JPH09502794A - 液体フローサイトメーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 液体中の生物細胞および他の微粒子のような粒子を計測し、そして分類するための液体フローサイトメーターであって、ここで該サイトメーターは、測定ゾーン（７）における照射および検出のための光学系を有することによって、粒子が測定ゾーンを通過するときに粒子によって発生する光散乱および蛍光を同時に検出することを可能にする。光学系は、第１のビーム路（Ｓ₁）内に、測定ゾーン（７）内に焦点を有する反射鏡（９）と、測定ゾーン（７）と反射鏡（９）との間に位置する1/4波板（８）と、測定ゾーン（７）内に焦点を有し、かつその反対側に設けられたレンズ（６）と、レンズの背後に位置し、かつ第２のビーム路（Ｓ₂）に対して反射を行うように設けられたダイクロイックミラー（５）とを有している。第２のビーム路（Ｓ₂）内では、ビームスプリッタ（４）がダイクロイックミラー（５）とそれ自体公知の光源（１）との間に位置しており、そして第３のビーム路（Ｓ₃）を創出する。サイトメーターは、第１のビーム路（Ｓ₁）内にダイクロイックミラー（５）の背後に設けられ、かつ測定ゾーン（７）内の粒子によって発せられた蛍光を検出するために設けられた第１の検出器（１３）と、第３のビーム路（Ｓ₃）内に設けられ、かつ測定ゾーン（７）内の粒子によって光散乱を検出するために設けられた第２の検出器（１６）とを有している。

Description

【発明の詳細な説明】 液体フローサイトメーター 本発明は、液体中の生物細胞または他の微粒子のような粒子を計測し、そして 分類するための液体フローサイトメーターに関する。このサイトメーターは、測 定ゾーン(meteringzone)における照射および検出のための光学系を有しており、 粒子が測定ゾーンを通過する際に、粒子によって発生した光散乱(dispersion)お よび蛍光を、同時に検出することを可能にする。 液体中の微粒子を計測し、そして分類するための光散乱に基づくサイトメータ ーの使用は、従来技術において公知である。この従来技術を図１〜図３に概略的 に示す。図１は、フローセルを有するフロー系を示し、図２はフローセルに割り 付けられた流体力学的絞り(focusing)装置を示し、そして図３はフローセル内の 粒子によって発生する光散乱の検出装置を示す。図１において、試料は、容器か らフローセル内に汲み入れられる濾過水の形態の輸送液とともに、フローセル中 に供給される。輸送液および試料、すなわち計測され、そして分類されるべき粒 子は、フローセル、ポンプ系、および粒子を除去するフィルターを通過し、その 後輸送液、すなわち濾過水は、容器に戻される。フローセル内には、毛細管から 構成される実際のフローセルと流体接続する流体力学的絞り 装置が設けられている。流体力学的絞り装置は、毛細管に向かって先細りし、そ して毛細管内に導く円錐形のノズルの形態を有している。試料は、ノズル中心の 細管を通ってノズル内を通過し、そして輸送水ともに、ノズルの開口部および毛 細管に近づくに従って試料が加速するように運ばれる。好ましくは単色のコヒー レント光の集束ビームをフローセル上に向けることによって、液体中の粒子は、 光を拡散または散乱させる。拡散光はレンズ装置によって光検出器上に集束され 、そして検出された拡散光の強度が散乱度の尺度となる。また、散乱度は、測定 ゾーン中の粒子の数およびそのサイズに関係する。レーザビームからの光が検出 器に入射することを防止するために、フローセルと絞り装置との間に、レーザか らの直接的な照射を遮蔽するが拡散光を実質的に損なわないビームストップが配 置されている。 上記原理に実質的に基づき、そして液体中の生物細胞および他の微粒子の検出 、計測および分類に適したサイトメーターは、本明細書中で参考として援用され るノルウェー特許出願番号第91 424号から公知である。 また、粒子が光源からの光を用いて照射されるときに粒子から発せられる蛍光 を使用することに基づいた、粒子を検出するための公知のサイトメーターおよび 類似の機器が存在する。この種の検出器の一例としては、EP-A1-0539 743号が公 知である。ここでは、検出中に拡散された光照射をブロックするためにバンドパ スフィルターをより効率よく用いること を可能にするパラボラ状の反射器40の形態のコリメータが開示されている。 水、飲料、油、および体液のような液体中の微生物内容物および細胞内容物を 決定するための、安定であり、信頼性を有し、かつ高感度の分析機器の必要性が 、ますます増加している。 