり、またはなくなる。
図１Ａは、マイクロタイタープレート１００における２つのウェルの断面図である。一実施例で、ウェル基板１０５はポリスチレンベースからなる。他の可能な基板材料は、これに限られないが、例えばニトロセルロース、ガラスおよび他のプラスチック材料である。図１Ｂは、マイクロタイタープレート１００における２つのウェルの平面図である。
図２は、下側検出用のマイクロタイタープレートのウェル２０５へ挿入される上側プレート２５０の挿入部２５５の断面図２００である。図２に示すように、上側プレート２５０は、マイクロタイタープレートのウェル２０５内へ突出する挿入部２５５を有する。挿入部と試験用基板は（例えばそのウェルが）、互いに嵌合する相補的な形状を有する。上側プレート２５０は、例えば、これに限られないが、ポリスチレンやポリプロピレンからなる。幾つかの実施形態では、上側プレート２５０の挿入部２５５は、アライメント機構２２５を有する。アライメント機構２２５は、ウェル２０５の挿入部２５５を中央揃えして固定し、検出中にずれが生じるのを抑制する。幾つかの実施形態で、アライメント機構は、挿入部２５５を有する上側プレート２５０とマイクロタイタープレートのウェル２０５との間で締まり嵌めを行うことができる大きさに形成される。典型的には、成形されるプレートは約２００μｍの寸法公差を有するので、アライメント機構２２５は、この公差の範囲内に挿入部２５５を調節するように形成できる。
幾つかの実施形態では、挿入部２５５の底部は、結合能力を向上させるためにニトロセルロースでコーティングされる。フォワードフェーズ検定(forward-phase assay)では、ニトロセルロースでコーティングされた表面２１２の上に捕捉抗体がプリントされる。リバースフェーズ検定(reverse-phase assay)では、ニトロセルロースでコーティングされた表面２１２の上に抗原（例えば、分析対象のタンパク質または材料）をプリントできる。ニトロセルロースコーティングにより挿入部２５５の底部が不透明になるので、検出は検出器２１７を用いて下方から行われる。マイクロタイタープレートのウェル２０５は、透明ウインドウ２６０を有する。
幾つかの実施形態では、挿入部２５５とウェル２０５との間にはギャップ２３５が存在する。検定の間、ギャップ２３５は液体で満たされる。略水平な基準面に対する液体のレベルは、ニトロセルロースでコーティングされた表面２１２よりも高い。これにより、照明用光路と検出用光路との間の空気の量が低下し、またはなくなる。それゆえ、表面張力効果により生じる光学収差は、ほとんど存在しないか全く存在しない。幾つかの実施形態で、ニトロセルロースでコーティングされた表面２１２とウェル底部２０５の上面との間の距離はミリメートルオーダの大きさである。幾つかの実施形態では、この距離は約０．５ｍｍから約１ｍｍであって、化学発光検出のための適切な反応体積を実現する。
図３は、幾つかの実施形態による、ＥＬＩＳＡを既知の方法で実施する間にマイクロタイタープレートのウェルへ挿入される上側プレートの挿入部の断面図である。検定の種類に応じて、捕捉抗体機構と抗原機構を含む分析機構(analysis feature)を、ニトロセルロースでコーティングされた挿入部３５５の表面３１２の上にプリントできる。フォワードフェーズ検定では、捕捉抗体（または機構）３１０が、挿入部３５５のニトロセルロースでコーティングされた表面３１２の上にプリントされる。ＥＬＩＳＡ中、ウェルに抗原含有サンプルが加えられる。まず、抗原３２０が捕捉抗体（機構）３１０に結合する。次に、ウェルが洗い流され、結合していない抗原が除去される。次に、酵素結合した検出用抗体３３０が加えられる。検出用抗体３３０は抗原３２０に結合する。次に、ウェルが洗い流され、結合していない抗体酵素複合体が除去される。次に、酵素を検出可能なシグナル（例えばカラーシグナル、蛍光シグナルまたは電気化学的シグナル）に変換する物質が塗布される。最後に、ウェルの吸光度シグナル、蛍光シグナルまたは電気化学的シグナルが検出器３１７により測定され、基準との比較が行われ、サンプル抗原の存在の有無と量が決定される。基準は、患者サンプルを受けるウェルから分離したウェルにおいて、既知の抗原濃度で校正機構をプリントすることにより生成できる。
