JP2772370B2 - 粒子の型の分析方法と装置 - Google Patents
粒子の型の分析方法と装置Info
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は光の散乱による粒子または微粒子の識別また
は分析に関し，さらに詳しくは，異なる光散乱および偏
光解消を行う構造に基づいて粒子または微粒子を識別ま
たは分析するための方法および流動細胞測定装置に関す
る。 （文献） 下に掲げたものは，本発明に関連する参考文献であ
る。以下においてこれらの文献を参照する場合は著者名
により参照されている文献を示す。 Benson,M.C.,et al.,Cytometry,5:515-522（1984）． Hoffman,R.A.,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,77:491
4（1980）． Hulst van de,H.D.,Light Scattering by Small Part
icles,Dover Publications,Inc.,New York,1981. Julius,M.H.,et al.,in Mammalian Cells:Probes and
Problems（Richmond,C.R.,et al.,eds.）,ERDA Sympos
ium Series CONF-731007,Technical Information Cente
r,Oak Ridge,Tennessee,1975,p.107. Hoffman,R.A.,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,77:491
4（1980）． Loken,M.R.,et al.,Ann.N.Y.Acad.Sic.,254:163-171
（1975）． Marston,P.L.,J.Opt.Soc.Am.73:1816-1819（1983）． Mullaney,P.F.,et al.,Biophys.J.10:764-772（197
0）． Salzman,G.C.,et al.,Acto.Cytol.19:374-377（197
5）． Terstappen,L.W.M.M.,et al.,Cytometry,7:178-183
（1986）． Terstappen,L.W.M.M.,et al.,J.Immunol.Methods,95:
211（1986）． Terstappen,L.W.M.M.,et al.,Cytometry,6:316-320
（1985）． Visser,J.W.,et al.,Blood Cells,6:391-407（198
0）． Weil,G.J.,et al.,Blood,57:1099（1981）． （従来の技術およびその問題点） 粒子の識別方法は血液サンプル中の細胞の数および型
の決定，体液サンプル中の細菌性もしくはウイルス性粒
子の検出，細胞の容積や密度の定量または分析たとえば
精子の計数といった様なさまざまの臨床分析において有
益なものである。尿のサンプル中の尿酸結晶といった非
細胞粒子の検出もまたある臨床検査では大切である。液
状懸濁液中の結晶および他の粒子の分析もまた重要な産
業上の用途をもっている。 粒子の懸濁液サンプル中の粒子を速く効率的に識別で
きる一つの方法は流動細胞測定法（flow cytometry）で
ある。この方法では，粒子の懸濁液，典型的には血液サ
ンプル中の細胞が流動室（flow chamber）を通って輸送
される。そこでサンプル中の個々の粒子が一つもしくは
一つ以上の焦点のあわされた光線により照らされる。こ
の室を通って流動する個々の粒子に対する光線（群）の
相互作用が一つもしくはそれ以上の光検出装置により検
出される。通常，検出装置は特定の光線または放出の波
長における光吸収または螢光放出および，あるいは特定
の散乱角度における光の散乱を測定するように設計され
ている。このようにして流動室を通過する個々の粒子は
その吸収，螢光，光散乱もしくは他の光学的または電気
的特性に関連した一つもしくはそれ以上の特性について
特徴づけられ得る。検出装置により測定される一つもし
くはそれ以上の特性によって，個々の粒子は検出装置で
測定される光の強さまたは他の特性を軸とする特徴空間
の中に写像される。理想的にはサンプル中の異なった粒
子が特徴空間の別個な重複しない領域に写像され，特徴
空間におけるその写像に基づいて個々の粒子が分析でき
るとよい。そのような分析は粒子の計数，同定，定量
（一つもしくはそれ以上の物理的特性についての）およ
び，または分類を含むものになるであろう。 ２つの一般的な型の光散乱測定が慣例的に流動細胞測
定法においておこなわれる。小さな角度（入射光線に対
して約1.5°−13°）でおこなわれる光強度の測定は通
常前方散乱もしくは小角度散乱と呼ばれるが，細胞の大
きさに関する情報を与える（Mullaney）。前方散乱また
は細胞と細胞の外の媒体との間の屈折作用の差異に強く
依存しているので例えば損傷された膜を有する細胞が区
別される。入射光線から約65°−115°の角度でおこな
われる光強度の測定は通常直交光散乱と呼ばれるが，こ
れらは粒子の大きさと構造化の程度についての情報を提
供する（Visser）。例えば発明者と共同作業者は最近，
人間の細胞障害リンパ球は調節リンパ球（regulatory l
ymphoctyte）やＢリンパ球とは異なる構造特性を持つと
思われることを細胞毒性細胞（cytotoxic cell）のより
大きな直交光散乱の強度に基づいて明らかにした（Ters
tappen）。もし照明光線の幅が粒子の直径より小さけれ
ば直交散乱角度における光のパルス形は細胞の長さと形
状についての情報を与える。 異なる角度で同時に行われる光散乱測定，あるいは吸
収または螢光の測定と組みあわされた光散乱測定が流動
細胞測定法において提案されている。前方および直交光
散乱の同時測定は上述の（Terstappen）細胞障害リンパ
球の調節リンパ球およびＢリンパ球からの識別（Tersta
ppen）並びにリンパ球の他の周辺の白血球細胞からの識
別（Hoffman）に用いることができる。光散乱と組み合
わされた光の吸収作用は流動細胞測定法において赤血球
と血小板との間の区別，ならびにリンパ球，単核細胞，
好塩基性顆粒細胞，好酸性顆粒細胞および好中性顆粒細
胞の間の区別をするために用いられる（Technicon Hema
logもしくはH1 systems）。しかしながらこの方法は細
胞の着色を要し，従ってかなり複雑であり細胞の分類後
に細胞をさらに研究に使用するのを妨げることになるで
あろう。 円偏光二色性（CD）および旋光分散（ORD）と組み合
わされた光散乱測定もまた，ウイルス性粒子または細胞
の懸濁液の中での粒子の識別に対し可能性を持ってい
る。ウイルス性粒子の中のDNAのCDおよびORDスペクトル
上のミー（等方性粒子）散乱の効果の研究（Gordon,197
2;Gordon,1974）は，散乱測定はウイルス性粒子や細胞
といったより大きな生物学的組織中のORDおよびCDの測
定を補正するために使用することができ，独特なORDお
よびCD特性にもとづいて粒子識別ができることを示唆し
ている。数多くの異なった粒子の識別のために右および
左に円偏光された光の散乱の差分（differential）が実
地に行われた（Salzman）。円強度差分散乱（circular
intersity differential scattering;CIDS）方式はCDに
似ており,CDが左および右に円偏光された光の吸収の差
分を利用しているのに対し，右および左に円偏光された
光のDNAのような螺旋状構造による散乱の差分を利用し
ている。 本発明の全般的な目的は，流動細胞測定システムによ
り区別できる粒子の型を拡げる光散乱方法を提供するこ
とである。 本発明のさらに特別な目的は，異なる粒子の型に特有
の偏光解消構造に基づいて粒子を区別するためのその様
な方法を提供することである。 一つの代表的な方法として，本発明のひとつの目的
は，異なる顆粒細胞の型を区別するための方法を提供す
ることである。 本発明のさらに他の目的は偏光解消を行う粒子の光散
乱の差分に基づく粒子の識別のための装置を提供するこ
とである。 （問題点を解決するための手段） 本発明の方法は，異なる粒子の型に特有の異なる偏光
解消構造特性に基づいて少なくとも２つの異なる粒子の
型を分析する方法であって，異なる粒子の型を含む粒子
の懸濁液を光学測定区域を通して導くこと，直線偏光さ
れた入射光線で該区域内の粒子を照明すること，該照明
によって，選択された角度における強度が粒子の偏光解
消構造に依存し，該強度が，（ａ）粒子の型のひとつに
特有であり（ｂ）懸濁液中の他の粒子の型の強度分布と
実質的に重複しない適当な識別空間における強度分布の
範囲内にある偏光解消された散乱光を各粒子から生じさ
せること，該選択された角度において核粒子からの該偏
光解消された散乱光を測定すること，および該識別空間
において測定された偏光解消された散乱光の強度に基づ
いて懸濁液中の異なる粒子の型を分析することを含むこ
とにより，上記目的が達成される。 本発明方法の他の実施態様では，前記照明がコヒーレ
ントな直線偏光された光線を用いて行われる。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記選択され
た角度が入射光線に対して直交している。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記識別空間
が，前記選択された角度において測定された前記照明さ
れた粒子からの偏光解消された散乱光の強度によって定
義される一次元空間である。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記識別空間
が，第１の次元においては前記選択された角度において
測定された前記照明された粒子からの偏光解消された散
乱光の強度によって定義され，第２の次元においては粒
子の型が異なれば平均の反応値が異なる第２の光測定に
対する粒子の反応によって定義される少なくとも二次元
の空間内にある。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記第２の次
元が選択された角度において測定された偏光散乱光の強
度によって定義される。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記偏光解消
された散乱光の強度が前記光線の方向に対して実質的に
直交する角度において測定され，好酸球と好中球とが区
別される。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記偏光散乱
光の強度もまた前記光線の方向に対して実質的に直交す
る角度において測定される。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記識別空間
が，第１の次元においては前記照明された粒子からの偏
光解消された散乱光の強度によって定義され，第２の次
元および第３の次元においては前記照明された粒子から
の前記入射光線に対して実質的に直交しおよび平行な方
向への偏光散乱光の強度によってそれぞれ定義される。 本発明方法のさらに他の実施態様では，異なる粒子が
波長に特有の異なる吸光率をもち，前記第２の次元が波
長に特有の吸光率に起因する前方方向における光の強度
によって定義される。 本発明方法のさらに他の実施態様では，粒子が異なる
螢光偏光性をもち，前記第２の次元が前方方向で測定さ
れる該粒子からの螢光偏光によって定義される。 本発明方法のさらに他の実施態様では，粒子が選択さ
れた螢光染料の存在下で異なる螢光分析上の性質をも
ち，前記第２の次元が選択された放出波長範囲において
測定される螢光放出の強度によって定義される。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記偏光解消
された散乱光が選択された角度に関し比較的大きな受け
入れ角度で測定され，前記第２の次元が比較的小さな受
け入れ角度で測定され，異なった固有の偏光解消性を有
する粒子が区別される。 本発明の装置は，異なる粒子の型に特有の異なる偏光
解消構造特性に基づいて少なくとも２つの異なる粒子の
型を分析するための方法であって，光学測定区域を定め
る手段，粒子の懸濁液を該区域を通して導くための手
段，該区域内の粒子を直線偏光された入射光線を用いて
照明し，それによって選択された角度における強度が粒
子の偏光解消構造に依存し，該強度が，（ａ）粒子の型
のひとつに特有であり（ｂ）懸濁液中の他の粒子の型の
強度分布と実質的に重複しない適当な識別空間における
強度分布の範囲内にある偏光解消された散乱光を各粒子
から生じさせるための光源，該選択された角度において
各粒子からの該偏光解消された散乱光を測定するための
検出器，および該識別空間において測定された偏光解消
された散乱光の強度に基づいて異なる粒子の型を分析す
るための分析器を備える。 本発明装置の他の実施態様では，前記識別空間が，第
１の次元においては前記選択された角度において測定さ
れた前記照明された粒子からの偏光解消された散乱光の
強度によって定義され，第２の次元においては粒子の型
が異なれば平均の反応値が異なる第２の光測定に対する
粒子の反応によって定義される少なくとも二次元の空間
内にあり，さらに該第２の光測定を行うための第２の検
出器を含む。 本発明装置のさらに他の実施態様では，前記第２の検
出器が，前記選択された角度と一致するような散乱角度
において偏光散乱光を測定するように適合させられてい
