CN101084429A - 用于增加由荧光团发射的荧光的系统、照明子系统和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于增加由荧光团发射的荧光的系统、照明子系统和方法。被配置成测量粒子的荧光的一种系统包括被配置成用具有在非垂直方向上定向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振的光来照明粒子的照明子系统。光的偏振导致由荧光团发射的荧光比在用在主要为垂直的方向上定向的线偏振光或非偏振光照明时由荧光团发射的荧光更明亮。该系统还包括被配置成响应于由荧光团发射的荧光来生成输出信号的检测子系统。

Description

用于增加由荧光团发射的荧光的系统、照明子系统和方法
发明背景
1.发明领域
本发明一般涉及用于增加由荧光团发射的荧光的系统、照明子系统和方法。某些实施例涉及改变用于照明附着了荧光团或其中包含荧光团的粒子的光的偏振从而增加由荧光团发射的荧光。
2.相关技术的描述
以下描述和示例由于它们包含在本节中而不认为是现有技术。
光学系统已经并将越来越多地用于获得对诸如生物试样之类的多个不同试样的测量。一种在生物化验领域变得越来越重要的特定的基于光学的系统是流式细胞器，它允许科学家在相对短的时间内检查相对大量分析物的试样。和所有的光学系统一样，流式细胞器的测量的精确度很大一部分取决于可利用该流式细胞器获得的信噪比(SNR)。具体地，随着信噪比的增加，测量精确度增加。
因此，类似于所有的光学系统，考虑到SNR要求开发了流式细胞器的光学设计和配置。例如，可增加SNR的一种方式是增加用于照明被测量的粒子的光源的亮度。具体地，随着可用于测量的光量增加，测量的SNR一般将增加。如此，诸如激光器之类的高亮度光源通常用于流式细胞器。增加流式细胞器的SNR的其它方式可包括包含在流式细胞器中的聚焦光学器件、聚集光学器件(用于聚集从试样散射或发射的光)以及检测器的选择和配置。尽管自从首次提出流式细胞器以来已经对流式细胞器的SNR进行了改进，但寻求最大可能的SNR是仍在进行的任务。
目前，为了散射和荧光测量的目的，使用线偏振光来照明流式细胞器中的流动细胞。例如，de Grooth等人的美国专利第5,017,497号中描述了利用在与光束轴垂直的平面中呈一垂直角度的线偏振光，该专利的内容通过引用结合于此，如同在本文中完全陈述一样。然而，de Grooth等人没有提供“线偏振”光的偏振比的限定。此外，为了荧光测量的目的改变照明光的偏振状态(诸如改变为椭圆)以前也没有进行。
还探索过优化诸如荧光染色珠和荧光染色剂之类的流式细胞器中测量的试样，作为用于增加流式细胞器测量的SNR的手段。然而，可用于流式细胞器测量的材料通常在某种程度上是有限的。例如，材料必须与将检查的试样相容。换言之，较佳的是，珠和荧光染料的材料不改变被测试样，反之亦然。此外，材料较佳地与流式细胞器的设计相容。例如，较佳的是，荧光染料在流式细胞器的至少一个光源的波长处被激发。此外，珠的材料较佳地不被由流式细胞器用于将其曝光的光的波长改变。至少出于这些原因，通过改变流式细胞器的光学设计和配置而非改变试样中所使用的材料来试图增加流式细胞器测量的SNR更有吸引力且复杂性更小。
因此，有利的是开发通过改变流式细胞器或其它基于荧光的成像和/或测量系统的一个或多个参数来增加由荧光团发射的荧光的系统、照明子系统和方法。
发明概述
以下对各种系统、照明子系统和方法实施例的描述决不解释为限制所附权利要求书的主题。
一实施例涉及被配置成测量粒子的荧光的系统。该系统包括被配置成以具有在非垂直方向上定向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振的光来照明粒子的照明子系统。将荧光团附着或包含在粒子中。光的偏振导致由荧光团发射的荧光比在以主要在垂直方向上定向的线偏振光(例如，来自激光器或非激光光源)或非偏振光(例如，来自任何光源)照明时由荧光团发射的荧光更亮。该系统还包括被配置成响应于由荧光团发射的荧光来生成输出信号的检测子系统。
在一个实施例中，该照明子系统包括一个或多个激光器。在另一个实施例中，该照明子系统包括选自由发光二极管(LED)、弧光灯、光纤发光器以及灯泡组成的组的一个或多个非激光光源。
在一个实施例中，偏振具有沿任何方向小于100∶1的偏振比(即，偏振的半长轴与偏振的半短轴之比)。在另一个实施例中，偏振具有沿非垂直方向大于100∶1的偏振比。相反，在主要为垂直的方向上定向的线偏振具有大于100∶1的偏振比，并且主要在垂直方向上定向。线偏振在本文中定义为具有大于100∶1的偏振比的偏振状态，而不管半长轴相对于垂直方向的定向。
作为椭圆偏振并在相对于垂直的任何方向上定向的非线偏振具有小于100∶1的偏振比；另外，可认为椭圆偏振是具有某一定向的线偏振。在技术上，所有的偏振可被称为是椭圆的。如果以此方式定义偏振，则圆偏振将是其中半长轴和半短轴具有相同大小的椭圆偏振的特殊情况。线偏振则也是其中半长轴和半短轴之比大于100∶1的椭圆偏振的特殊情况。
在一个实施例中，荧光团包括R-藻红蛋白(R-PE)。在另一个实施例中，荧光团包括有机或非有机染料。在某些实施例中，粒子被配置成发射荧光。在一个这样的实施例中，光的偏振导致由粒子发射的荧光比在用在主要为垂直的方向上定向的线偏振光或非偏振光照明时由粒子发射的荧光更明亮。
在一个实施例中，该系统被配置为流式细胞器。在一个不同的实施例中，该系统被配置为荧光成像系统。以上所述的系统的实施例中的每一个可如本文所述进一步配置。
另一个实施例涉及一种被配置成为测量系统提供照明的照明子系统。该照明子系统包括被配置成生成光的光源。该照明子系统还包括被配置成在由测量系统执行的测量期间在光照明粒子前改变光的偏振的偏振组件。经改变的偏振是沿非垂直方向定向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振。将荧光团附着或包含在粒子中。经改变的偏振导致由荧光团发射的荧光比在用在主要为垂直的方向上定向的线偏振光或非偏振光照明时由荧光团发射的荧光更明亮。
在一个实施例中，光源包括一个或多个激光器。在另一个实施例中，光源包括选自由LED、弧光灯、光纤发光器以及灯泡组成的组的一个或多个非激光光源。在某些实施例中，偏振组件包括半波延迟器、四分之一波延迟器、延迟器组或其某一组合。
在一个实施例中，经改变的偏振具有沿任何方向小于100∶1的偏振比。在一个不同的实施例中，经改变的偏振具有沿非垂直方向大于100∶1的偏振比。在另一个实施例中，荧光团包括R-PE。在一个不同的实施例中，荧光团包括有机或非有机染料。
在一个实施例中，该测量系统被配置成流式细胞器。在一个不同的实施例中，该测量系统被配置为荧光成像系统。以上所述照明系统的实施例中的每一个可如本文所述进一步配置。
另外的实施例涉及一种用于增加由附着或包含于粒子中的荧光团发射的荧光的方法。该方法包括在测量期间在光照明粒子前改变光的偏振。经改变的偏振是沿非垂直方向定向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振。在一个实施例中，经改变的偏振具有沿任何方向小于100∶1的偏振比。在一个不同的实施例中，经改变的偏振具有沿非垂直方向大于100∶1的偏振比。以上所述的方法的实施例中的每一个可包括本文所述的任何其它步骤。
