DE69412646T2 - Durchflusszytometer für flüssigkeiten - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft ein Durchflußzytometer für Flüssigkeiten zum Zählen und Klassifizieren von Partikeln, wie etwa biologischen Zellen oder anderen mikroskopischen Partikeln in Flüssigkeiten, wobei das Zytometer ein optisches System zur Bestrahlung und Detektion in einer Meßzone umfaßt, wodurch optische Dispersion und Fluoreszenz, verursacht durch die Partikel, gleichzeitig detektiert werden können, wenn die Partikel die Meßzone durchsetzen.
• Die Verwendung von Zytometern auf Grundlage der optischen Dispersion gehört zum Stand der Technik für das Zählen und Klassifizieren von mikroskopischen Partikeln in einer Flüssigkeit. Dieser Stand der Technik ist schematisch in Fig. 1 bis 3 gezeigt, wobei Fig. 1 das Durchflußsystem mit einer Durchflußzelle zeigt, wobei Fig. 2 eine der Durchflußzelle zugeordnete hydrodynamische Fokussiervorrichtung zeigt, wobei Fig. 3 die Detektorvorrichtung für die optische Dispersion, verursacht durch Partikel in der Durchflußzelle, zeigt. In Fig. 1 wird die Probe in eine Durchflußzelle zusammen mit einer Transportflüssigkeit in Form gefilterten Wassers zugeführt, welches in die Durchflußzelle ausgehend von einem Behälter gepumpt wird. Die Transportflüssigkeit und die Probe, d. h., diejenigen Partikel, welche gezählt und klassifiziert werden wollen, durchsetzen die Durchflußzelle, ein Pumpsystem und einen Filter, welcher Partikel entfernt, woraufhin die Transportflüssigkeit, d. h. das gefilterte Wasser, zurück zum Behälter geschickt wird. In der Durchflußzelle ist eine hydrodynamische Fokussiereinrichtung in Strömungsverbindung mit der aktuellen Durchflußzelle vorgesehen, die aus einer Kapillarröhre besteht. Die hydrodynamische Fokussiervorrichtung hat die Form einer kegelförmigen Düse, die sich in Richtung auf die Kapillarröhre verjüngt und in diese führt. Die Probe wird in die Düse durch eine dünne Röhre im Zentrum der Düse hindurchgelassen und zusammen mit dem Transportwasser derart mitgenommen, daß die Probe in Richtung auf den Mund der Düse und die Kapillarröhre beschleunigt wird. Durch Richten des fokussierten Strahls aus bevorzugt monochromem kohärentem Licht auf die Durchflußzelle verursachen die Partikel in der Flüssigkeit eine Streuung oder Dispersion des Lichts. Das gestreute Licht wird durch eine Linsenvorrichtung auf einen Photodetektor fokussiert und die Intensität des detektierten gestreuten Lichts bildet ein Maß für den Dispersionsgrad, der seinerseits in Beziehung zu der Anzahl von Partikeln in der Meßzone und ihrer Größe steht. Um zu verhindern, daß das Licht von dem Laserstrahl in den Detektor eintritt, ist zwischen der Durchflußzelle und der Fokussiervorrichtung ein Strahlenstoppen positioniert, welcher eine Abschirmung gegenüber der direkten Strahlung von dem Laser bildet, jedoch im wesentlichen das gestreute Licht nicht beeinträchtigt.
• Ein Zytometer, das im wesentlichen auf den vorstehend genannten Prinzipien beruht und zur Detektion zum Zählen und zur Klassifizierung von biologischen Zellen sowie weiteren mikroskopischen Partikeln in Flüssigkeiten geeignet ist, ist aus der norwegischen Patentanmeldung Nr. 914247 bekannt.
