JP2584530B2 - 多重免疫評価分析方式 - Google Patents
多重免疫評価分析方式Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、問題とするそれぞれの反応性成分と特異的
に結合する一つ以上の配位子が関与する化学的および生
物化学的評価分析に関し、さらに詳しくはその型の多重
評価分析に関する。
に結合する一つ以上の配位子が関与する化学的および生
物化学的評価分析に関し、さらに詳しくはその型の多重
評価分析に関する。
抗体−抗原複合体の形成が関与する免疫反応は、互い
に非常に特異的に結合する成分の反応により複合体が形
成される、既知の化学的または生物化学的な評価分析物
／配位子反応を代表するものである。その様な反応は他
にも数多く知られており、例えば核酸ハイブリダイゼー
ション、酵素−抑制体−、酵素−助酵素、ホルモン−受
容体、酵素−受容体、および類似の基質−特異性反応な
どである。ここで使用する「成分」および「配位子」の
用語は、一般的に、その様な複合体、特に抗原−抗体複
合体の反応性部分を、相互に交換的に意味する。例えば
これらの用語は、ハプテン、完全抗原、反応性抗原−抗
体断片、および完全抗体などの、免疫学的に反応性があ
るすべての部分を含むものとする。用語「評価分析物」
は、定性的、定量的あるいはその両方で評価分析する成
分または配位子を意味し、用語「捕獲体」は、問題とす
る評価分析物と特異的に結合する配位子または成分を意
味する。
に非常に特異的に結合する成分の反応により複合体が形
成される、既知の化学的または生物化学的な評価分析物
／配位子反応を代表するものである。その様な反応は他
にも数多く知られており、例えば核酸ハイブリダイゼー
ション、酵素−抑制体−、酵素−助酵素、ホルモン−受
容体、酵素−受容体、および類似の基質−特異性反応な
どである。ここで使用する「成分」および「配位子」の
用語は、一般的に、その様な複合体、特に抗原−抗体複
合体の反応性部分を、相互に交換的に意味する。例えば
これらの用語は、ハプテン、完全抗原、反応性抗原−抗
体断片、および完全抗体などの、免疫学的に反応性があ
るすべての部分を含むものとする。用語「評価分析物」
は、定性的、定量的あるいはその両方で評価分析する成
分または配位子を意味し、用語「捕獲体」は、問題とす
る評価分析物と特異的に結合する配位子または成分を意
味する。
これらのよく知られた免疫および他の特異的な結合反
応に基づく評価分析には、広範囲な技術が関与する。評
価分析の中には、配位子または評価分析物に結合し、そ
の反応生成物または複合体からの放射を測定することに
より評価できる、放射性、発光または蛍光標識を使用す
るものがある。一般的に、基質上に固定した抗体などの
捕獲体が、未知量の、その捕獲体と結合させるための抗
原などの反応性成分または評価分析物を含む溶液中で反
応する場合、その抗原の力価は容易に得られる。例え
ば、公知の競合評価分析技術では、評価分析物および既
知量の標識を付けた評価分析物の混合物を固定相に塗布
し、結合場所を求めて互いに競合させる。供試評価分析
物の量が多い程、標識評価分析物がその捕獲体に結合す
る程度は少なくなる。予め決めた検量曲線を使用し、結
合した捕獲体と複合体を形成した標識抗原からの放射強
度を測定することにより、標識を付けていない、つまり
供試評価分析物の量を求める、つまり評価分析すること
ができる。
応に基づく評価分析には、広範囲な技術が関与する。評
価分析の中には、配位子または評価分析物に結合し、そ
の反応生成物または複合体からの放射を測定することに
より評価できる、放射性、発光または蛍光標識を使用す
るものがある。一般的に、基質上に固定した抗体などの
捕獲体が、未知量の、その捕獲体と結合させるための抗
原などの反応性成分または評価分析物を含む溶液中で反
応する場合、その抗原の力価は容易に得られる。例え
ば、公知の競合評価分析技術では、評価分析物および既
知量の標識を付けた評価分析物の混合物を固定相に塗布
し、結合場所を求めて互いに競合させる。供試評価分析
物の量が多い程、標識評価分析物がその捕獲体に結合す
る程度は少なくなる。予め決めた検量曲線を使用し、結
合した捕獲体と複合体を形成した標識抗原からの放射強
度を測定することにより、標識を付けていない、つまり
供試評価分析物の量を求める、つまり評価分析すること
ができる。
別の一般的な技術では、評価分析物を含む試験溶液
を、捕獲体の溶液に加える。形成された複合体が十分に
凝集して沈殿するまたは膠着すると仮定して、その様な
生じた膠着または沈殿反応を観察することにより、捕獲
体に対して特異性がある評価分析物がその試験溶液に含
まれていたかどうかが分かる。この場合、膠着物または
沈殿物から反射されるまたは散乱される放射、または膠
着物または沈澱物によって透過率が弱められた放射を観
察する。反応生成物から放射（例えばα放射、発光放射
または蛍光放射）が起こる免疫評価分析では、その放射
を一般的にガイガーまたはシンチレーションカウンタ
ー、オートラジオグラフィー、フルオリメーター等によ
り検出および／または測定することができる。
を、捕獲体の溶液に加える。形成された複合体が十分に
凝集して沈殿するまたは膠着すると仮定して、その様な
生じた膠着または沈殿反応を観察することにより、捕獲
体に対して特異性がある評価分析物がその試験溶液に含
まれていたかどうかが分かる。この場合、膠着物または
沈殿物から反射されるまたは散乱される放射、または膠
着物または沈澱物によって透過率が弱められた放射を観
察する。反応生成物から放射（例えばα放射、発光放射
または蛍光放射）が起こる免疫評価分析では、その放射
を一般的にガイガーまたはシンチレーションカウンタ
ー、オートラジオグラフィー、フルオリメーター等によ
り検出および／または測定することができる。
抗体−抗原反応に関与する結合力は、多くの点で他の
特異的結合、例えば酵素−基質および酵素助酵素複合体
形成において生じる特異的な結合に類似した、静電気、
水素結合およびファンデルワールス力の相互作用の組み
合わせであり、それによって非常に強い特異的な結合を
与えると考えられる。しかし、その様な結合反応の特異
性は絶対的なものではない。その様な特異的反応に関与
する成分、特に標識を付けた抗体は他の物質と結合する
ことが多いので、結合の特異性に依存する免疫評価分析
および捕獲体評価分析などの評価分析においては、その
様な非特異性結合が起こることにより、評価分析の感度
および再現性に悪影響を及ぼすことがある。ここで使用
する用語「結合した」は、特異的または非特異的なあら
ゆる種類の結合により結合した配位子に関して使用して
いることは明らかである。
特異的結合、例えば酵素−基質および酵素助酵素複合体
形成において生じる特異的な結合に類似した、静電気、
水素結合およびファンデルワールス力の相互作用の組み
合わせであり、それによって非常に強い特異的な結合を
与えると考えられる。しかし、その様な結合反応の特異
性は絶対的なものではない。その様な特異的反応に関与
する成分、特に標識を付けた抗体は他の物質と結合する
ことが多いので、結合の特異性に依存する免疫評価分析
および捕獲体評価分析などの評価分析においては、その
様な非特異性結合が起こることにより、評価分析の感度
および再現性に悪影響を及ぼすことがある。ここで使用
する用語「結合した」は、特異的または非特異的なあら
ゆる種類の結合により結合した配位子に関して使用して
いることは明らかである。
この評価分析に対する非特異的結合の影響を排除する
ための先行技術の試みは、主として化学的であり、非特
異的結合を抑制する、または阻止するためのタンパク質
を含む試薬を使用することに向けられていた。しかし、
その様な試薬は、抗体−抗原評価分析には多くの異なっ
た種類の阻止物（例えば牛胎血清、ゼラチン、カゼイ
ン、等）が使用されているので、万能ではない。
ための先行技術の試みは、主として化学的であり、非特
異的結合を抑制する、または阻止するためのタンパク質
