JPH052180B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の分野］ 蛍光放射による流動懸濁体中の粒子の係数は一
般にイムノアツセイ法および生物学的材料の検出
に広範に用いられている。しかし、公知の方法
は、試料中の無関係または目的としない成分から
目標粒子を識別するために、特別に設計されたオ
リフイス、流動路または検知域あるいは複雑な計
算技術を必要とする。 したがつて、粒子の存在、濃度および／または
粒径の直接的な指標を与え、とくにシグナル対ノ
イズ比が低くても検出できる、安価で正確な技術
が要望されている。 ［先行技術の記載］ 狭い流路を通る細胞懸濁液の流れを注意深く制
御することを包含する流動細胞計の使用がミラー
ら「ユーセイジ・オブ・ザ・フローシトメーター
−セル・ソーター」、ジヤーナル・オブ・イムノ
ロジカル・メソツド（Muller，et al.，“Usage
of the Flow Cytometer−Cell Sorter，”
Journal of Immunological Methods）、47巻、
13〜24頁（1981年）、ホフマンら「イムノフルオ
レセント・アナリシス・オブ・ブラツド・セル・
バイ・フロー・シトメトリイ」、インターナシヨ
ナル・ジヤーナル・オブ・イミユノフアラマコロ
ジイ（Hoffman，et al.，“Immunofluorescent
Analysis of Blood Cells by Flow
Cytometry”，Int.J.Immunophatmac.）、３巻
（３）、249〜254頁（1981年）に記載されており、
流動細胞計の一般的な記載は、フロー・シトメト
リイ・アンド・ソーテイング、エム・アール・メ
ラメツド、ピイ・イー・マラニイおよびエム・エ
ル・メンデルソン（Flow Cytometry and
Sorting，M.R.Melamed，P.E.Mullaney and
M.L.Mendelsohn）、ジエイ・ワイリイ・アン
ド・サンズ（J.Wiley ＆ Sons）ニユーヨーク
（1979年）・米国特許第4284355号［ハンセンら
（Hansen，el al，）、1981年８月18日発行］、米国
特許第4284412号［ハンセンら、1981年８月18日
発行］、米国特許第4284924号［オーエルら
（Auer et al.）、1981年８月４日発行］および米
国特許第3275834号［ステイーブンスら
（Stevens et al.）、1966年９月27発行］に見られ
る。 比較的大きな試料容積中の蛍光フラクチユエー
シヨン（ゆらぎまたは変動）の相関によるそれら
の相対的な寸法に基づき粒子を区別するためのレ
ーザービームおよびスリツトの使用はブリツグら
「ホモジエナス・フルオレセント・イム）アツセ
イ」、サイエンス（Briggs，et al.，
“Homogenous Fluoresent Immunoassay，”，
Science）、212巻、1266〜1267頁（1981年）およ
びニコリら「フルオレセンス・イムノアツセイ・
バースド・オン・ロング・タイム・コリレーシヨ
ン・オブ・ナンバー・フルクチユエーシヨン」、
プローシーデイング・オブ・ナシヨナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ
（Nicoli et al.，“Fluorescence Immunoassay
Based on Long Time Correlations of
Number Fluctuations，“Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A）、77巻（８）、4904〜4908頁（1980年）］に
記載されている。 米国特許第4421860号［エリングスら（Elings
et al.）］は光学的に検知されたシグナルの自己
相関処理を包含するホモジニアスフルオロイムノ
アツセイを記載している。米国特許第4407964号
［エリングスら（Elings et al.）］は前方および後
方の光線を検知することからなるホモジニアスフ
ルオロイムノアツセイを開示している。 免疫試薬およびラジオイムノアツセイは米国特
許第3853987号［ドレイヤー（Dreyer）］に開示
されている。 ［発明の概要］ 最も広範な態様において、この発明の方法は液
体媒体から発せられる約350〜1200nmの波長の電
磁シグナルの強度フラクチユエーシヨンを測定す
るのに有用である。この発明の方法において、こ