る。 本発明装置のさらに他の実施態様では，前記偏光解消
された散乱光を測定するための検出器が直交する散乱光
を受光するための位置にあり，好酸球と好中球との区別
に使用される。 本発明装置のさらに他の実施態様では，前記第２の検
出器もまた直交する散乱光を受光するための位置にあ
る。 本発明装置のさらに他の実施態様では，前記識別空間
が，第１の次元においては前記照明された粒子からの偏
光解消された散乱光の強度によって定義され，第２の次
元および第３の次元においては前記照明された粒子から
の前記入射光線に対して実質的に直交しおよび平行な方
向への偏光散乱光の強度によってそれぞれ定義され，さ
らに前方方向への偏光散乱光を測定するための第３の測
定手段を含む。 本発明の方法は粒子の型に特有の異なった偏光解消構
造に基づいて２つもしくはそれ以上の異なる粒子の型を
識別するために設計されている。この方法の実施におい
ては，異なった型の粒子を含んだ粒子の懸濁液が光学測
定区域を通って導かれ，その区域内の粒子は直線偏光さ
れた入射光線により照らされる。その区域を通過する個
々の照明された粒子は偏光解消された散乱光を生じ，選
択された散乱角度におけるその散乱光の強度は，その粒
子の偏光解消構造に依存する。選択された角度における
偏光解消された散乱光の強度は適当な識別空間内の強度
の分布範囲の中にあり，その分布範囲は，（ａ）粒子の
型の内の一つに特有であり，（ｂ）実質的には懸濁液中
の他の粒子の型の強度分布に重複しないものである。選
択された角度において測定された偏光解消された散乱光
の強度が，識別空間において評価されると，懸濁液中の
異なる粒子の型が識別されることになる。さらに一般的
に言えばこの方法では，異なる粒子の型の計数，識別，
物理的特性の定量および，または分類をすることを含ん
だ異なった粒子の型の分析が考慮されている。 粒子が偏光解消のみに基づいて分析できる（例えば区
別される）場合には，特徴空間は選択された角度におい
て照明された粒子から散乱される偏光解消された光の強
度により定義される一次元の空間となるであろう。より
一般的に言うと，粒子は偏光解消の強度並びに，少なく
とも一つの他の光学的もしくは電気的反応特性，例えば
全散乱光量，吸収，螢光,CD,またはORDといった，平均
の反応値が異なった粒子の型に対し相違している特性に
基づいて分析される。ここでは識別空間は，一つの次元
においては偏光解消された散乱の強度により定義され，
少なくとも一つの他の次元においては少なくとも一つの
他の粒子測定のパラメータにおける増大変化により定義
される増分要素であり，以下でさらに説明される。 一つの代表的な実施例において，この方法は顆粒細胞
の好酸性と好中球を分析する，そして特に区別するため
に用いられる。細胞の識別は，第１の次元においては偏
光解消された直交光散乱により定義され，そして第２の
次元においては全直交散乱光により定義される二次元特
徴空間においておこなわれる。 本発明はさらに，異なった粒子の型に特有の異なった
偏光解消構造に基づいて少なくとも２つの粒子の型を分
析するための装置を含んでいる。そのシステム中のフロ
ーセル（flow cell）内において，光学測定区域が定義
され，その中で懸濁液中の粒子が偏光光線によって照ら
される。粒子からの偏光解消された散乱光の強度は選択
された角度において検出装置により測定され，その測定
により，適当な特徴空間において，異なった偏光解消構
造に基づいて粒子の識別を行うことができる。本装置は
測定された細胞のパラメータの記録のためおよび適当な
識別空間における偏光解消された散乱の強度に基づく粒
子の分析のための分析装置を含んでいる。 本発明のこれらのそして他の目的と特徴は添付図面を
共に下記の実施例を読めば十分明らかになる。 （実施例） I.細胞測定装置 本発明による使用のために構成された細胞測定装置が
第１図において10で示される。その装置内の流動細胞測
定器12はＡ部で詳述されるように，サンプル粒子からの
偏光解消された光散乱を測定するために設計されてい
る。装置内の分析器14はＢ部に述べる様に，偏光解消さ
れた光散乱を含む一つもしくはそれ以上の光学的測定に
基づいてサンプル中の粒子を分析するために機能する。
この中で明らかにされる様に，本方法による粒子の分析
は粒子の計数，識別，（物理的パラメータの）定量およ
び，または分類を包含し得る。 A.流動細胞測定器 流動細胞測定器の基本的なハードウエアは，懸濁液サ
ンプル中の粒子がその中を選ばれていく流動室16,フロ
ーセルを通って動く粒子を照らすための光源18,ならび
に照明された細胞の光学的反応パラメータを測定するた
めの検出器20,22および24のような光検出器である。 光源18は流動室内の粒子を焦点をあわせられ直線偏光
された光線で照らすように設計されている。図中で26で
示される光線は従来のレーザ28により造られたコヒーレ
ントな光線である。488nmに調整された3Wのアルゴンイ
オンレーザ（Coherent Radiation,Palo,Alto）もしくは
5mWヘリウムネオンレーザ（Model 120S,Spectra Physic
s,San Jose,CA）が適している。レーザからの光線はレ
ンズ30によりフローセル内の細胞の流れの上に焦点をあ
わせられている。このレンズは上述のアルゴンレーザに
対しては焦点距離200mmおよび20mmの２つの円筒形のレ
ンズを含み，ヘリウムネオンレーザの場合には焦点距離
70mmの単一の球形レンズである。コヒーレントな（レー
ザ）光源が示されてはいるが，光源は代わりにレンズ30
によりその光線が焦点を合わせられる従来のアークラン
プ（非コヒーレントな）光源でもよい。 光線は,Melles Griot（Irvine,CA）から調達できるHN
7フィルタのような偏光フィルタ32を用いて直線偏光さ
れる。代わりに直線偏光されたアルゴンレーザの場合の
ように，レーザ28を直線偏光された光線を出力するよう
に設計することもできる。議論の目的で，偏光フィルタ
の方向づけはその電界ベクトルＥが図に示されているｘ
−ｙ−ｚ座標系においてｘ軸に平行である直線偏光を生
成するように仮定される。そこでは光線はｚ軸に沿って
導かれ，粒子はｘ軸に沿ってフローセルを通って移動す
る。すなわち偏光された電界ベクトルは粒子の流れの方
向と一直線になる。しかしながら光線はｘ−ｚ平面内で
典型的にはｘ軸に関して約10°から170°の角度の範囲
で導かれ，電界ベクトルはｘ−ｙ平面内で実質的にどの
方向にも偏光され得るということが注目される。 ここでは示されていないが，細胞測定器12は光散乱に
加えて光の吸収，螢光,CD,およびORDのような多種類の
光学的パラメータを測定するために非偏光光源や他の光
源を含んでもよいし，あるいは光散乱の測定のための第
２の方向で偏光された光を含んでもよい。 流動室16は250μm X 250μｍの四角形のフローチャン
ネル（flow channel）を有する石英製のフローセルのよ
うな従来形の密閉された光学的セル（cell）でよく,Hel
lma Gmbh and Co（Mullheim/Baden,W.Germany）から調
達できる。該流動室は液状懸濁液中の粒子が注入管（in
jection tube）34を経由して光散乱測定がおこなわれる
光学測定区域34の中へそして通って導かれるように配設
されている。 流動細胞測定器が細胞の分類に使用されるように意図
された場合には流動室は，測定区域のちょうど下流に懸
濁液の小滴の噴射を造る「ジェット−イン−エア（jet-
in-air）」形のセルであり得る。螢光活性化された細胞
の分類で使用されるような従来形のジェット−イン−エ
アセルであって市販で購入できる（Becton Dickinson,M
T.View,CA）ものが適している。代わりに，細胞の分類
は小滴形成のための小さな宝石でできた穴を持っている
フローチャンネルを用いておこなわれ得る。細胞測定器
は従来から行われているように，測定区域内で測定され
た粒子の光学パラメータに基づいて選択された粒子を採
集管の中にそらす働きをする細胞分類器38を追加として
含むことができる。さらに，小さな掩蔽用の障害物（図
示せず）を，流動体の円筒状の流れにより散乱されたレ
ーザ光を妨げるために直交光を検出する対物レンズの前
に置くことができる。典型的には障害物は入射光に関し
て約87°−93°の間の角度における光を妨げる。そのよ
うな掩蔽障害物により，全ての偏光解消に対する斜めの
偏光解消（cross depolarization）（以下で議論され
る）の相対的寄与が増加した。掩蔽用障害物を用いた流
動分類システムは以下述べるように，偏光解消の識別に
基づく細胞分類において連続して用いられている。 本発明の重要な特徴に従って，細胞測定器は測定区域
内の粒子によって散乱された偏光解消された光の強度を
検出するための少なくとも一つの光検出器を含んでい
る。ここで明らかなように，「偏光解消された散乱光」
とは，その電界ベクトルが入射光線の電界ベクトルに対
して垂直な平面において重要なベクトル成分を含む光で
ある。図示された構成では，入射光の電界ベクトルがｙ
−ｚ平面に対して垂直なｘ軸に沿って方向づけられるの
で，偏光解消された散乱光の電界ベクトルはｙ−ｚ平面
において重要な成分を含む。 図に示される本発明の実施例は，直交する偏光解消さ
れた光，すなわち入射光線の方向に関して，約65°と11
5°の間，なるべくなら約90°の角度において散乱され
た偏光解消された光，すなわち第１図においてｙ軸に沿
って散乱される光の測定のために設計されたものであ
る。図にみられるように，図において44で示される散乱
光線を平行にするための機能を有するレンズ42によっ
て，全ての直交する散乱光が集められる。Leitz H32,NA
O.6対物レンズのような従来の顕微鏡の対物レンズが適
している。 図に示された実施例はまた，偏光入射光の粒子散乱に
より生じる，偏光された電界ベクトルおよび偏光解消さ
れた電界ベクトルの双方を含む直交散乱光としてここで
定義される全直交散乱光を測定するために設計されてい
る。光学縦列（optical train）における従来型のビー
ムスプリッタ46が光線44を48および50で示される各々が
全直交散乱光から構成される２つの光線に分離する。光
線48は,x軸に沿って偏光された散乱光を濾過して取り除
き，従って偏光解消された散乱光，すなわち図において
ｚ方向にベクトル成分を持っている散乱光のみを通過さ
せる偏光子を通過する。ひとつの適当な偏光子はポラロ
イドフィルタHN7でMelles Griot（Irvine,CA）から調達
できる。 濾過された光線の強度は検出器20により測定される。
この検出器はできればHamamatsu（middlesex,NJ）から
市販で調達できるModel R928増倍型光電管のような増倍
型光電管がよい。増倍型光電管は以下でさらに検討され
るように，集光される光の円錐体の角度Δφが約３°−
13°の間に分布できるｙ軸に沿った円錐体からの光を集
光するように調節される。検出器により集光される光の
円錐体はレンズ42の前に置かれた絞り（図示しない）に
より調節できる。検出器により測定された電圧レンズ
は，その機能がＢ部で述べられてある分析器14に入力さ
れる。 全直交散乱光で構成される光線50の強度は，上述した
ようなできれば増倍型光電管である検出器22により測定
される。検出器22により測定される光の円錐体は上述の
ようにレンズ42の前に置かれた絞りにより調節できる。
検出器により記録された電圧レベルの信号は分析器14に
供給される。ホトダイオード検出器のような他の光検出
器は，直交散乱光線の強度が十分である場合には検出器
20,22の一つもしくは両方に対して使用できることが認
められるであろう。 図に示された細胞測定器はまた，全前方散乱光，すな
わち入射光の軸に対して約25°以内の，できれば入射光
の軸上に中心をおく円錐体内の角度において散乱された
光の強度を測定するように設計されている。前方散乱光
はレンズ54によって平行にされる。光線の強さは検出器
24によって測定されるが，その検出器はできればUnited
Detector Thechnology（Hawthorne,CA）から調達でき
るホトダイオードモデルPin 10-Dのようなホトダイオー
ドがよい。レンズ54の前に置かれた絞り（図示しない）
によって調節できる，集光される光の円錐体は典型的に
約２°−17°の間にある。検出器24の出力は分析器14に
与えられる。 偏光解消された散乱光を測定するのに必要とされる最
小の検出器のハードウエアは，検出器20のような単一の
光検出器および偏光解消された散乱光のみを通過させる
偏光フィルタであることが，ここでは注目される。さら
に，図示された細胞測定器は直交する偏光解消された散
乱光を測定するために設計されているが，もし調べられ
る異なった粒子の型の間の適切な強度識別が測定角度に
よって与えられるならば，検出器20は図におけるｘ−ｚ
平面により制限される半球上の任意の点に位置すること
ができることが理解される。例えば検出器は，約90°−
180°の間の角度（後方散乱光の偏光解消を測定するた
め）に，また図示された直交の位置に，あるいは検出器
24の位置（前方散乱光の偏光解消を測定するため）に置
かれ得る。 検出器22および24のような一つもしくはそれ以上の追
加の検出器は，以下のＢ部で考察されるような，偏光解
消された散乱光の異なった強度の分布に基づいて異なっ
た粒子の型の識別を行うために必要とされる追加の特徴
情報を提供する。上述した様に，図に示した本発明の実
施例において，検出器22および24はそれぞれ直交と前方
の方向における全散乱光についての情報を提供する。探
知器22,24に加えてのもしくはその代わりの他の光学的