附图简述
得益于以下较佳实施例的详细描述并参考附图后本领域的技术人员将清楚本发明的其它优点，附图中：
图1是示出用于流式细胞器的光学配置的一个示例的立体图的示意图；
图2是示出用于流式细胞器的光学配置的一个实施例的立体图的示意图；
图3-6是示出在不改变光的偏振和改变光的偏振的情况下通过以光照明粒子获得的数据的曲线图；
图7-8是示出被配置成测量粒子的荧光的系统的各实施例的横截面图的示意图。
尽管本发明允许各种修改和替换形式，但其具体实施例在附图中作为示例示出，并在本文中详细描述。附图不是按比例的。然而，应该理解附图和详细描述并不旨在将本发明限于所公开的具体形式，而正相反，目的在于覆盖落入由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内的所有修改、等价技术方案和替换方案。
较佳实施例的详细描述
以下描述一般涉及用于通过改变用于照明荧光团的光束的偏振状态和/或方向(例如，椭圆偏振的程度)来从诸如R-藻红蛋白(R-PE)等荧光团获得增加的荧光的系统、照明子系统和方法。
尽管本文中参考粒子描述了各实施例，但应理解，该系统、照明子系统和方法也可用于微球、聚苯乙烯珠、微观粒子、金纳米粒子、量子点、纳米点、纳米粒子、纳米壳、珠、微珠、胶乳粒子、胶乳珠、荧光珠、荧光粒子、有色粒子、有色珠、组织、细胞、微有机体、有机物或任何非有机物。粒子可用作分子反应的载体。适当的微球、珠和粒子的示例示于Fulton的美国专利第5,736,330号、Chandler等人的美国专利第5,981,180号、Fulton的美国专利第6,057,107号、Chandler等人的美国专利第6,268,222号、Chandler等人的美国专利第6,449,562号、Chandler等人的美国专利第6,514,295号、Chandler等人的美国专利第6,524,793号以及Chandler的美国专利第6,528,165号，其全部内容通过引用结合于此，如同在本文中完全陈述一样。本文中描述的系统、照明子系统以及方法可与这些专利中描述的微球、珠和粒子中的任一个一起使用。此外，流式细胞器中使用的微球可从诸如得克萨斯州奥斯汀市的Luminex公司等制造商获得。术语“粒子”、“珠”和“微球”在本文中可互换地使用。
尽管在本文中参考激光器描述了某些实施例，但应该理解该系统、照明子系统和方法实施例也可与一种或多种激光器和/或一种或多种非激光光源一起使用。这些非激光光源包括发光二极管(LED)、弧光灯、光纤发光器、灯泡以及本领域中已知的任何其它适当的非激光光源。应该理解，可将由任何相干、部分相干或非相干光源生成的光通过可如本文所述配置的适当的滤光器和/或偏振组件调节或改变成具有所选择的偏振状态和/或方向。
现在转到附图，应注意附图不是按比例的。具体地，极大地放大了附图的某些元件的比例以强调该元件的特性。还应注意，附图不是按同一比例绘制的。在一幅以上图中所示的相似配置的元件利用相同的参考标号来指示。
流式细胞器一般利用线偏振激光束来照明包含在流动细胞中的试样。由流式细胞器中所使用的大部分激光器生成的光是线偏振的，且最小偏振比是100∶1。由实际的激光器生成的线偏振光的偏振比从100∶1到超过800∶1显著地改变。偏振比描述了椭圆偏振的轴分量的大小之比。可将光波在数学上建模为两个正交波分量。取决于两正交波的相对相位，所得的瞬时偏振状态向量将随着光波传播一个波长而形成椭圆形“踪迹”。偏振比是该椭圆偏振的半长轴分量的大小与半短轴分量(正交于半长轴分量)的大小之比。因此，术语“线偏振”不是绝对术语，而是相对的，且指的是具有超过100∶1的最小值的偏振比的线偏振光束，但该偏振比在实际的实践中可显著地改变。半长轴的方向将定义偏振的方向。
实验数据证明当用激光束照射时将一定量的相位延迟施加到激光束显著地增加由某一荧光团发射的荧光量。可增加由荧光团发射的荧光的相位延迟将激光束的偏振状态改变成经改变的偏振状态。该经改变的偏振状态可包括具有相对于垂直的角定向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振。椭圆偏振的方向可具有远离垂直方向的大的分量。
术语“垂直”或“垂直方向”对于不同的测量系统可不同地定义。例如，在流式细胞器中，主要在垂直方向上定向的偏振一般在本文中定义为具有在照明粒子的点处主要平行于通过流式细胞器的粒子流的半长轴的偏振。如此，可将激光器安排在任何位置和方向上，并且通过镜子等的使用，可确定光束路线、反射和指引光束使得当光束照射到粒子上时，光束的偏振具有所选择的方向。在这种情况下，偏振的方向可沿照明路径改变，只要照射到粒子上的光的偏振状态具有所选择的方向。
在荧光成像系统(或“板读取器”)中，粒子在衬底上具有基本固定的位置。因此，在这种系统中，不能相对于粒子流来定义垂直方向。对于诸如本文中进一步描述的某些成像测量系统，可将光以基本垂直的入射角度指引到放置粒子的平面。在这种系统中，在照明粒子的点处，不管方向如何，光的偏振向量将基本平行于该平面。如此，偏振的方向可参考测量系统的不同轴或平面来定义。在该配置中，入射光的偏振方向将源于某些荧光染料发出的荧光的“主要”偏振分量(或方向)。诸如Luminex校准珠中使用的校准器染料之类的染料较小并且是线性的。这种染料在发出的荧光中将入射光的偏振再现到显著并可测量的程度。如果利用偏振光束分离器将发出的荧光分离，则与入射光的偏振对准的线偏振荧光将或者穿过偏振光束分离器或者由其反射，取决于光束分离器的方向。如果该偏振光束分离器被定向成使得光束分离表面平行于荧光的线偏振，则这将是用于具有以法线入射的入射光的板读取器配置的线偏振入射光的定义的几何形状。在任一情况下，根据本文中所描述的实施例，由光源发射的光的偏振可以是线性的(在任一方向上定向)并且可通过改变偏振的方向或通过将偏振的状态改变为圆形或椭圆形(在任何方向上定向)来改变。
或者，荧光成像测量系统可被配置成使得光以倾斜或不垂直于保持试样粒子的板的平面的入射角定向到粒子。以此配置，当偏振的半长轴基本平行于入射平面时，可将入射光的偏振方向定义为垂直。入射平面是光学表面外的包含入射光线、反射光线和部分或全部透过或进入介质(或者如果表面介质是不透射的则被传播)的任何光线的平面。这种偏振则主要是“p”偏振。
因此，根据一个实施例，用于增加由附着或包含在粒子中的荧光团发射的荧光的方法包括在测量期间光照明粒子之前改变光的偏振。经改变的偏振是沿非垂直方向定向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振。在一个实施例中，经改变的偏振具有沿任何方向的小于100∶1的偏振比。在另一个实施例中，经改变的偏振具有沿非垂直方向大于100∶1的偏振比。相反，在主要为垂直的方向上定向的线偏振具有大于100∶1的偏振比，并在垂直方向上定向。在非垂直方向上定向的线偏振(即，具有在非垂直方向上定向的半长轴的线偏振)具有大于100∶1的偏振比但垂直与水平偏振之比小于100∶1。不管线偏振方向如何，偏振比均大于100∶1。即，给定线偏振的主要方向，半长轴偏振分量与垂直于半长轴的偏振分量之比大于100∶1。