を含む試薬を使用することに向けられていた。しかし、
その様な試薬は、抗体−抗原評価分析には多くの異なっ
た種類の阻止物（例えば牛胎血清、ゼラチン、カゼイ
ン、等）が使用されているので、万能ではない。
分かり易くするために以下の説明では、特異的結合反
応が関与する評価分析を免疫評価分析に関して説明する
が、無論、そこに関与する原理は、特に注意がない限
り、特異的結合反応が関与する他の種類の評価分析にも
適用することができる。
応が関与する評価分析を免疫評価分析に関して説明する
が、無論、そこに関与する原理は、特に注意がない限
り、特異的結合反応が関与する他の種類の評価分析にも
適用することができる。
特異的結合反応が関与する測定の最高感度を達成する
ことは、最も強力な信号および最も感度の高い機器を使
用するということではない。感度の中には、抗体の親和
性による制限があるために、標識や機器の改良によって
向上させることができないものがある。
ことは、最も強力な信号および最も感度の高い機器を使
用するということではない。感度の中には、抗体の親和
性による制限があるために、標識や機器の改良によって
向上させることができないものがある。
例えば、捕獲または非競合性免疫評価分析を考えてみ
る。原則的に、抗体の親和性が低いために生じる影響
は、標識を付けた抗体の濃度を高くすることによって克
服できるので、非競合性免疫評価分析は、競合性免疫評
価分析よりも感度をより高くできる可能性がある。それ
ぞれ同じ抗体を使用する場合、競合方法に対して非競合
方法が有する潜在的な感度に関する優越性は、抗体の親
和性が低くなる程増加する。抗体親和性1012Mを使用し
て、例えば、非特異的結合の影響を１％から0.01％に低
下させることができる場合、潜在的な評価分析感度は10
5から103分子/mlに増加するであろう。しかし、標識を
付けた抗体の量を増加させると、標識を付けた抗体の非
特異的結合の絶対量が増加することになり、より量が少
ない抗原を見分ける能力が低下し、非競合方法の実際の
感度の長所を排除あるいは低下させることになろう。
る。原則的に、抗体の親和性が低いために生じる影響
は、標識を付けた抗体の濃度を高くすることによって克
服できるので、非競合性免疫評価分析は、競合性免疫評
価分析よりも感度をより高くできる可能性がある。それ
ぞれ同じ抗体を使用する場合、競合方法に対して非競合
方法が有する潜在的な感度に関する優越性は、抗体の親
和性が低くなる程増加する。抗体親和性1012Mを使用し
て、例えば、非特異的結合の影響を１％から0.01％に低
下させることができる場合、潜在的な評価分析感度は10
5から103分子/mlに増加するであろう。しかし、標識を
付けた抗体の量を増加させると、標識を付けた抗体の非
特異的結合の絶対量が増加することになり、より量が少
ない抗原を見分ける能力が低下し、非競合方法の実際の
感度の長所を排除あるいは低下させることになろう。
配位子−結合測定における従来の方法では、通常、先
ず使用する機器のゼロ応答に対する一連の外部測定（つ
まり結合の実測とは別に、またはそれに先立って）を行
なう、即ち、実行すべき評価分析に関係ない非特異的結
合の測定を、問題とする評価分析物を全く含まないこと
が分かっている試料の評価分析により行なうことによっ
て、非特異的結合を推定する。一般に、その様な測定は
一定ではなく、ある平均値の辺りで変動する。その様な
一連の測定から、平均非特異的結合（NSB）応答、およ
びNSBノイズ水準を決定できるが、そこではNSB測定にお
ける２乗平均（RMS）ノイズがNSB応答の標準偏差と等し
い。それに続く未知の評価分析物の濃度の評価分析で
は、その系の応答から平均NSB応答を引いたものとし
て、特異的応答を得る。無論、与えられた試料が評価分
析物を確実に含んでいるためには、特異的応答はノイズ
よりも大きくなければならない。評価分析物水準が非常
に低い場合、ノイズは通常NSBノイズにより支配され
る。
ず使用する機器のゼロ応答に対する一連の外部測定（つ
まり結合の実測とは別に、またはそれに先立って）を行
なう、即ち、実行すべき評価分析に関係ない非特異的結
合の測定を、問題とする評価分析物を全く含まないこと
が分かっている試料の評価分析により行なうことによっ
て、非特異的結合を推定する。一般に、その様な測定は
一定ではなく、ある平均値の辺りで変動する。その様な
一連の測定から、平均非特異的結合（NSB）応答、およ
びNSBノイズ水準を決定できるが、そこではNSB測定にお
ける２乗平均（RMS）ノイズがNSB応答の標準偏差と等し
い。それに続く未知の評価分析物の濃度の評価分析で
は、その系の応答から平均NSB応答を引いたものとし
て、特異的応答を得る。無論、与えられた試料が評価分
析物を確実に含んでいるためには、特異的応答はノイズ
よりも大きくなければならない。評価分析物水準が非常
に低い場合、ノイズは通常NSBノイズにより支配され
る。
そこで、本発明の主目的は、系の感度を向上させるた
めに、「外部の」比較測定を補足するのに使用できる
「内部の」標準を使用する配位子−結合測定方式を提供
することである。
めに、「外部の」比較測定を補足するのに使用できる
「内部の」標準を使用する配位子−結合測定方式を提供
することである。
本発明のもう一つの重要な目的は、抗体などの標識を
付けた配位子の非特異的結合の影響を抑制し、または最
小に抑えることにより、先行技術による免疫評価分析で
現在達成できる感度以上に、評価分析の感度を増加させ
る様な方式を提供することである。
付けた配位子の非特異的結合の影響を抑制し、または最
小に抑えることにより、先行技術による免疫評価分析で
現在達成できる感度以上に、評価分析の感度を増加させ
る様な方式を提供することである。
本発明の他の目的は、以下に説明する。
したがって、本発明は、構造を有し、素子を組み合わ
せ、部品を配列した装置、および幾つかの段階を含み、
その様な段階の一つ以上が他のそれぞれと関連した方法
から成るが、それらのすべてを以下に詳細に説明し、そ
の適用範囲を請求項に示す。
せ、部品を配列した装置、および幾つかの段階を含み、
その様な段階の一つ以上が他のそれぞれと関連した方法
から成るが、それらのすべてを以下に詳細に説明し、そ
の適用範囲を請求項に示す。
本発明の性格および目的を理解し易くするために、本
発明の原理を具体化した装置を部分的に図式的に、部分
的に断面で示した添付の図面を参照しながら、以下に詳
細に説明する。
発明の原理を具体化した装置を部分的に図式的に、部分
的に断面で示した添付の図面を参照しながら、以下に詳
細に説明する。
本発明の方式は、全体的には多重評価分析方式であ
り、そこではその系内の二つの異なった配位子の結合程
度に比例する信号を発信し、それをリアルタイムで、一
般的に同時期に、即ち本質的に同時に、あるいは評価分
析中の同じ試料に関して比較的短時間の間に行なった観
察または測定の順に評価する。多くの場合、背景におけ
る急速な変化の影響をできるだけ少なくするために、観
察をできるだけ同時に行うのが望ましい。
り、そこではその系内の二つの異なった配位子の結合程
度に比例する信号を発信し、それをリアルタイムで、一
般的に同時期に、即ち本質的に同時に、あるいは評価分
析中の同じ試料に関して比較的短時間の間に行なった観
察または測定の順に評価する。多くの場合、背景におけ
る急速な変化の影響をできるだけ少なくするために、観
察をできるだけ同時に行うのが望ましい。
本発明の多重方式は、それぞれ対応する評価分析物と
特異的に結合する異なった標識を付けた配位子を使用
し、二つ以上の評価分析物を本質的に同時に評価分析す
る、公知の多重チャネル評価分析とは区別すべきであ
る。尿中のモルヒネおよびコカインを検出するための二
重無線免疫評価分析（Dual Radioimmunoassay）、A.S.Y
oung,F.RubioおよびS.E.Wagner,Clinical Chemistry,第
34巻、第６号、1988、1161頁参照。