検出器は，（ａ）第２の散乱角度における偏光解消され
た散乱光の強度，（ｂ）集光された光の円錐体の異なる
角度における偏光解消された散乱光もしくは全散乱光の
強度，（ｃ）光の吸収，（ｄ）螢光の放出並びに（ｅ）
ORDおよびCDのパラメータに関する光学的パラメータ情
報を提供することができる。細胞測定器はまた，クール
ター効果検出器のような非光学的細胞検出器を，流動室
内の粒子の抵抗特性もしくはキャパシタンス特性により
細胞容積を測定するために装備することもできる。 B.分析器 装置内の分析器は，粒子の型について懸濁液中の個々
の粒子を分析する目的で，一つもしくはそれ以上の検出
器からの信号応答情報を記録し処理するために機能す
る。本質的には，分析されるべき個々の粒子の型は一つ
もしくは複数の次元を有する特徴空間内の各々の次元に
おいてその型のとる値の範囲についてまず特徴づけられ
る。特徴空間における少なくとも一つの次元は，分析さ
れるべき粒子の型の各々によって生成される，選択され
た散乱角度における，偏光解消された散乱光の強度の値
の範囲である。 最も単純な場合，懸濁液中の異なる粒子は偏光解消さ
れた散乱の強度のみを基準として区別されることができ
る。この場合は第２図に図示されており，同図は，粒子
の懸濁液中の粒子ＡおよびＢに対し選択された角度にお
いて測定された偏光解消された光散乱の強度Idの範囲を
表わしている。２つの粒子の異なる偏光解消の強度は２
つの粒子の中の異なった偏光解消構造に関係しており，
以下で考察されるように，粒子からの異なる程度の異方
性散乱を生じさせる。 図に見られるように，個々の粒子はId軸にそって強度
の分布範囲を持ち，その分布範囲は個々の粒子の型に特
有のものであり実質的には他の粒子の型の強度分布とは
重複しない。 多くの場合，粒子の分析は，多パラメータ特徴空間に
おける細胞の分布を分離した重複しない領域へ分離する
ために，一つもしくはそれ以上の追加の光学的または非
光学的な反応の測定を必要とする。二次元の特徴空間
（２−パラメータ密度図）に基づいた粒子識別の例が第
３図に図示されている。ここでは異なるＡおよびＢの型
の粒子の偏光解消の強度の分布は図示されている様にId
軸上で多少重複しているので，粒子はこのパラメータの
みに基づいては一つあるいは他の分布範囲の中へ明確に
写像され得ない。この重複は，第１の次元においては偏
光解消された散乱の強度（Id）により定義され，第２の
次元においては全散乱の強度（It）によって定義される
領域の中へ粒子が写像される時に「解決」され,2つの別
箇で重複しない領域へと帰着する。全散乱の強さだけを
基準としたのでは粒子はあいまいさなしに区別され得な
い。なぜならばこのパラメータは２つの粒子の型の間に
かなりの重複を与えるからである。 さらに一般的には，二次元の特徴空間は，全散乱の強
度における増加によって定義される要素56のようなId軸
に平行な一連の領域要素を定義する。この中で識別空間
とも呼ばれる個々のその様な要素内では,2つの粒子はそ
れらの異なった偏光解消散乱の強度に基づいて区別され
得る。すなわち，個々の要素すなわち識別空間内で，懸
濁液中の粒子は，粒子の型の１つに特有であり懸濁液中
の他の粒子の型の分布に重複しない偏光解消された散乱
の強度を生じる。 適切な特徴空間を定義するのに用いられる第２のパラ
メータは,2つもしくはそれ以上の粒子の型の写像を特徴
空間の別箇の重複しない領域へ分離するものでなければ
ならないということが認められる。本例では，同じ角度
の全光散乱は効果的な第２のパラメータである。なぜな
ら個々の粒子の型について，より高い偏光解消された散
乱の強度を持つ粒子はより高い全散乱光の強さを示す傾
向にあるからである。しかしながら，他の粒子に対して
は，強度Idの分布の重複を同じ角度における全散乱以外
の光学的もしくは非光学的パラメータを用いて「解決」
することが望ましいかまたは必要である。 この粒子識別方法の三次元への拡張が第４図に図示さ
れている。ここでは，異なるＡおよびＢの粒子は，第１
の次元において粒子の偏光解消された散乱の強度（Id）
により，第２の次元において全光散乱（It）により，そ
して第３の次元において光の吸収（Ao）により定義され
た２つの別箇の体積領域の１つの中への写像によって特
徴づけられる。第３図で示された二次元の場合に類似し
て，三次元の特徴空間は，要素58のような全散乱の強度
と吸収とにおける増加により定義されるId軸に平行な一
連の体積要素を定義する。個々のそのような要素（識別
空間）の中で２つの粒子はそれらの異なった偏光解消さ
れた散乱の強度を基準として区別され得る。すなわち個
々の要素の中で，懸濁液中の粒子は，粒子の型の１つに
特有であり，他の粒子の分布とは重複しない偏光解消さ
れた散乱の強度を生じる。 第５図は，この粒子ＡおよびＢを第４図に図示されて
いるId/It/Ao特徴空間におけるそれらの分布に基づいて
分析するために分析器14により実行されるアルゴリズム
の流れ図である。３つのパラメータの分布範囲は前もっ
て個々の粒子に対し確定しており，この情報は分析器の
中の記憶装置の内部に識別空間要素の配列の形で格納さ
れると仮定する。それぞれの要素は増分領域ΔIt×ΔAo
およびその要素内の異なった粒子の型に特有の偏光解消
された散乱光の該増分領域に関連した強度分布によって
定義される。 個々の粒子が流動室内の一つもしくはそれ以上の測定
区域を通過するとき，その光学的散乱および，または吸
収の特徴が細胞測定器内の対応する光学的もしくは非光
学的検出器により測定され，それらの検出器は反応デー
タを電圧信号の形で分析器に供給する。分析器は入力電
圧信号をId,It,およびAoのディジタル値に変換するアナ
ログディジタル変換器（ADC）（図示しない）を含んで
いる。It値およびAo値は順序対を形成し，そしてその順
序対は識別空間体積要素の一つのΔIt×ΔAo領域内に存
在するものとして，その体積要素と同一視される。ひと
度対応する体積要素がつきとめられると，測定されたId
値はその体積要素内の粒子Ａに対するId値の分布と比較
される。もし測定された値が粒子ＡのIdの範囲内にあれ
ば粒子は粒子Ａとして分類され，そしてこの情報は,Aお
よびＢの粒子を分離する目的のために記録されおよび，
または細胞測定器内の細胞分類器に供給される。さら
に，定量されたデータは特徴空間内の細胞の密度を表示
するために第４図の様に三軸グラフ上にプロット（plot
t）されそして細胞数が計算されることもある。 もし粒子のId値が，関連する識別空間における粒子Ａ
の範囲内になく粒子Ｂの範囲内にある場合には，粒子は
その様に分類され，この情報は同様に格納され分類器に
供給されおよび，または表示される。同様に粒子はＡで
もなければＢでもないと分類されそしてその様に分析さ
れることもあり得る（それは粒子の型の格納もしくはプ
ロットおよび，または粒子の計数もしくは分類を包含す
る）。粒子の分析後，分析器は測定区域内に見られる次
の粒子からのパラメータデータの処理のための状態に戻
る。三次元以外の次元数をもつ特徴空間における動作の
ためにアルゴリズムがどのように修正されるかは分るで
あろう。 分析器は前述のADC,データ格納のための記憶装置なら
びに測定され入力されたIt値およびAo値に基づいて適切
な識別空間体積要素をつきとめるための，そしてつきと
められた体積要素内のId値に基づいて粒子の型を分類す
るためのマイクロプロセッサを包含している。マイクロ
プロセッサは従来型の設計でよく，そして従来のプログ
ラム作業により上述のデータ格納と分類を実行するため
にプログラムされる。 II.作用 偏光解消された光の散乱は粒子の識別（Ａ部）および
代表的な細胞識別方法と成果（Ｂ部）のために本発明で
利用されるが，本節では偏光解消された光散乱の理論を
述べる。 A.理論的考察 第６図は直交光散乱に対する第１図に示された光学的
配置を説明している。入って来るレーザ光線はｚ軸に沿
って伝搬しそしてｘ軸に沿う入射電界Ｅでもって直線偏
光されている。我々の座標系の原点０において，レーザ
光線はｘ軸に沿って移動している流動細胞測定器内の粒
子を横切る。散乱光の方向は球座標r,θおよびφにより
記述される。θおよびφ方向に偏光された散乱光の振幅
はそこで以下の式のように記述される（van de Huls
t）： Ｅφ＝（S4cosφ−S1sinφ）fE0 （１） Ｅθ＝（S2cosφ−S3sinφ）fE0 （２） ここで,fは球面波の複素表示で，散乱体と検出器との
間の距離であるｒに反比例する。S1,S2,S3およびS4は，
φ，θおよび散乱体の幾何形状と物理的構成に依存する
いわゆる振幅関数（van de Hulst）である。測定可能な
光の散乱強度ＩφとＩθはこれらの電界に関連し，以下
のように表される： Ｉφ＝|Eφ｜２ （３） Ｉθ＝|Eθ｜２ （４） ｘ軸方向に偏光された電界もしくはｚ軸方向に偏光さ
れた電界のみを伝導する理想的な偏光子を用いて測定さ
れた光の強度はそれぞれIl（平行について）およびIr
（垂直について）と呼ばれる。Irは偏光解消光散乱強度
と呼ばれ，偏光解消率（depolarizationratio）はここ
で次の様に定義される： yz平面に散乱された光，すなわち入射光の偏光方向に
関して直交している光に対しては，φ＝90°であるの
で,IlとIrは次の式で表される： Il＝｜S1fE0｜ Ir＝｜S3fE0｜ （６） このようにIlはS1により決定されるのに対し，この配
置での偏光解消された光散乱の強度の測定は項S3につい
ての情報を生ずる。この項の重要性が手短かに説明され
る。 均質な球面，球殻などに対して項S2は零であり（van
de Hulst），S3は光学的異方性（形状および，または構
成のために）をもつ粒子および多数の散乱が重要となる
ような構造を含む粒子に対し重要になる。簡単だが著し
い後者の零が第７図に図示されている。ここでは照明さ
れている粒子（細胞）はｘ軸上に位置する２つの細胞内
部の球体を含んでいる。ｚ軸に沿って進行する特別な入
射光線は最初の球体によってｘ軸に沿って反射され,2番
目の球体によってｙ軸に沿って反射される。反射の法則
を適用すると，この光線の偏光の方向はｘ軸に沿う方向
からｚ軸に沿う方向へ変わることが見いだされる。この
ように，多数の反射がいかに偏光解消につながり，従っ
て，項S3に対する寄与につながるかがわかる。同様に，
回折および屈折による多数の散乱もまた偏光解消につな
がることが示される。微粒子内部で多数の散乱をおこす
ことができる多数の顆粒もしくは他の個々の粒子からな
る物質，および非球形状のような他の粒子組織で異方性
の光散乱を起こすことのできるものはここでは集合的に
偏光解消組織と呼ばれる。上述した振幅の方程式の取り
扱いは，Δφが０°もしくは90°（それぞれ前方もしく
は直交散乱）の場合にはより簡単であるにもかかわら
ず，細胞内の粒子の偏光解消組織は実質的に全ての散乱
角度において偏光解消散乱光を生ずることが第７図から
認められる。例えば第７図に示される細胞において，第
３の細胞内粒子はｙ軸に沿って進行する偏光解消された
光を前方もしくは後方の散乱方向にさらに反射すること
ができるであろう。 典型的には，偏光解消散乱光に対する最適の測定角度
は，一次元（Id）の特徴の場（field）において粒子の
間の最良の識別を与える角度である。これは今度は異な
る粒子の型の相対的な振幅関数に依存する。これらの中
で最も重要なのは直交散乱角度を支配するS3および前方
散乱角度を支配するS4である。これらの２つの項の相対
的寄与は前方および直交の角度における異なった粒子の
偏光解消光散乱の測定によりたやすく評価できる。 異なった偏光解消組織に基づく粒子の間の識別は，光
検出器によって光の強度が測定される円錐体の角度Δφ
を減らすことによりさらに高められる。上述のように増
倍型光電管のような光学検出器は選択された測定角度に
おける軸を囲む円錐体からの光を集める。直交の偏光解
消光散乱の場合には，これは偏光解消効果はS3（90°で
の唯一の項）のみによって起こされるのではなく，S1,S
2，およびS4の他の振幅関数によっても起こされる。こ
の余分な偏光解消は測定システムの幾何形状によるもの
で，相互的偏光解消（cross depolarization）と呼ばれ
る。それは蛍光偏光実験の説明をする時に用いられる
「開口偏光（aperture polarization）」という専門用
語に密接に関係している。 相互的偏光解消の90°において測定された偏光解消効
果に対する寄与は，円錐体の角度φに対する偏光解消率
の依存を分析することにより決定することができる。こ
れは集光レンズ（第１図におけるレンズ42）の前に長四
辺形の絞りを置き集光される光の角度をφ＝90±Δθの
間に制限することによりおこなわれる。発明を補助する
ために行われた１つの研究において，受け入れ角度の関
数としての異なる細胞および粒子の型について測定され
た偏光解消の強度が調べられた。第８図を参照し，調べ
られた粒子は：好中球（黒い円），好酸球（十文字），
単核細胞（白抜き四角形），リンパ球（白抜き円），お
よび平均約1.16μｍの直径を持つポリスチレンの小球体
（白抜き三角形）である。直交の偏光解消光散乱の強度
は円錐体の角度Δφ＝2.5°および14.5°で測定され
た。結果は表１に示されている。 表１ Δφ＝2.5° Δφ＝14.5° 好酸性顆粒細胞 4.7 4.4 好中性顆粒細胞 1.3 1.3 単核細胞 0.5 0.7 リンパ球 0.5 0.8 小球体 0.62 3.9 上に見られるように，相互的偏光（cross polarizati
on）効果は，受け入れ角度に対する偏光解消の依存状態
により決定されるが，内部の顆粒組織が豊富な細胞（好