椭圆偏振并在任何方向上定向的非线性偏振具有小于100∶1的偏振比；另外，可将椭圆偏振认为是具有某一方向的线偏振。在技术上，可将所有的偏振认为是椭圆的。如果以此方式定义偏振，则圆偏振是其中半长轴和半短轴具有相同的大小的椭圆偏振的特殊情况。线偏振则也是其中半长轴和半短轴之比大于100∶1的椭圆偏振的特殊情况。
在某些实施例中，荧光团包括R-PE。在其它实施例中，荧光团包括有机或非有机染料。有机或非有机染料可包括本领域中已知的任何适当的染料，其某些示例包含在以上通过引用结合的专利中。荧光团可以按本领域中已知的任何方式附着或包含在粒子中，其某些示例包含在以上通过引用结合的专利中。荧光团可用于粒子的分类或标识(例如，粒子所属的总体的子集的标识)。或者，荧光团可用于粒子表面发生的反应的标识、确定或量化。
以上所述的方法的实施例中的每一个可包括本文中描述的任何其它步骤。此外，以上所述的方法的实施例中的每一个可由本文所描述的照明子系统或系统中的任一个来执行。此外，以上所述的方法的实施例中的每一个具有本文所述的其它实施例的所有优点。
可将以上所述的技术应用于被配置成利用生成主要为线偏振光的光束的激光器来照明粒子的现有的流式细胞器。现有的流式细胞器中使用的一种光学配置示于图1中。如图1所示，该光学配置包括光源10，它可以是本领域中已知的激光器或其它适当的光源。该光源可被配置成生成在主要为垂直的方向上定向的线偏振光。具体地，由光源10生成的光12具有偏振14，它是线性的，并在主要为垂直的方向(即，基本平行于通过试管16的粒子(未示出)流的方向)上定向。
光12被定向到试管16，使得光照明流过试管的粒子。光12也可由诸如设置在光源10和试管16之间的聚焦透镜之类的一个或多个光学元件(未示出)聚焦到试管16上。由粒子、附着其上的材料或包含于其中的材料发射和/或散射的光由聚集光学器件18聚集。聚集光学器件18被配置成将聚集的光定向到检测器20。检测器20响应于由聚集光学器件18聚集的发射和/或散射的光来生成输出信号。试管16、聚集光学器件18和检测器20可包括本领域中已知的任何适当的组件。
在图2所示的流式细胞器光学配置的实施例中，将图1所示的光学配置修改成使得照明的偏振状态通过相位延迟修改成例如椭圆或圆偏振状态以使由诸如R-PE之类的荧光团发射的荧光增加甚至可能是最大化。为了简明起见，如以上参考图1所述配置的图2所示的元件此处不再进一步描述。
图2所示的光学配置实施例包括被配置成为测量系统提供照明的照明子系统。具体地，类似于图1所示的光学配置，图2中所示的光学配置包括光源10。将光源10被配置成如上所述生成光12。在一个实施例中，光源10是激光器。激光器可以是本领域中已知的任何适当的激光器。此外，该光学配置可包括一个以上激光器(未示出)。在其它实施例中，光源10是选自由LED、弧光灯、光纤发光器和灯泡组成的组的非激光光源。光源可包括本领域中已知的任何这种适当的光源。此外，图2所示的光学配置可包括一个以上非激光光源(未示出)。此外，该光学配置可包括一个或多个激光器和一个或多个非激光光源。光源可如本文所述进一步配置。
与图1所示的光学配置不同，图2所示的光学配置包括设置在光源10和试管16之间的偏振组件22。偏振组件22被配置成在测量系统执行的测量期间在光照明粒子(图12中未示出)之前改变光12的偏振。换言之，偏振组件22被设置在光12的光程中以改变光的偏振状态和/或方向。例如，如图2所示，离开偏振组件22的光24具有经改变的偏振26，它被示为在不同于偏振14所定向的方向的方向上定向的椭圆偏振。然而，经改变的偏振26可以是在非垂直方向上定向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振(在相对于垂直方向的任何方向上定向)。经改变的偏振可具有沿任何方向小于100∶1的偏振比。经改变的偏振或者可具有沿非垂直方向大于100∶1的偏振比。因为大部分激光器生成具有变化的线偏振比的光(当它们被配置成生成线偏振光时)，因此由偏振组件22施加到光12的特定量的相位延迟在各激光器之间变化，并可在系统对准期间选择。
因此，在本文所述的实施例中，将诸如波片、偏振延迟器之类的偏振组件或其它偏振组件或本文所述的偏振组件的组合放置在光源(例如，激光器)和照明目标(例如，在流式细胞器情况下测量的粒子)之间以改变光束(例如，线偏振束)的偏振。在某些实施例中，偏振组件包括半波延迟器、四分之一波延迟器、诸如延迟器组之类的被配置成具有相位延迟功能的任何组合的偏振组件、本领域中已知的可用于改变由光源10生成的光的偏振的任何其它光学组件、或它们的某一组合。如果在照明子系统中包括聚焦光学器件，则该延迟器可被放置在聚焦光学器件(未示出)之前或之后的照明路径上。此外，尽管本文中将系统和照明子系统实施例描述为包括一偏振组件，但应理解，该系统和照明子系统可包括位于照明路径中的一个以上偏振组件，使得偏振组件连续地改变由光源生成的光束的偏振。
荧光团(未示出)被附着或包含在流过试管16的粒子中。荧光团可包括R-PE。或者，荧光团可包括有机或非有机染料。有机或非有机染料可包括本领域中已知的任何适当的染料。荧光团可如本文所述地进一步配置。经改变的偏振较佳地导致由荧光团发射的荧光比在以主要为垂直的方向上定向的线偏振光(例如来自激光器或非激光光源)或非偏振光(例如，来自任何光源)照明时荧光团发射的荧光更明亮。换言之，偏振组件22将光12的偏振比和/或方向(或偏振的相对相位)改变成选择的偏振状态和/或方向，这增加了目标荧光团的测得的荧光发射。
在另外的实施例中，粒子本身可被配置成发射荧光。在一个这样的实施例中，离开偏振组件22并照明粒子的光的偏振导致由粒子发射的荧光比在以在主要为垂直的方向上定向的线偏振光或非偏振光照明时粒子发射的荧光更明亮。如上所述，改变光12的偏振的相对相位可导致经改变的偏振状态和/或方向，诸如具有非垂直方向的线偏振、圆偏振或以相对于垂直的任何角度定向的椭圆偏振。
在一个实施例中，图2所示的光学配置用于为被配置为流式细胞器的测量系统提供照明。图2所示的光学配置与流式细胞器中当前使用的光学配置相比有几个优点。例如，为了增加由荧光团发射的荧光，仅将诸如偏振波片之类的偏振组件插入到光学配置的照明路径中。如此，可按相当简单的方式来改变当前使用的流式细胞器的光学配置以实现信噪比以及由此的流式细胞器的精确度的显著增加。此外，在某些实施例中，图2所示的光学配置可被配置成向被配置为诸如本文中进一步描述的成像系统之类的荧光成像系统的测量系统提供照明。这些实施例也将具有图2所示的光学配置的优点。此外，图2所示的光学配置可在执行由荧光团发射的荧光的测量并得益于由本文所述的实施例提供的较高的信噪比的任何测量系统中使用。图2所示的光学配置可如本文所述进一步配置。
导致最优荧光团吸收/发射的施加到照明的偏振的精确量的相位延迟可取决于例如流式细胞器特性(例如，光源的波长和其它特性)和荧光团的特性而改变。以下给出结果(例如，见表1)，它证明在市场上可从Luminex买到的Luminex LX100流式细胞器中测量到的利用532nm的照明由R-PE发射的荧光增加。