のシグナルの強度はフラクチユエーシヨンの平均
期間と比較して短い期間である非ゼロ区間の間自
己相関に付される。 この発明の方法の具体的な適用においては、液
体媒体中の蛍光強度値のフラクチユエーシヨンが
測定されるが、このフラクチユエーシヨンは液体
媒体中における蛍光粒子の存在の結果生ずる。複
数の収集区間において得られた蛍光強度値が自己
相関に付される。時間的に隣接した区間は、比較
的少数の蛍光粒子を含み部分的に重なる容積の蛍
光強度値を提示する。この発明の改良点は、この
容積中の蛍光粒子の平均滞留時間と比較して短い
長さの収集区間を使用することによるのであつ
て、その自己相関区間は収集区間と等しいか、小
倍数かあるいは分数である。 本発明に係る改良方法は、特にアナライト（分
析物）を含有する疑いのある試料中のアナライト
の定量に用いられる。試料を分析試薬と混合し
て、粒子の蛍光強度がアナライトの存在と関係す
る蛍光粒子含有分析混合物を得る。複数の部分的
に重複する試量容積を約250〜1200nmの波長で照
射する。照射された試料容積は比較的少数の蛍光
粒子を含有する。複数の等しい蛍光収集区間にお
ける蛍光強度値が測定されるが、この蛍光収集区
間の長さは照射された試料容積内の蛍光粒子の平
均滞留時間よりも短い。収集区間における蛍光強
度値は、収集区間と等しいか、小倍数か、あるい
は分数である自己相関時間区間の間自己相関に付
される。ついで、自己相関された蛍光強度値を既
知量のアナライトを含有する分析媒体から得た同
様な自己相関蛍光強度値と関係づける。 ［実施態様］ この発明の方法は液体媒体から発せられる約
350〜1200nm波長の電磁シグナルの強度フラクチ
ユエーシヨンを測定する方法の改良法を提供す
る。改良点は平均フラクチユエーシヨン期間と比
較して短かい期間である非ゼロ区間の間シグナル
強度を自己相関に付することである。 この発明はシグナル対ノイズ比が低い場合の、
例えば蛍光粒子による強度フラクチユエーシヨン
の検知に用いられる。シグナル量は、しばしば一
定時間区間のカウント数、例えば光度の測定値
（光子計数）のような時間区間当りのフオト・カ
ウント（photo−count）数によつて表示される
ことが多い。アナログ検知が採用される場合で
も、シグナルは、一般にｎすなわち一定時間当り
のカウント数に等しい値に比例する。連続的にｎ
をモニターすることにより、とび離れて大きなシ
グナルを発する粒子が試料中に存在することの指
識として大きすぎるフラクチユエーシヨンが観察
されることがある。これは小さな試料容積を１個
または数個の粒子（または細胞）からの蛍光の検
知に用いる場合の技術、例えば流動細胞計算法、
フアイバーオプテイクプローベ細胞計算法におい
て有用である。フラクチユエーシヨンの大きさの
標準的な値は測定したシグナルの二乗の平均、＜
n² _i＞（下付きのｉは計数の集合を意味し、その
各々は平均する（＜＞で示す）前に二乗する）を
算出することによつて得られる。ｎの代表的な値
がn_i＝＋δn_i（は平均値、δn_iはフラクチユエー
シヨンを意味する）である場合、 ＜n_i ²＞＝＜（＋δn_i）²＞ ＝＜²＋２δn_i＋δn_i ²＞ ＝＜²＞＋＜δn_i ²＞ ＝²＋＜δn_i ²＞ となり、ここで＜＞＝および＜nδ_i＞＝
＜δn_i＞＝０である。 つぎに、フラクチユエーシヨンの絶対量は標準
偏差： σ＝［＜n_i ²＞−²］^1/2＝［＜δn_i ²＞］^1/2によつ
て
特徴付けられ、相対量は変動変数（CV＝σ／）
によつて与えられる。 粒子が通過するのにつれて少量の試料容積から
得られる読みの集合のCVは、個々の粒子がシグ
ナルを発したか否かの指標である。粒子がほとん
どあるいは全くシグナルを発しない場合、この方
法の感度はCVの大きさにより変わる。 CVに対する主要な背景的関与因子はポアソン
数フラクチユエーシヨンである。たとえ真のシグ
ナルが不変であつてもそのシグナルの計数による
連続的な読みは σ_Ppisspo＝［］^1/2 に従い変動する。これは背景フラクチユエーシヨ
ンの相対的な大きさが （CV）_Ppisspo＝^-1/2 であることを意味する。 シグナルが低い（ｎが小さい）場合、CVは本
質的に大きく、したがつて弱い標識の粒子（弱い
シグナルを発する粒子）の存在に対しては敏感な
指標ではない。 この発明の主題は、ポアソンフラクチユエーシ
ヨンが影響しないように、シグナルフラクチユエ
ーシヨンの相対的な大きさを計算する方法を改良
することである。収集区間は、個々の事象（例え
ばフオト・カウント）を計数するに際し、２つの