本発明の実施形態により、化学発光検出の感度が向上し、結合能力が向上した検定が実現する。既知の基板表面前処理技術のデメリット（例えば自家蛍光と低い結合能力）は、開示しているシステムと方法を用いて解消できる。検出器は自家蛍光の干渉を受けずに化学発光を検出できる。さらに、捕捉抗体と抗原は、ニトロセルロースコーティングにより結合する。また、挿入部を用いることにより、表面張力効果に起因して液体と空気の境界面がカーブしていることによって生じる光学収差が小さくなる。
図４は、上側プレートの挿入部と上側プレートのホール内のディスペンスニードルの断面図４００である。上側プレート４５０の挿入部４５５にはホール４４５が設けられている。ホール４４５は、ニードル４４０を挿入してウェル４０５に液体を導入できるように設計されている。ニードル４４０は、プレートウォッシャや液体ディスペンサ（流体ディスペンサ）を含む市販のマイクロタイタープレート自動化ツールであってもよい。液体ディスペンサとして、ニードル４４０は液体をギャップ４３５に分注してもよい。プレートウォッシャとして、ニードル４４０はウェル４０５と上側プレート４５０の挿入部４５５を洗い流してもよい。
図５Ａは上側プレート５５０の下面図であり、図５Ｂはベースプレート５０３である。上側プレート５５０には複数の挿入部５５５が存在する。複数の挿入部５５５の間の距離５６０は、ベースプレート５０３の複数のウェル５０５の間の距離５６５と一致するように決定できる。複数のベースプレートが有するウェル（またはキャビティ）の数と大きさは異なるので、複数の挿入部の数と大きさはベースプレートのウェルに適合するように異なることになる。
さらに、挿入部の構成が異なっていてもよい。例えば、挿入部の構成は、タンパク質のリバースフェーズ検定用の４キャビティ型マイクロタイタープレートについて標準の２５ｍｍ×７５ｍｍ（または１ｍｍ×３ｍｍ）スライドを有するものであってもよい。あるいは、挿入部の構成は、円筒状キャビティ９６ウェル型のマイクロタイタープレートであってもよい。挿入部の構成は、商用の（または特注の）マイクロタイタープレートと結合する任意の構成で製造できる。リバースフェーズアレイ用のスライド構成により充分に大きい表面積が得られ、これにより、抗体の検出を通じて個々のタンパク質に対する試験を行うための（希釈系列における）多くの抗原サンプルをプリントできる。
図６は、上側検出用のマイクロタイタープレートのウェルへ挿入される上側プレートの挿入部の断面図である。これらの代替の実施形態では、ウェル６０５の上にニトロセルロースコーティング６１２が塗布される。上側プレート６５０は透明ウインドウ６０を有し、その結果検出器６１７が上側プレート６５０の上方で光子を検出する。本明細書で開示している下側検出法の実施形態と同様に、水平な基準面に対して挿入部６５５の底部よりも高いレベルまで液体が充填され、これにより表面張力効果に起因する光学収差が小さくなる。
図７は、幾つかの実施形態による、ターゲットプレートに対して検定用基板を前処理する方法を示す。本明細書で用いる場合、「ターゲットプレート」は、一連の特定の分析について処理される（例えばプリントされる、ブロックされる、後段で利用するために加工される）プレートである。下側検出法の場合、上側プレートがターゲットプレートである。上側検出法の場合、ベースプレートがターゲットプレートである。「ソースプレート」は、ターゲットプレートの上にプリントされる材料の供給源を有するプレートである。例えば、ソースプレートのウェルは、ターゲットプレートの上にプリントされる種々の抗体で充填できる。方法７００に従って、ソースプレートがプリントプロセスのために処理される（ステップ７１０）。このステップは、ターゲットプレートの上にプリントされる所望の材料でソースプレートのウェルを充填することを含んでもよい。
次に、複数の挿入部を有する上側プレートが、例えばプラスチックを用いて成形される（ステップ７１５）。幾つかの実施形態では、次に、上側プレートが洗い流されてプラズマ処理が行われる（ステップ７２０）。挿入部を清浄に維持するオプションとして、上側プレートは袋詰めされる。幾つかの実施形態では、窒素パージされ、真空パックされたホイルの袋により、上側プレートを封止できる。底部の撮影のために、コーティング（例えばニトロセルロースコーティング）が上側プレート（ステップ７２５）に塗布され、続いて選択的に上側プレートが袋詰めされる。あるいは、上部の撮影のために、コーティング（例えばニトロセルロースコーティング）がウェルに塗布される。選択的に、ターゲットプレートに対してプラズマ処理とニトロセルロース塗布の両方が行われてもよく、一方のみが行われてもよい。