• Außerdem sind Zytometer und ähnliche Instrumente zur Detektion von Partikeln auf Grundlage der Verwendung von Fluoreszenz bekannt, die durch die Partikel emittiert wird, wenn sie mit Licht von einer Lichtquelle bestrahlt werden. Ein Beispiel eines Detektors dieser Art ist aus der EP-A1-0 539 743 bekannt, in welcher ein Kollimator in Form eines parabolischen Reflektors 40 offenbart ist, welcher eine wirksamere Verwendung von Bandpaßfiltern erlaubt, um gestreute Strahlung während der Detektion zu blockieren.
• Das US-Patent Nr. 4 662 742 offenbart eine Durchfluß-Zytometrievorrichtung, aufweisend einen optischen Pfad mit einem Strahlenteiler zum Durchlassen von Fluoreszenz und zum Reflektieren von Streuung.
• Die EP-A-0 538 551 offenbart ein Durchflußzytometer für die Detektion von Fluoreszenz alleine.
• Die Notwendigkeit für stabile zuverlässige und empfindliche Analyseinstrumente zur Ermittlung des Mikroben- und Zellengehalts in Flüssigkeiten, wie etwa Wasser, Getränken, Ölen und Körperflüssigkeiten nimmt konstant zu.
• Mittels Durchflußzytometrie für Flüssigkeiten können biologische Partikel, die sich in Suspension befinden, rasch und zuverlässig gezählt und klassifiziert werden. Wie vorstehend ausgeführt, wird die Partikelprobe in Übereinstimmung mit diesem Verfahren zusammen mit einer Transportflüssigkeit zugeführt, und Sorgfalt muß walten gelassen werden, um sicherzustellen, daß die Partikel im wesentlichen jeweils eines zu einer Zeit durch die Durchflußzelle hindurchtreten, wo sie dem Stoß durch einen intensiven Lichtstrahl ausgesetzt sind, dessen Ergebnis darin besteht, daß die Partikel einzeln gezählt und in bezug auf Lichtstreuung und Fluoreszenz gemessen werden können. Aktuell wird Durchflußzytometrie für Flüssigkeiten routinemäßig prinzipiell zur Analyse weißer Blutzellen (Leukozyten) eingesetzt, und auf dem Gebiet der Bakteriologie ist die Durchflußzytometrie für Flüssigkeiten lediglich zu Forschungszwecken verwendet worden.
• Zellen, wie etwa Leukozyten, sind im Vergleich zu Mikroben sehr groß, wie beispielsweise Enterobakterien. Folglich muß das Erfordernis für Stabilität und Empfindlichkeit für ein Durchlflußzytometer für Flüssigkeiten, das routinemäßig auf dem Gebiet der Mikrobiologie verwendet wird, viel größer als für ein Zytometer zur Verwendung in der Hämatologie sein.
• Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Durchflußzytometer für Flüssigkeiten zu schaffen, das ausreichend stabil und empfindlich ist, damit es allgemein auf dem Gebiet der Mikrobiologie eingesetzt werden kann, das selbstverständlich auch in bekannter Weise zum Zählen und zur Klassifikation von Blutzellen in Säugetieren verwendet werden kann.
• Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Durchflußzytometer zu schaffen, welches eine verbesserte Bestrahlung der Partikel und ein besseres Sammeln von sowohl Streulicht wie Fluoreszenzlicht, verursacht durch die Partikel, bereitstellt, wodurch die Empfindlichkeit erhöht werden kann.
• Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Durchflußzytometer für Flüssigkeiten bereitzustellen, das gleichzeitig zur Ermittlung von sowohl optische Dispersion, wie Fluoreszenz, verwendet werden kann, und zwar ohne die Notwendigkeit eines komplizierten optischen Systems für diesen Zweck.
• Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, das optische System zu vereinfachen und Detektoren und optisches System zu integrieren, um dadurch ein Durchflußzytometer für Flüssigkeiten mit weniger optischen Bestandteilen und verringerten körperlichen Abmessungen bereitzustellen, wodurch wiederum die Stabilität des Instruments verbessert werden kann und Produktionskosten verringert werden können.
