JPS6183938A - 高度粒子検出能のフラクチユエーシヨン分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 蛍光放射による流動懸聞体中の粒子の計数は一般にイム
ノアッセイ法および生物学的材料の検出に広範に用いら
れている。しかし、公知の方法は、試料中の無関係また
は目的としない成分から目標粒子を識別するために、特
別に設計されたオリフィス、流動路または検知域あるい
はｍ雑な計算技術を必要とする。

したがって、粒子の存在、濃度および／または拉漫の直
接的な指標を与え、とくにノブナル対ノイズ比が低くて
ら検出できる、安価で正確な技術が要望されている。

「先行技術の記載］ 狭い流路を通る細胞懸濁液の流れを注！深く制御するこ
とを包含する流動細胞計の使用がミラーら「ユーセイジ
・オン・ザ・フローシトメーター−セル・ソーター」、
ジャーナル・オン・イムノロジカル・メソッド（Ｍｕｔ
ｔｅｒ、　ｅｔ　ａｔ、　。

−Ｕｓａｇｅ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｆ　ｌｏｗ　Ｃ，ｙｔｏ
ｍｅｔｅｒ　−Ｃｅ１ｌ　５ｏｒｔｅｒ、　”　　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　）、４７巻、１３〜２４頁（１９８１年
）、ホフマンら「イムノフルオレセント・アナリシス・
オン・ブラッド・セル・パイ・フロー・シトメトリイ」
、インターナシジナル・ジャーナル・オン・イミュノフ
ァラマコロジイ（ＨｏｆＴｆａａｎ、　ｅｔ　ａｌ、　
、−Ｅ　ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ　ｏｆ　［３１００（Ｉ　Ｃｅ１ｌｓ　ｂｙ　
Ｆ　ｌｏｗ　Ｃｙｔｏ＋ａｅｔｒｙ”、　　Ｉ　ｎｔ、
　Ｊ　、　　Ｉ　ｍｍｕｎｏｐｈａｔ＋＋＋ａｃ、　）
　、３巻（３）、２４９〜２５４頁（１９８１年）に記
載されており、流動細胞計の一般的な記載は、フロー・
シトメトリイ・アンド・ソーティング、エム・アール・
メラメッド、ビイ・イー・マラニイおよびエム・エル・
メンデルソン（ＦｌｏｗＣｙＬｏｗａＬｒｙ　ａｎｄ　
Ｓｏｒｔｉｎｇ、　Ｍ、　Ｉｆ　Ｍｃｌａｍｃｄ。

Ｐ　、　Ｅ　、　Ｍｕｌｌａｎｅｙ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｌ
　、　Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ）、ジエイ・ワイリイ・ア
ンド・サンズ（Ｊ　、　Ｗｉｌｅｙ＆　５ｏｎｓ）ニュ
ーヨーク（１９７９年）、米国特許第４２８４３５５号
［ハンセンら（Ｈａｎｓｅｎ、　ｅｌ　ａｌ、）、１９
８１年８月１８日発行コ、米国特許第４２８４４１２号
［ハンセンら、１９８１年８月１８日発行〕、米国特許
第４２８４９２４号［オーエルら（Ａｕｅｒ　ｅｔ　ａ
ｌ、　）　、１９８１年８月４日発行］および米国特許
第３２７５８３４号［ステイーブンスら（Ｓｔｅｖｅｎ
ｓ　ｅｔ　ａｔ、　）、１９６６年９月２７発行］に見
られる。

比較的大きな試料容積中の蛍光フラクチュエーノヨン（
ゆらぎまたは変動）の相関によるそれらの相対的な寸法
に基づき粒子を区別するためのレーザービームおよびス
リットの使用はブリラグら［ホモノエナス・フルオレセ
ント・イム）アッセイ」、サイエンス（Ｂｒｉｇｇｓ、
　ｅｔ　ａｔ、　、　”Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ　Ｆｌｕ
ｏｒｅｓｅｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、”　、　５
ｃｉｅｎｃｅ）、２１２ａ、１２６６〜１２６７頁（１
９８１年）およびニコリら「フルオレセンス・イムノア
ッセイ・バースト・オン・ロング・タイム・コリレーシ
ョン・オン・ナンバー・フルクチユニージョン」、プロ
ーノーディング・オン・ナンヨナル・アカデミイ・オン
・サイエンス・ニー・ニス・エイ（Ｎ１ｃｏｌｔ　　ｅ
ｔ　ａｌ、、”　　Ｐ　１ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　　Ｉ
　ｍｍｕｎｏａｓｓａｙＢａｓｅｄ　ｏｎ　　Ｌｏｎｇ
　　Ｔｉｍｅ　　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ　　ｏｒ　
　ＮＵｍｂｅｒ　　Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ、”Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

ｔＪ、Ｓ、Ａ）　、７７巻（８）、４９０４〜４９０８
頁（１９８０年）］に記載されている。

米国特許第４４２１８６０号［ニリンゲスら（Ｅｌｉｎ
ｇｓ　ｅｔ　ａｔ、　）］は光学的に検知されたシグナ
ルの自己相関処理を包含するホモジニアスフルオロイム
ノアッセイを記載している。米国特許第４４０７９６４
号［ニリンゲスら（Ｅｌｔｎｇｓ、　ｅｔ　ａｌ、　）
コは前方および後方の光線を検知することからなるホモ
ジニアスフルオロイムノアッセイを開示している。