特異的に結合する異なった標識を付けた配位子を使用
し、二つ以上の評価分析物を本質的に同時に評価分析す
る、公知の多重チャネル評価分析とは区別すべきであ
る。尿中のモルヒネおよびコカインを検出するための二
重無線免疫評価分析（Dual Radioimmunoassay）、A.S.Y
oung,F.RubioおよびS.E.Wagner,Clinical Chemistry,第
34巻、第６号、1988、1161頁参照。
しかし、本発明の多重評価分析方式の代表的な実施形
態は、ある試料中の問題とする特定の評価分析物との特
異的な結合反応を測定するもので、その方式では、二つ
以上の、異なった標識を付けた、それぞれ固有の異なっ
た結合特性を持つ配位子を、その系内の試料に関して同
時に観察する。
態は、ある試料中の問題とする特定の評価分析物との特
異的な結合反応を測定するもので、その方式では、二つ
以上の、異なった標識を付けた、それぞれ固有の異なっ
た結合特性を持つ配位子を、その系内の試料に関して同
時に観察する。
得られた応答は処理によって、その様な評価分析中の
特異的結合の応答をより正確に決定できる様に、非特異
的結合の影響を少なくする。
特異的結合の応答をより正確に決定できる様に、非特異
的結合の影響を少なくする。
したがって、本発明の方法は、試料中の問題となる評
価分析物のための評価分析を提供する。この方法は、少
なくとも二つの異なった配位子を与える工程を含み、各
配位子はそれぞれ異なった、互いに見分けが付く種類の
標識に結合し、その様な配位子の少なくとも第一の配位
子はその評価分析物と特異的に結合することができる。
それらの配位子と試料は混合により互いに接触し、少な
くともその第一の配位子および評価分析物が関与する複
合体を含む試験体（これは液体でよい）を形成する。次
いで、その試験体中の配位子にのみ結合した標識のそれ
ぞれを同時に、定量的に、個別に測定し、これらの測定
を比較する。無論、先ず未結合配位子を洗い流し、結合
配位子を未結合配位子から分離することによって、より
簡単に測定を行なうことができる。
価分析物のための評価分析を提供する。この方法は、少
なくとも二つの異なった配位子を与える工程を含み、各
配位子はそれぞれ異なった、互いに見分けが付く種類の
標識に結合し、その様な配位子の少なくとも第一の配位
子はその評価分析物と特異的に結合することができる。
それらの配位子と試料は混合により互いに接触し、少な
くともその第一の配位子および評価分析物が関与する複
合体を含む試験体（これは液体でよい）を形成する。次
いで、その試験体中の配位子にのみ結合した標識のそれ
ぞれを同時に、定量的に、個別に測定し、これらの測定
を比較する。無論、先ず未結合配位子を洗い流し、結合
配位子を未結合配位子から分離することによって、より
簡単に測定を行なうことができる。
本発明は、反応表面上の固定した配位子に評価分析物
を特異的に結合して、複合体を形成することにより、試
料中の評価分析物を評価分析する装置において具体化さ
れている。特異的な結合は、試料を、固定した配位子、
および別の、異なった標識を付けた第二の配位子に接触
させて行なう。二つの異なった配位子は、互いに予め決
めた比率で与えられ、免疫学的に相互反応しないもので
ある。第二の配位子は、評価分析物または試料中の他の
成分と特異的に結合しないのが好ましい。配位子上の異
なった標識は定量的に測定できる。装置に対する、これ
らの配位子の相対的な非特異的結合特性は、既知の、あ
るいは予め決めた関数または関係にある。次いで、結合
した量の配位子にのみ結合したこれらの標識の定量測定
を本質的に同時に行う。試験体中の配位子の既知の比
率、装置に対する配位子の非特異的結合特性間の既知の
関係、および結合標識の定量測定から、第一の配位子の
評価分析物に対する特異的結合を比較的正確に求めるこ
とができる。
を特異的に結合して、複合体を形成することにより、試
料中の評価分析物を評価分析する装置において具体化さ
れている。特異的な結合は、試料を、固定した配位子、
および別の、異なった標識を付けた第二の配位子に接触
させて行なう。二つの異なった配位子は、互いに予め決
めた比率で与えられ、免疫学的に相互反応しないもので
ある。第二の配位子は、評価分析物または試料中の他の
成分と特異的に結合しないのが好ましい。配位子上の異
なった標識は定量的に測定できる。装置に対する、これ
らの配位子の相対的な非特異的結合特性は、既知の、あ
るいは予め決めた関数または関係にある。次いで、結合
した量の配位子にのみ結合したこれらの標識の定量測定
を本質的に同時に行う。試験体中の配位子の既知の比
率、装置に対する配位子の非特異的結合特性間の既知の
関係、および結合標識の定量測定から、第一の配位子の
評価分析物に対する特異的結合を比較的正確に求めるこ
とができる。
特に、互いに容易に区別できる信号、例えば異なった
波長における蛍光、をそれぞれ与えられる様に、異なっ
た標識を選択する。この様に、評価分析の中で特異的お
よび非特異的の両方で結合した配位子に結合した励起標
識から与えられる信号の大きさを定量測定するのであ
る。試験体または試薬中の配位子の相互の比率は既知で
あるので、また評価分析装置に対するこれらの配位子の
非特異的結合特性間の関係も既知である、または予め決
定できるので、評価分析物に特異的に結合するであろう
配位子のみに関して測定した信号が、その様な特異的に
結合した配位子のためにどの程度生じるかをリアルタイ
ムで決定するのは比較的簡単になる。
波長における蛍光、をそれぞれ与えられる様に、異なっ
た標識を選択する。この様に、評価分析の中で特異的お
よび非特異的の両方で結合した配位子に結合した励起標
識から与えられる信号の大きさを定量測定するのであ
る。試験体または試薬中の配位子の相互の比率は既知で
あるので、また評価分析装置に対するこれらの配位子の
非特異的結合特性間の関係も既知である、または予め決
定できるので、評価分析物に特異的に結合するであろう
配位子のみに関して測定した信号が、その様な特異的に
結合した配位子のためにどの程度生じるかをリアルタイ
ムで決定するのは比較的簡単になる。
例えば、評価分析物に特異的に結合する配位子（Ls）
およびその評価分析物に特異的に結合しない配位子
（Ln）が試験体中に試薬の形で、1:1の比（R1）で存在
すると仮定する。さらに、問題の評価分析物が全く存在
しない状態で評価分析装置中の試薬の予備試験を行な
い、その配位子が非特異的に1:2（Ls:Ln）の比（R2）で
結合することが分かったとする。次いで、評価分析は、
問題の評価分析物を含む可能性がある試料を試薬体に接
触させる必要がある。これにより、評価分析物とLsの特
異的結合および配位子の評価分析装置への非特異的結合
（この用語は、本文では、評価分析物のLsへの特異的結
合以外の、生じる結合反応のすべてを含むものとする）
の両方が起こる。次いで、結合した配位子上のそれぞれ
の標識から来る、特有の、個別の信号（即ち別チャネル
測定）を同時に測定する。理想的な場合には、Lnから来
る信号は、非特異的に結合した配位子Lnにのみ帰せられ
るのに対し、Lsから来る信号は、特異的および非特異的
の両方で結合した配位子から発生する。配位子は比R1で
存在し、試薬中のこれらの配位子の相対的な非特異的結
合特性はR2であることが分かっているので、これらの関
係を使って特異的に結合したLsから発生した信号の程度
を求めることができる。
およびその評価分析物に特異的に結合しない配位子
（Ln）が試験体中に試薬の形で、1:1の比（R1）で存在
すると仮定する。さらに、問題の評価分析物が全く存在
しない状態で評価分析装置中の試薬の予備試験を行な
い、その配位子が非特異的に1:2（Ls:Ln）の比（R2）で
結合することが分かったとする。次いで、評価分析は、
問題の評価分析物を含む可能性がある試料を試薬体に接
触させる必要がある。これにより、評価分析物とLsの特
異的結合および配位子の評価分析装置への非特異的結合
（この用語は、本文では、評価分析物のLsへの特異的結