应该理解，本文中所描述的系统、照明子系统和方法不限于可实现荧光增加的特定机制(即，荧光信号响应的增加可通过增加的吸收机制来实现和/或通过更高效的发射和/或发射检测来部分实现)。然而，以下描述了若干可能的机制。
LX100流式细胞器中所使用的荧光报告(reporter)染料是R-PE。R-PE分子相对较大并具有240,000道尔顿的分子量。因为这些分子经由其它分子(例如，经由反应产物)附着到粒子，所以可认为每一个R-PE分子的“中心”与粒子的表面隔开。R-PE分子的至少一个外边缘将超出其远离粒子的中心相当大的距离。
当这一粒子被包含在诸如盐之类的移动液柱中时，粒子由每一个都受到压力的数百或数千个液体分子在液体移动的方向上传送或“推动”。该压力是造成液体移动的原因。此外，该压力的连续施加导致附着到粒子的大多数(或者至少某些)R-PE分子在朝向液流的方向上定向(即，分子沿向上的方向弯曲)。当对于位于微球体的整个表面上的所有R-PE相加时，该方向导致最终方向向量。该方向向量可影响哪一个偏振状态和/或方向对于照明是最优的。
标准的Luminex校准和控制粒子被耦合到作为斯夸甙(squaraine)类染料的一种的校准染料或包括该校准染料。该校准染料以与R-PE相同的方式不受照明光束的偏振状态影响。由于校准染料是形状因数相对较小且“平”(或线性)并随机分布在粒子的整个内部中的合成染料的这一事实，该非响应性是非常可能的。因此，在粒子上没有校准染料分子的最终方向。因此，如果将校准染料分子的吸收偶极矩一起积分，最终结果将接近0。此外，因为校准染料是小的、线性分子，所以校准染料往往比具有其它偏振状态的光更高效地响应于线偏振光。
当用除在主要为垂直的方向上定向的线偏振光之外的光或非偏振光照明时，其它机制也有助于观察到的由R-PE发射的荧光的增加。例如，类似于所有的蛋白质，R-PE具有螺旋形或手征结构。这种螺旋形或手征结构可以是造成由于照明的椭圆偏振的程度的对应改变引起的R-PE的响应性(即，测得的荧光发射的亮度)改变的部分原因。诸如R-PE之类的蛋白质由氨基酸组成，它们通常是光学活性物质，因为它们在其对于入射光和所得的散射光的偏振状态的影响的意义上是“旋转的”。可评价吸收发色团、其最终的偶极矩以及其手征结构的组合，以确定将导致荧光团对光的最有效吸收的照明的偏振状态和方向。
本文所描述的用于荧光增加的另一种可能的机制是R-PE中发生的Frster共振能量转移(FRET)。R-PE具有多个吸收发色团，导致宽吸收光谱。然而，R-PE具有相对窄的发射光谱，这指示单一发射发色团。发射发色团通过FRET从吸收发色团获得能量。该过程发生直到荧光发色团发出光子。当发色团的振荡偶极子彼此很接近且可经由偶极矩的电场而发生能量转移(即，在FRET过程中没有发射光子)时，发生相邻的发色团之间的FRET。在R-PE中，吸收发色团不发射光子，而是将吸收的能量转移到邻近的发射团。照明的偏振状态和/或方向的改变不仅影响最初的吸收发色团，而且可能通过对准相邻的发色团之间的偶极矩来提高FRET过程的效率。
另外，圆偏振(或椭圆偏振)的光受最终角动量的影响，而线偏振光不具有最终角运动。圆偏振光将导致吸收材料中的电子响应于电场生成的力而具有部分的圆(或椭圆)运动。该运动向激发的电子施加最终角动量，而线偏振光不向激发的电子施加角动量。施加给电子的角动量取决于相对于光传播方向的圆(或椭圆)偏振的偏手性(右或左)和吸收发色团的偶极矩。该最终角动量转移是在照明偏振的椭圆率改变时可解释R-PE的吸收增加的另外的机制。
改变照明的偏振以导致由荧光团发射的荧光增加在流式细胞器以及诸如本文进一步描述的荧光成像系统之类的其它类型的基于荧光的仪器中具有广泛的应用。具体地，该技术可显著增加R-PE的测得的平均荧光亮度(MFI)响应。
本文将进一步描述利用各种激光器获得的实验数据。应该理解包含在本文中的所有实验数据不描述或定义本发明的限制实施例。荧光响应以MFI为单位来测量。由Luminex公司提供的10丛珠组用于实验。该珠组既包含用校准染料染色的珠、R-PE附着的珠，也包含没有染料的空白珠。用与对该珠所预期的MFI不相关的唯一区域编号(例如，9-R-PE)来标识每一个珠。在不改变激光器生成的光的偏振的情况下利用流式细胞器对于每一种激光器测量10丛十次。该数据集形成用于校准染料和R-PE的基线数据。
然后将在532nm处提供π/2相对延迟的波片(四分之一波片)放置在激光器和激光聚焦透镜之间。基于前面的实验，将波片的快轴的角度设置成对于垂直约呈40度。该配置将线偏振照明改变为椭圆偏振照明。在不进行任何另外的光学对准的情况下，由流式细胞器再次测量10丛，并收集数据。在该配置中，R-PE的MFI响应增加，而校准染料的MFI响应减小。然后再校准该仪器，并再次测量10丛十次。该数据提供了R-PE响应相对于校准染料响应的MFI增加量。表1所示的数据说明了该响应。
在表1中，在不改变照明的偏振的情况下没有偏振光学器件指示如上所述测得的数据。第一组40度四分之一波片的数据是利用如上所述的波片来改变照明的偏振而测得的数据。第二组40度四分之一波片的数据是利用如上所述的波片以在仪器重新校准后改变照明的偏振而测得的数据。
表1
9-R-PE   17-DYE   18-R-PE   45-R-PE   48-R-PE   54-DYE   57-R-PE    80-空白     89-DYE     90-R-PE
  非偏振光学器件非偏振光学器件非偏振光学器件非偏振光学器件非偏振光学器件平均非偏振光学器件40度四分之一波 346437363670359736463622.63818   390386380.5375369380.1328.5   121412321332125512301252.61337   736736785741743748.2826.5   431432489.5442466.5452.2519   1031.51015997972.5959995866.5   8510689989093.699     0000000     10336.5102849857974895419953.38596     591760046160.5601159446007.36755
片40度四分之一波片40度四分之一波片平均40度四分之一波片变化％R-PE平均变化％DYE平均变化％重新校准w四分之一波片40度四分之一波片40度四分之一波片40度四分之一波片40度四分之一波片平均40度四分之一波片变化％R-PE平均变化％DYE平均变化％ 393035933780.34.49.2-14.145354414443746554510.324.528.8-1.2 326320.5325.0-14.5372373383.5397381.40.3 14371373.51382.510.41535.51632.5159516101593.327.2 857.5804829.310.89549399681028972.329.9 493485.5499.210.4575595581.5591585.629.5 854837852.5-14.3956966969999972.5-2.3 106.598101.28.1111.5120124134122.430.7 000.00000 863586378622.7-13.49644.59683.59732101049791.0-1.6 6723.565996692.511.47770.57487768884727854.430.7