免疫試薬およびラジオイムノアッセイは米国特許第３８
５３９８７号［ドレイヤ−（Ｄｒｅｙｅｒ）　］に開示
されている。

［発明の概要］ 最も広範な態様において、この発明の方法は液体媒体か
ら発せられる約３５０−１２００ｎｍの波長の電磁シグ
ナルの強度フラクチュエーノヨンを測定するのに有用で
ある。この発明の方法において、このシグナルの強度は
フラクチュエーノヨンの平均期間と比較して短い期間で
ある非ゼロ区間の間自己相関に付されろ。

この発明の方法の具体的な適用においては、液体媒体中
の蛍光強度値のフラクチュエーソヨンが測定されるが、
このフラクチュエーノヨンは液体媒体中における蛍光粒
子の存在の結果化ずる。複数の収集区間において得られ
た蛍光強度値が自己相関に付されろ。時間的に隣接した
区間は、比較的少数の蛍光粒子を含み部分的に重なる容
積の蛍光強度値を提示する。この発明の改良点は、この
容積中の蛍光粒子の平均滞留時間と比較して短い長さの
収集区間を使用することによるのであって、その自己相
関区間は収集区間と等しいが、小倍数かあるいは分数で
ある。

本発明に係る改良方法は、特にアナライト（分析物）を
含有する疑いのある試料中のアナライトの定量に用いら
れる。試料を分析試薬と混合して、粒子の蛍光強度がア
ナライトの存在と関係する蛍光粒子含有分析混合物を得
る。複数の部分的に重復する試量容積を約２５０〜１２
００ｎｍの波長で照射する。照射された試料容積は比較
的少数の蛍光粒子を含有する。複数の等しい蛍光収集区
間における蛍光強度値が測定されるが、この蛍光収集区
間の長さは照射された試料容積内の蛍光粒子の平均滞留
時間よりも短い。収集区間における蛍光強度値は、収集
区間と等しいが、小倍数が、あるいは分数である自己相
関時間区間の間自己相関に付される。ついで、自己相関
された蛍光強度値を既知量のアナライトを含有する分計
媒体から得ｆ二同様な自己相関蛍光強度値と関係づける
。

［実施態様〕 この発明の方法は液体媒体から発せられる約３５０〜１
２００ｎｍ波長の電磁シグナルの強度フラクチュエーシ
ョンを測定する方法の改良法を提供する。改良点は平均
フラクチュエーション期間と比較して短かい期間である
非ゼロ区間の間シグナル強度を自己相関に付することで
ある。

この発明はシグナル対ノイズ比が低い場合の、例えば蛍
光粒子による強度フラクチュエーションの検知に用いら
れる。シグナル量は、しばしば一定時間区間のカウント
数、例えば光度の測定値（光子計数）のような時間区間
当りのフォト・カウント（ｐｈｏｔｏ　−ｃｏｕｎｔ）
数によって表示されることが多い。アナログ検知が深川
される場合でも、シグナルは、一般にｎすなわち一定時
間当りのカウント数に等しい値に比例する。連続的にｎ
をモニターずろことにより、とび離れて大きなシグナル
を発する粒子が試料中に存在することの指識として大き
すぎるフラクチュエーションが観察されることがある。

これは小さな試料容積を１個またはｒｌｌ、個の粒子（
または細胞）からの蛍光の検知に用いる場合の技術、例
えば流動細胞計算法、ファイバーオンティクブローへ細
胞計算法において有用である。

フラクチュエーノヨンの大きさの標準的な値は測定した
シグナルの二乗の平均、＜ｎ１ｐ（下付きの１は計数の
集合を行線し、その各々は平均する（く〉で示す）的に
二乗する）を算出することによって得ら４ｔろ。ｎの代
表的な値がｎｌ−ｎ＋δｎ、（ｎは平均値、δｎ１はフ
ラクチュエーノヨンを意味する）である場合、 ＜　　ｎ　１”＞＝＜（ｎ＋　δ　ｎｌ）２　＞＝（ｎ
’＋２ｎδｎｉ＋δｎ　ｉｌ　　＞＝　（、ｎ　　”＞
十＜δｎ（″　〉 ＝ｎ”　　十＜δｎ１′　〉 となり、ここで〈π〉−におよびく口δｉ（＞＝ｎ＜δ
ｎｉ＞＝Ｏである。

つぎに、フラクチュエーションの絶対量は標桑偏差。

σ　＝　［＜　　ｎＩ”＞７　　ｎ　　’　　］　ｉｌ
／２＝［＜δｎｌ　２　　〉１１　　／　２によって特
徴付けられ、相対量は変動変数（ｃＶ＝σ／ｒ）によっ
て与えられる。

粒子が通過するにつれて少量の試料容積から得られる読
みの集金のＣｖは、個々の粒子がシグナルを発したか否
かの指標である。粒子かはとんとあるいは全（シグナル
を発しない場合、この方法の感度はＣＶの大きさにより
変わる。

ＣＶに対する主要な背景的関与因子はポアソン敗フラク
チュエーションである。たとえ具のノグナルが不変てめ
ってらそのシグナルの計数による連続的な読みは Ｐ　ｏ＋５ｓｏｎ　　−〔”　ｌ／２ に従い変動する。これは背景フラクチュエーションの相
対的な大きさが （。Ｖ）　　　　、　　＝、−１−１／２Ｐ　０ＩＳ８
０ｎ であることを仮線する。