液体フローサイトメトリーによって、懸濁液中に存在する生物粒子を、高速か つ高信頼性の方法で計測し、そして分類することが可能である。上記のように、 この方法によれば、粒子試料は輸送液とともに供給され、粒子が実質的に一度に 一粒だけを、強い光ビームの衝撃に曝されるフローセル内を通過させるように通 常工夫される。その結果、粒子は個別に計測され、光散乱および蛍光について測 定され得る。現在、液体フローサイトメトリーは、主に白血球(leukocytes)の分 析のために日常的に使用されており、細菌学の分野では液体フローサイトメトリ ーは研究目的のために用いられるのみである。 白血球のような細胞は、例えば、腸内細菌などの微生物に比べて非常に大きい 。従って、必然的に微生物学の分野において日常的に用いられる液体フローサイ トメーターの安定性および感度に対する要求は、血液学に用いられるサイトメー ターに対するそれよりもずっと大きい。 よって、本発明の第１の目的は、微生物学の分野において一般に用いられ得る に十分な安定性および感度を有するが、 哺乳類の血球を計測し、そして分類するために公知の方法でも当然使用され得る 、液体フローサイトメーターを提供することである。 本発明の第２の目的は、粒子の照射を改善し、かつ粒子によって発せられた拡 散光と蛍光との両方の回収を改善することによって、感度を高めることが可能な 、液体フローサイトメーターを提供することである。 本発明のさらなる目的は、この目的のために複雑な光学系を必要とすることな く、光散乱と蛍光との両方を検出するために同時に使用し得る、液体フローサイ トメーターを提供することである。 本発明のさらに別の目的は、従って、光学系を簡素化し、検出器および光学系 を一体化することによって、光学部品(component)がより少なく、そして物理的 寸法が小さく、その結果機器の安定性を向上させることを助け、そして製造コス トもより低くする、液体フローサイトメーターを提供することである。 上記および他の目的は、本発明によれば、光学系が第１のビーム路内に、測定 ゾーン中に焦点を有する反射鏡と、測定ゾーンと反射鏡との間に位置する1/4波 板と、測定ゾーン内に焦点を有し、かつその反対側に設けられたレンズと、レン ズの背後に位置し、かつレンズ軸に対して実質的に法線方向に部分反射を行うよ うに設けられたダイクロイックミラーとを有し、この反射方向は光学系の第２の ビーム路内にあり、そ して第２のビーム路内に、ダイクロイックミラーとそれ自体公知の光源との間に 位置するビームスプリッタを有しており、ビームスプリッタは第２のビーム路に 対して実質的に法線方向に第３のビーム路を創出し、そしてサイトメーターはさ らに、第１のビーム路内にダイクロイックミラーの背後に設けられ、かつ測定ゾ ーン内の粒子によって発せられた蛍光を検出するために設けられた第１の検出器 と、第３のビーム路内に設けられ、かつ測定ゾーン内の粒子によって生じた光散 乱を検出するために設けられた第２の検出器とを有することを特徴とする、液体 フローサイトメーターによって達成される。 さらなる特徴および効果は、添付の独立した請求項中に記載されている。 本発明の液体フローサイトメーターを、以下により詳細に実施態様について図 面を用いながら説明する。図１〜図３は上記のように従来技術を示し、図４は本 発明の液体フローサイトメーターのための光学系を概略的に示し、そして図５は 図４の液体フローサイトメーターの一部分を形成する部品をより詳細に示してい る。 本発明の液体フローサイトメーターの光学系を図４に示す。レーザ１からの光 は、集束およびコリメートされて、ビームＳとなる。ビームＳは、ビーム路Ｓ₂ 内のビームスプリッタ４を通過し、ダイクロイックフィルターまたはミラー５に よって反射されて、ここでは毛細管の形態の測定ゾーンまたはフローセル７内を 通って、励起アンプに入る。毛細管７および 励起アンプ９は、さらなるビーム路Ｓ₂内に位置している。レーザビームＳは、 励起アンプ９およびダイクロイックミラーとフローセルとの間に設けられたレン ズ６のそれぞれによってフローセル７上に集束されるため、フローセル７を通過 し、そして励起アンプ９から戻る。従って、レーザビームは、フローセルを２回 通過し、この中の任意の粒子は光拡散および場合によって蛍光も発する。蛍光は ダイクロイックミラー中を通過して、引き続きビーム路Ｓ₁内を通って蛍光検出 器に入射する。一方、拡散光は反射してビーム路Ｓ₂およびビームスプリッタ上 に戻され、さらに別のビーム路Ｓ₃へとさらに反射され、光拡散用検出器で終結 する。 