フォワードフェーズ検定の場合、ソースプレートとターゲットプレートがプリント装置（例えば、マサチューセッツ州ビレリカのAushon Biosystems社から購入可能な2470 Arrayer）に嵌めこまれる。ターゲットプレートのニトロセルロースコーティングの上に捕捉抗体機構がプリントされる（ステップ７３０）。リバースフェーズ検定の場合、ターゲットプレートの上に抗原機構がプリントされる。次に、ニトロセルロース表面がブロックされ（ステップ７３５）、乾燥が行われる。このブロッキングにより、ＥＬＩＳＡ中、ウェルのベースへの試料抗原の非選択的結合（読み出しに誤りを生じさせる）が妨害される。ターゲットプレートは、使用されるまで包装されていてもよい。
選択的に、既知の方法を用いて、校正機構が試験基板の上にプリントされてもよい（例えば、米国特許出願(U.S. Publication No. 2013/0266969, entitled Method of and System for Printing In-Well Calibration Features, filed on September 28, 2012)に開示されている）（ステップ７４０）。この文献の内容は、参照により全体として組み込まれる。
プリントが行われたターゲットプレートは所定時間培養され（ステップ７４５）、既知の方法を用いてターゲットプレートにブロッキング材料（捕捉抗体または抗原とは反応しない）が塗布される。ブロッキング材料は、プレートの残りの結合面に吸着するとともに、抗原と結合して非特異的相互作用し、これによりバックグラウンドシグナルが低下する。次に、プリントされたターゲットプレートに対して乾燥が行われる（ステップ７５５）。一実施例では、米国特許出願(U.S. Publication No. 2012/0135154, entitled Method of and System for Applying Blocking Material to Assay Substrates, filed on August 10, 2011)に記載されている噴霧プロセスを用いて、マイクロタイタープレートにおける複数のウェルの底部表面にブロッキング材料の溶液が塗布される（ステップ７６０）。この文献の内容は、参照により全体として組み込まれる。
他の実施形態では、挿入部の底部に固体コーティングでなく膜コーティング(membrane coating)が施される。膜は、選択的バリアとして機能するフィルム状の構造であり、複数の合成膜を有する。合成膜は、有機材料で作成されても無機材料で作成されてもよく、液体、セラミックおよび高分子膜を含んでもよい。高分子膜の例は、酢酸セルロース、ニトロセルロース、セルロースエステル類、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリアミド、ポリイミド、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、およびポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）である。特定の実施例では、膜が透過性を有し、膜の上にプリントされる機構が膜構造の一部に埋め込まれるようになっていてもよい。プリントされる機構は、フォワードフェーズ検定については検出用抗体であってもよく、リバースフェーズ検定については試料材料であってもよい。さらに、透過性を有する膜では反応剤が膜を透過でき、これにより検定速度が増加し、洗浄の有効性が増す。膜の透過性は変化してもよい。幾つかの実施形態で、膜は三次元膜であり、これにより単位面積当たりの結合能力を高くすることができる。
図８は、膜挿入部８５７を示す。挿入部８５７は、上記と同じ方法で検定プレートのウェル内に配置されるように設計されている。膜挿入部８５７は、膜８１１を支持する円筒体であってもよい。他の形状についても、本発明の範囲に含まれる。幾つかの実施例で、膜８１１は、接着材料により挿入部８５７に取り付けられ、または挿入部８５７に溶接固定される。幾つかの実施形態では、膜８１１はニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）から作成されてもよい。また、膜８１１は他の材料を含んでもよい。