シグナルが低い（ｎが小さい）場合、ＣＶは本質的に大
きく、したがって弱い標識の粒子（弱いシグナルを発す
る粒子）の存在に対しては敏感な指標ではない。

この発明の主題は、ボアソンフラクチュエーンヨノか影
響しないように、ノグナルフラクチュエーノヨノの！ｔ
ｌス・１的な大きさを計算する方法を改良することであ
る。収集区間は、個々の事象（例えばフォト・カウント
）を計数するに際し、２つの隣接した収集区間の間で少
量の試料容積中の粒子分布が比較的一定であるように選
択される。すなわち、収集区間は試料容積中における粒
子存続期間と比較して短いように選択される。ついで、
ＣＶの計算のために個々の読みの二乗を用いる代わりに
、隣接した収集区間から読みの積を用いる。

この発明の方法において、フラクチュエーノヨンの相対
的な大きさの計算には粒子存続期間と比較して短い時間
区間により分離された読みの自己相関関数を用いる。こ
のようにして、この限定された区間の間に相関フラクチ
ュエーンヨノだけが寄与する。ボアソンフラクチュエー
ションは独立した収集区間の間では全面的に相関性がな
いので、これらポアソン背景フラクチュエーノヨンは寄
与しない。しかし、試料区間中の粒子の位置は２周の隣
接収集区間の間比較的不変なので、粒子からのシグナル
は寄与することができる。

この発明のよると、フラクチュエーソタンは下式 ［ここで、（ｃＶ）ｐは粒子の変動係数、ｎはフォト・
カウント（蛍光強度に比例する）、く〉は連続収集区間
の総体にわたり平均すること、Ｃ（ｔ）は自己相関区間
ｔにより分けられた収集区間の間のフォト・カウントの
自己相関を示すコ。で評価される。

自己相関関数をシグナルフラクチュエーションの分析に
用いて比較的大きな粒子を検知する先行技術の方法では
、正確な同一サンプリング容積を周期的に検出している
。相関時間が各サンプル期間（ｊ−１０秒）と等しいシ
グナルの自己相関関数か算出された。比較的大きな粒子
はその配置が長い相関時間にわたり変化しないようなゆ
っくりとした速度で拡散する。そのシグナルは自己相関
関数に寄与オろ。しかしなから、小さな粒子、例えば遊
離分子はこの期間にランダムになるので、寄り化ない。

ごの実験では長い相関区間を用いて遊離のシグナルと結
合したシグナルとを区別する。

統計学的に有意な相関関数を得るためには、合計測定時
間は相関時間と比較して長くしなければならない（代表
的には、１０００期間または１０’〜１０４秒）。

フラクチュエーションの相対的な寸法の従来からの測定
法のうちの１つの先行技術では、０時差異を用いた読み
の自己相関関数を用いる。この方法では、全てのタイプ
のフラクチュエーノヨンか寄与する。

この発明の記載をさらに進める前に、この明細書に用い
ろいくつかの言葉を定義する。

「電磁シグナルのフラクチュエーノヨン」なる語は電磁
シグナルの面後シフトを意味する。電磁シグナルは蛍光
、散乱光、透過光等によって生しろしのであり得る。蛍
光のフラクチュエーノヨンは通常連続媒体中で生じ、粒
子と連続媒体の種々の組合イつせて増加さ仕ることがで
きろ。例えば、液体中では、その組合わせは比較的蛍光
か少ない液体中の蛍光粒子、蛍光または非蛍光液体中の
非ホモジニアス蛍光粒子、または液体よりも蛍光が相対
的に少ない蛍光液体中の粒子が包含される。さらに、液
体中の蛍光フラクチュエーションは粒子の凝集、蛍光性
となる非蛍光粒子、非蛍光性となる蛍光粒子または液体
の蛍光の変化の結果生じるものであり得る。粒子は天然
または合成の両方のポリマーであってよく、該粒子には
天然粒子、例えばピリオン、細胞、例えば赤血球、バク
テリア等が包含される。粒径は０．０５〜ＩＯθミクロ
ンとすることができるが、合成粒子は一般に約０゜１−
１０ミクロンの直径を有する。この明細書に用いる「電
磁シグナルのフラクチュエーション」なる語には液体媒
体中の蛍光強度値のフラクチュエーションが包含される
。電磁シグナルの他のフラクチュエーションは液体媒体
中の粒子、例えば細胞から発せられる弾力的な散乱光の
変化または粒子の通過による発生源と検知機の間の透過
光の変化の結果生じる。

蛍光シグナルは通常の、蛍光性化合物の使用によって得
ることができる。蛍光を発する粒子は、蛍光性化合物を
粒子表面に結合させるが、または天然状態で存在し、そ
の表面に蛍光成分を有する粒子を用いることによって得
ることができる。代表的な蛍光物質にはキサンチン染料
、例えばフルオレスセイン、ローザミンおよびローダミ
ン、ナフチルアミン、クマリン誘導体、例えば３−フェ
ニル−７−ヒドロキシクマリン、４−メチル−７−シメ
チルアミノクマリンおよび４−メチル−７＝メトキシク
マリン、スチルベン誘導体、例えば４−ジメチルアミノ
−４°−シアノスチルベンおよびピレンが包含される。

蛍光物質の記載についてはブランドら［アニュアル・レ
ビュー・才ブ・バイオケミストリイ（Ｂｒａｎｄ　ｅｔ
　ａｔ、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、）、４１巻、８４３〜８６８頁］お
よびストライヤ−［サイエンス（Ｓ　ｔｒｙｅｒ、　Ｓ
　ｃｉｅｎｃｅ）、１６２：５２６（１９６８年）］参
照。