隣接した収集区間の間で少量の試料容積中の粒子
分布が比較的一定であるように選択される。すな
わち、収集区間は試料容積中における粒子存続期
間と比較して短いように選択される。ついで、
CVの計算のために個々の読みの二乗を用いる代
わりに、隣接した収集区間から読みの積を用い
る。 この発明の方法において、フラクチユエーシヨ
ンの相対的な大きさの計算には粒子存続期間と比
較して短い時間区間により分離された読みの自己
相関関数を用いる。このようにして、この限定さ
れた区間の間に相関フラクチユエーシヨンだけが
寄与する。ポアソンフラクチユエーシヨンは独立
した収集区間の間では前面的に相関性がないの
で、これらポアソン背景フラクチユエーシヨンは
寄与しない。しかし、試料区間中の粒子の位置は
２個の隣接収集区間の間比較的不変なので、粒子
からのシグナルは寄与することができる。 この発明のよると、フラクチユエーシヨンは下
式 （CV_p）＝［Ｃ（ｔ）−＜ｎ＞²］^1/2／＜ｎ＞ ［ここで、（CV）_pは粒子の変動係数、ｎはフオ
ト・カウント（蛍光強度に比例する）、＜＞は連続
収集区間の総体にわたり平均すること、Ｃ（ｔ）
は自己相関区間ｔにより分けられた収集区間の間
のフオト・カウントの自己相関を示す］で評価さ
れる。 自己相関関数をシグナルフラクチユエーシヨン
の分析に用いて比較的大きな粒子を検知する先行
技術の方法では、正確な同一サンプリング容積を
周期的に検出している。相関時間が各サンプル期
間（１〜10秒）と等しいシグナルの自己相関関数
が算出された。比較的大きな粒子はその配置が長
い相関時間にわたり変化しないようなゆつくりと
した速度で拡散する。そのシグナルは自己相関関
数に寄与する。しかしながら、小さな粒子、例え
ば遊離分子はこの期間にランダムになるので、寄
与しない。この実験では長い相関区間を用いて遊
離のシグナルと結合したシグナルとを区別する。
統計学的に有意な相関関数を得るためには、合計
測定時間は相関時間と比較して長くしなければな
らない（代表的には、1000期間または10³〜10⁴
秒）。 フラクチユエーシヨンの相対的な寸法の従来か
らの測定法のうちの１つの先行技術では、０時差
異を用いた読みの自己相関関数を用いる。この方
法では、全てのタイプのフラクチユエーシヨンが
寄与する。 この発明の記載をさらに進める前に、この明細
書に用いるいくつかの言葉を定義する。 「電磁シグナルのフラクチユエーシヨン」なる
語は電磁シグナルの前後シフトを意味する。電磁
シグナルは蛍光、散乱光、透過光等によつて生じ
るものであり得る。蛍光のフラクチユエーシヨン
は通常連続媒体中で生じ、粒子と連続媒体の種々
の組合わせで増加させることができる。例えば、
液体中では、その組合わせは比較的蛍光が少ない
液体中の蛍光粒子、蛍光または非蛍光液体中の非
ホモジニアス蛍光粒子、または液体よりも蛍光が
相対的に少ない蛍光液体中の粒子が包含される。
さらに、液体中の蛍光フラクチユエーシヨンは粒
子の凝集、蛍光性となる非蛍光粒子、非蛍光性と
なる蛍光粒子または液体の蛍光の変化の結果生じ
るものであり得る。粒子は天然または合成の両方
のポリマーであつてよく、該粒子には天然粒子、
例えばビリオン、細胞、例えば赤血球、バクテリ
ア等が包含される。粒径は0.05〜100ミクロンと
することができるが、合成粒子は一般に約0.1〜
10ミクロンの直径を有する。この明細書に用いる
「電磁シグナルのフラクチユエーシヨン」なる語
には液体媒体中の蛍光強度値のフラクチユエーシ
ヨンが包含される。電磁シグナルの他のフラクチ
ユエーシヨンは液体媒体中の粒子、例えば細胞か
ら発せられる弾力的な散乱光の変化または粒子の
通過による発生源と検知機の間の透過光の変化の
結果生じる。 蛍光シグナルは通常の、蛍光性化合物の使用に
よつて得ることができる。蛍光を発する粒子は、
蛍光性化合物を粒子表面に結合させるか、または
天然状態で存在し、その表面に蛍光成分を有する
粒子を用いることによつて得ることができる。代
表的な蛍光物質にはキサンテン染料、例えばフル
オレスセイン、ローザミンおよびローダミン、ナ
フチルアミン、クマリン誘導体、例えば３−フエ
ニル−７−ヒドロキシクマリン、４−メチル−７
−ジメチルアミノクマリンおよび４−メチル−７
−メトキシクマリン、スチルベン誘導体、例えば
４−ジメチルアミノ−4′−シアノスチルベンおよ
びピレンが包含される。蛍光物質の記載について
はブランドら［アニユアル・レビユー・オブ・バ
イオケミストリイ（Brand et at.，Ann.Rev.