• Gelöst werden die vorstehend genannten sowie weitere Aufgaben in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung durch ein Durchflußzytometer für Flüssigkeiten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das optische System in einem ersten Strahlpfad einen Spiegelreflektor mit einem Brennpunkt in der Meßzone umfaßt, eine Viertelwellenplatte zwischen der Meßzone und dem Spiegelreflektor, eine Linse mit einem Brennpunkt in der Meßzone sowie zwischen der Meßzone und einem dichroitischen Spiegel angeordnet, wobei der dichroitische Spiegel derart vorgesehen ist, das er teilweise Reflexion senkrecht zu der Achse der Linse bereitstellt, wobei die Reflexionsrichtung ein zweiter Strahlpfad des optischen Systems ist, und wobei in dem zweiten Strahlpfad ein Strahlenteiler zwischen dem dichroitischen Spiegel und einer Lichtquelle angeordnet ist, wobei der Strahlenteiler einen dritten Strahlpfad senkrecht zu dem zweiten Strahlpfad erzeugt, daß das Zytometer außerdem einen ersten Detektor umfaßt, der in dem ersten Strahlpfad hinter dem dichroitischen Spiegel vorgesehen und für die Detektion von Fluoreszenz ausgelegt ist, die durch die Partikel in der Meßzone emittiert wird, zusammen mit einem zweiten Detektor, der in dem dritten Strahlpfad vorgesehen und zur Detektion von optischer Dispersion ausgelegt ist, die durch die Partikel in der Meßzone verursacht ist.
• Weitere Merkmale und Vorteile ergeben sich aus den anliegenden unabhängigen Ansprüchen.
• Das Durchflußzytometer für Flüssigkeiten gemäß der vorliegenden Erfindung wird nunmehr in Verbindung mit einer. Ausführungsform sowie in Bezug auf die Zeichnungen näher erläutert, in welcher die Fig. 1 bis 3, die vorstehend erwähnt sind, den Stand der Technik zeigen, während Fig. 4 schematisch ein optisches System für ein Durchflußzytometer für Flüssigkeiten gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, und wobei Fig. 5 noch mehr im einzelnen diejenigen Bestandteile zeigt, welche einen Teil des Durchflußzytometers für Flüssigkeiten in Fig. 4 bilden.
• Das optische System eines Durchflußzytometers für Flüssigkeiten gemäß der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 4 gezeigt. Licht von einem Laser 1 wird zu einem Strahl S fokussiert und kollimiert, der den Strahlteiler 4 in einem Strahlpfad 52 durchsetzt, und es wird durch einen dichroitischen Filter oder Spiegel 5 durch die Meßzone oder Durchflußzelle 7 reflektiert, die vorliegend die Form einer Kapillarröhre aufweist, und in einen Erregungsverstärker hinein. Die Kapillarröhre 7 und der Erregungsverstärker 9 sind in einem zusätzlichen Strahlpfad 52 angeordnet. Der Laserstrahl S durchsetzt die Durchflußzelle 7 und kehrt von dem Erregungsverstärker 9 zurück, weil er auf die Durchlflußzelle 7 durch den Erregungsverstärker 9 fokussiert ist, und eine Linse 6 ist zwischen dem dichroitischen Spiegel und der Durchflußzelle vorgesehen. Der Laserstrahl durchsetzt dadurch die Durchflußzelle zweimal und sämtliche Partikel in dieser verursachen dabei Lichtstreuung und möglicherweise auch Fluoreszenz. Das Fluoreszenzlicht durchsetzt den dichroitischen Spiegel und breitet sich in dem Strahlpfad S1 zu einem Fluoreszenzdetektor aus, während das gestreute Licht zurück zu dem Strahlpfad S2 und auf den Strahlteiler gestreut wird, wo es einer weiteren Reflexion von noch einem weiteren Lichtstrahl S3 ausgesetzt ist, und es endet in einem Detektor für Lichtstreuung.