合以外の、生じる結合反応のすべてを含むものとする）
の両方が起こる。次いで、結合した配位子上のそれぞれ
の標識から来る、特有の、個別の信号（即ち別チャネル
測定）を同時に測定する。理想的な場合には、Lnから来
る信号は、非特異的に結合した配位子Lnにのみ帰せられ
るのに対し、Lsから来る信号は、特異的および非特異的
の両方で結合した配位子から発生する。配位子は比R1で
存在し、試薬中のこれらの配位子の相対的な非特異的結
合特性はR2であることが分かっているので、これらの関
係を使って特異的に結合したLsから発生した信号の程度
を求めることができる。
例えば、信号の大きさをAsおよびAnで測定し、それぞ
れ特異的および非特異的に結合したLsおよび非特異的に
結合したLnを表わすと仮定すると、特異的に結合したLs
にのみ帰せられる信号Asの部分Ｓは、次の式で表わさ
れ、 （１） Ｓ＝As−Anf（R1,R2） ここで、ｆ（R1,R2）は値R1およびR2の関数（直線また
は非直線である必要はない）である。
れ特異的および非特異的に結合したLsおよび非特異的に
結合したLnを表わすと仮定すると、特異的に結合したLs
にのみ帰せられる信号Asの部分Ｓは、次の式で表わさ
れ、 （１） Ｓ＝As−Anf（R1,R2） ここで、ｆ（R1,R2）は値R1およびR2の関数（直線また
は非直線である必要はない）である。
積としての関数の簡単な代表的な形は、 （２） ｆ＝K1R1K2R2 であり、ここでK1およびK2は単に実験的に求める比例定
数または荷重定数である。
数または荷重定数である。
本発明の上記の評価分析装置の変形では、定量的に測
定でき、他の二つの配位子上の標識から容易に区別で
き、問題の評価分析物上の異なった場所に、あるいは異
なった評価分析物に特異的に結合する標識を付けた、他
のまたは第三の配位子を追加使用する。無論、三つの配
位子はすべて、互いに予め決めた比率になっており、こ
れらの配位子は免疫学的に相互反応しない。これら三つ
の配位子の、装置に関する相対的な非特異的結合特性
は、既知のまたは予め決めた関数または関数にある。こ
の方式は三つのチャネル、すなわち二つの特異的および
一つの非特異的チャネルを与え、そのチャネルから二つ
の特異的結合配位子の特異的結合特性を求めることがで
きる。
定でき、他の二つの配位子上の標識から容易に区別で
き、問題の評価分析物上の異なった場所に、あるいは異
なった評価分析物に特異的に結合する標識を付けた、他
のまたは第三の配位子を追加使用する。無論、三つの配
位子はすべて、互いに予め決めた比率になっており、こ
れらの配位子は免疫学的に相互反応しない。これら三つ
の配位子の、装置に関する相対的な非特異的結合特性
は、既知のまたは予め決めた関数または関数にある。こ
の方式は三つのチャネル、すなわち二つの特異的および
一つの非特異的チャネルを与え、そのチャネルから二つ
の特異的結合配位子の特異的結合特性を求めることがで
きる。
本発明の一実施形態は、蛍光標識を使用する蛍光免疫
評価分析方式、特に減衰全反射（ATR）セルを使用する
評価分析で説明するが、無論、本発明の原理は、特異的
結合反応が関与し、他の種類の検出可能な標識を使用す
る、他の型の評価分析にも及ぶ。
評価分析方式、特に減衰全反射（ATR）セルを使用する
評価分析で説明するが、無論、本発明の原理は、特異的
結合反応が関与し、他の種類の検出可能な標識を使用す
る、他の型の評価分析にも及ぶ。
放射伝達性材料から成るスラブ形状のATRセルを使用
して、エバネッセント波によりセル表面に誘発され、そ
のセル表面に対して本質的に直角にセルを横切って進む
蛍光を観察し測定することが、最初にT.ヒルシュフェル
ドにより、米国特許第3,604,927号に提案されている。
より高度なATR免疫評価分析装置が1985年12月10日付米
国特許第4,558,014号に詳細に記載されているが、その
様なATRセルの説明および操作をここに参考として含め
る。その様なセルにより検出される蛍光信号はそのセル
の反応表面に近接するエバネッセント区域内にのみ生じ
るので、発明においてその様なATRセルを使用すること
により、明らかな利点が得られる。この様に、セル自体
が、反応表面に非特異的に結合し、および反応表面で形
成された複合体に特異的に結合した配位子から、遊離の
配位子を自動的に分離する。
して、エバネッセント波によりセル表面に誘発され、そ
のセル表面に対して本質的に直角にセルを横切って進む
蛍光を観察し測定することが、最初にT.ヒルシュフェル
ドにより、米国特許第3,604,927号に提案されている。
より高度なATR免疫評価分析装置が1985年12月10日付米
国特許第4,558,014号に詳細に記載されているが、その
様なATRセルの説明および操作をここに参考として含め
る。その様なセルにより検出される蛍光信号はそのセル
の反応表面に近接するエバネッセント区域内にのみ生じ
るので、発明においてその様なATRセルを使用すること
により、明らかな利点が得られる。この様に、セル自体
が、反応表面に非特異的に結合し、および反応表面で形
成された複合体に特異的に結合した配位子から、遊離の
配位子を自動的に分離する。
図面に関して、完全に内部反射する評価分析セル10の
部分断面を示す。セル10の好ましい実施形態は、円筒状
の棒またはファイバー12を含むが、これは引伸した、本
質的に円筒状の、光学的に透明な物体であり、多重内部
前反射によりその長さに沿って光を伝える様になってお
り、光学放射は、そのファイバーの縦軸を中心とする本
質的に回転対称の立体角度内で、そのファイバーの一端
に入射する。例として、ファイバー12は、評価分析する
液体試料の屈折率よりも大きな屈折率を持つものであれ
ば、ガラス、石英、サファイア、ポリプロピレン、ポリ
オレフィン、ナイロン、等の多くの光学的に透明な材質
のどれでもよい。以下に説明する様に、合成重合体はガ
ラスなどの無機基材よりも、以下に述べる被覆が密着し
易いので、合成重合体の方が好ましい。好ましくは、フ
ァイバー12は、評価分析する液体に比較的不溶性で、非
反応性の材料から成る毛細管14内に収容する。ファイバ
ー12は毛細管14の中を通り、一般的に栓16により同軸状
に支えてあり、末端表面18を除いてファイバーの全体が
管14の中に位置している。
部分断面を示す。セル10の好ましい実施形態は、円筒状
の棒またはファイバー12を含むが、これは引伸した、本
質的に円筒状の、光学的に透明な物体であり、多重内部
前反射によりその長さに沿って光を伝える様になってお
り、光学放射は、そのファイバーの縦軸を中心とする本
質的に回転対称の立体角度内で、そのファイバーの一端
に入射する。例として、ファイバー12は、評価分析する
液体試料の屈折率よりも大きな屈折率を持つものであれ
ば、ガラス、石英、サファイア、ポリプロピレン、ポリ
オレフィン、ナイロン、等の多くの光学的に透明な材質
のどれでもよい。以下に説明する様に、合成重合体はガ
ラスなどの無機基材よりも、以下に述べる被覆が密着し
易いので、合成重合体の方が好ましい。好ましくは、フ
ァイバー12は、評価分析する液体に比較的不溶性で、非
反応性の材料から成る毛細管14内に収容する。ファイバ
ー12は毛細管14の中を通り、一般的に栓16により同軸状
に支えてあり、末端表面18を除いてファイバーの全体が
管14の中に位置している。
ファイバー12の外側表面の部分に、例えば免疫型反応
の反応体、即ち抗体−抗原複合体の成分の一つから形成
できる、固定した、つまり予め結合した被覆20がある。
一般的に、被覆は、先ずファイバー表面または基材に複
数の結合場所を与え、次いで抗体−抗原複合体の望まし
い成分の多くをこれらの結合場所に、好ましくは共有結
合により、公知の方法で結合させる。抗体−抗原複合体
の選択した成分を先ず固定する基材上の結合場所は、複
合体の補完部分のための成分の親和性およびアビジチー
（avidity）を著しく損なわずに、必要な固定性を与え
る様に選択する。ファイバー12がガラスである場合、好