酸性および好酸性顆粒細胞）では大部分はなく，恐らく
光を等方的（S3＝S4＝０）に散布している球状粒子（小
球体）では非常に著しく（微小球），明白な内部顆粒組
織を持たない単核細胞やリンパ球では中間である。 円錐体の角度に対する偏光解消散乱の強度の依存はま
た円錐体の中間的な角度においても調べられ，その結果
は第８図にみられる。図における曲線は全て14.5°で共
通の値を持つように正規化されている。図中の点線は理
想的な球に対しては計算された，受け入れ角に対する理
論的な二次の依存である。結果は上述した高度に偏光を
行う（例えば顆粒）組織は相互的偏光効果をほとんど示
さない一方，中位の偏光解消組織をもつものは相互的偏
光効果を受けやすいという一般的な結論を支持してい
る。結果は高度に偏光解消を行う粒子と中位のそれとの
間の強度分布の相違は，低い円錐体の角度において直交
の強度の測定を行うことにより増大させられることを示
している。 もし懸濁液中の異なる粒子が直交および前方の両方の
光散乱角および低い円錐体の角度において重複する偏光
解消の強度分布範囲を持つことがわかったならば，粒子
の識別のためには一つもしくはそれ以上の追加の粒子の
パラメータが必要とされる。最も簡単なパラメータは光
散乱の測定である，なせならこれらは追加の光源およ
び，またはフローセルの改造を必要としないからであ
る。光散乱測定の一つの一般的な様式は第２の角度にお
ける偏光解消光散乱である。例えばもし区別されるべき
粒子が異なるS3およびS4の値を持ち，その結果直交と前
方の偏光解消された散乱の測定の組み合わせが別個の粒
子領域を与えるのであればこの方法は有益である。散乱
測定の第２の様式は，偏光解消された散乱光として同じ
かもしくは異なる角度で測定された全散乱光である。以
下で説明されるように，この方法により顆粒細胞の異な
る型の特徴空間領域のよい分離が得られる。最後に，偏
光解消された散乱光は異なった円錐体の角度で集光され
得る。 B.応用 上述のことから，本方法は区別されるべき粒子が異な
った偏光解消構造を持っているかいかなる流動細胞測定
器の応用に対しても適用可能であることが認められるで
あろう。一つの重要な適用は血液細胞サンプル中の異な
った血液細胞の区別または細胞の分別にある。区別され
るべき細胞の型は他の細胞の型からの顆粒細胞，顆粒細
胞の異なった型，単核細胞からのリンパ球，そして特定
の白血球のサブクラスを包含することができる。 強度の偏光解消を行う細胞の場合における細胞識別の
一例として，顆粒球性の好酸球と好中球とを識別するた
めにこの方法が用いられた。人間の血液は静脈穿刺によ
り健康な固体から得られた。ヘパリンが凝固防止に使用
された。（150USP Uナトリウムヘパリン（sodium hepar
in）/10ml Venoject Terumo Europe NV）。精製された
顆粒細胞は発表された方法に従って比重分離により得ら
れた（Terstappen 1985）。細胞の懸濁液は0.005％の窒
化ナトリウムと１％のウシ血清アルブミン（BSA）を含
有している緩衝生理食塩水（PBS）中で１×106/mlの濃
度に調節された。測定は細胞の生活能力を維持するため
に同日におこなわれた。 流動細胞測定の実験が上述の流動細胞測定器で行わ
れ，この場合レーザ照明光線は488nmにセットされ，散
乱は250μｍ×250μｍの四角形のフローチャンネルの中
で生じた。直交の偏光解消散乱と全光散乱との強さが第
１図に示された光線を分割する構成を用いて測定され
た。結果は２つのパラメータによる密度図として表示さ
れるが，第９図Ａに示されている。図にみられるように
この方法によって２つの細胞の型は第３図で説明したよ
うに別個のそして重複しない特徴領域に写像される。 偏光解消された直交の光散乱の強度は高くないので，
測定された偏光解消光は弾性光散乱によるものであり，
自動蛍光（autofluorescence）によって生ずるものでは
ないという可能性が調べられた。これは500nmの短波通
過フィルタを検出のための光学部品に挿入することで行
われたが，それは結果に影響をおよぼさなった。さら
に，使用されたアルゴンイオンレーザの照明波長が488n
mから509nmと514nmとに変えられ，また633nmのヘリウム
ネオンレーザが用いられた。全ての場合において，得ら
れた結果は同じであった。 本方法が顆粒細胞の２つの集団を分離するための細胞
の分類作業にも適用された。ここでは流動細胞測定器に
在来の分類器がとりつけられ，分析器は急速細胞識別法
（rapid cell discrimination）に基づいて分類器に信
号を送るように設計された。分類された顆粒細胞の下部
集団はメイ−グリュンバルト染色の後で光学顕微鏡法に
より調べられた。直交の光散乱の比較的に高い偏光解消
を有する細胞は好酸性顆粒細胞（99％の純度）と確認さ
れ，しかるに他方の集団は好中性顆粒細胞（99％の純
度）からなりたっていた。 中位に偏光解消を行う細胞の場合における細胞識別の
例として，本方法がリンパ球と単核細胞とを識別するた
めに用いられた。ヘパリンを添加された血液は前述の通
りに得られた。人間の白血球標本は190mlの溶解緩衝剤
（lysing buffer）（8.29g/lのNH4Cl,0.0037g/lのNa2ED
TA,1.00g/lのKHCO3）を10mlの全血液に加え,4℃で20分
間培養（incubate）することにより得られた。溶血（ly
sed blood）の懸濁液はPBS中で３回洗われた。細胞の懸
濁液は0.005％のアジ化ナトリウム（sodium azide）と
１％のウシ血清アルブミン（BSA）を含有しているPBS中
で１×106/mlの濃度に調節された。偏光解消された散乱
光および全散乱光が上述のように測定された。結果は２
つのパラメータの密度図として表示されるが，第９図Ｂ
に示されている。図にみられるように，本方法により２
つの細胞の型は別個の重複しない特徴領域に写像され
る。密度図はまた，比較的大きな偏光解消性を有するリ
ンパ球の小さな下部集団の存在を示している。 人間の赤血球もまた同じ方法により調べられ，その結
果は第９図Ｃに示される。細胞は偏光解消構造特性に基
づく不均質さをほとんどもしくは全く示さない。 本発明の方法によれば，いろいろな他の細胞の型や非
細胞粒子もまた区別されおよび／または分類されること
ができるであろう。これらは高度な異方性を有する構造
をもつ精子細胞や，異方性の形状に基づくバクテリアお
よび尿酸結晶のように不規則な結晶形状に基づく結晶性
の粒子を含んでいる。これらの粒子の型の各々に対し
て，偏光解消の測定の最適な条件が上述したように定め
られ，もし必要ならば追加の光学的および，または非光
学的なパラメータを粒子のさまざまな光学的および／ま
たは非光学的反応特性に対する粒子の型の既知のふるま
いに従って選択することができる。 上述のことから，いかに本発明の多様な目的や特徴が
合っているかが認識される。この方法は粒子の異なる偏
光解消構造特性に基づいて互いに区別されおよび，また
は分類される粒子の種類を拡大する。多くの場合，偏光
解消された直交の光散乱は現存する流動細胞測定器に対
し非常に費用削減効果のあるパラメータをつけ加えるこ
とになり，この簡単な追加により他の方法ではもたらさ
れない有益な情報が得られる。 一つの例として好酸性顆粒細胞を好中性顆粒細胞から
区別する能力は実用的にもまた理論的にも重要である。
今や低出力のレーザを備えた簡単な流動細胞測定器を構
成することが可能であり，それは白血球の弁別を染色さ
れていない細胞を用いて行うことができる。今迄は追加
のこみいったそして不安定な染色手続きを適用されなけ
ればならず，あるいは弱い自動蛍光が高価なアルゴンイ
オンレーザにより測定されなければならなかった（Wei
l）。 本発明は特定の実施例および応用に関して説明された
が，本発明の教えに基づく様々な他の実施例や応用が可
能であることが認められるであろう。 本発明をさらに要約すれば，異なる粒子の型に関連す
る異なる偏光解消構造に基づき粒子の分析を行うための
方式と装置である。流動細胞測定器内の細胞は直線偏光
された光により照明され，偏光解消された散乱光をつく
りだし，選択された測定角度における，そして適切な識
別空間におけるその強度の範囲は異なった粒子の型の分
析に用いられる。
は分析に関し，さらに詳しくは，異なる光散乱および偏
光解消を行う構造に基づいて粒子または微粒子を識別ま
たは分析するための方法および流動細胞測定装置に関す
る。 （文献） 下に掲げたものは，本発明に関連する参考文献であ
る。以下においてこれらの文献を参照する場合は著者名
により参照されている文献を示す。 Benson,M.C.,et al.,Cytometry,5:515-522（1984）． Hoffman,R.A.,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,77:491
4（1980）． Hulst van de,H.D.,Light Scattering by Small Part
icles,Dover Publications,Inc.,New York,1981. Julius,M.H.,et al.,in Mammalian Cells:Probes and
Problems（Richmond,C.R.,et al.,eds.）,ERDA Sympos
ium Series CONF-731007,Technical Information Cente
r,Oak Ridge,Tennessee,1975,p.107. Hoffman,R.A.,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,77:491
4（1980）． Loken,M.R.,et al.,Ann.N.Y.Acad.Sic.,254:163-171
（1975）． Marston,P.L.,J.Opt.Soc.Am.73:1816-1819（1983）． Mullaney,P.F.,et al.,Biophys.J.10:764-772（197
0）． Salzman,G.C.,et al.,Acto.Cytol.19:374-377（197
5）． Terstappen,L.W.M.M.,et al.,Cytometry,7:178-183
（1986）． Terstappen,L.W.M.M.,et al.,J.Immunol.Methods,95:
211（1986）． Terstappen,L.W.M.M.,et al.,Cytometry,6:316-320
（1985）． Visser,J.W.,et al.,Blood Cells,6:391-407（198
0）． Weil,G.J.,et al.,Blood,57:1099（1981）． （従来の技術およびその問題点） 粒子の識別方法は血液サンプル中の細胞の数および型
の決定，体液サンプル中の細菌性もしくはウイルス性粒
子の検出，細胞の容積や密度の定量または分析たとえば
精子の計数といった様なさまざまの臨床分析において有
益なものである。尿のサンプル中の尿酸結晶といった非
細胞粒子の検出もまたある臨床検査では大切である。液
状懸濁液中の結晶および他の粒子の分析もまた重要な産
業上の用途をもっている。 粒子の懸濁液サンプル中の粒子を速く効率的に識別で
きる一つの方法は流動細胞測定法（flow cytometry）で
ある。この方法では，粒子の懸濁液，典型的には血液サ
ンプル中の細胞が流動室（flow chamber）を通って輸送
される。そこでサンプル中の個々の粒子が一つもしくは
一つ以上の焦点のあわされた光線により照らされる。こ
の室を通って流動する個々の粒子に対する光線（群）の
相互作用が一つもしくはそれ以上の光検出装置により検
出される。通常，検出装置は特定の光線または放出の波
長における光吸収または螢光放出および，あるいは特定
の散乱角度における光の散乱を測定するように設計され
ている。このようにして流動室を通過する個々の粒子は
その吸収，螢光，光散乱もしくは他の光学的または電気
的特性に関連した一つもしくはそれ以上の特性について
特徴づけられ得る。検出装置により測定される一つもし
くはそれ以上の特性によって，個々の粒子は検出装置で
測定される光の強さまたは他の特性を軸とする特徴空間
の中に写像される。理想的にはサンプル中の異なった粒
子が特徴空間の別個な重複しない領域に写像され，特徴
空間におけるその写像に基づいて個々の粒子が分析でき
るとよい。そのような分析は粒子の計数，同定，定量
（一つもしくはそれ以上の物理的特性についての）およ
び，または分類を含むものになるであろう。 ２つの一般的な型の光散乱測定が慣例的に流動細胞測
定法においておこなわれる。小さな角度（入射光線に対
して約1.5°−13°）でおこなわれる光強度の測定は通
常前方散乱もしくは小角度散乱と呼ばれるが，細胞の大
きさに関する情報を与える（Mullaney）。前方散乱また
は細胞と細胞の外の媒体との間の屈折作用の差異に強く
依存しているので例えば損傷された膜を有する細胞が区
別される。入射光線から約65°−115°の角度でおこな
われる光強度の測定は通常直交光散乱と呼ばれるが，こ
れらは粒子の大きさと構造化の程度についての情報を提
供する（Visser）。例えば発明者と共同作業者は最近，
人間の細胞障害リンパ球は調節リンパ球（regulatory l
ymphoctyte）やＢリンパ球とは異なる構造特性を持つと
思われることを細胞毒性細胞（cytotoxic cell）のより
大きな直交光散乱の強度に基づいて明らかにした（Ters
tappen）。もし照明光線の幅が粒子の直径より小さけれ
ば直交散乱角度における光のパルス形は細胞の長さと形