图3-6中所示的曲线示出在不将上述波片放置在照明路径中的情况下对于上述珠组的六个R-PE珠测得的平均MFI以及在将波片放置在照明路径中并重新校准系统后对于六个R-PE珠测得的平均MFI。图3-6所示的曲线利用不同仪器上的不同激光器生成。六个R-PE珠具有附着到它们的变化量的R-PE。
图3所示的数据是利用可从加利福尼亚州圣何塞市的JDS Uniphase公司买到的型号为4602-010-0485的激光器获得的。曲线28示出在不将波片放置在照明路径中的情况下对于每一个珠测得的平均MFI。曲线30示出将波片放置在照明路径中时对于每一个珠测得的平均MFI。如图3所示，在不将波片放置在照明路径中的情况下对于每一个珠测得的平均MFI比将波片放置在照明路径中时对于每一个珠测得的平均MFI低。因此，在测量期间使用波片来改变照明珠的光的偏振时对于珠中的每一个测得的平均MFI较高。此外，如图3的曲线32所示，对于珠中的每一个测得的平均MFI的增加％在各珠之间有所变化，但对于珠中的每一个测得的平均MFI的增加％相当大(例如，24.0％或更大)。因此，图3所示的曲线清楚地示出在R-PE的荧光发射中珠表现出偏振诱导响应。
图4所示的数据是利用可从JDS Uniphase公司买到的型号为4602-010-0485的激光器获得的。曲线34示出在不将波片放置在照明路径中的情况下对于每一个珠测得的平均MFI。曲线36示出将波片放置在照明路径中时对于每一个珠测得的平均MFI。如图4所示，在不将波片放置在照明路径中的情况下对于每一个珠测得的平均MFI比将波片放置在照明路径中时对于每一个珠测得的平均MFI低。因此，在测量期间使用波片来改变照明珠的光的偏振时对于珠中的每一个测得的平均MFI较高。此外，如图4的曲线38所示，对于珠中的每一个测得的平均MFI的增加％在各珠之间有所变化，但对于珠中的每一个测得的平均MFI的增加％相当大(例如，20.0％或更大)。因此，图4所示的曲线清楚地示出在R-PE的荧光发射中珠表现出偏振诱导响应。
图5所示的数据是利用可从JDS Uniphase公司买到的型号为4602-010-0485的激光器获得的。曲线40示出在不将波片放置在照明路径中的情况下对于每一个珠测得的平均MFI。曲线42示出将波片放置在照明路径中时对于每一个珠测得的平均MFI。如图5所示，在不将波片放置在照明路径中的情况下对于每一个珠测得的平均MFI比将波片放置在照明路径中时对于每一个珠测得的平均MFI低。因此，在测量期间使用波片来改变照明珠的光的偏振时对于珠中的每一个测得的平均MFI较高。此外，如图5的曲线44所示，对于珠中的每一个测得的平均MFI的增加％在各珠之间有所变化，但对于珠中的每一个测得的平均MFI的增加％相当大(例如，22.0％或更大)。因此，图5所示的曲线清楚地示出在R-PE的荧光发射中珠表现出偏振诱导响应。
图6所示的数据是利用可从加利福尼亚州圣克拉拉市Coherent公司买到的COMPASS 215M-15激光器获得的。曲线46示出在不将波片放置在照明路径中的情况下对于每一个珠测得的平均MFI。曲线48示出将波片放置在照明路径中时对于每一个珠测得的平均MFI。如图6所示，在不将波片放置在照明路径中的情况下对于每一个珠测得的平均MFI比将波片放置在照明路径中时对于每一个珠测得的平均MFI低。因此，在测量期间使用波片来改变照明珠的光的偏振时对于珠中的每一个测得的平均MFI较高。此外，如图6的曲线50所示，对于珠中的每一个测得的平均MFI的增加％在各珠之间有所变化，但对于珠中的每一个测得的平均MFI的增加％相当大(例如，17.0％或更大)。因此，图6所示的曲线清楚地示出在R-PE的荧光发射中珠表现出偏振诱导响应。
本文所述的方法可在现有的LX100流式细胞器仪器中实现而不需要较大的修改(例如，通过将一个或多个偏振组件插入到照明路径中)并可容易地在任何流式细胞器上实现。本文所述的照明子系统和方法可增加由荧光团发射的荧光的量并由此增加流式细胞器的灵敏度和精确度。也可在不影响其余的光学组件的情况下将该技术结合到目前的流式细胞器仪器中。
图7示出被配置成测量粒子的荧光的系统的一个实施例。图7所示的测量系统包括根据本文所述的实施例配置的照明子系统。图7所示的系统的实施例被配置为流式细胞器。在图7中，测量系统沿穿过试管52的横截面示出，粒子54流过该试管52。在一个示例中，试管可以是诸如标准流式细胞器中所使用的标准的熔融石英试管。然而，任何其它适当类型的观察或传递腔室也可用于传递试样以供分析。
该系统包括被配置成用具有在非垂直方向上定向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振的光照明粒子54的照明子系统。将荧光团(未示出)附着或包含在粒子54中。光的偏振导致由荧光团发射的荧光比在用在主要为垂直的方向上定向的线偏振光或非偏振光照明时由荧光团发射的荧光更明亮。
照明子系统包括光源56。在一个实施例中，光源56是激光器。激光器可以是本领域中已知的任何适当的激光器。此外，照明子系统可包括一个以上激光器(未示出)。光源可被配置成发射具有一种或多种波长的光，诸如蓝光或绿光。在其它实施例中，该照明子系统包括选自由LED、弧光灯、光纤发光器和灯泡组成的组的一个或多个非激光光源(未示出)。非激光光源可包括本领域中已知的任何适当的非激光光源。如此，该照明子系统可包括一个以上光源。在一个实施例中，光源可被配置成用具有不同波长或波段的光(例如，蓝光或绿光)来照明粒子。在某些实施例中，光源可被配置成以不同的方向照明粒子。此外，该照明子系统可包括一个或多个激光器和/或一个或多个非激光光源。光源56可包括本领域中已知的任何其它适当的光源。
该照明子系统还可包括被设置在由光源56生成的光的光程中的偏振组件58。偏振组件58可包括半波延迟器、四分之一波延迟器、延迟器组、本文所述的任何其它适当的偏振组件或它们的任何组合。偏振组件58被配置成在测量系统执行的测量期间在光照明粒子54之前改变光的偏振。例如，光源可被配置成生成在主要为垂直的方向上定向的线偏振光或非偏振光。经改变的偏振是在非垂直方向上定向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振。在一个实施例中，经改变的偏振具有沿任何方向小于100∶1的偏振比。在另一个实施例中，经改变的偏振具有沿非垂直方向大于100∶1的偏振比。此外，尽管图7所示的系统包括设置在光源56和试管52之间的光程中的一个偏振组件，但该系统可包括设置在光源56和试管52之间的光程中的一个以上偏振组件(未示出)。偏振组件可连续地改变由光源56生成的光的偏振，使得粒子54利用选择的偏振状态和/或方向的光来照明。