適な結合場所は、良く知られている様に、ガラス表面に
シリル化合物を反応させることによって得られる。他の
好適なシリル化合物の結合、および抗体または抗原のカ
ルボキシル、アミノおよび他の反応性の基を各種の無機
材料と結合させる方法は、Weetallにより米国特許第3,6
52,761号に記載されている。重合体との結合の方が容易
である場合が多く、重合体の表面に抗体および抗原を固
定する方法を記載した文献が多数ある。場合により、適
切に選択した成分を有する好適な試薬でセルの表面を単
に濡らすことにより、被覆20の吸着により施すこともで
きる。
の反応体、即ち抗体−抗原複合体の成分の一つから形成
できる、固定した、つまり予め結合した被覆20がある。
一般的に、被覆は、先ずファイバー表面または基材に複
数の結合場所を与え、次いで抗体−抗原複合体の望まし
い成分の多くをこれらの結合場所に、好ましくは共有結
合により、公知の方法で結合させる。抗体−抗原複合体
の選択した成分を先ず固定する基材上の結合場所は、複
合体の補完部分のための成分の親和性およびアビジチー
（avidity）を著しく損なわずに、必要な固定性を与え
る様に選択する。ファイバー12がガラスである場合、好
適な結合場所は、良く知られている様に、ガラス表面に
シリル化合物を反応させることによって得られる。他の
好適なシリル化合物の結合、および抗体または抗原のカ
ルボキシル、アミノおよび他の反応性の基を各種の無機
材料と結合させる方法は、Weetallにより米国特許第3,6
52,761号に記載されている。重合体との結合の方が容易
である場合が多く、重合体の表面に抗体および抗原を固
定する方法を記載した文献が多数ある。場合により、適
切に選択した成分を有する好適な試薬でセルの表面を単
に濡らすことにより、被覆20の吸着により施すこともで
きる。
例えば、公知のサンドイッチ評価分析には、ATR基材
上に固定する選択成分は、問題の評価分析物に特異的に
結合する配位子であろう。その様な配位子は、好ましく
は十分な量で与え、評価分析すべき評価分析物分子また
は成分の数を優に上回る、多数の反応場所を獲得し、反
応場所がその後で飽和しない様にする。次いで被覆した
セルを、評価分析する評価分析物を含むことがある試
料、および二つの標識を付けた配位子を含む試薬の両方
に接触させ、結合反応が確実に完了するのに十分な時
間、反応物を処理する。次いで、固定した評価分析物に
結合し、評価分析装置の他の部分に非特異的に結合し
た、標識を付けた配位子から得た信号を測定する。そこ
で第二の結合配位子（即ち評価分析物に特異的に結合で
きない配位子）から測定した信号は、第一の結合配位子
から受けた信号のどれだけの量または比率の後者の評価
分析物への特異的な結合から発生しているのかを予見す
る（計算図表、表または公式により）のに使用できる。
上に固定する選択成分は、問題の評価分析物に特異的に
結合する配位子であろう。その様な配位子は、好ましく
は十分な量で与え、評価分析すべき評価分析物分子また
は成分の数を優に上回る、多数の反応場所を獲得し、反
応場所がその後で飽和しない様にする。次いで被覆した
セルを、評価分析する評価分析物を含むことがある試
料、および二つの標識を付けた配位子を含む試薬の両方
に接触させ、結合反応が確実に完了するのに十分な時
間、反応物を処理する。次いで、固定した評価分析物に
結合し、評価分析装置の他の部分に非特異的に結合し
た、標識を付けた配位子から得た信号を測定する。そこ
で第二の結合配位子（即ち評価分析物に特異的に結合で
きない配位子）から測定した信号は、第一の結合配位子
から受けた信号のどれだけの量または比率の後者の評価
分析物への特異的な結合から発生しているのかを予見す
る（計算図表、表または公式により）のに使用できる。
例として説明したATRにおいては、光源24がセル10に
光線22を送るように設けられている。光線24は、白熱電
球、発光ダイオード、日光、等から放射される光で照明
したコンデンサーの様な、広帯域光源でよいが、光源24
は、一対の狭い波長帯内で励起放射するための二重光源
を備えているのが好ましく、この目的のために、適当な
帯域フィルターを含むことができる。二つの帯域の中央
波長は、照明した時に標識配位子を励起して蛍光を出さ
せるために、標識配位子上の標識として使用する発蛍光
団の吸収特性により選択する。また、光源24は、対物レ
ンズ28を適当な緑を持った光線で照明し、レンズ28が光
源の口径（aperture）を末端表面18に映し、好ましくは
ファイバーの口径数に相当する角度よりも大きな角度で
末端表面18に光源が入射しない様にするために、当業者
なら理解できる様な、好適な光線の形状を調整する手段
を含む。
光線22を送るように設けられている。光線24は、白熱電
球、発光ダイオード、日光、等から放射される光で照明
したコンデンサーの様な、広帯域光源でよいが、光源24
は、一対の狭い波長帯内で励起放射するための二重光源
を備えているのが好ましく、この目的のために、適当な
帯域フィルターを含むことができる。二つの帯域の中央
波長は、照明した時に標識配位子を励起して蛍光を出さ
せるために、標識配位子上の標識として使用する発蛍光
団の吸収特性により選択する。また、光源24は、対物レ
ンズ28を適当な緑を持った光線で照明し、レンズ28が光
源の口径（aperture）を末端表面18に映し、好ましくは
ファイバーの口径数に相当する角度よりも大きな角度で
末端表面18に光源が入射しない様にするために、当業者
なら理解できる様な、好適な光線の形状を調整する手段
を含む。
光線分割器30の様な手段を光源24とレンズ28の間に配
置する。好ましい実施態様では、光線分割器30は、二つ
の励起波長帯域を反射し、表面18から来るそれぞれの蛍
光放射を透過する様に形成する。
置する。好ましい実施態様では、光線分割器30は、二つ
の励起波長帯域を反射し、表面18から来るそれぞれの蛍
光放射を透過する様に形成する。
評価分析物を含む試料をファイバー12と管14との間の
内部空間32に導入した場合、被覆20中の固定配位子がそ
の評価分析物と特異的に結合する様に選択してあり、そ
の試料中にその評価分析物がある程度含まれていれば、
試料中の評価分析物は被覆20中の固定配位子と反応す
る。ここで、サンドイッチ評価分析を行なうには、二つ
の異なった標識を付けた、異なった配位子を内部空間26
に導入するが、第一の標識を付けた配位子は遊離の評価
分析物および固定配位子に結合した評価分析物の両方に
特異的に結合する。第二の標識を付けた配位子は、その
評価分析物に特異的に結合しないが、第一の標識を付け
た配位子の幾らかがする様に、ファイバー12の表面に非
特異的に結合することが予想できる。光源24から光線に
適当な角度でファイバー12の表面18に導入すると、光線
はファイバーを通して内部全反射により伝播し、ファイ
バー表面に連続したエバネッセント区域（図には示して
いない）でエバネッセント波を生じる。エバネッセント
波は、その様な結合した配位子に入射する所で、二つの
異なった波長、即ち二つの異なったチャネルで標識に蛍
光を発生させ、その蛍光の大部分は、幾らかは臨界角以
上で、幾らかな臨界角未満でファイバー12の中に戻され
る。
内部空間32に導入した場合、被覆20中の固定配位子がそ
の評価分析物と特異的に結合する様に選択してあり、そ
の試料中にその評価分析物がある程度含まれていれば、
試料中の評価分析物は被覆20中の固定配位子と反応す
る。ここで、サンドイッチ評価分析を行なうには、二つ
の異なった標識を付けた、異なった配位子を内部空間26
に導入するが、第一の標識を付けた配位子は遊離の評価
分析物および固定配位子に結合した評価分析物の両方に
特異的に結合する。第二の標識を付けた配位子は、その
評価分析物に特異的に結合しないが、第一の標識を付け
た配位子の幾らかがする様に、ファイバー12の表面に非
特異的に結合することが予想できる。光源24から光線に
適当な角度でファイバー12の表面18に導入すると、光線