状についての情報を与える。 異なる角度で同時に行われる光散乱測定，あるいは吸
収または螢光の測定と組みあわされた光散乱測定が流動
細胞測定法において提案されている。前方および直交光
散乱の同時測定は上述の（Terstappen）細胞障害リンパ
球の調節リンパ球およびＢリンパ球からの識別（Tersta
ppen）並びにリンパ球の他の周辺の白血球細胞からの識
別（Hoffman）に用いることができる。光散乱と組み合
わされた光の吸収作用は流動細胞測定法において赤血球
と血小板との間の区別，ならびにリンパ球，単核細胞，
好塩基性顆粒細胞，好酸性顆粒細胞および好中性顆粒細
胞の間の区別をするために用いられる（Technicon Hema
logもしくはH1 systems）。しかしながらこの方法は細
胞の着色を要し，従ってかなり複雑であり細胞の分類後
に細胞をさらに研究に使用するのを妨げることになるで
あろう。 円偏光二色性（CD）および旋光分散（ORD）と組み合
わされた光散乱測定もまた，ウイルス性粒子または細胞
の懸濁液の中での粒子の識別に対し可能性を持ってい
る。ウイルス性粒子の中のDNAのCDおよびORDスペクトル
上のミー（等方性粒子）散乱の効果の研究（Gordon,197
2;Gordon,1974）は，散乱測定はウイルス性粒子や細胞
といったより大きな生物学的組織中のORDおよびCDの測
定を補正するために使用することができ，独特なORDお
よびCD特性にもとづいて粒子識別ができることを示唆し
ている。数多くの異なった粒子の識別のために右および
左に円偏光された光の散乱の差分（differential）が実
地に行われた（Salzman）。円強度差分散乱（circular
intersity differential scattering;CIDS）方式はCDに
似ており,CDが左および右に円偏光された光の吸収の差
分を利用しているのに対し，右および左に円偏光された
光のDNAのような螺旋状構造による散乱の差分を利用し
ている。 本発明の全般的な目的は，流動細胞測定システムによ
り区別できる粒子の型を拡げる光散乱方法を提供するこ
とである。 本発明のさらに特別な目的は，異なる粒子の型に特有
の偏光解消構造に基づいて粒子を区別するためのその様
な方法を提供することである。 一つの代表的な方法として，本発明のひとつの目的
は，異なる顆粒細胞の型を区別するための方法を提供す
ることである。 本発明のさらに他の目的は偏光解消を行う粒子の光散
乱の差分に基づく粒子の識別のための装置を提供するこ
とである。 （問題点を解決するための手段） 本発明の方法は，異なる粒子の型に特有の異なる偏光
解消構造特性に基づいて少なくとも２つの異なる粒子の
型を分析する方法であって，異なる粒子の型を含む粒子
の懸濁液を光学測定区域を通して導くこと，直線偏光さ
れた入射光線で該区域内の粒子を照明すること，該照明
によって，選択された角度における強度が粒子の偏光解
消構造に依存し，該強度が，（ａ）粒子の型のひとつに
特有であり（ｂ）懸濁液中の他の粒子の型の強度分布と
実質的に重複しない適当な識別空間における強度分布の
範囲内にある偏光解消された散乱光を各粒子から生じさ
せること，該選択された角度において核粒子からの該偏
光解消された散乱光を測定すること，および該識別空間
において測定された偏光解消された散乱光の強度に基づ
いて懸濁液中の異なる粒子の型を分析することを含むこ
とにより，上記目的が達成される。 本発明方法の他の実施態様では，前記照明がコヒーレ
ントな直線偏光された光線を用いて行われる。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記選択され
た角度が入射光線に対して直交している。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記識別空間
が，前記選択された角度において測定された前記照明さ
れた粒子からの偏光解消された散乱光の強度によって定
義される一次元空間である。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記識別空間
が，第１の次元においては前記選択された角度において
測定された前記照明された粒子からの偏光解消された散
乱光の強度によって定義され，第２の次元においては粒
子の型が異なれば平均の反応値が異なる第２の光測定に
対する粒子の反応によって定義される少なくとも二次元
の空間内にある。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記第２の次
元が選択された角度において測定された偏光散乱光の強
度によって定義される。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記偏光解消
された散乱光の強度が前記光線の方向に対して実質的に
直交する角度において測定され，好酸球と好中球とが区
別される。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記偏光散乱
光の強度もまた前記光線の方向に対して実質的に直交す
る角度において測定される。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記識別空間
が，第１の次元においては前記照明された粒子からの偏
光解消された散乱光の強度によって定義され，第２の次
元および第３の次元においては前記照明された粒子から
の前記入射光線に対して実質的に直交しおよび平行な方
向への偏光散乱光の強度によってそれぞれ定義される。 本発明方法のさらに他の実施態様では，異なる粒子が
波長に特有の異なる吸光率をもち，前記第２の次元が波
長に特有の吸光率に起因する前方方向における光の強度
によって定義される。 本発明方法のさらに他の実施態様では，粒子が異なる
螢光偏光性をもち，前記第２の次元が前方方向で測定さ
れる該粒子からの螢光偏光によって定義される。 本発明方法のさらに他の実施態様では，粒子が選択さ
れた螢光染料の存在下で異なる螢光分析上の性質をも
ち，前記第２の次元が選択された放出波長範囲において
測定される螢光放出の強度によって定義される。 本発明方法のさらに他の実施態様では，前記偏光解消
された散乱光が選択された角度に関し比較的大きな受け
入れ角度で測定され，前記第２の次元が比較的小さな受
け入れ角度で測定され，異なった固有の偏光解消性を有
する粒子が区別される。 本発明の装置は，異なる粒子の型に特有の異なる偏光
解消構造特性に基づいて少なくとも２つの異なる粒子の
型を分析するための方法であって，光学測定区域を定め
る手段，粒子の懸濁液を該区域を通して導くための手
段，該区域内の粒子を直線偏光された入射光線を用いて
照明し，それによって選択された角度における強度が粒
子の偏光解消構造に依存し，該強度が，（ａ）粒子の型
のひとつに特有であり（ｂ）懸濁液中の他の粒子の型の
強度分布と実質的に重複しない適当な識別空間における
強度分布の範囲内にある偏光解消された散乱光を各粒子
から生じさせるための光源，該選択された角度において
各粒子からの該偏光解消された散乱光を測定するための
検出器，および該識別空間において測定された偏光解消
された散乱光の強度に基づいて異なる粒子の型を分析す
るための分析器を備える。 本発明装置の他の実施態様では，前記識別空間が，第
１の次元においては前記選択された角度において測定さ
れた前記照明された粒子からの偏光解消された散乱光の
強度によって定義され，第２の次元においては粒子の型
が異なれば平均の反応値が異なる第２の光測定に対する
粒子の反応によって定義される少なくとも二次元の空間
内にあり，さらに該第２の光測定を行うための第２の検
出器を含む。 本発明装置のさらに他の実施態様では，前記第２の検
出器が，前記選択された角度と一致するような散乱角度
において偏光散乱光を測定するように適合させられてい
る。 本発明装置のさらに他の実施態様では，前記偏光解消
された散乱光を測定するための検出器が直交する散乱光
を受光するための位置にあり，好酸球と好中球との区別
に使用される。 本発明装置のさらに他の実施態様では，前記第２の検
出器もまた直交する散乱光を受光するための位置にあ
る。 本発明装置のさらに他の実施態様では，前記識別空間
が，第１の次元においては前記照明された粒子からの偏
光解消された散乱光の強度によって定義され，第２の次
元および第３の次元においては前記照明された粒子から
の前記入射光線に対して実質的に直交しおよび平行な方
向への偏光散乱光の強度によってそれぞれ定義され，さ
らに前方方向への偏光散乱光を測定するための第３の測
定手段を含む。 本発明の方法は粒子の型に特有の異なった偏光解消構
造に基づいて２つもしくはそれ以上の異なる粒子の型を
識別するために設計されている。この方法の実施におい
ては，異なった型の粒子を含んだ粒子の懸濁液が光学測
定区域を通って導かれ，その区域内の粒子は直線偏光さ
れた入射光線により照らされる。その区域を通過する個
々の照明された粒子は偏光解消された散乱光を生じ，選
択された散乱角度におけるその散乱光の強度は，その粒
子の偏光解消構造に依存する。選択された角度における
偏光解消された散乱光の強度は適当な識別空間内の強度
の分布範囲の中にあり，その分布範囲は，（ａ）粒子の
型の内の一つに特有であり，（ｂ）実質的には懸濁液中
の他の粒子の型の強度分布に重複しないものである。選
択された角度において測定された偏光解消された散乱光
の強度が，識別空間において評価されると，懸濁液中の
異なる粒子の型が識別されることになる。さらに一般的
に言えばこの方法では，異なる粒子の型の計数，識別，
物理的特性の定量および，または分類をすることを含ん
だ異なった粒子の型の分析が考慮されている。 粒子が偏光解消のみに基づいて分析できる（例えば区
別される）場合には，特徴空間は選択された角度におい
て照明された粒子から散乱される偏光解消された光の強
度により定義される一次元の空間となるであろう。より
一般的に言うと，粒子は偏光解消の強度並びに，少なく
とも一つの他の光学的もしくは電気的反応特性，例えば
全散乱光量，吸収，螢光,CD,またはORDといった，平均
の反応値が異なった粒子の型に対し相違している特性に
基づいて分析される。ここでは識別空間は，一つの次元
においては偏光解消された散乱の強度により定義され，
少なくとも一つの他の次元においては少なくとも一つの
他の粒子測定のパラメータにおける増大変化により定義
される増分要素であり，以下でさらに説明される。 一つの代表的な実施例において，この方法は顆粒細胞
の好酸性と好中球を分析する，そして特に区別するため
に用いられる。細胞の識別は，第１の次元においては偏
光解消された直交光散乱により定義され，そして第２の
次元においては全直交散乱光により定義される二次元特
徴空間においておこなわれる。 本発明はさらに，異なった粒子の型に特有の異なった
偏光解消構造に基づいて少なくとも２つの粒子の型を分
析するための装置を含んでいる。そのシステム中のフロ
ーセル（flow cell）内において，光学測定区域が定義
され，その中で懸濁液中の粒子が偏光光線によって照ら
される。粒子からの偏光解消された散乱光の強度は選択
された角度において検出装置により測定され，その測定
により，適当な特徴空間において，異なった偏光解消構
造に基づいて粒子の識別を行うことができる。本装置は
測定された細胞のパラメータの記録のためおよび適当な
識別空間における偏光解消された散乱の強度に基づく粒
子の分析のための分析装置を含んでいる。 本発明のこれらのそして他の目的と特徴は添付図面を
共に下記の実施例を読めば十分明らかになる。 （実施例） I.細胞測定装置 本発明による使用のために構成された細胞測定装置が
第１図において10で示される。その装置内の流動細胞測
定器12はＡ部で詳述されるように，サンプル粒子からの
偏光解消された光散乱を測定するために設計されてい
る。装置内の分析器14はＢ部に述べる様に，偏光解消さ
れた光散乱を含む一つもしくはそれ以上の光学的測定に
基づいてサンプル中の粒子を分析するために機能する。
この中で明らかにされる様に，本方法による粒子の分析
は粒子の計数，識別，（物理的パラメータの）定量およ
び，または分類を包含し得る。 A.流動細胞測定器 流動細胞測定器の基本的なハードウエアは，懸濁液サ
ンプル中の粒子がその中を選ばれていく流動室16,フロ
ーセルを通って動く粒子を照らすための光源18,ならび
に照明された細胞の光学的反応パラメータを測定するた
めの検出器20,22および24のような光検出器である。 光源18は流動室内の粒子を焦点をあわせられ直線偏光
された光線で照らすように設計されている。図中で26で
示される光線は従来のレーザ28により造られたコヒーレ
ントな光線である。488nmに調整された3Wのアルゴンイ
オンレーザ（Coherent Radiation,Palo,Alto）もしくは
5mWヘリウムネオンレーザ（Model 120S,Spectra Physic
s,San Jose,CA）が適している。レーザからの光線はレ
ンズ30によりフローセル内の細胞の流れの上に焦点をあ
わせられている。このレンズは上述のアルゴンレーザに
対しては焦点距離200mmおよび20mmの２つの円筒形のレ
ンズを含み，ヘリウムネオンレーザの場合には焦点距離
70mmの単一の球形レンズである。コヒーレントな（レー
ザ）光源が示されてはいるが，光源は代わりにレンズ30
によりその光線が焦点を合わせられる従来のアークラン
プ（非コヒーレントな）光源でもよい。 光線は,Melles Griot（Irvine,CA）から調達できるHN
7フィルタのような偏光フィルタ32を用いて直線偏光さ