電磁シグナルの強度フラクチュエーションの「自己相関
」はシグナルのフラクチュエーションをモ゛ニターする
都合よい方法であって、一般的（ｆａｍｉｌｉａｒ）強
度自己相関関数 Ｃ（ｔ）　＝＜　ｎ（ｔ’　）　ｎ（ｔ’　　Ｌ’）　
〉ｔ・（式中、ｎＱ’　）は時間ｔ°における収集間隔
当たりのフォト・カウント数、ｎは強度に対する比例項
、記号く〉・は多数の試料収集時間ｔ°の間の強度積【 の平均を意味する） で評価することである。

自己相関はニ一定の収集区間の間に生じるフォトパルス
数に比例した電磁シグナルを得、相関区間【により時間
的に分離された２つの異なる収集区間で得た２つのシグ
ナルの積の多数を平均することによって決定される。

７収集区間」はフォトパルスを計数する間の時間の長さ
を意味し、「ゲート・タイム」とも称する。

収集区間の長さは電磁ノブナルの強度フラクチュエーシ
ョンの平均期間よりも短かく、例えば一定容ｈ′１内の
蛍光粒子の平均残留時間よりも短い。収集区間は一般的
には約０．１−１０ミリ秒、より一般的には約１〜１０
ミリ秒である。

「有効容積」は電磁シグナルの検知に用いる液体溶媒の
容積である。一般には（１効容積は比較的少数の当該粒
子を含有する。その最も単純な形では、有効試料容積中
で１個よりも多い当該粒子を見いだす可能性は低い。

「アナライト」は測定される化合物、粒子、または組成
物を意味し、これは細胞、細胞内器官、微生物等であっ
てよさ、特異的結合対（ｓｂｐ）の−員、を含有するが
、または該−員であってよく、１価または多価、即ち１
つ以上の決定部位を有するリガンド、抗原、単一化合物
または、少なくとも１つの共通の決定部位を共有する複
数の化合物またはレセプターであることができる。

ｒｓ’ｂｐ構成員」は２つの異なる分子からなる特異的
結合対の一員を意味し、分子の一方は他方の分子の特定
の空間および極性構造に特異的に結合する表面上または
空洞内の区域を有する。ｓｂｐ構成員はリガンドおよび
レセプター（アンチリガンド）と称し、特異的結合対の
構成員はホモロガス（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）称する。

「リガンド」はレセプターが天然に存在するかまたは合
成できる任０の有機化合物である。

「レセプター（アンチリガンド）」は分子の特定の空間
的および極性構造、即ちエピトープまたは決定部位を認
識することができる（該組織に対し高い結合親和性を有
する）任意の巨大分子化合物である。レセプターの代表
例には天然のレセプター、例えばチロキシン−結合グロ
ブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レクチン等
が包含される。「抗体」なろ語はこの場合レセプターの
例示として、またより一般的に示すために用いる。

「細胞」は組織を作り上げる微小の原形質塊の任意の１
つを意味し、有核および無核細胞、細胞器官、胞子およ
び卵母細胞を包含し、膜によって囲まメ−ろ原形質塊か
らなるものである。

この発明は特に、アナライトを含む悲劇試料中のアナラ
イトを測定するのに用いられる。試料を分析試薬と混合
して粒子または溶液の蛍光強度がアナライトの存在と関
係する分析粒子含有混合物を得る。粒子は分析試料の一
部として試料に直接加えろことができ、また試料が細胞
を含む場合のように試料の一部であってよい。他方、粒
子は、分析試薬を試料と混合した結果、例えば凝集等に
より形成することもできる。広範な定義によれば、分析
試薬には試料と組み合わせて粒子または溶液°の蛍光強
度が試料中のアナライトの存在と関係するような粒子含
有分析混合物を提供する試薬か包含される。

ついで、複数の、部分的に重なる有効容積の該試料を約
２５０〜１２００ｎｍ、好ましくは約３２５〜７００ｎ
ｍの波長の光で照射する。「部分的に重なる」とは液体
媒体のある部分が連続的に採取した有効容積と共通であ
ることを意味する。即ち、部分的に重なる有効容積とは
一定の粒子が１つより多い連続的収集区間の記録したシ
グナルに寄与することを意味する。

重なる有効容積を照射するための１つの手段は米国特許
第３９７２８５号（１９８２年７月１２日発行）記載の
方法および装置を用いることである。この特許の記載全
部をこの明細書の記載として引用する。基本的には、有
効容積は光ファイバーを用いて照射されるが、有効容積
は光ファイバーの構造によって決定される。容積の形は
通常円錐形である。光ファイバーは代表的にはコア域と
彼覆域からなり、その厚さく直径）および相対的な屈折
指数かファイバーの先端部における円錐のハーフ・アン
グル（半角ｈａｌｆａｎｇｌｅ）と円錐の最も小さい直
径を決定する。軸方向の有効長さは励起ビームの強度お
よびファイバー先端部から軸に沿った距離での励起光強
度の降下率によって決定されろ。率は円錐のハーフ・ア
ングルによって決定され、ハーフ・アングルが大きな湿
強度降下率かを大きく、従って有効コア長さが短くなる
。また、強度降下に影響を与えるものは光の散乱および
媒体の吸収特性である。