はファイバーを通して内部全反射により伝播し、ファイ
バー表面に連続したエバネッセント区域（図には示して
いない）でエバネッセント波を生じる。エバネッセント
波は、その様な結合した配位子に入射する所で、二つの
異なった波長、即ち二つの異なったチャネルで標識に蛍
光を発生させ、その蛍光の大部分は、幾らかは臨界角以
上で、幾らかな臨界角未満でファイバー12の中に戻され
る。
臨界角以上でセル内に戻る光はファイバー12を通して
伝播し、その幾らかが入力面18から外に現れる。
伝播し、その幾らかが入力面18から外に現れる。
表面18から外に出る、二つの異なった波長を持つ蛍光
のそれぞれの大きさを、電子光学的検出手段34により測
定し、結合配位子のそれぞれの存在量を示す。この目的
のために、手段34は、それぞれの波長に感応する二つの
電子光学的検出器を含むことができる。あるいは、光源
24および検出手段34の代わりに、それぞれ励起および対
応する標識からの放射を検出するのに適した、スイッチ
操作できる励起および放射フィルターを有するフルオリ
メーターを使用することもできる。その様な標識から来
る信号の大きさ測定並びにR1およびR2の値に関する予め
決定した他の情報を、適切にプログラム化したデジタル
コンピュータまたは適当に配線した回路の様な手段36に
供給し、達成された特異的結合の程度を上記の様に求め
る。
のそれぞれの大きさを、電子光学的検出手段34により測
定し、結合配位子のそれぞれの存在量を示す。この目的
のために、手段34は、それぞれの波長に感応する二つの
電子光学的検出器を含むことができる。あるいは、光源
24および検出手段34の代わりに、それぞれ励起および対
応する標識からの放射を検出するのに適した、スイッチ
操作できる励起および放射フィルターを有するフルオリ
メーターを使用することもできる。その様な標識から来
る信号の大きさ測定並びにR1およびR2の値に関する予め
決定した他の情報を、適切にプログラム化したデジタル
コンピュータまたは適当に配線した回路の様な手段36に
供給し、達成された特異的結合の程度を上記の様に求め
る。
特異的結合の存在下における非特異的結合を測定する
ための多重方式の有用性を、下記の詳細な実施例におけ
る試験機構で示す。試薬試験は、公知の方法でフルオレ
セインで標識を付けたヤギの抗ウシIgG（ウシIgGに特異
的に結合すると予想される第一の配位子）、および公知
の方法でローダミンで標識を付けた、ヤギの抗マウスIg
G（第二の配位子として）から成る。ポリスチレン被覆
石英ファイバー製のATRセルの、少なくともその表面の
反応区域に、ウシIgGを塗布した。これらの試薬はジャ
クソン免疫会社（Jackson Immunological Corporatio
n）から入手し、抗体は供給者側で相互反応性に対して
予めスクリーンしてある。
ための多重方式の有用性を、下記の詳細な実施例におけ
る試験機構で示す。試薬試験は、公知の方法でフルオレ
セインで標識を付けたヤギの抗ウシIgG（ウシIgGに特異
的に結合すると予想される第一の配位子）、および公知
の方法でローダミンで標識を付けた、ヤギの抗マウスIg
G（第二の配位子として）から成る。ポリスチレン被覆
石英ファイバー製のATRセルの、少なくともその表面の
反応区域に、ウシIgGを塗布した。これらの試薬はジャ
クソン免疫会社（Jackson Immunological Corporatio
n）から入手し、抗体は供給者側で相互反応性に対して
予めスクリーンしてある。
両抗体の非特異的結合の予備測定を行なうために、先
ず、多数の本質的に同一の、剥き出しの、ポリスチレン
被覆した石英ファイバーに関して、これを先ずシグマ
ケミカルから入手したリン酸塩緩衝食塩（PBS）水溶液
（pH7.4）中で後者を処理した。処理の後、各ファイバ
ーをフルオレセインおよびローダミンの主波長（530nm
および580nm）にそれぞれ応答する一対の検出チャネル
を有するATRフルオリメーターのフローセルの中に入れ
た。好ましい実施態様は、フルオレセインおよびローダ
ミンを励起し、そこから放射される蛍光を検出するのに
適した、スイッチ操作できる励起および放射フィルタ
ー、即ちフルオレセイン用に480/20（480nm中央波長、2
0nm帯域）およびローダミン用に530/30の励起フィルタ
ー、フルオレセイン用に530/30およびローダミン用に58
0/20の蛍光フィルターを有するフルオリメーターを使用
する。
ず、多数の本質的に同一の、剥き出しの、ポリスチレン
被覆した石英ファイバーに関して、これを先ずシグマ
ケミカルから入手したリン酸塩緩衝食塩（PBS）水溶液
（pH7.4）中で後者を処理した。処理の後、各ファイバ
ーをフルオレセインおよびローダミンの主波長（530nm
および580nm）にそれぞれ応答する一対の検出チャネル
を有するATRフルオリメーターのフローセルの中に入れ
た。好ましい実施態様は、フルオレセインおよびローダ
ミンを励起し、そこから放射される蛍光を検出するのに
適した、スイッチ操作できる励起および放射フィルタ
ー、即ちフルオレセイン用に480/20（480nm中央波長、2
0nm帯域）およびローダミン用に530/30の励起フィルタ
ー、フルオレセイン用に530/30およびローダミン用に58
0/20の蛍光フィルターを有するフルオリメーターを使用
する。
各ファイバーはPBS流の中で２分間洗浄した。流れを
止め、一定強度の励起光線（順に480nmおよび530nm）を
ファイバーの一端から導入し、および一つはフルオレセ
イン検出チャネル、もう一つはローダミン検出チャネル
におけるバックグラウンドを読み、二つのチャネルのそ
れぞれについてバックグラウンドの読み（mV）を記録し
た。次に、PBSをフローセルから流し、等体積の、7.5μ
g/mlのローダミン標識抗マウスIgGおよび7.0μg/mlのフ
ルオロセイン標識抗ウシIgGの溶液の流れに置き換え
た。流れを止め、ファイバーを室温で２分間処理した。
次いで、抗体溶液をPBSの流れで４分間洗い流した。同
じ励起光線を再びファイバー中に導入し、それぞれのバ
ックグラウンドおよび非特異的結合の合計を表わす読み
（mV）を取り、４本のその様なファイバーのそれぞれに
ついてフルオレセインおよびローダミンに対するAfおよ
びArの値を得た。
止め、一定強度の励起光線（順に480nmおよび530nm）を
ファイバーの一端から導入し、および一つはフルオレセ
イン検出チャネル、もう一つはローダミン検出チャネル
におけるバックグラウンドを読み、二つのチャネルのそ
れぞれについてバックグラウンドの読み（mV）を記録し
た。次に、PBSをフローセルから流し、等体積の、7.5μ
g/mlのローダミン標識抗マウスIgGおよび7.0μg/mlのフ
ルオロセイン標識抗ウシIgGの溶液の流れに置き換え
た。流れを止め、ファイバーを室温で２分間処理した。
次いで、抗体溶液をPBSの流れで４分間洗い流した。同
じ励起光線を再びファイバー中に導入し、それぞれのバ
ックグラウンドおよび非特異的結合の合計を表わす読み
（mV）を取り、４本のその様なファイバーのそれぞれに
ついてフルオレセインおよびローダミンに対するAfおよ
びArの値を得た。
データを下記の表にまとめて示すが、そこではAfおよ
びArは、それぞれ結合したフルオレセインおよびローダ
ミン標識を付けたIgGから得た信号の大きさをmvで表わ
してある。処理前および処理後は、それぞれ処理前およ
び処理および洗浄後に測定した信号を表わす。結合応答
は、単に処理前および処理後それぞれの信号の差であ
り、結合率は結合応答の比率である。
びArは、それぞれ結合したフルオレセインおよびローダ
ミン標識を付けたIgGから得た信号の大きさをmvで表わ
してある。処理前および処理後は、それぞれ処理前およ
び処理および洗浄後に測定した信号を表わす。結合応答
は、単に処理前および処理後それぞれの信号の差であ
り、結合率は結合応答の比率である。
平均結合率は1.215で、標準偏差0.070およびC.V.が5.