• Mit dieser Ausführungsform wird die Aufgabe gelöst, daß zwei unterschiedliche Detektionsprinzipien in ein und demselben optischen System eingesetzt werden können, während gleichzeitig eine Intensivierung desjenigen Lichts erzielt wird, welches für die zwei Detektionsmechanismen genutzt wird.
• Das Durchflußzytometer für Flüssigkeiten gemäß der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 5 näher gezeigt, wobei die drei Strahlpfade in derselben Weise bezeichnet sind wie in Fig. 2. Eine Lichtquelle 1, bevorzugt ein Diodenlaser, emittiert einen monochromatischen kohärenten Strahl S polarisierten Lichts, und dieser Strahl S wird durch eine Linsenvorrichtung 2, 3 fokussiert und kollimiert, welche eine plankonvexe Linse 2 und eine plankonkave Linse 3 umfaßt. Der Strahl S durchsetzt einen Polarisationsstrahlteiler 4, der als quaderförmiger Körper ausgebildet ist, und trifft auf einen dichroitischen Spiegel oder einen Filter 5, der einen Strahlpfad S1 im wesentlichen senkrecht zu dem Strahlpfad S2 erzeugt. Der Laserstrahl S, der durch den dichroitischen Filter 5 reflektiert wird, wird auf die Meßzone oder die Durchflußzelle 6 durch eine Linse 6 fokussiert, bei welcher es sich um ein gewöhnliches Mikroskop objektiv handeln kann, und durchsetzt daraufhin eine Viertelwellenlängenplatte 8, die in dem Strahlpfad S1 angeordnet ist, welche Platte eine Polarisationsdrehung des Laserlichts um π/4 verursacht. Das Licht trifft daraufhin auf einen Erregungsver stärker in Form des Spiegelreflektors 9, welcher wie die Linse 6 einen Brennpunkt in der Meßzone 7 aufweist, wobei der Spiegelreflektor 9, bei dem es sich bevorzugt um einen sphärischen konkaven Spiegel handeln kann, erneut das Licht durch die Viertelwellenlängenplatte 8 reflektiert, wo es erneut eine Polarisationsdrehung von π/4 erfährt und die Meßzone 7 durchsetzt. Das Licht von dem Laser 1 hat dadurch die Meßzone 7 zweimal durchsetzt und wird jedesmal durch die Partikel in der Meßzone gestreut oder veranlaßt diese dazu, Fluoreszenzlicht zu emittieren. Sowohl das gestreute Licht wie das Fluoreszenzlicht durchsetzen die Linse 6 und treffen auf den dichroitischen Spiegel 5. Das gestreute Licht, das in bezug auf den Polarisationswinkel des Laserstrahls um 90º gedreht ist, wird durch den dichroitischen Spiegel reflektiert und läuft zurück entlang dem Strahlpfad S2 zu dem Strahlteiler 4, wo es aufgrund der geänderten Polarisationsebene zu einem weiteren Strahlpfad S3 reflektiert wird. In dem Strahlpfad S3 ist ein Strahlstopper 14 vorgesehen, welcher den schmalen kollimierten Laserstrahl veranlaßt, blockiert zu werden, während das gestreute Licht im wesentlichen unbeeinträchtigt zu der Linsenvorrichtung 15 hindurchtritt, die beispielsweise die Form einer plankonvexen Linse mit langer Brennweite aufweist und das gestreute Licht auf einen Detektor 16 zur Detektion der optischen Dispersion fokussiert. Eine Photodiode, beispielsweise eine PIN-Diode, wird bevorzugt als Detektor 16 genutzt.