Biochem.）、41巻、843〜868頁］およびストライ
ヤー［サイエンス（Stryer，Science）、162：526
（1968年）］参照。 電磁シグナルの強度フラクチユエーシヨンの
「自己相関」はシグナルのフラクチユエーシヨン
をモニターする都合よい方法であつて、一般的
（familiar）強度自己相関関数 Ｃ（ｔ）＝＜ｎ（t′）ｎ（t′−ｔ）＞_t′ （式中、ｎ（t′）は時間t′における収集間隔当た
りのフオト・カウント数、ｎは強度に対する比例
項、記号＜＞_t′は多数の試料収集時間t′の間の強
度積の平均を意味する） で評価することである。 自己相関は：一定の収集区間の間に生じるフオ
トパルス数に比例した電磁シグナルを得、相関区
間ｔにより時間的に分離された２つの異なる収集
区間で得た２つのシグナルの積の多数を平均する
ことによつて決定される。 「収集区間」はフオトパルスを計数する間の時
間の長さを意味し、「ゲート・タイム」とも称す
る。収集区間の長さは電磁シグナルの強度フラク
チユエーシヨンの平均期間よりも短かく、例えば
一定容積内の蛍光粒子の平均残留時間よりも短
い。収集区間は一般的には約0.1〜10ミリ秒、よ
り一般的には約１〜10ミリ秒である。 「有効容積」は電磁シグナルの検知に用いる液
体溶媒の容積である。一般には有効容積は比較的
少数の当該粒子を含有する。その最も単純な形で
は、有効試料容積中で１個よりも多い当該粒子を
見いだす可能性は低い。 「アナライト」は測定される化合物、粒子、ま
たは組成物を意味し、これは細胞、細胞内器官、
微生物等であつてよく、特異的結合対（sbp）の
一員を含有するか、または該一員であつてよく、
１価または多価、即ち１つ以上の決定部位を有す
るリガンド、抗原、単一化合物または、少なくと
も１つの共通の決定部位を共有する複数の化合物
またはレセプターであることができる。 「sbp構成員」は２つの異なる分子からなる特
異的結合対の一員を意味し、分子の一方は他方の
分子の特定の空間および極性構造に特異的に結合
する表面上または空洞内の区域を有する。sbp構
成員はリガンドおよびレセプター（アンチリガン
ド）と称し、特異的結合対の構成員はホモロガス
（homologous）称する。 「リカンド」はレセプターが天然に存在するか
または合成できる任意の有機化合物である。 「レセプター（アンチリガンド）」は分子の特
定の空間的および極性構造、即ちエピトープまた
は決定部位を認識することができる（該組織に対
し高い結合親和性を有する）任意の巨大分子化合
物である。レセプターの代表例には天然のレセプ
ター、例えばチロキシンー結合グロブリン、抗
体、酵素、Fabフラグメント、レクチン等が包含
される。「抗体」なる語はこの場合レセプターの
例示として、またより一般的に示すために用い
る。 「細胞」は組織を作り上げる微小の原形質塊の
任意の１つを意味し、有核および無核細胞、細胞
器官、胞子および卵母細胞を包含し、膜によつて
囲まれる原形質塊からなるものである。 この発明は特に、アナライトを含む懸濁試料中
のアナライトを測定するのに用いられる。試料を
分析試薬と混合して粒子または溶液の蛍光強度が
アナライトの存在と関係する分析粒子含有混合物
を得る。粒子は分析試料の一部として試料に直接
加えることができ、また試料が細胞を含む場合の
ように試料の一部であつてよい。他方、粒子は、
分析試薬を試料と混合した結果、例えば凝集等に
より形成することもできる。広範な定義によれ
ば、分析試薬には試料と組み合わせて粒子または
溶液の蛍光強度が試料中のアナライトの存在と関
係するような粒子含有分析混合物を提供する試薬
が包含される。 ついで、複数の、部分的に重なる有効容積の該
試料を約250〜1200nm、好ましくは約325〜
700nmの波長の光で照射する。「部分的に重なる」
とは液体媒体のある部分が連続的に採取した有効
容積と共通であることを意味する。即ち、部分的
に重なる有効容積とは一定の粒子が１つより多い
連続的収集区間の記録したシグナルに寄与するこ
とを意味する。 重なる有効容積を照射するための１つの手段は
米国特許第397285号（1982年７月12日発行）記載
の方法および装置を用いることである。この特許
の記載全部をこの明細書の記載として引用する。
基本的には、有効容積は光フアイバーを用いて照
射されるが、有効容積は光フアイバーの構造によ
つて決定される。容積の形は通常円錐形である。
光フアイバーは代表的にはコア域と被覆域からな
り、その厚さ（直径）および相対的な屈折指数が
フアイバーの先端部における円錐のハーフ・アン
グル（半角 half angle）と円錐の最も小さい直
径を決定する。軸方向の有効長さは励起ビームの
強度およびフアイバー先端部から軸に沿つた距離
での励起光強度の降下率によつて決定される。率