798％であることに注意する。Afに対する平均NSB応答は
521mv、標準偏差は172.5mv（C.V.33％）であるが、これ
は事実上、ゼロ評価分析物水準におけるノイズの尺度で
ある。
798％であることに注意する。Afに対する平均NSB応答は
521mv、標準偏差は172.5mv（C.V.33％）であるが、これ
は事実上、ゼロ評価分析物水準におけるノイズの尺度で
ある。
無論、上記の応答は抗原の無い表面でなされたもので
ある。しかし、どちらの抗体とも特異的に結合しないタ
ンパク質または他の閉塞剤で閉塞したファイバーで、類
似の一連の測定が可能であることは明らかである。その
様な閉塞物を使用すると、閉塞したファイバーと剥き出
しのファイバーのそれぞれに対応する抗体の非特異的結
合特性に差があるために生じる、好ましく無い効果を少
なくするのに役立つ。
ある。しかし、どちらの抗体とも特異的に結合しないタ
ンパク質または他の閉塞剤で閉塞したファイバーで、類
似の一連の測定が可能であることは明らかである。その
様な閉塞物を使用すると、閉塞したファイバーと剥き出
しのファイバーのそれぞれに対応する抗体の非特異的結
合特性に差があるために生じる、好ましく無い効果を少
なくするのに役立つ。
次に、同じ抗体の混合物を、前に使用した様な５本の
同一のファイバーと反射させた。ファイバーをPBS中で
処理するのではなく、0.5μg/mlのウシIgG中で５分間処
理して調製した以外は、上記と同じ手順を繰り返した。
この実施例を結果を第２表に示す。
同一のファイバーと反射させた。ファイバーをPBS中で
処理するのではなく、0.5μg/mlのウシIgG中で５分間処
理して調製した以外は、上記と同じ手順を繰り返した。
この実施例を結果を第２表に示す。
このデータから、フルオレセイン標識IgGによって与
えられる特異的応答は、全平均Ar結合応答から1.215
（第１表から分かった、予め決定した結合比率）を引
き、平均値Arを乗じたものである、と言うことができ
る。ここから、平均結合応答146.2mv、標準偏差102mvが
得られる。
えられる特異的応答は、全平均Ar結合応答から1.215
（第１表から分かった、予め決定した結合比率）を引
き、平均値Arを乗じたものである、と言うことができ
る。ここから、平均結合応答146.2mv、標準偏差102mvが
得られる。
先行技術による従来のデータ解析方法では、第２表か
ら平均Af値を取り、そこから、第１表で平均Afとして示
される非特異的号にのみ帰せられる平均Af値を差し引
く。この方法に従うと、平均特異的結合応答は284.63mv
で、標準偏差は284.3mvになる。先行技術の方法と本発
明に係わる方法とを比較する都合の良い方法は、使用す
る評価分析物水準における平均の信号対ノイズ比（S/
N）を求めることである。先行技術の方法によれば、S/N
は248.6/284.3つまり1.00であるが、本発明の方法ではS
/Nが146.2/102つまり1.43となる。このことから、選択
した評価分析物水準でS/Nが約1.5改善され、ゼロ評価分
析物応答では約2.8のファクターでノイズ水準が低下す
ることになる。
ら平均Af値を取り、そこから、第１表で平均Afとして示
される非特異的号にのみ帰せられる平均Af値を差し引
く。この方法に従うと、平均特異的結合応答は284.63mv
で、標準偏差は284.3mvになる。先行技術の方法と本発
明に係わる方法とを比較する都合の良い方法は、使用す
る評価分析物水準における平均の信号対ノイズ比（S/
N）を求めることである。先行技術の方法によれば、S/N
は248.6/284.3つまり1.00であるが、本発明の方法ではS
/Nが146.2/102つまり1.43となる。このことから、選択
した評価分析物水準でS/Nが約1.5改善され、ゼロ評価分
析物応答では約2.8のファクターでノイズ水準が低下す
ることになる。
NSB測定に使用する、本発明の多重装置のもう一つの
実施例を以下に説明する。ウィルスは一種類以上の抗
体、例えばそのウィルスの外皮および核のそれぞれに特
異的な、二つの異なった抗体を形成できることが分かっ
ている。診断目的には、その様な特異的なウィルスの種
類に抗体を含むと疑われる試料、例えば血液の試料を評
価分析するのが望ましい場合がある。
実施例を以下に説明する。ウィルスは一種類以上の抗
体、例えばそのウィルスの外皮および核のそれぞれに特
異的な、二つの異なった抗体を形成できることが分かっ
ている。診断目的には、その様な特異的なウィルスの種
類に抗体を含むと疑われる試料、例えば血液の試料を評
価分析するのが望ましい場合がある。
その場合、そのウィルスの溶解質を、例えば吸着によ
り付着させた被覆として、光学ファイバーの表面に固定
することができる。次いで、その被覆したファイバーを
試料と接触させ、核および外皮の溶解質部分を、その試
料中に存在する可能性があるそれぞれの対応する抗体と
特異的に結合させることによって、複合体を形成する。
そのウィルスの核および外皮のタンパク質にそれぞれ対
応し、公知の方法でフルオレセインおよびローダミンの
様な蛍光標識をそれぞれ付けた、第一および第二の合成
または天然タンパク質を既知の比率で含む試薬を調製す
る。この試薬を試料および被覆したファイバーと混合
し、その試薬中のタンパク質が、溶解質被覆に予め結合
した抗体に特異的に結合し、ファイバーのその他の場所
に非特異的に結合できる様にする。
り付着させた被覆として、光学ファイバーの表面に固定
することができる。次いで、その被覆したファイバーを
試料と接触させ、核および外皮の溶解質部分を、その試
料中に存在する可能性があるそれぞれの対応する抗体と
特異的に結合させることによって、複合体を形成する。
そのウィルスの核および外皮のタンパク質にそれぞれ対
応し、公知の方法でフルオレセインおよびローダミンの
様な蛍光標識をそれぞれ付けた、第一および第二の合成
または天然タンパク質を既知の比率で含む試薬を調製す
る。この試薬を試料および被覆したファイバーと混合
し、その試薬中のタンパク質が、溶解質被覆に予め結合
した抗体に特異的に結合し、ファイバーのその他の場所
に非特異的に結合できる様にする。
二つのタンパク質の特異的結合比率を、その試料中に
存在し、被覆に結合した二種類の抗体の相対量により与
えられる結合場所の比率により決定する。その様な結合
場所の比率が予め分かっていれば、その結合場所の比率
と明らかに異なった比率のタンパク質で試薬を調製す
る。
存在し、被覆に結合した二種類の抗体の相対量により与
えられる結合場所の比率により決定する。その様な結合
場所の比率が予め分かっていれば、その結合場所の比率
と明らかに異なった比率のタンパク質で試薬を調製す
る。
ファイバーに結合した標識タンパク質を個別におよび
本質的に同時に本発明の装置で励起し、蛍光を発生さ
せ、標識タンパク質の特異的および非特異的結合の組み
合わせにより造られた信号を得る。しかし、無論、特異
的に結合したタンパク質上の標識から発生するそれぞれ
の信号の比率は結合場所の比率に相当するが、非特異的
に結合した標識タンパク質から発生する信号の比率は、
試薬中に配合したそれぞれのタンパク質の既知の比率に
相当する。結合場所または抗体の比率も分かっている場
合には、二つの比率は著しく異なっている（試薬を調製
する者によって決定される）ので、それぞれの信号の振
幅をそれに応じて調整し、非特異的結合の影響を除くこ
とができる。
本質的に同時に本発明の装置で励起し、蛍光を発生さ
せ、標識タンパク質の特異的および非特異的結合の組み
合わせにより造られた信号を得る。しかし、無論、特異
的に結合したタンパク質上の標識から発生するそれぞれ
の信号の比率は結合場所の比率に相当するが、非特異的
に結合した標識タンパク質から発生する信号の比率は、
試薬中に配合したそれぞれのタンパク質の既知の比率に
相当する。結合場所または抗体の比率も分かっている場
合には、二つの比率は著しく異なっている（試薬を調製
する者によって決定される）ので、それぞれの信号の振
幅をそれに応じて調整し、非特異的結合の影響を除くこ
とができる。
結合場所の比率、即ち抗体の比率が予め分かっていな
い場合は、タンパク質が第一の比率、例えば単独で存在
する他の試薬を使用して予備評価分析を行なうことがで
きる。その評価分析の結果を使用して、タンパク質の比
率が、例えば第一の評価分析における信号測定の逆数と
して決定されている第二の試薬で第二の評価分析を行な
う。第二の評価分析における信号測定から、非特異的結
合の影響を排除する計算を行なうことができる十分な情
報が得られる。
い場合は、タンパク質が第一の比率、例えば単独で存在
する他の試薬を使用して予備評価分析を行なうことがで
きる。その評価分析の結果を使用して、タンパク質の比
率が、例えば第一の評価分析における信号測定の逆数と
して決定されている第二の試薬で第二の評価分析を行な