本実施態様により、２つの異なる検出原理が同一の光学系内に用いられ得、同 時にこの２つの検出メカニズムに用いられる光を増強するという目的が達成され る。 本発明による液体フローサイトメーターを、より詳しく図５に示す。図５にお いて、３つのビーム路は図２と同様に示される。光源１（好ましくはダイオード レーザ）は、単色かつコヒーレント偏光ビームＳを発し、そしてこのビームＳは 、平凸レンズ２および平凹レンズ３を具備するレンズ装置２、３によって集束お よびコリメートされる。ビームＳは、立方体に設計され得る偏向ビームスプリッ タ４中を通過し、そしてダイクロイックミラーまたはフィルター５に当たる。ダ イクロイックミラーまたはフィルター５は、ビーム路Ｓ₂に対して実質的に法線 方向にビーム路Ｓ₁を創出する。ダイクロイッ クフィルター５によって反射されたレーザビームＳは、通常の顕微鏡対物レンズ (microscope objective)であり得るレンズ６によって測定ゾーンまたはフローセ ル７上に集束され、そしてその後ビーム路Ｓ₁内に位置する1/4波板８を通過する 。この板は、レーザ光をπ/4だけ偏光回転させる。次いで、光は、反射鏡９の形 態であり、レンズ６と同様に測定ゾーン７内に焦点を有する励起アンプに当たり 、好ましくは球面凹面鏡であり得る反射鏡９により再び光が反射されて1/4板８ 内を通過し、1/4板８において再びπ/4の偏光回転を受け、測定ゾーン７内を通 過する。このように、レーザ１からの光は測定ゾーン７を２回通り、そして各回 において測定ゾーン内の粒子によって拡散されるか、または粒子に蛍光を発せさ せる。拡散光および蛍光の両方がレンズ６を通り、そしてダイクロイックミラー ５に当たる。レーザビームの偏光角に対して90°回転した拡散光は、ダイクロイ ックミラー５によって反射され、そしてビーム路Ｓ₂に沿ってブームスプリッタ ４に戻され、偏光面が変更されているためにさらなるビーム路Ｓ₃に反射される 。ビーム路Ｓ₃には、狭くコリメートされたレーザビームがブロックされるビー ムストップ14が設けられており、一方拡散光は、実質的に損なわれずに、例えば 長い焦点距離を有する平凸レンズの形態のレンズ装置15まで通過する。このレン ズ装置15は、光散乱検出用光検出器16上で拡散光を集束する。例えば、PINダイ オードなどのフォトダイオードが、検出器16として好適に使用される。 検出されるべき粒子が蛍光性である場合、粒子は上記のようにさらに蛍光も発 する。粒子が本来的に蛍光性でない場合、粒子は光源の波長に対応する吸収を有 する１つ以上の蛍光色素によって標識（tag）され得、そして両方の場合におい て粒子は、測定ゾーン７を通過し、そしてレーザビームで照射されたとき、蛍光 を発する。蛍光はレンズ６によって直接遮断され、そして反射鏡９によって間接 的に遮断される。蛍光は、励起光、すなわちレーザビームよりも長い波長を有し 、ダイクロイックミラー５で反射されることなく通過し、引き続きビーム路Ｓ₁ を通って、好ましくはフォトダイオードで特にシリコンなだれダイオード(silic on avalanche diode)が用いられる蛍光検出器13に入射する。ダイクロイックミ ラー５を通過し、そしてビーム路Ｓ₁上を通った拡散光の残りを除くために、ビ ーム路Ｓ₁内において、ダイクロイックミラー５と蛍光を検出器13上に集束させ るレンズ装置12との間に光学フィルター10、11が設けられている。光学フィルタ ー10、11は、レーザ光より長い波長を有する蛍光を透過させるような透過帯域（ passband）を有している。集束用レンズ装置12は、好ましくは長い焦点距離を有 する色消しレンズであり得る。 検出されるべき粒子からの拡散光および蛍光の両方は、レンズ６によって直接 遮断され、そして反射鏡９によって間接的に遮断される結果、測定ゾーン７を２ 回通るため、実効光回収率(effective light collection)ならびに光散乱と蛍光 との両方の強度が増大する。レンズ６は２つの異なる偏光面 における拡散光および蛍光の両方を遮断し、1/4波板８を通過し、そして反射鏡 ９によって反射された光は、レーザビームの元の偏光面に対してπ/2だけ回転し ていることに注意すべきである。このことによって、別の(optional)偏光面で検 出を行うことが可能になる。上記のように、なだれダイオードの形態のフォトダ イオードは検出器13に用いられ得る。これは蛍光が弱い場合でも有利であり、光 を増強するために光電子増倍管を用いる必要がない。