観察されたシグナルに影響を与える種々のパラメーター
は、背景シグナルに対し識別を可能とする、合理的な限
界値を有効試料容積にもたらすことかできろように選択
される。

有効容積の相異は試料容積内外の粒子の拡散を可能とず
ろ延長時間の長さによるもので、各々がになろ有効容積
からのシグナルを受は取る複数の光ファイバーの結果で
ある。また、試料が１つ以上の光ファイバーにより流れ
るが、または１つ以上の光ファイバーが試料中を移動す
るようなダイナミックシステムを用いることができる。

励起光は試料全体または試料の主要部分を励起光で照射
することで提供することができる。別法として、好まし
くは励起光は光ファイバーで与えることができ、その結
果試料容積は照射された容積に比例する。

特に有用な光フアイバー装置はカシプラー（ｃｏ（１ｐ
ｉｅｒ）またはマラチブレックサ−（ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｘｃｅｒ）として知られている市販の装置である。この
装置は３つの光ファイバーを結合して、励起光が供給さ
れる通称投入口、試料中に浸漬するブローへ口および検
知口の３つの末端口を有する二股の管を形成する。この
発明の使用に都合よい形では、ファイバーは投入口に入
る実質的に全ての光かプローベロに伝導されるように結
合する。蛍光放射のようなプローベロに入る光は管接合
部で別れて第一部分か投入口に、第２部分が検知口に進
む。まｆこ、−色性反射鏡を接合部に用い、検知口に移
動オろ実質的にすべての蛍光を検知ずろことかてきろ。

この種の装置は販売会社、例えばカブトロン・イノコー
ホレイテッド（パロ　アルド、カルホルニア）から人手
できろ。

この発明の実施態様の次の段階では、複数の等［、い蛍
光収集区間に才ｊけろ蛍光強度が測定されろ。

蛍光収集区間の長さは一般に照射された試料容積の蛍光
粒子の滞留時間より短い。好ましくは、蛍光強度値は前
記した光ファイバーを用いて測定されろ。

この発明の次の段階では、前記した収集区間におけろ蛍
光強度値は収集区間と等しいが、該収集区間の、好まし
くは整数の小倍数、または分数、θ子ましくは１−１０
、より好ましくは１〜３＠で力ろ相関時間区間にイつｆ
こり自己相関に付されろ。

一般に、相関区間は１つの収集区間の長さに等しく１が
、まｆ肛よ長いが、あるいは照射された試料容ｒ１′１
内の蛍光粒子の滞留時間より短い。相関区間は趙常明射
：Ｓ　ｉ、″Ｌｆ二試料容積内の蛍光粒子の滞留時間の
、１／３〜１／１００、好ましくは１／３〜１／１０で
ある。

つぎに、相関された蛍光強度値は既知量のアナライトを
含む分析媒体から同条に相関しｆコ蛍光強度値と関係づ
けることができる。自己相関関数および既知試料および
未知試料から得た結果の関係づけは自己相関関数化を行
うに適当なプログラムを含むコンピューターを用いて行
うことができ・ろ。

すなわち、コンピューターは前記測定に基づき試料中の
アナライトの濃度を自動的に計算することができる。

蛍光分析において前記方法を用いることにより、多数の
プロトコールおよび試薬を用いることができる。１群の
プロトコールには蛍光粒子を測定することが包含されろ
。この群は次のような分析法に分けることができる。（
１）アナライトは媒体中において他の蛍光粒子と比較し
て特異な吸収および／または放射を有する蛍光粒子から
なり、従ってその蛍光フラクチュエーシタンにより直接
検出することができろ。（２）粒子上のｓｂｐ構成員お
よび相補的ｓｂｐ構成員か結合して粒子の凝集が生じ、
χ↑むするフラクチュエーノヨンの変化か得られろ場合
、アナライトまたは該アナライトの相補的ｓｂｐ構成員
のい１゛れかか蛍光粒子に結合する。（３）粒子上のｓ
ｂｐ構成員に対し相補的なｓｂｐ構成構成型光性である
が、または例えば第３の蛍光物質ラベルｓｂｐ構成員の
ような蛍光試薬との結合または反応により蛍光性になる
場合、アナライトまたは該アナライトの相補的ｓｂｐ構
成員のいずれかが非蛍光粒子に結合する。（４）粒子上
のｓｂｐ構成員に対１−７川！！！！的ｒ；ｓｂｐ構成
員か粒子の凝集を起こし、生成しｆ二粒子凝集物がそれ
と等容積の溶解蛍光染料含ｆ丁溶液と置換することによ
り蛍光フラクチュエー注１ノの変化が生じろ場合、アナ
ライトまたは１ｊＫアナライトのｓｂｐ構成員が非蛍光
粒子に結合す前記技術は中、にアナライト測定に用いら
れろ多数の分版、去の中の少数の例を説明したにすぎな
い。

二１ｔらの分析法はいくつかの文献および特許にみろ、
１１ろ（米ｎ、ｌ特許第３８２６６１３．３８５３９８
７．３９２５５４１．４０６］４６６．５０６２９３５
．４１４１９６５．４１６４５５８．４２５６８３４．
４２７５１４９および４３１８７０７号参照）。上記種
々の方法の記載を引用してこの発明の記載とするが、こ
れらに限定されるものではなくこの発明の種々の方法を
説明する例として用いる。