• Wenn diejenigen Partikel, welche detektiert werden sollen, fluoreszieren, werden sie, wie vorstehend erwähnt, Fluoreszenzlicht emittieren. Wenn Partikel nicht von sich aus fluoreszieren, können sie mit einem oder mehreren Fluorochromen verbunden werden, die eine Absorption entsprechend der Wellenlänge der Lichtquelle aufweisen, und in beiden Fällen fluores zieren die Partikel, wenn sie die Meßzone 7 durchsetzen und durch den Laserstrahl bestrahlt werden. Das Fluoreszenzlicht wird durch die Linse 6 direkt und über den Spiegelreflektor 9 indirekt abgefangen. Das Fluoreszenzlicht hat eine längere Wellenlänge als das Erregungslicht, d. h. des Laserstrahls, und durchsetzt unreflektiert den dichroitischen Spiegel 5 und breitet sich weiter auf dem Lichtpfad S1 zu einem Fluoreszenzdetektor 13 auf, welcher bevorzugt eine Photodiode, insbesondere eine Siliciumavalanchediode, verwendet. Um sämtliche Reste von gestreutem Licht zu beseitigen, welches den dichroitischen Spiegel 5 durchsetzt hat und auf dem Lichtpfad S1 sich weiter ausgebreitet hat, sind optische Filter 10, 11 in dem Strahlpfad S1 zwischen dem dichroitischen Spiegel 5 und der Linsenvorrichtung 12 vorgesehen, welche das Fluoreszenzlicht auf den Detektor 13 fokussiert. Die optischen Filter 10, 11 weisen ein Durchlaßband auf, welches das Fluoreszenzlicht durchläßt, das eine längere Wellenlänge als das Laserlicht aufweist. Die Linsenvorrichtung 12 zum Fokussieren kann bevorzugt eine achromatische Linse mit langer Brennweite sein.
• Da sowohl das gestreute Licht wie die Fluoreszenz von den Partikeln, die detektiert wurden, direkt über die Linse 6 und indirekt über den Spiegelreflektor 9 abgefangen wurden, wodurch sie die Meßzone 7 zweimal durchsetzen, wird die wirksame Lichtsammlung ebenso vergrößert wie die Intensität von sowohl der Lichtdispersion wie der Fluoreszenz. Es wird bemerkt, daß die Linse 6 sowohl das gestreute wie das Fluoreszenzlicht in zwei unterschiedlichen Polarisationsebenen abfängt, wobei das Licht, welches die Viertelwellenlängenplatte 18 durchsetzt und zu dem Spiegelreflektor 9 zurückreflektiert wird, in bezug auf die ursprüngliche Polarisationsebene des Laserstrahls um π/2 reflektiert wird. Dies ermöglicht es, daß die Detektion in einer optionalen Polarisationsebene durchgeführt wird. Wie angeführt, kann eine Photodiode in Form einer Avalanchediode in dem Detektor 13 verwendet werden, was vorteilhaft ist, wenn das Fluoreszenzlicht zusätzlich dazu schwach ist, wodurch außerdem die Verwendung eines Photovervielfachers zur Lichtverstärkung überflüssig gemacht wird. Es wird auch bemerkt, daß die Auslegung des Durchflußzytometers für Flüssigkeiten gemäß der vorliegenden Erfindung aufgrund der doppelten Streuung in der Meßzone ein Streusignal hoher Intensität erzielt wird. Hintergrundrauschen wird weitgehend beseitigt und ein Durchflußzytometer für Flüssigkeiten wird dadurch bereitgestellt, das zur Nutzung in der Mikrobiologie geeignet ist und das die notwendige Stabilität, Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit hat.
• Wenn das Durchflußzytometer für Flüssigkeiten gemäß der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist, hat es kleinere Abmessungen und ist einfach verwendbar. Die Analysezeit beträgt weniger als 10 Sekunden und das Probenvolumen, das normalerweise verwendet wird, beträgt ungefähr 0,5 ml.
• Das Durchflußzytometer für Flüssigkeiten gemäß der vorliegenden Erfindung ist zur Analyse sowie zum Zählen von biologischen Mikropartikeln mit Durchmessern von 0,2 bis 30 um in Konzentrationen von zwischen 10³ und 10&sup7; Partikeln pro ml geeignet.