は円錐のハーフ・アングルによつて決定され、ハ
ーフ・アングルが大きな程強度降下率がを大き
く、従つて有効コア長さが短くなる。また、強度
降下に影響を与えるものは光の散乱および媒体の
吸収特性である。 観察されたシグナルに影響を与える種々のパラ
メーターは、背景シグナルに対し識別を可能とす
る、合理的な限界値を有効試料容積にもたらすこ
とができるように選択される。 有効容積の相異は試料容積内外の粒子の拡散を
可能とする延長時間の長さによるもので、各々が
異なる有効容積からのシグナルを受け取る複数の
光フアイバーの結果である。また、試料が１つ以
上の光フアイバーにより流れるか、または１つ以
上の光フアイバーが試料中を移動するようなダイ
ナミツクシステムを用いることができる。 励起光は試料全体または試料の主要部分を励起
光で照射することで提供することができる。別法
として、好ましくは励起光は光フアイバーで与え
ることができ、その結果試料容積は照射された容
積に比例する。 特に有用な光フアイバー装置はカツプラー
（coupler）またはマラチプレツクサー
（multiplexcer）として知られている市販の装置
である。この装置は３つの光フアイバーを結合し
て、励起光が供給される通称投入口、試料中に浸
漬するプローベ口および検知口の３つの末端口を
有する二股の管を形成する。この発明の使用に都
合よい形では、フアイバーは投入口に入る実質的
に全ての光がプローベ口に伝導されるように結合
する。蛍光放射のようなプローベ口に入る光は管
接合部で別れて第一部分が投入口に、第２部分が
検知口に進む。また、二色性反射鏡を接合部に用
い、検知口に移動する実質的にすべての蛍光を検
知することができる。この種の装置は販売会社、
例えばカプトロン・インコーポレイテツド（パロ
アルト、カルホルニア）から入手できる。 この発明の実施態様の次の段階では、複数の等
しい蛍光収集区間における蛍光強度が測定され
る。蛍光収集区間の長さは一般に照射された試料
容積の蛍光粒子の滞留時間より短い。好ましく
は、蛍光強度値は前記した光フアイバーを用いて
測定される。 この発明の次の段階では、前記した収集区間に
おける蛍光強度値は収集区間と等しいか、該収集
区間の、好ましくは整数の小倍数、または分数、
好ましくは１〜10、より好ましくは１〜３倍であ
る相関時間区間にわたり自己相関に付される。一
般に、相関区間は１つの収集区間の長さに等しい
か、または長いか、あるいは照射された試料容積
内の蛍光粒子の滞留時間より短い。相関区間は通
常照射された試料容積内の蛍光粒子の滞留時間の
１／３〜1/100、好ましくは1/3〜1/10である。 つぎに、相関された蛍光強度値は既知量のアナ
ライトを含む分析媒体から同様に相関した蛍光強
度値と関係づけることができる。自己相関関数お
よび既知試料および未知試料から得た結果の関係
づけは自己相関関数化を行うに適当なプログラム
を含むコンピユーターを用いて行うことができ
る。すなわち、コンピユーターは前記測定に基づ
き試料中のアナライトの濃度を自動的に計算する
ことができる。 蛍光分析において前記方法を用いることによ
り、多数のプロトコールおよび試薬を用いること
ができる。１群のプロトコールには蛍光粒子を測
定することが包含される。この群は次のような分
析法に分けることができる。(1)アナライトは媒体
中において他の蛍光粒子と比較して特異な吸収お
よび／または放射を有する蛍光粒子からなり、従
つてその蛍光フラクチユエーシヨンにより直接検
出することができる。(2)粒子上のsbp構成員およ
び相補的sbp構成員が結合して粒子の凝集が生
じ、対応するフラクチユエーシヨンの変化が得ら
れる場合、アナライトまたは該アナライトの相補
的sbp構成員のいずれかが蛍光粒子に結合する。
(3)粒子上のsbp構成員に対し相補的がsbp構成員
が蛍光性であるか、または例えば第３の蛍光物質
ラベルsbp構成員のような蛍光試薬との結合また
は反応により蛍光性になる場合、アナライトまた
は該アナライトの相補的sbp構成員のいずれかが
非蛍光粒子に結合する。(4)粒子上のsbp構成員に
対し相補的なsbp構成員が粒子の凝集を起こし、
生成した粒子凝集物がそれと等容積の溶解蛍光染
料含有溶液と置換することにより蛍光フラクチユ
エーシヨンの変化が生じる場合、アナライトまた
は該アナライトのsbp構成員が非蛍光粒子に結合
する。 前記技術は単にアナライト測定に用いられる多
数の分析法の中の少数の例を説明したにすぎな
い。これらの分析法はいくつかの文献および特許
にみられる（米国特許第3826613，3853987，
3925541，4061466，5062935，4141965，4164558，
4256834，4275149および4318707号参照）。上記
種々の方法の記載を引用してこの発明の記載とす
るが、これらに限定されるものではなくこの発明