れる。代わりに直線偏光されたアルゴンレーザの場合の
ように，レーザ28を直線偏光された光線を出力するよう
に設計することもできる。議論の目的で，偏光フィルタ
の方向づけはその電界ベクトルＥが図に示されているｘ
−ｙ−ｚ座標系においてｘ軸に平行である直線偏光を生
成するように仮定される。そこでは光線はｚ軸に沿って
導かれ，粒子はｘ軸に沿ってフローセルを通って移動す
る。すなわち偏光された電界ベクトルは粒子の流れの方
向と一直線になる。しかしながら光線はｘ−ｚ平面内で
典型的にはｘ軸に関して約10°から170°の角度の範囲
で導かれ，電界ベクトルはｘ−ｙ平面内で実質的にどの
方向にも偏光され得るということが注目される。 ここでは示されていないが，細胞測定器12は光散乱に
加えて光の吸収，螢光,CD,およびORDのような多種類の
光学的パラメータを測定するために非偏光光源や他の光
源を含んでもよいし，あるいは光散乱の測定のための第
２の方向で偏光された光を含んでもよい。 流動室16は250μm X 250μｍの四角形のフローチャン
ネル（flow channel）を有する石英製のフローセルのよ
うな従来形の密閉された光学的セル（cell）でよく,Hel
lma Gmbh and Co（Mullheim/Baden,W.Germany）から調
達できる。該流動室は液状懸濁液中の粒子が注入管（in
jection tube）34を経由して光散乱測定がおこなわれる
光学測定区域34の中へそして通って導かれるように配設
されている。 流動細胞測定器が細胞の分類に使用されるように意図
された場合には流動室は，測定区域のちょうど下流に懸
濁液の小滴の噴射を造る「ジェット−イン−エア（jet-
in-air）」形のセルであり得る。螢光活性化された細胞
の分類で使用されるような従来形のジェット−イン−エ
アセルであって市販で購入できる（Becton Dickinson,M
T.View,CA）ものが適している。代わりに，細胞の分類
は小滴形成のための小さな宝石でできた穴を持っている
フローチャンネルを用いておこなわれ得る。細胞測定器
は従来から行われているように，測定区域内で測定され
た粒子の光学パラメータに基づいて選択された粒子を採
集管の中にそらす働きをする細胞分類器38を追加として
含むことができる。さらに，小さな掩蔽用の障害物（図
示せず）を，流動体の円筒状の流れにより散乱されたレ
ーザ光を妨げるために直交光を検出する対物レンズの前
に置くことができる。典型的には障害物は入射光に関し
て約87°−93°の間の角度における光を妨げる。そのよ
うな掩蔽障害物により，全ての偏光解消に対する斜めの
偏光解消（cross depolarization）（以下で議論され
る）の相対的寄与が増加した。掩蔽用障害物を用いた流
動分類システムは以下述べるように，偏光解消の識別に
基づく細胞分類において連続して用いられている。 本発明の重要な特徴に従って，細胞測定器は測定区域
内の粒子によって散乱された偏光解消された光の強度を
検出するための少なくとも一つの光検出器を含んでい
る。ここで明らかなように，「偏光解消された散乱光」
とは，その電界ベクトルが入射光線の電界ベクトルに対
して垂直な平面において重要なベクトル成分を含む光で
ある。図示された構成では，入射光の電界ベクトルがｙ
−ｚ平面に対して垂直なｘ軸に沿って方向づけられるの
で，偏光解消された散乱光の電界ベクトルはｙ−ｚ平面
において重要な成分を含む。 図に示される本発明の実施例は，直交する偏光解消さ
れた光，すなわち入射光線の方向に関して，約65°と11
5°の間，なるべくなら約90°の角度において散乱され
た偏光解消された光，すなわち第１図においてｙ軸に沿
って散乱される光の測定のために設計されたものであ
る。図にみられるように，図において44で示される散乱
光線を平行にするための機能を有するレンズ42によっ
て，全ての直交する散乱光が集められる。Leitz H32,NA
O.6対物レンズのような従来の顕微鏡の対物レンズが適
している。 図に示された実施例はまた，偏光入射光の粒子散乱に
より生じる，偏光された電界ベクトルおよび偏光解消さ
れた電界ベクトルの双方を含む直交散乱光としてここで
定義される全直交散乱光を測定するために設計されてい
る。光学縦列（optical train）における従来型のビー
ムスプリッタ46が光線44を48および50で示される各々が
全直交散乱光から構成される２つの光線に分離する。光
線48は,x軸に沿って偏光された散乱光を濾過して取り除
き，従って偏光解消された散乱光，すなわち図において
ｚ方向にベクトル成分を持っている散乱光のみを通過さ
せる偏光子を通過する。ひとつの適当な偏光子はポラロ
イドフィルタHN7でMelles Griot（Irvine,CA）から調達
できる。 濾過された光線の強度は検出器20により測定される。
この検出器はできればHamamatsu（middlesex,NJ）から
市販で調達できるModel R928増倍型光電管のような増倍
型光電管がよい。増倍型光電管は以下でさらに検討され
るように，集光される光の円錐体の角度Δφが約３°−
13°の間に分布できるｙ軸に沿った円錐体からの光を集
光するように調節される。検出器により集光される光の
円錐体はレンズ42の前に置かれた絞り（図示しない）に
より調節できる。検出器により測定された電圧レンズ
は，その機能がＢ部で述べられてある分析器14に入力さ
れる。 全直交散乱光で構成される光線50の強度は，上述した
ようなできれば増倍型光電管である検出器22により測定
される。検出器22により測定される光の円錐体は上述の
ようにレンズ42の前に置かれた絞りにより調節できる。
検出器により記録された電圧レベルの信号は分析器14に
供給される。ホトダイオード検出器のような他の光検出
器は，直交散乱光線の強度が十分である場合には検出器
20,22の一つもしくは両方に対して使用できることが認
められるであろう。 図に示された細胞測定器はまた，全前方散乱光，すな
わち入射光の軸に対して約25°以内の，できれば入射光
の軸上に中心をおく円錐体内の角度において散乱された
光の強度を測定するように設計されている。前方散乱光
はレンズ54によって平行にされる。光線の強さは検出器
24によって測定されるが，その検出器はできればUnited
Detector Thechnology（Hawthorne,CA）から調達でき
るホトダイオードモデルPin 10-Dのようなホトダイオー
ドがよい。レンズ54の前に置かれた絞り（図示しない）
によって調節できる，集光される光の円錐体は典型的に
約２°−17°の間にある。検出器24の出力は分析器14に
与えられる。 偏光解消された散乱光を測定するのに必要とされる最
小の検出器のハードウエアは，検出器20のような単一の
光検出器および偏光解消された散乱光のみを通過させる
偏光フィルタであることが，ここでは注目される。さら
に，図示された細胞測定器は直交する偏光解消された散
乱光を測定するために設計されているが，もし調べられ
る異なった粒子の型の間の適切な強度識別が測定角度に
よって与えられるならば，検出器20は図におけるｘ−ｚ
平面により制限される半球上の任意の点に位置すること
ができることが理解される。例えば検出器は，約90°−
180°の間の角度（後方散乱光の偏光解消を測定するた
め）に，また図示された直交の位置に，あるいは検出器
24の位置（前方散乱光の偏光解消を測定するため）に置
かれ得る。 検出器22および24のような一つもしくはそれ以上の追
加の検出器は，以下のＢ部で考察されるような，偏光解
消された散乱光の異なった強度の分布に基づいて異なっ
た粒子の型の識別を行うために必要とされる追加の特徴
情報を提供する。上述した様に，図に示した本発明の実
施例において，検出器22および24はそれぞれ直交と前方
の方向における全散乱光についての情報を提供する。探
知器22,24に加えてのもしくはその代わりの他の光学的
検出器は，（ａ）第２の散乱角度における偏光解消され
た散乱光の強度，（ｂ）集光された光の円錐体の異なる
角度における偏光解消された散乱光もしくは全散乱光の
強度，（ｃ）光の吸収，（ｄ）螢光の放出並びに（ｅ）
ORDおよびCDのパラメータに関する光学的パラメータ情
報を提供することができる。細胞測定器はまた，クール
ター効果検出器のような非光学的細胞検出器を，流動室
内の粒子の抵抗特性もしくはキャパシタンス特性により
細胞容積を測定するために装備することもできる。 B.分析器 装置内の分析器は，粒子の型について懸濁液中の個々
の粒子を分析する目的で，一つもしくはそれ以上の検出
器からの信号応答情報を記録し処理するために機能す
る。本質的には，分析されるべき個々の粒子の型は一つ
もしくは複数の次元を有する特徴空間内の各々の次元に
おいてその型のとる値の範囲についてまず特徴づけられ
る。特徴空間における少なくとも一つの次元は，分析さ
れるべき粒子の型の各々によって生成される，選択され
た散乱角度における，偏光解消された散乱光の強度の値
の範囲である。 最も単純な場合，懸濁液中の異なる粒子は偏光解消さ
れた散乱の強度のみを基準として区別されることができ
る。この場合は第２図に図示されており，同図は，粒子
の懸濁液中の粒子ＡおよびＢに対し選択された角度にお
いて測定された偏光解消された光散乱の強度Idの範囲を
表わしている。２つの粒子の異なる偏光解消の強度は２
つの粒子の中の異なった偏光解消構造に関係しており，
以下で考察されるように，粒子からの異なる程度の異方
性散乱を生じさせる。 図に見られるように，個々の粒子はId軸にそって強度
の分布範囲を持ち，その分布範囲は個々の粒子の型に特
有のものであり実質的には他の粒子の型の強度分布とは
重複しない。 多くの場合，粒子の分析は，多パラメータ特徴空間に
おける細胞の分布を分離した重複しない領域へ分離する
ために，一つもしくはそれ以上の追加の光学的または非
光学的な反応の測定を必要とする。二次元の特徴空間
（２−パラメータ密度図）に基づいた粒子識別の例が第
３図に図示されている。ここでは異なるＡおよびＢの型
の粒子の偏光解消の強度の分布は図示されている様にId
軸上で多少重複しているので，粒子はこのパラメータの
みに基づいては一つあるいは他の分布範囲の中へ明確に
写像され得ない。この重複は，第１の次元においては偏
光解消された散乱の強度（Id）により定義され，第２の
次元においては全散乱の強度（It）によって定義される
領域の中へ粒子が写像される時に「解決」され,2つの別
箇で重複しない領域へと帰着する。全散乱の強さだけを
基準としたのでは粒子はあいまいさなしに区別され得な
い。なぜならばこのパラメータは２つの粒子の型の間に
かなりの重複を与えるからである。 さらに一般的には，二次元の特徴空間は，全散乱の強
度における増加によって定義される要素56のようなId軸
に平行な一連の領域要素を定義する。この中で識別空間
とも呼ばれる個々のその様な要素内では,2つの粒子はそ
れらの異なった偏光解消散乱の強度に基づいて区別され
得る。すなわち，個々の要素すなわち識別空間内で，懸
濁液中の粒子は，粒子の型の１つに特有であり懸濁液中
の他の粒子の型の分布に重複しない偏光解消された散乱
の強度を生じる。 適切な特徴空間を定義するのに用いられる第２のパラ
メータは,2つもしくはそれ以上の粒子の型の写像を特徴
空間の別箇の重複しない領域へ分離するものでなければ
ならないということが認められる。本例では，同じ角度
の全光散乱は効果的な第２のパラメータである。なぜな
ら個々の粒子の型について，より高い偏光解消された散
乱の強度を持つ粒子はより高い全散乱光の強さを示す傾
向にあるからである。しかしながら，他の粒子に対して
は，強度Idの分布の重複を同じ角度における全散乱以外
の光学的もしくは非光学的パラメータを用いて「解決」
することが望ましいかまたは必要である。 この粒子識別方法の三次元への拡張が第４図に図示さ
れている。ここでは，異なるＡおよびＢの粒子は，第１
の次元において粒子の偏光解消された散乱の強度（Id）
により，第２の次元において全光散乱（It）により，そ
して第３の次元において光の吸収（Ao）により定義され
た２つの別箇の体積領域の１つの中への写像によって特
徴づけられる。第３図で示された二次元の場合に類似し
て，三次元の特徴空間は，要素58のような全散乱の強度
と吸収とにおける増加により定義されるId軸に平行な一
連の体積要素を定義する。個々のそのような要素（識別
空間）の中で２つの粒子はそれらの異なった偏光解消さ
れた散乱の強度を基準として区別され得る。すなわち個
々の要素の中で，懸濁液中の粒子は，粒子の型の１つに
特有であり，他の粒子の分布とは重複しない偏光解消さ
れた散乱の強度を生じる。 第５図は，この粒子ＡおよびＢを第４図に図示されて
いるId/It/Ao特徴空間におけるそれらの分布に基づいて
分析するために分析器14により実行されるアルゴリズム
の流れ図である。３つのパラメータの分布範囲は前もっ
て個々の粒子に対し確定しており，この情報は分析器の
中の記憶装置の内部に識別空間要素の配列の形で格納さ
れると仮定する。それぞれの要素は増分領域ΔIt×ΔAo
およびその要素内の異なった粒子の型に特有の偏光解消
された散乱光の該増分領域に関連した強度分布によって
定義される。 個々の粒子が流動室内の一つもしくはそれ以上の測定
区域を通過するとき，その光学的散乱および，または吸
収の特徴が細胞測定器内の対応する光学的もしくは非光
学的検出器により測定され，それらの検出器は反応デー
タを電圧信号の形で分析器に供給する。分析器は入力電
圧信号をId,It,およびAoのディジタル値に変換するアナ
ログディジタル変換器（ADC）（図示しない）を含んで
いる。It値およびAo値は順序対を形成し，そしてその順