离开偏振组件58的光在粒子流过试管时照明粒子。照明导致粒子或附着于其上或包含于其中的荧光团发射具有一种或多种波长或波段的荧光。此外，离开偏振组件的光的经改变的偏振导致由荧光团发射的荧光比在用在主要为垂直的方向上定向的线偏振光或非偏振光照明时由荧光团发射的荧光更明亮。在一个实施例中，荧光团包括R-PE。在一个不同的实施例中，荧光团包括有机或非有机染料。有机或非有机染料可包括本领域中已知的任何适当的染料。
在某些实施例中，粒子54本身可被配置成发射荧光。在一个这样的实施例中，离开偏振组件58的光的偏振导致由粒子发射的荧光比在用在主要为垂直的方向上定向的线偏振光或非偏振光照明时由粒子发射的荧光更明亮。
在某些实施例中，该系统可包括被配置成将来自光源的光聚焦到粒子或流动路径上的一个或多个透镜(未示出)。一个或多个透镜可位于光源56和偏振组件58之间或偏振组件58和试管52之间的光程中。
可将从粒子向前散射的光通过折叠式反射镜62或另一种适当的光定向组件定向到检测系统60。或者，可将检测系统60直接放置在向前散射的光的路径中。如此，折叠式反射镜或其它光定向组件可以不包含于系统中。在一个实施例中，向前散射光可以是由粒子以与光源56的照明方向呈约180°的角度散射的光，如图7所示。向前散射的光的角度可以不与照明方向呈精确的180°，使得来自光源的入射光可以不照射在检测系统的光敏表面上。例如，向前散射的光可以是由粒子以与照明方向呈小于或大于180°的角度散射的光(例如，以约170°、约175°、约185°或约190°的角度散射的光)。
也可收集由粒子以与照明方向呈约90°的角度散射的光。也可或者替换地以任何角度或方向来收集由粒子散射的光。在一个实施例中，该散射的光可由一个或多个光束分离器或分色镜分离成一个以上光束。例如，可将以与照明方向呈90°的角度散射的光用光束分离器64分离成两个不同的光束。这两个不同的光束可再次由光束分离器66和68分离以产生四个不同的光束。光束中的每一个可定向到一不同的检测系统，检测系统可包括一个或多个检测器。例如，四个光束中的一个可定向到检测系统70。检测系统70可被配置成检测由粒子散射的光。
由检测系统60和/或检测系统70检测的散射光一般可以与由光源照明的粒子的体积成正比。因此，检测系统60的输出信号和/或检测系统70的输出信号可用于确定位于照明区或检测窗口中的粒子的直径。此外，检测系统60和/或检测系统70的输出信号可用于识别粘在一起或几乎同时通过照明区的一个以上粒子。因此，这些粒子可与其它的试样粒子或校准粒子相区分。
该系统还包括被配置成响应于由荧光团发射的荧光而生成输出信号的检测子系统。例如，可将其它三个光束定向到检测系统72、74和76。检测系统72、74和76可被配置成检测由荧光团或粒子本身发射的荧光。检测系统中的每一个可被配置成检测不同波长或不同波长范围的荧光。例如，检测系统中的一个可被配置成检测绿色荧光。检测系统中的另一个可被配置成检测黄橙荧光，而将其它检测系统可被配置成检测红荧光。
在某些实施例中，可将光谱过滤器78、80和82分别耦合到检测系统72、74和76。光谱过滤器可被配置成阻止除配置检测系统来检测的以外的波长的荧光。此外，可将一个或多个透镜(未示出)光学耦合到检测系统中的每一个。透镜可被配置成将散射光或发射的荧光聚焦到检测器的光敏表面。
检测器的输出电流与照射到其上的荧光成正比并得到电流脉冲。可将电流脉冲转换成电压脉冲、进行低通滤波、然后由A/D转换器(未示出)数字化。诸如数字信号处理器(DSP)之类的处理器84对脉冲下的面积求积分以提供表示荧光大小的数字。如图7所示，可将处理器84经由传输介质86耦合到检测器70。也可将处理器84经由传输介质86和诸如A/D转换器之类的一个或多个其它组件(未示出)间接地耦合到检测器70。可将处理器以类似的方式耦合到系统的其它检测器。处理器84可进一步如本文所述配置。
在某些实施例中，从由荧光团或粒子发射的荧光生成的输出信号可用于确定粒子的身份和关于粒子表面上已发生或正在发生的反应的信息。例如，检测系统中的两个的输出信号可用于确定粒子的身份，而其它检测系统的输出信号可用于确定粒子表面上已发生或正在发生的反应。因此，检测器和光谱过滤器的选择可取决于包含或结合到粒子中的染料或荧光团的类型和/或测量的反应(即，包含或结合到反应中所涉及的反应物的染料)而改变。
用于确定试样粒子的身份的检测系统(例如，检测系统72和74)可以是APD、PMT或另一类型的光检测器。用于识别粒子表面上已发生或正在发生的反应的检测系统(例如，检测系统76)可以是PMT、APD或另一类型的光检测器。测量系统可如本文所述地进一步配置。
尽管图7的系统被示为包括具有用于区分具有不同染料特性的粒子的两个不同的检测窗口的两个检测系统，但应理解该系统可包括两个以上这种检测窗口(即，3个检测窗口、4个检测窗口等)。在这些实施例中，该系统可包括另外的波束分离器和具有其它检测窗口的另外的检测系统。此外，可将光谱过滤器和/或透镜耦合到另外的检测系统中的每一个上。
在另一个实施例中，该系统可包括被配置成区分粒子表面上反应的不同材料的两个或更多检测系统。不同的反应物材料可具有不同于粒子的染料特性的染料特性。
如本文所述配置(例如，通过将一个或多个偏振组件插入到系统的照明路径中)的测量系统的另外的示例示于Chandler等人的美国专利第5,981,180号、Chandler的美国专利第6,046,807号、Chandler的美国专利第6,139,800号、Chandler的美国专利第6,366,354号、Chandler的美国专利第6,411,904号、Chandler等人的美国专利第6,449,562号以及Chandler等人的美国专利第6,524,793号中，其内容通过引用结合于此，如同在本文中完全陈述一样。本文所述的测量系统也可如这些专利所述地进一步配置。图7所示的系统可如本文对于其它系统和实施例所描述地进一步配置。此外，图7所示系统具有本文所述的其它实施例的所有优点。
被配置成测量粒子的荧光的系统的另一个实施例示于图8中。图8所示的系统可用于诸如试样的多分析物测量之类的应用。系统的该实施例可被配置为荧光成像系统。该系统包括被配置成用具有在非垂直方向上定向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振的光照明粒子的照明子系统。将荧光团附着或包含在粒子中。光的偏振导致由荧光团发射的荧光比在用在主要为垂直的方向上定向的线偏振光或非偏振光照明时由荧光团发射的荧光更明亮。
在一个实施例中，该照明子系统包括光源88。光源88可包括诸如任何适当的LED、弧光灯、光纤发光器、灯泡、白炽灯或本领域中已知的任何适当的光源等一个或多个光源。此外，该照明子系统可包括一个以上光源(未示出)，其中的每一个被配置成生成至少一种波长或至少一种波段的光。图8所示的系统中所使用的光源的适当的组合的一个示例包括但不限于两个或多个LED。
可将一个以上光源生成的光用波束分离器(未示出)或本领域中已知的任何其它适当的光学元件组合到一公共照明路径中，使得来自光源的光可同时定向到粒子。或者，该成像子系统可包括诸如反射镜之类的光学元件(未示出)和被配置成取决于哪一个光源用于照明粒子来将光学元件移入和移出照明路径的装置(未示出)。如此，光源可用于以不同波长或波段的光顺序地照明粒子。光源也可从上面(未示出)而不是衬底的下面照明衬底。