の種々の方法を説明する例として用いる。 この発明はアナライトがリガンドとその同族レ
セプターからなる特異的結合対（sbp構成員）で
ある、アナライトを含有する疑のある試料中のア
ナライト測定用の装置を包含する。 この装置は (a) 複数個の部分的に重複する上記試料容積を約
250nm〜1200nmの波長光で光フアイバーを用
いて順次照射する手段（ここで、上記試料は分
析試薬と合わせて蛍光粒子を含む分析混合物と
したものであり、上記粒子は上記媒質中のアナ
ライト量に比例したsbp構成員間の結合による
ものである）、 (b) 複数個の等しい蛍光収集区間について蛍光強
度値を測定する手段（ここで、上記蛍光収集区
間の長さは、照射試料容積中の蛍光粒子の平均
時間より短かい）、 (c) 上記収集区間における蛍光強度値を、連続的
に自己相関に付す手段（ここで、上記手段はソ
フトウエアまたは専用のハードウエアであつて
よい）、 (d) 自己相関蛍光強度値を、既知量のアナライト
を含む分析媒質から得た同様な自己相関蛍光強
度値と関係づける手段 からなる。 〔実施例〕 次に実施例を挙げてこの発明を更に明らかにす
るが、これらに限定するわけではない。 実施例 ひと赤血球細胞（RBCs）のＡ群抗原について
ホモジニアス蛍光アツセイを行つた。このアツセ
イにおいて、50μlの全血を50μlの蛍光標識（フル
オレスセインイソチオシアナート−FITC）抗Ａ
群抗体（モノクローナル IgM、ケムバイオム
ド、エドモントン、アルベルタ）を用いて10分間
インキユベートした。次いで試料を緩衝液7.5ml
（0.1M重炭酸ナトリウム、EDTA20mM、ウシ血
清アルブミン（BSA）、PH8.5）で希釈し、光フア
イバープローベ血球計算機で読み取る。 カリフオルニア、パロ・アルト在カプトロン社
から入手できる「Ｙ」型フアイバーオプテイツク
スマルチプレクサーのプローベフアイバーを懸濁
液に浸した。フアイバーは直径50ミクロンを有
し、12°の半角の円錐型励起および１×10^-7mlの
有効試料容積をもたらした。He−Cdレーザーか
ら発する励起型光を２方に枝分かれしたフアイバ
ーの一方に注ぎ、マルチプレクサーによりプロー
ベフアイバーに伝達した。円錐形の励起光は、機
械的に試料を走査したプローベから発した。浸漬
したフアイバープローベに再入した試料容積から
発した蛍光の一部をマルチプレクサーにより第２
の分枝状フアイバーに伝達させ、これをフイルタ
ーにかけた後、高率フオトマルチプレクサーにつ
ないだ。このフイルターは蛍光発生波長光にたい
して励起波長光を減ずるものである。 フアイバープローベを約１cm／秒の速さで細胞
懸濁液に移した。こうすると、与えられた細胞
を、試料容積におけるフアイバーの先端の下に約
5smおくことになつた。フアイバープローベから
の蛍光を1ms毎（収集区間）に1ms当たりのフオ
トカウント数ｎを用いて記録した。このアツセイ
の場合数の平均は一般的に45であつた。1000回の
連続読みにおいて、読みの平均に関するフラクチ
ユエーシヨンを２方法により分析した。このアツ
セイでは、1000回の読みの10ブロツクのフラクチ
ユエーシヨン度を平均して最終結果を出した。 フラクチユエーシヨン分析の２方法を記載する
前に、蛍光フラクチユエーシヨン間の関係および
試料が陽性か陰性かを理解すべきである。血液が
Ａ群（陽性試料）の場合、蛍光は、抗体−細胞表
面抗原反応によりRBCsに結合するものと溶液中
で遊離しているものに分配される。フアイバープ
ローベの正面を通過する蛍光細胞は、フラクチユ
エーシヨンシグナルを発生する。しかしながら、
血液がＢ群またはＯ群（陰性試料）である場合、
蛍光は溶液中に遊離したままで、フアイバープロ
ーベはより均質のシグナルを感知する。したがつ
てこのアツセイにおいて、大量の蛍光フラクチユ
エーシヨンが陽性試料に対応する。 公知方法によりフラクチユエーシヨンを測定し
た。１収集区間（1ms）あたりのフオトカウント
の変動変数（CV）を次式を用いて計算した。 （CV）＝［＜n² _i＞−＜ｎ＞²］^1/2／＜n_i＞＝σ／ｎ 式中、n_iは、第ｉ番目の収集区間におけめフオ
トカウント（蛍光強度値に比例）であり、＜＞は
全体の連続収集区間にわたる平均をとるものとす
る。下付きのＴは、これがCV合計によるもので
あることを示す、すなわち、フラクチユエーシヨ
ンのあらゆるタイプが寄与する。CV合計を異な
る時間に得たフオトカウントに関連する相関関数
によつて書き直すことができる。 （CV）_T＝［Ｃ（Ｏ）−＜ｎ＞²］^1/2／＜ｎ＞ Ｃ（ｔ）＝＜ｎ（t′）ｎ（t′−ｔ）＞_t′ CV合計は０時間差、ｔ＝０における相関関数を
含むものとする。 次式を用い、この発明によりフラクチユエーシ
ヨンを計算した： （CV）_p＝［Ｃ（Δt）−＜ｎ＞²］^1/2／＜ｎ＞ 式中、（CV）_pは、粒子に対する変動係数であ