序対は識別空間体積要素の一つのΔIt×ΔAo領域内に存
在するものとして，その体積要素と同一視される。ひと
度対応する体積要素がつきとめられると，測定されたId
値はその体積要素内の粒子Ａに対するId値の分布と比較
される。もし測定された値が粒子ＡのIdの範囲内にあれ
ば粒子は粒子Ａとして分類され，そしてこの情報は,Aお
よびＢの粒子を分離する目的のために記録されおよび，
または細胞測定器内の細胞分類器に供給される。さら
に，定量されたデータは特徴空間内の細胞の密度を表示
するために第４図の様に三軸グラフ上にプロット（plot
t）されそして細胞数が計算されることもある。 もし粒子のId値が，関連する識別空間における粒子Ａ
の範囲内になく粒子Ｂの範囲内にある場合には，粒子は
その様に分類され，この情報は同様に格納され分類器に
供給されおよび，または表示される。同様に粒子はＡで
もなければＢでもないと分類されそしてその様に分析さ
れることもあり得る（それは粒子の型の格納もしくはプ
ロットおよび，または粒子の計数もしくは分類を包含す
る）。粒子の分析後，分析器は測定区域内に見られる次
の粒子からのパラメータデータの処理のための状態に戻
る。三次元以外の次元数をもつ特徴空間における動作の
ためにアルゴリズムがどのように修正されるかは分るで
あろう。 分析器は前述のADC,データ格納のための記憶装置なら
びに測定され入力されたIt値およびAo値に基づいて適切
な識別空間体積要素をつきとめるための，そしてつきと
められた体積要素内のId値に基づいて粒子の型を分類す
るためのマイクロプロセッサを包含している。マイクロ
プロセッサは従来型の設計でよく，そして従来のプログ
ラム作業により上述のデータ格納と分類を実行するため
にプログラムされる。 II.作用 偏光解消された光の散乱は粒子の識別（Ａ部）および
代表的な細胞識別方法と成果（Ｂ部）のために本発明で
利用されるが，本節では偏光解消された光散乱の理論を
述べる。 A.理論的考察 第６図は直交光散乱に対する第１図に示された光学的
配置を説明している。入って来るレーザ光線はｚ軸に沿
って伝搬しそしてｘ軸に沿う入射電界Ｅでもって直線偏
光されている。我々の座標系の原点０において，レーザ
光線はｘ軸に沿って移動している流動細胞測定器内の粒
子を横切る。散乱光の方向は球座標r,θおよびφにより
記述される。θおよびφ方向に偏光された散乱光の振幅
はそこで以下の式のように記述される（van de Huls
t）： Ｅφ＝（S4cosφ−S1sinφ）fE0 （１） Ｅθ＝（S2cosφ−S3sinφ）fE0 （２） ここで,fは球面波の複素表示で，散乱体と検出器との
間の距離であるｒに反比例する。S1,S2,S3およびS4は，
φ，θおよび散乱体の幾何形状と物理的構成に依存する
いわゆる振幅関数（van de Hulst）である。測定可能な
光の散乱強度ＩφとＩθはこれらの電界に関連し，以下
のように表される： Ｉφ＝|Eφ｜２ （３） Ｉθ＝|Eθ｜２ （４） ｘ軸方向に偏光された電界もしくはｚ軸方向に偏光さ
れた電界のみを伝導する理想的な偏光子を用いて測定さ
れた光の強度はそれぞれIl（平行について）およびIr
（垂直について）と呼ばれる。Irは偏光解消光散乱強度
と呼ばれ，偏光解消率（depolarizationratio）はここ
で次の様に定義される： yz平面に散乱された光，すなわち入射光の偏光方向に
関して直交している光に対しては，φ＝90°であるの
で,IlとIrは次の式で表される： Il＝｜S1fE0｜ Ir＝｜S3fE0｜ （６） このようにIlはS1により決定されるのに対し，この配
置での偏光解消された光散乱の強度の測定は項S3につい
ての情報を生ずる。この項の重要性が手短かに説明され
る。 均質な球面，球殻などに対して項S2は零であり（van
de Hulst），S3は光学的異方性（形状および，または構
成のために）をもつ粒子および多数の散乱が重要となる
ような構造を含む粒子に対し重要になる。簡単だが著し
い後者の零が第７図に図示されている。ここでは照明さ
れている粒子（細胞）はｘ軸上に位置する２つの細胞内
部の球体を含んでいる。ｚ軸に沿って進行する特別な入
射光線は最初の球体によってｘ軸に沿って反射され,2番
目の球体によってｙ軸に沿って反射される。反射の法則
を適用すると，この光線の偏光の方向はｘ軸に沿う方向
からｚ軸に沿う方向へ変わることが見いだされる。この
ように，多数の反射がいかに偏光解消につながり，従っ
て，項S3に対する寄与につながるかがわかる。同様に，
回折および屈折による多数の散乱もまた偏光解消につな
がることが示される。微粒子内部で多数の散乱をおこす
ことができる多数の顆粒もしくは他の個々の粒子からな
る物質，および非球形状のような他の粒子組織で異方性
の光散乱を起こすことのできるものはここでは集合的に
偏光解消組織と呼ばれる。上述した振幅の方程式の取り
扱いは，Δφが０°もしくは90°（それぞれ前方もしく
は直交散乱）の場合にはより簡単であるにもかかわら
ず，細胞内の粒子の偏光解消組織は実質的に全ての散乱
角度において偏光解消散乱光を生ずることが第７図から
認められる。例えば第７図に示される細胞において，第
３の細胞内粒子はｙ軸に沿って進行する偏光解消された
光を前方もしくは後方の散乱方向にさらに反射すること
ができるであろう。 典型的には，偏光解消散乱光に対する最適の測定角度
は，一次元（Id）の特徴の場（field）において粒子の
間の最良の識別を与える角度である。これは今度は異な
る粒子の型の相対的な振幅関数に依存する。これらの中
で最も重要なのは直交散乱角度を支配するS3および前方
散乱角度を支配するS4である。これらの２つの項の相対
的寄与は前方および直交の角度における異なった粒子の
偏光解消光散乱の測定によりたやすく評価できる。 異なった偏光解消組織に基づく粒子の間の識別は，光
検出器によって光の強度が測定される円錐体の角度Δφ
を減らすことによりさらに高められる。上述のように増
倍型光電管のような光学検出器は選択された測定角度に
おける軸を囲む円錐体からの光を集める。直交の偏光解
消光散乱の場合には，これは偏光解消効果はS3（90°で
の唯一の項）のみによって起こされるのではなく，S1,S
2，およびS4の他の振幅関数によっても起こされる。こ
の余分な偏光解消は測定システムの幾何形状によるもの
で，相互的偏光解消（cross depolarization）と呼ばれ
る。それは蛍光偏光実験の説明をする時に用いられる
「開口偏光（aperture polarization）」という専門用
語に密接に関係している。 相互的偏光解消の90°において測定された偏光解消効
果に対する寄与は，円錐体の角度φに対する偏光解消率
の依存を分析することにより決定することができる。こ
れは集光レンズ（第１図におけるレンズ42）の前に長四
辺形の絞りを置き集光される光の角度をφ＝90±Δθの
間に制限することによりおこなわれる。発明を補助する
ために行われた１つの研究において，受け入れ角度の関
数としての異なる細胞および粒子の型について測定され
た偏光解消の強度が調べられた。第８図を参照し，調べ
られた粒子は：好中球（黒い円），好酸球（十文字），
単核細胞（白抜き四角形），リンパ球（白抜き円），お
よび平均約1.16μｍの直径を持つポリスチレンの小球体
（白抜き三角形）である。直交の偏光解消光散乱の強度
は円錐体の角度Δφ＝2.5°および14.5°で測定され
た。結果は表１に示されている。 表１ Δφ＝2.5° Δφ＝14.5° 好酸性顆粒細胞 4.7 4.4 好中性顆粒細胞 1.3 1.3 単核細胞 0.5 0.7 リンパ球 0.5 0.8 小球体 0.62 3.9 上に見られるように，相互的偏光（cross polarizati
on）効果は，受け入れ角度に対する偏光解消の依存状態
により決定されるが，内部の顆粒組織が豊富な細胞（好
酸性および好酸性顆粒細胞）では大部分はなく，恐らく
光を等方的（S3＝S4＝０）に散布している球状粒子（小
球体）では非常に著しく（微小球），明白な内部顆粒組
織を持たない単核細胞やリンパ球では中間である。 円錐体の角度に対する偏光解消散乱の強度の依存はま
た円錐体の中間的な角度においても調べられ，その結果
は第８図にみられる。図における曲線は全て14.5°で共
通の値を持つように正規化されている。図中の点線は理
想的な球に対しては計算された，受け入れ角に対する理
論的な二次の依存である。結果は上述した高度に偏光を
行う（例えば顆粒）組織は相互的偏光効果をほとんど示
さない一方，中位の偏光解消組織をもつものは相互的偏
光効果を受けやすいという一般的な結論を支持してい
る。結果は高度に偏光解消を行う粒子と中位のそれとの
間の強度分布の相違は，低い円錐体の角度において直交
の強度の測定を行うことにより増大させられることを示
している。 もし懸濁液中の異なる粒子が直交および前方の両方の
光散乱角および低い円錐体の角度において重複する偏光
解消の強度分布範囲を持つことがわかったならば，粒子
の識別のためには一つもしくはそれ以上の追加の粒子の
パラメータが必要とされる。最も簡単なパラメータは光
散乱の測定である，なせならこれらは追加の光源およ
び，またはフローセルの改造を必要としないからであ
る。光散乱測定の一つの一般的な様式は第２の角度にお
ける偏光解消光散乱である。例えばもし区別されるべき
粒子が異なるS3およびS4の値を持ち，その結果直交と前
方の偏光解消された散乱の測定の組み合わせが別個の粒
子領域を与えるのであればこの方法は有益である。散乱
測定の第２の様式は，偏光解消された散乱光として同じ
かもしくは異なる角度で測定された全散乱光である。以
下で説明されるように，この方法により顆粒細胞の異な
る型の特徴空間領域のよい分離が得られる。最後に，偏
光解消された散乱光は異なった円錐体の角度で集光され
得る。 B.応用 上述のことから，本方法は区別されるべき粒子が異な
った偏光解消構造を持っているかいかなる流動細胞測定
器の応用に対しても適用可能であることが認められるで
あろう。一つの重要な適用は血液細胞サンプル中の異な
った血液細胞の区別または細胞の分別にある。区別され
るべき細胞の型は他の細胞の型からの顆粒細胞，顆粒細
胞の異なった型，単核細胞からのリンパ球，そして特定
の白血球のサブクラスを包含することができる。 強度の偏光解消を行う細胞の場合における細胞識別の
一例として，顆粒球性の好酸球と好中球とを識別するた
めにこの方法が用いられた。人間の血液は静脈穿刺によ
り健康な固体から得られた。ヘパリンが凝固防止に使用
された。（150USP Uナトリウムヘパリン（sodium hepar
in）/10ml Venoject Terumo Europe NV）。精製された
顆粒細胞は発表された方法に従って比重分離により得ら
れた（Terstappen 1985）。細胞の懸濁液は0.005％の窒
化ナトリウムと１％のウシ血清アルブミン（BSA）を含
有している緩衝生理食塩水（PBS）中で１×106/mlの濃
度に調節された。測定は細胞の生活能力を維持するため
に同日におこなわれた。 流動細胞測定の実験が上述の流動細胞測定器で行わ
れ，この場合レーザ照明光線は488nmにセットされ，散
乱は250μｍ×250μｍの四角形のフローチャンネルの中
で生じた。直交の偏光解消散乱と全光散乱との強さが第
１図に示された光線を分割する構成を用いて測定され
た。結果は２つのパラメータによる密度図として表示さ
れるが，第９図Ａに示されている。図にみられるように
この方法によって２つの細胞の型は第３図で説明したよ
うに別個のそして重複しない特徴領域に写像される。 偏光解消された直交の光散乱の強度は高くないので，
測定された偏光解消光は弾性光散乱によるものであり，
自動蛍光（autofluorescence）によって生ずるものでは
ないという可能性が調べられた。これは500nmの短波通
過フィルタを検出のための光学部品に挿入することで行
われたが，それは結果に影響をおよぼさなった。さら
に，使用されたアルゴンイオンレーザの照明波長が488n
mから509nmと514nmとに変えられ，また633nmのヘリウム
ネオンレーザが用いられた。全ての場合において，得ら
れた結果は同じであった。 本方法が顆粒細胞の２つの集団を分離するための細胞
の分類作業にも適用された。ここでは流動細胞測定器に
在来の分類器がとりつけられ，分析器は急速細胞識別法
（rapid cell discrimination）に基づいて分類器に信
号を送るように設計された。分類された顆粒細胞の下部
集団はメイ−グリュンバルト染色の後で光学顕微鏡法に
より調べられた。直交の光散乱の比較的に高い偏光解消
を有する細胞は好酸性顆粒細胞（99％の純度）と確認さ
れ，しかるに他方の集団は好中性顆粒細胞（99％の純
度）からなりたっていた。 中位に偏光解消を行う細胞の場合における細胞識別の
例として，本方法がリンパ球と単核細胞とを識別するた
めに用いられた。ヘパリンを添加された血液は前述の通
りに得られた。人間の白血球標本は190mlの溶解緩衝剤
（lysing buffer）（8.29g/lのNH4Cl,0.0037g/lのNa2ED
TA,1.00g/lのKHCO3）を10mlの全血液に加え,4℃で20分
間培養（incubate）することにより得られた。溶血（ly
sed blood）の懸濁液はPBS中で３回洗われた。細胞の懸
濁液は0.005％のアジ化ナトリウム（sodium azide）と
１％のウシ血清アルブミン（BSA）を含有しているPBS中
で１×106/mlの濃度に調節された。偏光解消された散乱
光および全散乱光が上述のように測定された。結果は２
つのパラメータの密度図として表示されるが，第９図Ｂ