この発明はアナライトがリガンドとその同族レセプター
からなる特異的結合対（ｓｂｐ構成員）である、アナラ
イトを含有する疑のある試料中のアナライト測定用の装
置を包含する。

この装置は　（ａ）複数個の部分的に重複する上記試料
容積を約２５０ｎｍ〜１２００ｎｍの波長光で光ファイ
バーを用いて順次照射する手段（ここで、上記試料は分
析試薬と合イっせて蛍光粒子を含む分析混合物とした乙
のであり、上記粒子は上記媒質中のアナライト量に比例
したｓｂｐ構成員間の結合によるものである）、 （ｂ）　’Ｅｌ数個の等しい蛍光収集区間について蛍光
強度値を測定する手段（ここで、上記蛍光収集区間の長
さは、照射試料容積中の蛍光粒子の平均時間より短かい
）、 （ｃ）　、ｈ記収集区間における蛍光強度値を、連続的
に自己相関に付す手段（ここで、上記手段はソフトウェ
アまたは専用のハードウェアであってよい）、 （ｄ）自己相関蛍光強度値を、既知量のアナライトを含
む分析媒質から得た同様な自己相関蛍光強度値と関係づ
ける手段 からなろ。

〔実施例〕

次に実施例を挙げてこの発明を更に明らかにするが、こ
れらに限定するわけではない。

実施例 ひと赤血球細胞（ＲＢＣ３）のＡ群抗原についてホモジ
ニアス蛍光アッセイを行った。このアッセイにおいて、
５０μＱの全血を５０ｔ１ｆ）の蛍光標識（フルオレス
セインイソチオシアナートーＦＩＴＣ）抗Ａ群抗体（モ
ノクローナル　ＩｇＭ、ケムバイオムド、エドモントン
、アルベルタ）を用いて１０分間インキュベートした。

次いで試料を緩衝液７．５１（！（０，１Ｍ重炭酸ナト
リウム、ＥＤＴＡ２０ｍＭ、ウシ血清アルブミン（Ｂ　
Ｓ　Ａ）、ｐＨｓ。

５）で希釈し、光ファイバープローベ血球計算機で読み
取る。

カリフォルニア、パロ・アルド在カプトロン肚から入手
できる「Ｙ」型ファイバーオプティックスマ、ルチプレ
クサーのブローベファイバーをＨ２液に浸した。ファイ
バーは直径５０ミクロンを有し、■２°の半角の円錐型
励起およびｌＸｌ０−’々Ｑの有効試料容積をもたらし
た。Ｈｅ−Ｃｄレーザーから発する励起型光を２方に枝
分かれしたファイバーの一方に注ぎ、マルチプレクサ−
によりブローへファイバーに伝達した。円錐形の励起光
は、機械的に試料を走査したプローベから発した。浸漬
したファイバープローベに再入した試料容積から発した
蛍光の一部をマルチプレクサーにより第２の分枝状ファ
イバーに伝達させ、これをフィルターにかけた後、高率
フォトマルヂプレクサーにつないだ。このフィルターは
蛍光発生波長光にたいして励起波長光を減するものであ
る。

ファイバープローベを約１ｃｍ７秒の速さで細胞懸濁液
に移した。こうすると、与えられた細胞を、試料容積に
おけろファイバーの先端の下に約５ｓｍおぐことになっ
た。ファイバープローベからの蛍光をｌｍ５ｌＨ（収集
区間）に１ｍｓ当たりのフォトカウント敗ｎを用いて記
録した。このアッセイの場合数の平均は一般的に４５で
あった。’１０００回の連続読みにおいて、読みの平均
に関するフラクチュエーションを２方法により分析した
。このアッセイでは、１０００回の読みの１０ブロツク
のフラクチュエーション度を平均して最終結果を出した
。

フラクチュエーション分析の２方法を記載する前に、蛍
光フラクチュエーション間の関係および試料が陽性か陰
性かを理解すべきである。血液がＡ群（陽性試料）の場
合、蛍光は、抗体−細胞表面抗原反応によりＲＢＣｓに
結合するものと溶液中で遊離しているものに分配される
。ファイバープローベの正面を通過する蛍光細胞は、フ
ラクチュエーティングングナルを発生する。しかしなが
ら、血液が８群またはＯｎ（陰性試料）である場合、蛍
光は溶液中に遊離したままで、ファイバープローベはよ
り均質のシグナルを感知する。したかってこのアッセイ
において、大量の蛍光フラクヂュエーンヨンが陽性試料
に対応する。

公知方法によりフラクチュエーションを測定した。１収
集区間（ｌ　ｍｓ）あたりのフォトカウントの変動変数
（ｃＶ）を次式を用いて計算した。

式中、ローは、第１番目の収集区間におけめフォトカウ
ント（蛍光強度値に比例）であり、く〉は全体の連続収
集区間にわたる平均をとるものとする。

下付きのＴは、これがＣ■合計によるもの、であること
を示す、すなわち、フラクチュエーションのあらゆるタ
イプが寄与する。ＣＶ合計を異なる時間に得たフォトカ
ウントに関連する相関関数によって書き直すことができ
る。