り、ｎはフオトカウント（蛍光強度に比例）であ
り、＜＞は全体の連続収集区間にわたる平均をと
るものとする。また、Ｃ（ｔ）は、自己相関区間
ｔにより分離された収集区間におけるフオト・カ
ウントの自己相関である。この場合、ｔはΔt、
すなわち１収集区間（この例の場合1ms）に等し
い。少なくとも１収集区間にわたつて自己相関さ
れたフラクチユエーシヨンだけが、フラクチユエ
ーシヨン度の測定値に寄与する。 結果を第１表に示す。５種の全血試料をそれぞ
れ５回分析した。５種の試料は、強陽性（A₁）、
弱陽性（A₂Ｂ）、極弱陽性（弱A₂Ｂ）および陰性
２種（ＢおよびＯ）であつた。各場合とも、５回
反復値の平均値および標準偏差をフラクチユエー
シヨン分布の２法について計算した。

【表】 この発明の方法は、最も弱い陽性をよく解析し
得る。公知方法を用いると、明らかに最も弱い陽
性と陰性との間のあらゆる差異がなくなる。 通常、陰性と陽性の結果間の限界値は、全陰性
結果の分布を用いて、平均値プラス３×標準偏差
によつて決められる。上記例では、この発明の方
法では限界値は5.2であり、公知方法では18.4で
ある。この発明の方法では、弱A₂Ｂの全５回の
分析は陽性を記録し、最も低い１回の陽性結果
（7.3）は６×標準偏差だけこの限界値から差があ
つたのに対して、公知方法では弱A₂Ｂ試料の５
回の分析の何れも陽性と記録されない。 上記結果から明らかなように、この発明は種々
の低濃度のリガンドを測定する簡単で正確な方法
を提供する。この方法は蛍光ラベルを用いて種々
の分析に適用することができる。さらに、この方
法は蛍光体全てが実質的に同じ蛍光を有するか、
または広範に変る蛍光を有することができる場合
の蛍光体の計数を包含する新規なプロトコールに
適用することができる。装置は簡単な構造であつ
て、容易に自動化でき、観察されたシグナルに基
づき試料中のアナライト量の直接的な読みを提供
することができる。 この発明は、０時試料収集における自己相関ま
たは反復試料収集の長さと等しい長い相関時間を
用いてホモジニアスイムノアツセイでの遊離また
は結合蛍光を識別するために自己相関関数を用い
る先行技術と比較して優れた改良点を有する。第
１の場合にとして、定期的な試料収集は、該試料
を簡単な方法で機械走査できるのでこの発明では
必要ない。また、測定の合計時間もより短い。こ
の発明では、1msの収集区間を用いれば、自己相
関関数に対する1000の寄与を１秒で集積すること
ができるが、一方、定期的な１秒の試料収集を用
いれば、自己相関関数に対する1000の寄与は1000
秒かかる。第２の場合として、この発明の技術は
弱くラベルした細胞のように弱い蛍光を示す粒子
と関連した特定のシグナルよりもしばしば大きい
ことがある背景ポアソンフラクチユエーシヨンの
寄与を排除する。 この発明の技術は公知の技術と比較して良好な
感度が可能である。何故ならば、この発明では背
景よりも良好なシグナルの識別が得られるからで
ある。バルク媒体の強度に対してわずかだけ大き
い蛍光強度を有する粒子を測定することができ
る。この発明で得られるのと同じ感度を達成する
他の方法は非常に強力なレザーおよび流動システ
ムを必要とする。従来からの非流動蛍光検知法は
非常に長い時間をかけなければかかるレベル感度
を提供することはできない。 この発明の目的および内容を明らかにするため
に実施例を用いて説明したが、ある種の変形は全
て特許請求の範囲内で行うことができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 液体媒質からの電磁シグナルの強度フラクチ
   ユエーシヨン測定法において、上記強度フラクチ
   ユエーシヨンの平均持続時間に比較して短かい期
   間である非ゼロ相関区間の間、上記シグナルの強
   度フラクチユエーシヨンを自己相関に付すことか
   らなる、改良方法。 ２ 電磁シグナルが蛍光放射により生ずるもので
   あり、強度フラクチユエーシヨンを上記フラクチ
   ユエーシヨンの平均持続時間の３分の１〜100分
   の１の長さを有する区間の間自己相関に付す、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 液体媒質中の蛍光強度値のフラクチユエーシ
   ヨン測定法であつて、上記フラクチユエーシヨン
   は上記液体媒質中に蛍光粒子が存在することによ
   り生ずる方法において、複数個の収集区間で得ら
   れた蛍光強度値を自己相関に付すことからなり、
   その際時間的に隣接した収集空間は部分的に重な
   る上記液体媒質容積の蛍光強度値を示し、各容積
   は比較的少数の蛍光粒子を含み、任意の上記収集
   区間の長さは上記容積中における蛍光粒子の平均