に示されている。図にみられるように，本方法により２
つの細胞の型は別個の重複しない特徴領域に写像され
る。密度図はまた，比較的大きな偏光解消性を有するリ
ンパ球の小さな下部集団の存在を示している。 人間の赤血球もまた同じ方法により調べられ，その結
果は第９図Ｃに示される。細胞は偏光解消構造特性に基
づく不均質さをほとんどもしくは全く示さない。 本発明の方法によれば，いろいろな他の細胞の型や非
細胞粒子もまた区別されおよび／または分類されること
ができるであろう。これらは高度な異方性を有する構造
をもつ精子細胞や，異方性の形状に基づくバクテリアお
よび尿酸結晶のように不規則な結晶形状に基づく結晶性
の粒子を含んでいる。これらの粒子の型の各々に対し
て，偏光解消の測定の最適な条件が上述したように定め
られ，もし必要ならば追加の光学的および，または非光
学的なパラメータを粒子のさまざまな光学的および／ま
たは非光学的反応特性に対する粒子の型の既知のふるま
いに従って選択することができる。 上述のことから，いかに本発明の多様な目的や特徴が
合っているかが認識される。この方法は粒子の異なる偏
光解消構造特性に基づいて互いに区別されおよび，また
は分類される粒子の種類を拡大する。多くの場合，偏光
解消された直交の光散乱は現存する流動細胞測定器に対
し非常に費用削減効果のあるパラメータをつけ加えるこ
とになり，この簡単な追加により他の方法ではもたらさ
れない有益な情報が得られる。 一つの例として好酸性顆粒細胞を好中性顆粒細胞から
区別する能力は実用的にもまた理論的にも重要である。
今や低出力のレーザを備えた簡単な流動細胞測定器を構
成することが可能であり，それは白血球の弁別を染色さ
れていない細胞を用いて行うことができる。今迄は追加
のこみいったそして不安定な染色手続きを適用されなけ
ればならず，あるいは弱い自動蛍光が高価なアルゴンイ
オンレーザにより測定されなければならなかった（Wei
l）。 本発明は特定の実施例および応用に関して説明された
が，本発明の教えに基づく様々な他の実施例や応用が可
能であることが認められるであろう。 本発明をさらに要約すれば，異なる粒子の型に関連す
る異なる偏光解消構造に基づき粒子の分析を行うための
方式と装置である。流動細胞測定器内の細胞は直線偏光
された光により照明され，偏光解消された散乱光をつく
りだし，選択された測定角度における，そして適切な識
別空間におけるその強度の範囲は異なった粒子の型の分
析に用いられる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の流動細胞測定光散乱装置の一実施例の
説明図，第２図は偏光解消された光散乱強度により定義
された一次元の特徴空間と２つの異なった粒子の重複し
ない強度分布を示す図，第３図は垂直軸に沿って２つの
異なった粒子について測定された偏光解消の強度を示
し，水平軸に沿って全散乱光の強さを示している二次元
の特徴空間の説明図，第４図は第１の次元において偏光
解消された散乱光により，第２の次元において全散乱光
により，そして第３の次元において吸収光により定義さ
れた三次元の特徴空間の説明図，第５図は本発明による
粒子の型の分析に用いられるアルゴリズムの流れ図，第
６図は散乱光の伝搬が極座標r,θおよびφによって記述
される図中の原点Ｏにおける単一の点からの直交散乱光
の説明図，第７図は入射光線が細胞内部の二つの粒子に
より反射された時に軸方向に完全に偏光された散乱光が
生じ，負のｙ軸に沿って伝搬していくことを示す図，第
８図は好中球（●），好酸球（×），リンパ球（○），
単核細胞（□）および1.16μの直径を持つ小球体（△）
に対する受け入れ角Δφの関数として測定されるＤ＝
（Ir/（Ir＋Il））であり，破線は理想的な球体に対す
る理論的な曲線を表している，偏光解消率Ｄ（Δφ）/D
（15°）をプロットした図，第９図Ａから第９図Ｃは人
間の異なった血液細胞の偏光解消された直交光散乱に対
する全直交光散乱を表す流動細胞測定の密度図である。 10……細胞測定装置,12……流動細胞測定器,14……分析
器,16……流動室,18……光源,20,22,24……検出器,32…
…偏光フィルタ。
説明図，第２図は偏光解消された光散乱強度により定義
された一次元の特徴空間と２つの異なった粒子の重複し
ない強度分布を示す図，第３図は垂直軸に沿って２つの
異なった粒子について測定された偏光解消の強度を示
し，水平軸に沿って全散乱光の強さを示している二次元
の特徴空間の説明図，第４図は第１の次元において偏光
解消された散乱光により，第２の次元において全散乱光
により，そして第３の次元において吸収光により定義さ
れた三次元の特徴空間の説明図，第５図は本発明による
粒子の型の分析に用いられるアルゴリズムの流れ図，第
６図は散乱光の伝搬が極座標r,θおよびφによって記述
される図中の原点Ｏにおける単一の点からの直交散乱光
の説明図，第７図は入射光線が細胞内部の二つの粒子に
より反射された時に軸方向に完全に偏光された散乱光が
生じ，負のｙ軸に沿って伝搬していくことを示す図，第
８図は好中球（●），好酸球（×），リンパ球（○），
単核細胞（□）および1.16μの直径を持つ小球体（△）
に対する受け入れ角Δφの関数として測定されるＤ＝
（Ir/（Ir＋Il））であり，破線は理想的な球体に対す
る理論的な曲線を表している，偏光解消率Ｄ（Δφ）/D
（15°）をプロットした図，第９図Ａから第９図Ｃは人
間の異なった血液細胞の偏光解消された直交光散乱に対
する全直交光散乱を表す流動細胞測定の密度図である。 10……細胞測定装置,12……流動細胞測定器,14……分析
器,16……流動室,18……光源,20,22,24……検出器,32…
…偏光フィルタ。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 レオナルダス ダブリュ．エム．エム.
テルスタッペン
オランダ国 7511 ケーエイチ アンシ
ュデ，ウィレム アレキサンダーストラ
ート 16
(56)参考文献 特開 昭50−159788（ＪＰ，Ａ)
特開 昭53−86298（ＪＰ，Ａ)
特開 昭56−16872（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．異なる血液細胞の型に特有の異なる偏光解消構造特
性に基づいて、血液細胞を含む試料から少なくとも２つ
の異なる血液細胞の型を分析する方法であって、 異なる血液細胞の型を含む懸濁液を光学測定区域を通し
て導くこと、 直線偏光された入射光線で該光学測定区域内の血液細胞
を照明すること、 該照明によって、入射光線の方向に対してほぼ直交して
いる角度における強度が細胞の偏光解消構造に依存し、
該強度が、（ａ）細胞の型のひとつに特有であり（ｂ）
懸濁液中の他の細胞の型の強度分布と実質的に重複しな
い適当な識別空間における強度分布の範囲内にある偏光
解消された散乱光を各細胞から生じさせること、 該入射光線の方向に対してほぼ直交している角度におい
て各細胞からの該偏光解消された散乱光を測定するこ
と、および 該識別空間において測定された偏光解消された散乱光の
強度に基づいて懸濁液中の異なる細胞の型を分析するこ
とを含み、 該懸濁液に含まれる該異なる細胞が、染色されている細
胞または染色されていない細胞である、方法。 ２．前記照明がコヒーレントな直線偏光された光線を用
いて行われる特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．前記識別空間が、第１の次元においては前記選択さ
れた角度において測定された前記照明された細胞からの
偏光解消された散乱光の強度によって定義され、第２の
次元においては細胞の型が異なれば平均の反応値が異な
る第２の光測定に対する細胞の反応によって定義される
少なくとも二次元の空間内にある特許請求の範囲第１項
に記載の方法。 ４．前記第２の次元が選択された角度において測定され
た偏光散乱光の強度によって定義される特許請求の範囲
第３項に記載の方法。 ５．前記偏光解消された散乱光の強度が前記光線の方向
に対して実質的に直交する角度において測定される、好
酸球と好中球とを区別するための特許請求の範囲第４項
に記載の方法。 ６．前記偏光散乱光の強度もまた前記光線の方向に対し
て実質的に直交する角度において測定される特許請求の
範囲第５項に記載の方法。 ７．前記識別空間が、第１の次元においては前記選択さ
れた角度において測定された前記照明された細胞からの
偏光解消された散乱光の強度によって定義され、第２の
次元および第３の次元においては前記照明された細胞か
らの前記入射光線に対して実質的に直交しおよび平行な
方向への偏光散乱光の強度によってそれぞれ定義される
特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ８．異なる血液細胞が波長に特有の異なる吸光率をも
ち、前記第２の次元が波長に特有の吸光率に起因する前
方方向における光の強度によって定義される特許請求の
範囲第３項に記載の方法。 ９．血液細胞が異なる蛍光偏光性をもち、前記第２の次
元が前方方向で測定される該血液細胞からの蛍光偏光に
よって定義される特許請求の範囲第３項に記載の方法。 １０．血液細胞が選択された蛍光染料の存在下で異なる
蛍光分析上の性質をもち、前記第２の次元が選択された
放出波長範囲において測定される蛍光放出の強度によっ
て定義される特許請求の範囲第３項に記載の方法。 １１．前記偏光解消された散乱光が選択された角度に関
し比較的大きな受け入れ角度で測定され、前記第２の次
元が比較的小さな受け入れ角度で測定される、異なった
固有の偏光解消性を有する血液細胞を区別するための特
許請求の範囲第３項に記載の方法。 １２．異なる血液細胞の型に特有の異なる偏光解消構造
特性に基づいて少なくとも２つの異なる血液細胞の型を
分析する方法であって、 光学測定区域を定める手段、 血液細胞の懸濁液を該区域を通して導くための手段、 該区域内の血液細胞を直線偏光された入射光線を用いて
照明し、それによって、入射光線の方向に対してほぼ直
交している角度における強度が細胞の偏光解消構造に依
存し、該強度が、（ａ）血液細胞の型のひとつに特有で
あり（ｂ）懸濁液中の他の血液細胞の型の強度分布と実
質的に重複しない適当な識別空間における強度分布の範
囲内にある偏光解消された散乱光を各血液細胞から生じ
させるための光源、 該入射光線の方向に対してほぼ直交している角度におい
て各血液細胞からの該偏光解消された散乱光を測定する
ための検出器、および 該識別空間において測定された偏光解消された散乱光の
強度に基づいて異なる血液細胞の型を分析するための分
析器を備える、装置。 １３．前記識別空間が、第１の次元においては前記選択
された角度において測定された前記照明された細胞から
の偏光解消された散乱光の強度によって定義され、第２
の次元においては細胞の型が異なれば平均の反応値が異
なる第２の光測定に対する細胞の反応によって定義され
る少なくとも二次元の空間内にあり、さらに該第２の光
測定を行うための第２の検出器を含む特許請求の範囲第
12項に記載の装置。 １４．前記第２の検出器が、前記選択された角度と一致
するような散乱角度において偏光散乱光を測定するよう
に適合させられた特許請求の範囲第13項に記載の装置。 １５．前記偏光解消された散乱光を測定するための検出
器が直交する散乱光を受光するための位置にある、好酸
球と好中球との区別に使用される特許請求の範囲第14項
に記載の装置。 １６．前記前記第２の検出器もまた直交する散乱光を受
光するための位置にある特許請求の範囲第15項に記載の
装置。 １７．前記識別空間が、第１の次元においては前記選択
された角度において測定された前記照明された粒子から
の偏光解消された散乱光の強度によって定義され、第２
の次元および第３の次元においては前記照明された粒子
からの前記入射光線に対して実質的に直交しおよび平行
な方向への偏光散乱光の強度によってそれぞれ定義さ
れ、さらに前方方向への偏光散乱光を測定するための第
３の測定手段を含む特許請求の範囲第16項に記載の装
置。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8601000 | 1986-04-21 | ||
| NL8601000A NL8601000A (nl) | 1986-04-21 | 1986-04-21 | Het gebruik van gepolariseerd licht in stromingscytometrie. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63113345A JPS63113345A (ja) | 1988-05-18 |
| JP2772370B2 true JP2772370B2 (ja) | 1998-07-02 |
Family
ID=19847902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62096091A Expired - Lifetime JP2772370B2 (ja) | 1986-04-21 | 1987-04-17 | 粒子の型の分析方法と装置 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5017497A (ja) |
| JP (1) | JP2772370B2 (ja) |
| DE (1) | DE3712862C2 (ja) |
| NL (1) | NL8601000A (ja) |
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