一実施例では、挿入部８５７の側壁を構成する円筒体の底縁部に粘着テープが貼り付けられる。次に、側壁の縁部の裏側に粘着物質を残して粘着テープが取り外される。次に、底縁部に膜が貼り付けられ粘着物質により適切な位置に保持される。
膜を遮るものは、抗体または抗原機構がプリントされる領域の上方と下方の両方で存在しない。機構は、コーティングされた表面の上にプリントされるのでなく、膜の上に直接にプリントされる。他の検定プラットフォームにて用いられる硬質な表面上でのプリントと異なり、膜上でのプリントは、プリントヘッド（例えばプリントピン）と膜との間に軽い接触がある状態で、あるいは、膜表面とプリントヘッド（または機構材料のソース）との間にまったく接触がない状態で行われてもよい。
図９は環状膜挿入部９５７を示す。環状膜挿入部９５７は、外側膜支持部９７５と内側膜支持部９７０とを有する。２つの膜支持部には環状部材９１１が取り付けられている。環状部材９１１は、挿入部９５７の中央にホールを残して、ウェルに挿入するときにウェル底部へのアクセスを可能にする。このホールにより、ウェルへのアクセスが可能となって、標準の検定装置、検定技術を利用することが可能となる。
図１０Ａは、環状膜を有しない環状膜挿入部１０５７の下面図である。この実施形態では、内側支持部と外側支持部の両方が円筒体であって環状膜を支持する。材料が自由に流れるように、２つの支持部の間に中空の空間が存在する。図１０Ｂは、環状膜１０１１を有する環状膜挿入部１０５７の下面図である。環状膜１０１１の上に、機構１０１０がプリントされる。
図１１Ａは、幾つかの実施形態による、ＥＬＩＳＡを既知の方法で実施する間にマイクロタイタープレートのウェルへ挿入される上側プレートの膜挿入部の断面図である。図１１Ｂは、マイクロタイタープレートのウェルへ挿入される上側プレートの環状膜挿入部の断面図である。下側検出法の場合、ウェル１１０５は、下部の上に透明ウインドウ１１６０を有する。
ＥｌＩＳＡ中、プリントされた機構を有する挿入部がウェルに挿入され、反応用の液体がウェルに加えられる。この液体は、水平な基準面を基準と膜よりも高いレベルまで加えることができる。これにより、反応物質を膜の上方に運んで、表面張力効果により生じる光学収差を低下させることができる。検出器は、透明ウインドウを通じて底部から化学発光反応を検出してもよい。
上記の特定の動作パラメータは単に例示的な値であって、他の値も本発明の範囲に含まれる。
関連する装置または試薬（例えば、検定の結果を読み出して分析するためのレポーター試薬またはソフトウェア）と組み合わせて上記デバイスを組み込んだキットを製造できる。幾つかの実施形態で、キットは、使用説明書に沿って説明されるシステムとデバイスを含む。
上記実施形態を用いて、患者（例えば自己免疫疾患の患者）の体内の抗原とタンパク質、ウイルス性疾患に対する抗体、細菌性疾患に対する抗体、アレルギー反応に対する抗体、または癌に対する抗体の存在を検出できる。
本明細書で用いている用語や表現は、説明のために用いているのであって非限定的である。こうした用語や表現を用いることにより、図示しまたは説明した機構の等価物またはその一部を除外する意図はなく、特許請求の範囲に記載の発明の範囲内であれば種々の変形例が可能である。
Claims (35)
- 所定の形状を有するウェルと、該ウェルの底部の下方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウとを有する検定プレートと、
前記検定プレートのウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部であって前記透明ウインドウの上方に位置する挿入部を有する上側プレートと、
前記上側プレートの挿入部の水平な底面の上にあるコーティングとを備え、
前記コーティング表面と前記透明ウインドウとの間にミリメートルオーダのギャップが形成され、前記透明ウインドウはギャップの直下に位置する
システム。 - 所定の形状を有するウェルと、該ウェルの底部の下方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウとを有する検定プレートと、