［Ｃ（０）−＜・〉・］１／２ （ｃＶ）　　＝ Ｔ　　　　　　くｎ〉 Ｃ（ｔ）＝＜ｎ（ｔ’　）ｎＱ’　”−ｔ）＞　。

ＣＶ合計は０時間差、１＝０における相関関数を含む乙
のとする。

次式を用い、この発明によりフラクチュエーションを計
算した （ｃＶ）＝ ｐ　　　　　　　＜ｎ＞ す、ｎはフォトカウント（蛍光強度に比例）であり、く
〉は全体の連続収集区間にわたる平均をとるものとする
。また、Ｃ（ｔ）は、自己相関区間ｔにより分離された
収集区間におけるフォト・カウントの自己相関である。

この場合、ｔはΔｔ、すなわちｌ収集区間（この例の場
合１　ｍｓ）に等しい。少なくともｌ収集区間にわたっ
て自己相関されたフラクチュエーションだけが、フラク
チュエーション度の測定値に寄与する。

結果を第１表に示す。５種の全血試料をそれぞれ５回分
析した。５種の試料は、強陽性（Ａ１）、弱陽性（Ａ、
Ｂ）、極東陽性（弱Ａ、Ｂ）および陰性２種（Ｂおよび
０）であった。各場合とも、５回反復値の平均値および
標準偏差をフラクチュエーション分布の２法について計
算した； 第１表 −本発明方法　　公知方法 （ｃｖ）ｐ（ｃＶ）Ｔ 平均値　標準偏差　平均値　標準偏差 陽性 Ａ、　　　１６，８　　１．７　　　２３．２　　１．
２Ａ、Ｂ　　１２．３　　０．５　　　１９．８　　０
．３弱Ａ、Ｂ　　　８．１　０．５　　　１７．２　０
．：（陰性 Ｂ　　　　４．０　　０．３　　　１５．１　　０．５
０　　　４．２　　０．４　　　１Ｂ、１　　１．０こ
の発明の方法は、最も弱い陽性をよく解析しｉ−）ろ３
公知方法を用いると、明らかに最も弱い陽性と陰性との
間のあらゆる差異がなくなる。

通常、陰性と陽性の結果間の限界値は、全陰性結果の分
布を用いて、平均値プラス３×標準偏差によって決めら
れろ。上記例では、この発明の方法では限界値は５２で
あり、公知方法では１８゜４である。この発明の方法で
は、弱Ａ、Ｂの全５回の分析は陽性を記録し、最も低い
１回の陽性結果（７，３）は６×標準偏差だけこの蝙界
値から差があったのに対して、公知方法では弱Ａ、Ｂ試
料の５回の分析の何れも陽性と記録されない。

上記結果から明らかなように、この発明は種々の低濃度
のリガンドを測定する簡単で正確な方法を提１ノ（する
。この方法は蛍光ラベルを用いて種々の分析に適用する
ことができる。さらに、この方法は蛍光体全てが実質的
に同じ蛍光を有するが、ま゛たは広範に変る蛍光を有す
ることができる場合の蛍光体の計数を包含する新規なプ
ロトコールに適用することができる。装置は簡単な構造
であって、容易に自動化でき、観察されたシグナルに基
づき試料中のアナライト量の直接的な読みを提供するこ
とができろ。

この発明は、０時試料収集における自己相関または反復
試料収集の長さと等しい長い相関時間を用いてホモジニ
アスイムノアッセイでの遊離または結合蛍光を識別する
ために自己相関関数を用いる先行技術と比較して優れた
改良点を有する。第１の場合にとして、定期的な試料収
集は、該試料を簡単な方法で殺滅走査できるのでこの発
明では必要ない。また、測定の合計時間らより短い。こ
の発明では、Ｉｍｓの収集区間を用いれば、自己相関関
数に対する１０００の寄与を１秒で集積することができ
るが、一方、定期的な１秒の試料収集を用いれば、自己
相関関数に対する＋０００の寄与は１０００秒かかる。

第２の場合として、この発明の技術は弱くラベルした細
胞のように弱い蛍・光を示す粒子と関連した特定のシグ
ナルよりもしばしば大きいことがある背景ボアソンフラ
クチュエーションの寄与を排除する。

この発明の技術は公知の技術と比較して良好な感度が可
能である。何故ならば、この発明では背景よりも良好な
シグナルの識別が得られるからである。バルク媒体の強
度に対してわずかだけ大きい蛍光強度を有する粒子を測
定することができる。