う。第二の評価分析における信号測定から、非特異的結
合の影響を排除する計算を行なうことができる十分な情
報が得られる。
上記の方法および装置は、本発明の範囲から逸脱する
ことなく、ある一定の変形が可能であるので、上記の説
明に含まれる、または添付の図面に示されるすべての事
項は、説明のために記載されているのであって、限定す
るものではない。
ことなく、ある一定の変形が可能であるので、上記の説
明に含まれる、または添付の図面に示されるすべての事
項は、説明のために記載されているのであって、限定す
るものではない。
【図面の簡単な説明】 図面は本発明による多重免疫評価分析方式に使用される
装置の一例を示す概略図である。 （図の主要な部分を表わす符号の説明） 10……評価分析セル、 12……ファイバー、 14……管、16……栓、 18……ファイバーの末端表面、 20……被覆、22……光線、 24……光源、28……対物レンズ、 30……光線分割器、 32……内部空間、 34……光検出器、 36……コンピュータ。
装置の一例を示す概略図である。 （図の主要な部分を表わす符号の説明） 10……評価分析セル、 12……ファイバー、 14……管、16……栓、 18……ファイバーの末端表面、 20……被覆、22……光線、 24……光源、28……対物レンズ、 30……光線分割器、 32……内部空間、 34……光検出器、 36……コンピュータ。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−5659（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−286753（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−9366（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−38362（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−506403（ＪＰ，Ａ) 米国特許4471058（ＵＳ，Ａ) 国際公開87／6346（ＷＯ，Ａ)
Claims (15)
- 【請求項１】試料中の問題とする評価分析物の評価分析
方法において、 分析系において互いに区別できる異なった種類の標識を
つけた少なくとも二つの異なった配位子を用意し、該配
位子の内の少なくとも第一の配位子は該評価分析物に特
異的に結合することができ、該配位子の内の少なくとも
第二の配位子は該評価分析物に特異的には結合すること
ができず、 該配位子および該試料を接触させて、少なくとも該第一
配位子および該評価分析物が関与する複合体を形成し、 該分析系を照明してエバネッセント波を励起し、該エバ
ネッセント波は該標識のそれぞれを励起して互いに異な
る波長の蛍光放射を生起し、 該第一の配位子および該第二の配位子にそれぞれつけた
各標識の該異なる波長の蛍光放射を同時且つ定量的且つ
個別に測定し、 測定された各標識の蛍光強度を比較することにより該特
異的結合の量を求める 工程からなることを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記第一および第二の標識をつけた異なっ
た配位子を予め定めた相互比率で用意し、前記分析系に
対する前記配位子の非特異的結合特性が互いに既知の相
関関係にあり、 前記分析系内で前記配位子を前記試料に接触させ、前記
特異的結合を達成して前記複合体を形成し、 前記測定結果、前記比率および前記相関関係から、前記
評価分析物に対する前記第一の配位子の特異的結合の量
を求める 工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】前記接触工程の後に、前記評価分析物、前
記分析系およびそれらに結合している配位子から、結合
していない実質的にすべての評価分析物および配位子を
分離する工程を含むことを特徴とする請求項２記載の方
法。 - 【請求項４】前記の異なった標識のそれぞれが、励起し
た時に、互いに区別できる信号を与えることができ、本
質的に、結合した配位子から来る前記信号の大きさだけ
を測定することを特徴とする請求項３記載の方法。 - 【請求項５】前記第二の配位子が、前記試料中の前記評
価分析物以外の成分とも特異的に結合しないことを特徴
とする請求項２記載の方法。 - 【請求項６】前記第一の配位子を、前記試料中の前記評
価分析物と特異的に結合すると予想される量を超える量
で用意することを特徴とする請求項５記載の方法。 - 【請求項７】前記評価分析物が存在しない状態で、前記
分析系中の前記配位子を予備評価分析し、その予備評価
分析中に非特異的に結合した前記配位子から発せられる
それぞれの信号の大きさを定量的に測定し、 測定された前記第一および第二の配位子から来る信号の
大きさの比を求めることによって前記相関関係を決定す
る工程を含むことを特徴とする請求項４記載の方法。 - 【請求項８】前記特異的結合を求める工程を、前記比率
および前記相関関係の関数により、前記第二の配位子か
ら来る信号の値を修正して修正値を与え、前記第一の配
位子から来る信号の大きさを該修正値と比較することに
よって行うことを特徴とする請求項４記載の方法。 - 【請求項９】前記特異的結合を求める工程を、前記第一
の配位子から来る信号の大きさから、前記第二の配位子
から来る信号の大きさに前記信号の大きさの比と前記比
率とを乗じた積を差し引くことによって行うことを特徴
とする請求項７記載の方法。 - 【請求項１０】問題となる評価分析物について溶液を評
価分析する装置において、 その存在が定量的に測定できる異なった標識をそれぞれ
つけた、該評価分析物と特異的に結合できる第一の配位
子および該評価分析物と特異的には結合することができ
ない第二の配位子から少なくともなる、少なくとも二つ
の標識配位子、 少なくとも該第一の配位子が該評価分析物と特異的に結
合した複合体を形成できる反応表面、 該異なった標識を励起して互いに異なる波長の蛍光放射
を生起するエバネッセント波を該表面に励起するための
照明手段、および 該表面に結合した該標識のそれぞれの該異なる波長の蛍
光放射を同時且つ定量的且つ個別に測定するための手段 を組み合わせて有する装置。 - 【請求項１１】前記第一の配位子が前記反応表面上に固
定してあることを特徴とする請求項10記載の装置。 - 【請求項１２】前記反応表面が細い全反射セルの表面で
あることを特徴とする請求項10記載の装置。 - 【請求項１３】前記標識の両方を励起し、それぞれ異な
った信号を発信させることができる波長で、前記セル中
に放射を導入するための手段を含むことを特徴とする請
求項12記載の装置。 - 【請求項１４】前記同時且つ定量的且つ個別に測定する
ための手段が、前記のそれぞれ異なった信号の一つに対
してそれぞれ感応する一対の検出器からなることを特徴
とする請求項13記載の装置。 - 【請求項１５】前記同時且つ定量的且つ個別に測定する
ための手段が、前記標識の励起およびそこからの放射を
検出するのにそれぞれ適した、スイッチ操作できる励起
および放射フィルターを有するフルオリメーターである
ことを特徴とする請求項13記載の装置。
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| WO2002048690A1 (en) * | 2000-12-11 | 2002-06-20 | Varian Australia Pty Ltd | Method and apparatus for analysis of multiplexed samples |
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-
1990
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- 1990-07-24 GB GB9016162A patent/GB2235292B/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-07-27 DE DE19904024350 patent/DE4024350C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-17 FR FR9010440A patent/FR2651327B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-24 JP JP2221447A patent/JP2584530B2/ja not_active Expired - Fee Related
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