前記検定プレートのウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有する上側プレートであって、該挿入部に広がる透明ウインドウを有しかつ該上側プレートの上方から撮影を行うことに適合した上側プレートと、
前記検定プレートのウェル底部の水平な上面の上にあるコーティングとを備え、
前記コーティング表面と前記挿入部の底面との間にミリメートルオーダのギャップが形成された
システム。 - 前記コーティング表面の上に分析機構がプリントされた
請求項１または２に記載のシステム。 - 前記コーティングはポリマーコーティングである
請求項１または２に記載のシステム。 - 前記コーティングは膜コーティングである
請求項１または２に記載のシステム。 - 前記コーティング表面と前記透明ウインドウの上面との間のギャップは、約０．５ｍｍから約１ｍｍである
請求項１に記載のシステム。 - 前記挿入部は、該挿入部を有する上側プレートと前記検定プレートのウェルとの間で締まり嵌めを行うように構成されたアライメント機構を有する
請求項１または２に記載のシステム。 - 前記締まり嵌めは、前記挿入部の幅と前記ウェルの幅との差が約２００μｍ以下であるように行われた
請求項７に記載のシステム。 - 前記上側プレートの挿入部と前記検定プレートのウェルとの間のギャップが液体で充填され、該液体の上側レベルは前記コーティング表面よりも高い
請求項１に記載のシステム。 - 前記コーティング表面と前記挿入部の底面との間のギャップが液体で充填され、該液体の上側レベルは前記挿入部の底面よりも高い
請求項２に記載のシステム。 - 前記上側プレート内に設けられたホールをさらに備え、
前記ホールは、前記上側プレートの挿入部に広がり、前記検定プレートのウェルへのアクセスを可能にする
請求項１または２に記載のシステム。 - 前記検定プレートはマイクロタイタープレートである
請求項１または２に記載のシステム。 - 前記検定プレートの透明ウインドウを通じて前記ウェルの下方から撮影を行う検出器をさらに備えた
請求項１に記載のシステム。 - 前記上側プレートの透明ウインドウを通じて該上側プレートの上方から撮影を行う検出器をさらに備えた
請求項２に記載のシステム。 - 検定プレートのウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有する上側プレートを備え、
前記挿入部は、該挿入部を有する上側プレートと前記検定プレートのウェルとの間で締まり嵌めを行うように構成され、
前記挿入部の幅と前記ウェルの幅との差は約２００μｍ以下であり、
前記ウェルの内部に突出する挿入部は、前記ウェルの底部の上面と前記挿入部の底面との間にギャップを残すように構成された
装置。 - 前記挿入部は、該挿入部を有する上側プレートと前記検定プレートのウェルとの間で締まり嵌めを行うように構成されたアライメント機構を有する
請求項１５に記載の装置。 - 前記挿入部は、外側膜支持部と、内側膜支持部と、該外側膜支持部および内側膜支持部に取り付けられた環状膜とを有し、
前記環状膜は、前記挿入部の中央にホールを残して前記検定プレートのウェルへのアクセスを可能にするようにした
請求項１５に記載の装置。 - 前記挿入部の底部はコーティングを有し、該コーティングはポリマーコーティングまたは膜コーティングである
請求項１５に記載の装置。 - 前記コーティングの上に分析機構がプリントされた
請求項１８に記載の装置。 - 検定プレートのウェルの形状を決定するステップであって、前記検定プレートのウェルは、該ウェルの底部の下方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウを有するステップと、
前記検定プレートのウェルの内部に突出するように構成されかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有する上側プレートを成形するステップであって、前記挿入部は前記透明ウインドウを通じて撮影を行うことに適合したステップと、
前記上側プレートの挿入部の水平な底面の上にコーティングを塗布するステップとを含み、
前記コーティング表面と前記透明ウインドウとの間にミリメートルオーダのギャップが形成され、該透明ウインドウはギャップの直下に位置する
システムを製造する方法。 - 検定プレートのウェルの形状を決定するステップと、