この発明で得られるのと同じ感度を達成する他の方法は
非常に強力なレザーおよび流動システムを必要とする。

従来からの非流動蛍光検知法は非常に長い時間をかけな
ければかかるレベル感度を提供することはできない。

この発明の目的および内容を明らかにするために実施例
を用いて説明したが、ある種の変形は全て特許請求の範
囲内で行うことができる。

特許出願人　ンンテックス（ニー・ニス・エイ）インコ
ーホレイテッド

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）液体媒質からの電磁シグナルの強度フラクチュエ
   ーション測定法において、上記強度フラクチュエーショ
   ンの平均持続時間に比較して短かい期間である非ゼロ相
   関区間の間、上記シグナルの強度フラクチュエーション
   を自己相関に付すことからなる、改良方法。
2. （２）電磁シグナルが蛍光放射により生ずるものであり
   、強度フラクチュエーションを上記フラクチュエーショ
   ンの平均持続時間の３分の１〜１００分の１の長さを有
   する区間の間自己相関に付す、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。
3. （３）液体媒質中の蛍光強度値のフラクチュエーション
   測定法であって、上記フラクチュエーションは上記液体
   媒質中に蛍光粒子が存在することにより生ずる方法にお
   いて、複数個の収集区間で得られた蛍光強度値を自己相
   関に付すことからなり、その際時間的に隣接した収集区
   間は部分的に重なる上記液体媒質容積の蛍光強度値を示
   し、各容積は比較的少数の蛍光粒子を含み、任意の上記
   収集区間の長さは上記容積中における蛍光粒子の平均滞
   留時間より短かく、自己相関区間の長さは任意の上記収
   集区間の長さと等しいか、または有限であって収集区間
   の長さの小倍数もしくは分数である、改良方法。
4. （４）蛍光強度値が光ファイバープローベを用いて得ら
   れるものである、特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）任意の自己相関区間の長さが媒質容積中の蛍光粒
   子の平均滞留時間の３分の１〜１００分の１である、特
   許請求の範囲第３項記載の方法。
6. （６）アナライトを含む疑のある試料中のアナライト量
   を測定し、上記試料中の蛍光強度のフラクチュエーショ
   ンをレファレンス試料の蛍光強度値のフラクチュエーシ
   ョンと比較する、特許請求の範囲第３項記載の方法。
7. （７）アナライトを含む疑のある試料中のアナライト測
   定法において、 （ａ）上記試料を分析試薬と合わせて蛍光粒子を含む分
   析混合物を作り、上記粒子の蛍光強度は上記アナライト
   の存在と関係し、 （ｂ）複数個の部分的に重複する上記試料容積を約２５
   ０ｎｍ〜１２００ｎｍの波長光で順次照射し、任意の上
   記照射試料容積は比較的少ない蛍光粒子を含み、 （ｃ）複数個の等しい蛍光収集区間について蛍光強度値
   を測定し、任意の上記蛍光収集区間の長さは上記照射試
   料容積中の蛍光粒子の平均滞留時間より短かく、 （ｄ）上記収集区間における蛍光強度値を、任意の上記
   収集区間の長さと等しいか、またはそれの小倍数もしく
   は分数の長さの自己相関区間の間自己相関に付し、 （ｅ）自己相関蛍光強度値を、既知量のアナライトを含
   む分析媒質から得た同様な自己相関蛍光強度値と関係づ
   けること からなる方法。
8. （８）照射試料容積を、分析混合物中に浸漬した光ファ
   イバーからの光に基づいて測定する、特許請求の範囲第
   ７項記載の方法。
9. （９）任意の１つの自己相関区間の長さが照射試料容積
   中の蛍光粒子の平均滞留時間の３分の１〜１００分の１
   である、特許請求の範囲第７項記載の方法。
10. （１０）蛍光粒子が赤血球またはラテックスビーズであ
    る、特許請求の範囲第７項記載の方法。
11. （１１）粒子の蛍光がリガンド・レセプター結合により
    変調され、好ましくは上記結合が免疫化学的なものであ
    る、特許請求の範囲第７項記載の方法。
12. （１２）自己相関蛍光強度値が、好ましくは蛍光粒子と
    非蛍光粒子の結合を含む、粒子凝集度の関数である、特
    許請求の範囲第７項記載の方法。
13. （１３）アナライトを含む疑のある試料中のアナライト
    測定法であって、上記アナライトがリガンドとその対応
    レセプターからなる特異的結合対の一員（ｓｂｐ構成員
    ）である方法において、（ａ）上記試料を分析試薬と合
    わせて蛍光粒子を含む分析混合物を作り、上記粒子は上
    記媒質中のアナライト量に比例したｓｂｐ構成員間の結
    合によるものであり、 （ｂ）複数個の部分的に重複する上記試料容積を約２５
    ０ｎｍ〜１２００ｎｍの波長光で光ファイバーを用いて
    順次照射し、 （ｃ）複数個の等しい蛍光収集区間について蛍光強度値
    を測定し、上記蛍光収集区間の長さは上記フラクチュエ
    ーションの平均持続時間の３分の１〜１０分の１であり
    、 （ｄ）上記収集区間における蛍光強度値を、連続的に自
    己相関に付し、 （ｅ）自己相関蛍光強度値を、既知量のアナライトを含
    む分析媒質から得た同様な自己相関蛍光強度値と関係づ
    けること からなる方法。
14. （１４）アナライトを含む疑のある試料中のアナライト
    測定装置であって、上記アナライトがリガンドとその対
    応レセプターからなる特異的結合対の一員（ｓｂｐ構成
    員）である装置において、（ａ）複数個の部分的に重複
    する上記試料容積を約２５０ｎｍ〜１２００ｎｍの波長
    光で光ファイバーを用いて順次照射する手段（ここで、
    上記試料は分析試薬と合わせて蛍光粒子を含む分析混合
    物としたものであり、上記粒子は上記媒質中のアナライ
    ト量に比例したｓｂｐ構成員間の結合によるものである
    ）、 （ｂ）複数個の等しい蛍光収集区間について蛍光強度値
    を測定する手段（ここで、上記蛍光収集区間の長さは、
    照射試料容積中の蛍光粒子の平均滞留時間より短かい）
    、 （ｃ）上記収集区間における蛍光強度値を、連続的に自
    己相関に付す手段、 （ｄ）自己相関蛍光強度値を、既知量のアナライトを含
    む分析媒質から得た同様な自己相関蛍光強度値と関係づ
    ける手段 からなる装置
15. （１５）（ｃ）の手段が、収集区間における蛍光強度値
    を連続的に自己相関に付すためのソフトウエアまたはハ
    ードウェアである、特許請求の範囲第１４項記載の装置
    。