   滞留時間より短かく、自己相関区間の長さは任意
   の上記収集区間の長さと等しいか、または有限で
   あつて収集区間の長さの小倍数もしくは分数であ
   る、改良方法。 ４ 蛍光強度値が光フアイバープローベを用いて
   得られるものである、特許請求の範囲第３項記載
   の方法。 ５ 任意の自己相関区間の長さが媒質容積中の蛍
   光粒子の平均滞留時間の３分の１〜100分の１で
   ある、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６ アナライトを含む疑のある試料中のアナライ
   ト量を測定し、上記試料中の蛍光強度のフラクチ
   ユエーシヨンをレフアレンス試料の蛍光強度値の
   フラクチユエーシヨンと比較する、特許請求の範
   囲第３項記載の方法。 ７ アナライトを含む疑のある試料中のアナライ
   ト測定法において、 (a) 上記試料を分析試薬と合わせて蛍光粒子を含
   む分析混合物を作り、上記粒子の蛍光強度は上
   記アナライトの存在と関係し、 (b) 複数個の部分的に重複する上記試料容積を約
   250nm〜1200nmの波長光で順次照射し、任意
   の上記照射試料容積は比較的少ない蛍光粒子を
   含み、 (c) 複数個の等しい蛍光収集区間について蛍光強
   度値を測定し、任意の上記蛍光収集区間の長さ
   は上記照射試料容積中の蛍光粒子の平均滞留時
   間より短かく、 (d) 上記収集区間における蛍光強度値を、任意の
   上記収集区間の長さと等しいか、またはそれの
   小倍数もしくは分数の長さの自己相関区間の間
   自己相関に付し、 (e) 自己相関蛍光強度値を、既知量のアナライト
   を含む分析媒質から得た同様な自己相関蛍光強
   度値と関係づけること からなる方法。 ８ 照射試料容積を、分析混合物中に浸漬した光
   フアイバーからの光に基づいて測定する、特許請
   求の範囲第７項記載の方法。 ９ 任意の１つの自己相関区間の長さが照射試料
   容積中の蛍光粒子の平均滞留時間の３分の１〜
   100分の１である、特許請求の範囲第７項記載の
   方法。 １０ 蛍光粒子が赤血球またはラテツクスビーズ
   である、特許請求の範囲第７項記載の方法。 １１ 粒子の蛍光がリガンド・レセプター結合に
   より変調され、好ましくは上記結合が免疫化学的
   なものである、特許請求の範囲第７項記載の方
   法。 １２ 自己相関蛍光強度値が、好ましくは蛍光粒
   子と非蛍光粒子の結合を含む、粒子凝集度の関数
   である、特許請求の範囲第７項記載の方法。 １３ アナライトを含む疑のある試料中のアナラ
   イト測定法であつて、上記アナライトがリガンド
   とその対応レセプターからなる特異的結合対の一
   員（sbp構成員）である方法において、 (a) 上記試料を分析試薬と合わせて蛍光粒子を含
   む分析混合物を作り、上記粒子は上記媒質中の
   アナライト量に比例したsbp構成員間の結合に
   よるものであり、 (b) 複数個の部分的に重複する上記試料容積を約
   250nm〜1200nmの波長光で光フアイバーを用
   いて順次照射し、 (c) 複数個の等しい蛍光収集区間について蛍光強
   度値を測定し、上記蛍光収集区間の長さは上記
   フラクチユエーシヨンの平均持続時間の３分の
   １〜10分の１であり、 (e) 自己相関蛍光強度値を、既知量のアナライト
   を含む分析媒質から得た同様な自己相関蛍光強
   度値と関係づけること からなる方法。 １４ アナライトを含む疑のある試料中のアナラ
   イト測定装置であつて、上記アナライトがリガン
   ドとその対応レセプターからなる特異的結合対の
   一員（sbp構成員）である装置において、 (a) 複数個の部分的に重複する上記試料容積を約
   250nm〜1200nmの波長光で光フアイバーを用
   いて順次照射する手段（ここで、上記試料は分
   析試薬と合わせて蛍光粒子を含む分析混合物と
   したものであり、上記粒子は上記媒質中のアナ
   ライト量に比例したsbp構成員間の結合による
   ものである）、 (b) 複数個の等しい蛍光収集区間について蛍光強
   度値を測定する手段（ここで、上記蛍光収集区
   間の長さは、照射試料容積中の蛍光粒子の平均
   滞留時間より短かい）、 (c) 上記収集区間における蛍光強度値を、連続的
   に自己相関に付す手段、 (d) 自己相関蛍光強度値を、既知量のアナライト
   を含む分析媒質から得た同様な自己相関蛍光強
   度値と関係づける手段 からなる装置 １５ (c)の手段が、収集区間における蛍光強度値
   を連続的に自己相関に付すためのソフトウエアま
   たはハードウエアである、特許請求の範囲第１４
   項記載の装置。