本発明による液体フローサ イトメーターの設計において、測定ゾーン内の二重拡散のために、高強度の拡散 信号が得られることも注意すべきである。バックグランドノイズは大部分が除去 され、その結果、微生物学上の使用に適し、必要とされる安定性、信頼性、およ び感度を有する液体フローサイトメーターが提供される。 本発明の設計によれば、液体フローサイトメーターは寸法が小さく、使用が単 純である。分析時間は10秒未満であり、通常用いられる試料容量は約0.5mlであ る。 本発明による液体フローサイトメーターは、0.2μから30μの直径を有し、濃 度が10³pr.ml.と10⁷pr.ml.との間の生物微粒子を分析し、そして計測するのに適 している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ 【要約の続き】 発せられた蛍光を検出するために設けられた第１の検出 器（１３）と、第３のビーム路（Ｓ₃）内に設けられ、 かつ測定ゾーン（７）内の粒子によって光散乱を検出す るために設けられた第２の検出器（１６）とを有してい る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．液体中の生物細胞または他の微粒子のような粒子を計測し、そして分類す るための液体フローサイトメーターであって、ここで該サイトメーターは、測定 ゾーン（７）における照射および検出のための光学系を有することによって、該 粒子が該測定ゾーンを通過するときに該粒子によって発生する光散乱および蛍光 を同時に検出することを可能にし、 該光学系が、第１のビーム路（Ｓ₁）内に、該測定ゾーン（７）内に焦点を有 する反射鏡（９）と；該測定ゾーン（７）と該反射鏡（９）との間に位置する1/ 4波板（８）と；該測定ゾーン（７）内に焦点を有し、かつその反対側に設けら れたレンズ（６）と；該レンズの背後に位置し、かつ該レンズ軸に対して実質的 に法線方向に部分反射を行うように設けられたダイクロイックミラー（５）とを 有し、 該反射の方向が該光学系の第２のビーム路（Ｓ₂）内にあり、そして該第２の ビーム路（Ｓ₂）内で、該ダイクロイックミラー（５）とそれ自体公知の光源（ １）との間に位置するビームスプリッタ（４）を有しており、 該ビームスプリッタ（４）が該第２のビーム路（Ｓ₂）に対して実質的に法線 方向に第３のビーム路（Ｓ₃）を創出し、そして該サイトメーターがさらに、該 第１のビーム路（Ｓ₁）内で、該ダイクロイックミラー（５）の背後に設けられ 、かつ該測定ゾーン（７）内の該粒子によって発せられた蛍光を検出する ために設けられた第１の検出器（１３）と；該第３のビーム路（Ｓ₃）内に設け られ、かつ該測定ゾーン（７）内の該粒子によって生じた光散乱を検出するため に設けられた第２の検出器（１６）とを有していることを特徴とする、液体フロ ーサイトメーター。 ２．前記反射鏡（９）が球面凹面鏡であることを特徴とする、請求項１に記載 のサイトメーター。 ３．前記ビームスプリッタ（４）が偏光ビームスプリッタであることを特徴と する、請求項１に記載のサイトメーター。 ４．前記第２のビーム路（Ｓ₂）内で、前記偏光ビームスプリッタ（４）と前 記光源（１）との間に、該光源（１）からの光を該ビームスプリッタ（４）上に 集束するための適切なレンズ装置（２、３）が設けられていることを特徴とする 、請求項３に記載のサイトメーター。 ５．前記光源（１）が、前記第２のビーム路（Ｓ₂）内に設けられたダイオー ドレーザであることを特徴とする、請求項４に記載のサイトメーター。 ６．前記ダイクロイックミラー（５）を通る蛍光を前記第１の検出器（１３） 上に集束するために、該第１の検出器 （１３）と該ダイクロイックフィルター（５）との間に、光学フィルター（１０ 、１１）が適切なレンズ装置（１２）とともに設けられていることを特徴とする 、請求項５に記載のサイトメーター。 ７．前記第１の検出器（１３）が、好ましくはなだれダイオードの形態である フォトダイオードを含むことを特徴とする、請求項６に記載のサイトメーター。 ８．前記ビームスプリッタ（４）によって反射された拡散光を前記第２の検出 器（１６）上に集束するために、該第２の検出器（１６）と該ビームスプリッタ （４）との間に、ビームストップ（１４）および適切なレンズ装置（１５）が設 けられていることを特徴とする、請求項１に記載のサイトメーター。 ９．前記第２の検出器（１６）が好ましくはPINダイオードの形態のフォトダ イオードを含むことを特徴とする、請求項７に記載のサイトメーター。