可选择光源以提供导致耦合于其中或包含于其中的粒子或材料发射荧光的波长或波段处的光。例如，可选择波长或波段以激发包含在粒子中和/或耦合到粒子表面的荧光团、荧光染料或其它荧光材料。如此，可选择波长或波段，使得粒子发射用于粒子的分类的荧光。此外，可选择波长或波段以激发经由粒子表面上的反应物耦合到粒子的荧光团、荧光染料或其它荧光材料。如此，可选择波长或波段，使得粒子发射用于检测和/或量化粒子表面发生的反应的荧光。
该照明子系统还包括被设置在由光源88生成的光的光程中的偏振组件90。偏振组件90可包括半波延迟器、四分之一波延迟器、延迟器组、其某一组合或本文所述的任何其它偏振组件或偏振组件的组合。偏振组件90被配置成在该系统执行的测量期间在光照明粒子92之前改变光的偏振。经改变的偏振是在非垂直方向上定向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振。在一个实施例中，经改变的偏振具有沿任何方向小于100∶1的偏振比。在另一个实施例中，经改变的偏振具有沿非垂直方向大于100∶1的偏振比。
经改变的偏振较佳地导致由荧光团发射的荧光比在以在主要为垂直的方向上定向的线偏振光或非偏振光照明时由荧光团发射的荧光更明亮。在一个实施例中，荧光团包括R-PE。在一个不同的实施例中，荧光团包括有机或非有机染料。有机或非有机染料可包括本领域中已知的任何适当的染料。在某些实施例中，粒子本身可被配置成发射荧光。在一个这样的实施例中，光的偏振导致由粒子发射的荧光比在以在主要为垂直的方向上定向的线偏振光或非偏振光照明时由粒子发射的荧光更明亮。
如图8所示，该照明子系统可包括被配置成将来自偏振组件90的光定向到其上固定粒子92的衬底96的光学元件94。在一个示例中，光学元件94可以是准直透镜。然而，光学元件94可包括可用于将来自偏振组件90的光映射到衬底96的任何其它适当的光学元件。此外，尽管光学元件在图8中被示为单个光学元件，但应该理解光学元件94可包括一个以上折射元件。此外，尽管光学元件94在图8中被示为折射光学元件，但应该理解可使用一个或多个折射和/或衍射光学元件(可能与一个或多个折射光学元件相结合)来将来自偏振组件90的光映射到衬底96上。此外，尽管光学元件94在图8中被示为将来自偏振组件90的光以基本垂直的入射角映射到衬底96上，但应该理解该系统可被配置成将光以倾斜的入射角定向到衬底90。
此外，尽管偏振组件90被示为位于光源88和光学组件94之间的光程中，但偏振组件90替换地可位于光学组件94和衬底96之间的光程中。此外，尽管图8所示的系统包括设置在光源88和衬底96之间的光程中的一个偏振组件，但该系统可包括设置在光源88和衬底96之间的光程中的一个以上偏振组件。偏振组件可连续地改变由光源88生成的光的偏振，使得粒子92以所选的偏振状态和/或方向的光来照明。
粒子92可包括上述粒子中的任何一种。衬底96可包括本领域中已知的任何适当的衬底。固定在衬底96上的粒子可置于成像室(未示出)或用于维持衬底96和固定于其上的粒子92相对于照明子系统的位置的任何其它装置。用于维持衬底96的位置的装置也可被配置成在成像前改变衬底的位置(例如，将照明聚焦到衬底上)。
粒子在衬底上的固定可利用磁吸力、真空滤板或本领域中已知的任何其它适当的方法来进行。定位用于成像的微球的方法和系统的示例示于2004年11月11日提交的Pempsell的美国专利申请第60/627,304号中，其内容通过引用结合于此，如同本文完全陈述一样。粒子固定方法本身对于本文所述的方法和系统不是特别重要。然而，较佳地固定粒子使得粒子在检测器积分周期期间(可能是几秒长的时间)不会明显移动。
图8所示的系统还包括被配置成响应于由荧光团发射的荧光来生成输出信号的检测子系统。例如，如图8所示，该检测子系统可包括光学元件98和分色光束分离器100。光学元件98可被配置成聚集和校准来自衬底96和固定于其上的粒子92的光并将该光定向到光束分离器100。光学元件98可如上对于光学元件94所描述地进一步配置。光束分离器100可包括本领域中已知的任何适当的光束分离器。光束分离器100可被配置成基于光的波长将来自光学元件98的光定向到不同的检测器。例如，具有第一波长或波段的光可由光束分离器100透射，而具有不同于第一波长的第二波长或波段的光可由光束分离器100反射。
该检测子系统也可包括光学元件102和检测器104。由光束分离器100透射的光可被定向到光学元件102。光学元件102被配置成将由光束分离器透射的光聚焦到检测器104。该检测子系统还可包括光学元件106和检测器108。由光束分离器100反射的光可被定向到光学元件106。光学元件106被配置成将由光束分离器反射的光聚焦到检测器108上。光学元件102和106可如上对于光学元件94所描述地配置。
检测器104和108可包括例如电荷耦合器件(CCD)检测器或诸如CMOS检测器、光敏元件的二维阵列、时延积分(TDI)检测器之类的本领域中已知的任何其它适当的成像检测器。在某些实施例中，可使用诸如二维CCD成像阵列之类的检测器来同时获得基本上整个衬底或固定在衬底上的所有粒子的图像。系统中包含的检测器的数量可等于关注的波长或波段的数量，使得每一个检测器用于在波长或波段中的一个上生成图像。
由检测器生成的图像中的每一个可利用设置在从光束分离器到检测器的光程中的光学带通元件(未示出)或本领域已知的任何其它适当的光学元件来进行光谱过滤。可对每一捕捉的图像使用不同的过滤器“带”。对于获得图像的每一个波长或波段的检测波长中心和宽度可与关注的荧光发射匹配，而不管它是用于粒子分类还是报告信号。
如此，图8所示的系统的检测子系统被配置成同时在不同的波长或波段处生成多个图像。尽管图8所示的系统包括两个检测器，但应该理解该系统可包括两个以上检测器(例如，三个检测器、四个检测器等)。如上所述，每一检测器可被配置成通过包括用于将不同波长或波段的光同时定向到不同的检测器的一个或多个光学元件来在不同的波长或波段上同时生成图像。此外，尽管该系统在图8中被示为包括多个检测器，但应该理解该系统可包括单个检测器。单个检测器可用于在多个波长或波段上顺序地生成多个图像。例如，可将不同波长或波段的光顺序地定向到衬底，并且在用不同波长或波段中的每一个照明衬底期间可生成不同的图像。在另一个示例中，可改变用于选择定向到单个检测器的光的波长或波段不同的过滤器(例如，通过将不同的过滤器移入或移出成像路径)以在不同的波长或波段处顺序地生成图像。
因此，图8所示的检测子系统被配置成在关注的几个波长上生成表示粒子92的荧光发射的多个或一系列图像。此外，该系统可被配置成向处理器(例如，处理引擎)提供表示粒子的荧光发射的多个或一系列数字图像。在一个这样的示例中，该系统可包括处理器110。处理器110可被配置成从检测器104和108获取(例如，接收)图像数据。例如，可将处理器110以本领域中已知的任何适当的方式(例如，经由各自将检测器中的一个耦合到处理器的传输介质(未示出)、经由各自耦合在检测器中的一个和处理器之间的诸如模-数转换器之类的一个或多个电子组件(未示出)等)耦合到检测器104和108。