Claims (9)

1. Flüssigkeitsströmungszytometer zum Zählen und zur Klassifizierung von Partikeln, wie zum Beispiel biologischen Zellen oder anderen mikroskopischen Partikeln, in Flüssigkeiten, wobei das Zytometer ein optisches System zur Bestrahlung und zur Erfassung in einem Meßbereich (7) umfaßt, wodurch ermöglicht wird, daß eine optische Dispersion und Fluoreszenz, die von den Partikeln verursacht werden, gleichzeitig erfaßt werden, wenn die Partikel den Meßbereich passieren, dadurch gekennzeichnet, daß das optische System folgendes umfaßt: in einem ersten Strahlenweg (S&sub1;) einen Spiegelreflektor (9), dessen Brennpunkt im Meßbereich (7) liegt, eine Lambda-Viertel-Platte (8) zwischen dem Meßbereich (7) und dem Spiegelreflektor (9), eine Linse (6), deren Brennpunkt im Meßbereich (7) liegt und die sich zwischen dem Meßbereich (7) und einem dichroitischen Spiegel (5) befindet, wobei der dichroitische Spiegel (5) auf eine solche Weise bereitgestellt wird, daß er eine Teilreflektion orthogonal zur Achse der Linse (6) liefert, wobei die Reflektionsrichtung in einem zweiten Strahlenweg (S&sub2;) des optischen Systems liegt, und in dem zweiten Strahlenweg (S&sub2;) einen Strahlteiler (4), der sich zwischen dem dichroitischen Spiegel (5) und einer Lichtquelle (1) befindet, wobei der Strahlteiler (4) einen dritten Strahlenweg (S&sub3;) erzeugt, der orthogonal zum zweiten Strahlenweg (S&sub2;) liegt, und dadurch, daß das Zytometer ferner folgendes umfaßt: einen ersten Detektor (13), der im ersten Strahlenweg (S&sub1;) nach dem dichroitischen Spiegel (5) vorgesehen ist und dazu angeordnet ist, eine von den Partikeln im Meßbereich (7) emittierte Fluoreszenz zu erfassen, zusammen mit einem zweiten Detektor (16), der im dritten Strahlenweg (S&sub3;) vorgesehen ist und dazu angeordnet ist, eine von den Partikeln im Meßbereich (7) verursachte optische Dispersion zu erfassen.

2. Zytometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Spiegelreflektor (9) ein sphärischer Konkavspiegel ist.

3. Zytometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlteiler (4) ein polarisierender Strahlteiler ist.

4. Zytometer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß im zweiten Strahlenweg (S&sub2;) zwischen dem polarisierenden Strahlteiler (4) und der Lichtquelle (1) eine geeignete Linsenvorrichtung (2, 3) vorgesehen ist, um Licht von der Lichtquelle (1) auf den Strahlteiler (4) zu fokussieren.

5. Zytometer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle (1) ein Diodenlaser ist, der im zweiten Strahlenweg (S&sub2;) vorgesehen ist.

6. Zytometer nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem ersten Detektor (13) und dem dichroitischen Filter (5) ein optisches Filter (10, 11) zusammen mit einer geeigneten Linsenvorrichtung (12) vorgesehen ist, um Fluoreszenzlicht zu fokussieren, das durch den dichroitischen Spiegel (5) und auf den ersten Detektor (13) geht.

7. Zytometer nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Detektor (13) eine Fotodiode umfaßt, bevorzugt in Form einer Lawinendiode.

8. Zytometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem zweiten Detektor (16) und dem Strahlteiler (4) ein Strahlenbegrenzer (14) und eine geeignete Linsenvorrichtung (15) vorgesehen sind, um Streulicht zu fokussieren, das vom Strahlteiler (4) und auf den zweiten Detektor (16) reflektiert wird.

9. Zytometer nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Detektor (16) eine Fotodiode umfaßt, bevorzugt in Form einer PIN-Diode.