前記検定プレートのウェルの内部に突出するように構成されかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有する上側プレートを成形するステップであって、前記上側プレートは該上側プレートの上方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウを有するステップと、
前記検定プレートのウェルの水平な上面の上にコーティングを塗布するステップとを含み、
前記コーティング表面と前記挿入部の底面との間にミリメートルオーダのギャップが形成される
システムを製造する方法。 - 前記コーティングの上に分析機構をプリントするステップをさらに含む
請求項２０または２１に記載の方法。 - 前記コーティングはポリマーコーティングである
請求項２０または２１に記載の方法。 - 前記コーティングは膜コーティングである
請求項２０または２１に記載の方法。 - 前記挿入部はアライメント機構を有し、
前記挿入部を有する上側プレートと前記検定プレートのウェルとを並べて確実に嵌まり締めを行うステップをさらに含む
請求項２０または２１に記載の方法。 - 前記挿入部は、該挿入部の幅と前記ウェルの幅との差が約２００μｍ以下であるように前記ウェル内で並べられる
請求項２５に記載の方法。 - 前記上側プレートは、該上側プレートの挿入部を貫通して延び、前記検定プレートのウェルへのアクセスを可能にするホールを有する、
請求項２０または２１に記載の方法。 - 前記検定プレートはマイクロタイタープレートである、
請求項２０または２１に記載の方法。 - 前記挿入部は、外側膜支持部と、内側膜支持部と、該外側膜支持部および内側膜支持部に取り付けられた環状膜を有し、該環状膜は、前記挿入部の中央にホールを残して前記検定プレートのウェルへのアクセスを可能にするようにした
請求項２０または２１に記載の方法。 - 検定プレートのウェルに上側プレートを適合させるステップであって、前記ウェルは、所定の形状を有しかつ該ウェルの底部の下方から撮影を行うことに適合した透明ウインドウを有し、前記上側プレートは、前記ウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有し、該挿入部は前記透明ウインドウの上方に位置し、前記挿入部の底面と前記透明ウインドウの間にミリメートルオーダのギャップが形成され、前記挿入部の水平な底面がコーティングされ、該透明ウインドウはギャップの直下に位置し、前記コーティングの上に分析機構がプリントされるステップと、
生化学的分析を行うステップであって、前記挿入部の底面と前記ウェルの底部の透明ウインドウとの間のギャップを液体で充填し、該液体の上側レベルが前記挿入部の底面より高くなるようにしたサブステップと、前記検出プレートの透明ウインドウを通じて該検出プレートのウェルの下方からシグナルを検出するサブステップとを含むステップと
を含む方法。 - 前記コーティングはポリマーコーティングまたは膜コーティングである
請求項３０に記載の方法。 - 前記生化学的分析は酵素結合免疫吸着剤検定法である
請求項３０に記載の方法。 - 検定プレートのウェルに上側プレートを適合させるステップであって、前記ウェルは所定の形状を有し、前記上側プレートは、前記ウェルの内部に突出しかつ該ウェルの形状に相補的な形状を有する挿入部を有し、該挿入部に広がる透明ウインドウを有し、前記ウェルの撮影が前記上側プレートの上方から行われるように配置され、前記試験用プレートのウェル底部の水平な上面がコーティングされ、前記コーティングの上に分析機構がプリントされ、前記コーティング表面と前記挿入部の底面との間にミリメートルオーダのギャップが形成されるステップと、
生化学的分析を行うステップであって、前記コーティング面と前記挿入部の底面との間のギャップを液体で充填し、該液体の上側レベルが前記挿入部の底面より高くなるようにしたサブステップと、前記上側プレートの透明ウインドウを通じて該上側プレートの上方からシグナルを検出するサブステップとを含むステップと
を含む方法。 - 前記コーティングはポリマーコーティングまたは膜コーティングである
請求項３３に記載の方法。 - 前記生化学的分析は酵素結合免疫吸着剤検定法である
請求項３４に記載の方法。
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