较佳的是，处理器110被配置成处理和分析图像以确定粒子92的一个或多个特性，诸如粒子的分类和关于粒子的表面上发生的反应的信息。该一个或多个特性可由处理器以诸如具有对于每一个波长或波段的每一个粒子的荧光大小的条目的数据数组之类的任何适当的格式来输出。
处理器110可以是诸如通常包含在典型的个人计算机、大型计算机系统、工作站等中的处理器。一般而言，术语“计算机系统”可广泛地定义为包括具有从存储介质执行指令的一个或多个处理器的任何装置。处理器可利用任何其它适当的功能硬件来实现。例如，处理器可包括具有固件中的固定程序的DSP、现场可编程门阵列(FPGA)或采用以诸如甚高速集成电路(VHSIC)硬件描述语言(VHDL)等高级程序设计语言“编写”的顺序逻辑的其它可编程逻辑器件(PLD)。在另一个示例中，可在处理器110上执行的程序指令(未示出)如所需地可用诸如C#、C++中的适当部分、ActiveX控件、JavaBeans、微软基础类(″MFC″)或其它技术或方法等高级语言来编码。程序指令可以用各种方式中的任一种来实现，包括基于过程的技术、基于组件的技术和/或面向对象的技术等等。
图8所示的系统可如此处对于其它系统和实施例所描述地进一步配置。此外，图8所示的系统具有本文所述的其它实施例的所有优点。
如上所述，图7-8所示的系统包括设置在系统的照明路径中的一个或多个偏振组件。此外，如上所述，图7-8所示的系统可包括一个以上光源。在某些这样的实施例中，光源中的某一些可用于激发来自耦合到粒子的不同材料的荧光(例如，第一光源可用作用于分类染料的激发光源，第二光源可用作用于报告染料的激发光源等)。如此，由光源中的每一个生成的光的偏振可独立地改变由此增加由光源中的每一个激发的材料的荧光。例如，诸如本文所述的偏振组件之类的偏振组件可位于光源中的每一个的照明路径中，并且如果由光源生成的光束被组合到一公共照明路径中，则可将偏振组件设置在组合光束的光学元件上游的照明路径中。如此，照明粒子的每一个光束的偏振可独立地改变和控制，以增加并且甚至可能最大化由系统执行的荧光测量中的每一个(或至少一个以上)的大小。
鉴于本说明书，本领域的技术人员将明白本发明的各方面的其它实施例和替换实施例。例如，提供了用于增加由荧光团发出的荧光的系统、照明子系统和方法。因此，本说明书应被解释为仅仅是说明性的，并且目的是教会本领域的技术人员实现本发明的一般方式。应该理解，本文所示和所述的本发明的形式应视为目前较佳的实施例。各种元件和材料可取代本文所示和所描述的那一些，可颠倒部件和过程，且可独立地使用本发明的某些特征，所有这些对得益于本发明的这一描述的本领域技术人员都是显而易见的。可在不背离所附权利要求书所述的本发明的精神和范围的情况下对本文所述的元件进行改变。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种被配置成测量粒子的荧光的系统，包括：
被配置成用具有沿不平行于通过所述系统的粒子流的方向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振的光照明所述粒子的照明子系统，其中主要为各向同性的荧光团被附着或包含于所述粒子中，并且其中，所述光的偏振导致由所述主要为各向同性的荧光团发射的荧光比在用主要在平行于通过所述系统的粒子流的方向上定向的线偏振光或非偏振光照明时由所述主要为各向同性的荧光团发射的荧光更明亮；以及
被配置成响应于由所述荧光团发射的荧光生成来输出信号的检测子系统。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述照明子系统包括一个或多个激光器。
3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述照明子系统包括选自由发光二极管、弧光灯、光纤发光器和灯泡组成的组的一个或多个非激光光源。
4.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述偏振具有小于100∶1的偏振比。
5.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述偏振具有大于100∶1的偏振比。
6.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述主要为各向同性的荧光团包括R-藻红蛋白。
7.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述主要为各向同性的荧光团包括有机或非有机染料。
8.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述系统还被配置为流式细胞器。
9.一种被配置成向测量系统提供照明的照明子系统，包括：
被配置成生成光的光源；以及
被配置成在由所述测量系统执行的测量期间在所述光照明粒子前改变所述光的偏振的偏振组件，其中所述经改变的偏振是圆偏振或椭圆偏振。
10.如权利要求9所述的照明子系统，其特征在于，所述光源包括一个或多个激光器。
11.如权利要求9所述的照明子系统，其特征在于，所述光源包括选自由发光二极管、弧光灯、光纤发光器和灯泡组成的组的一个或多个非激光光源。
12.如权利要求9所述的照明子系统，其特征在于，所述偏振组件包括半波延迟器、四分之一波延迟器、延迟器组或其某一组合。
13.如权利要求9所述的照明子系统，其特征在于，所述偏振组件被配置成生成具有小于100∶1的偏振比的偏振光。
14.如权利要求9所述的照明子系统，其特征在于，所述荧光团包括R-藻红蛋白。
15.如权利要求9所述的照明子系统，其特征在于，所述荧光团包括有机或非有机染料。
16.如权利要求9所述的照明子系统，其特征在于，所述测量系统被配置为流式细胞器。
17.如权利要求9所述的照明子系统，其特征在于，所述测量系统被配置为荧光成像系统。
18.一种用于增加由附着或包含在粒子中的主要为各向同性的荧光团发射的荧光的方法，包括在测量期间在光照明粒子前改变所述光的偏振，其中所述经改变的偏振是沿相对于由所述光和保持所述粒子的板限定的入射平面的非平行方向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振，并且其中所述光的偏振导致由所述主要为各向同性的荧光团发射的荧光比在用主要平行于所述入射平面定向的线偏振光或非偏振光照明时由所述主要为各向同性的荧光团发射的荧光更明亮。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述经改变的偏振具有小于100∶1的偏振比。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述经改变的偏振具有大于100∶1的偏振比。
21.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述检测子系统相对于所述粒子的照明方向呈大于约60度来定位。
22.如权利要求9所述的照明子系统，其特征在于，还包括置于所述光源和所述偏振组件之间的用于聚焦所述非偏振光的光学元件。
23.如权利要求9所述的照明子系统，其特征在于，所述偏振组件是多个串联排列的偏振组件中的一个，并且其中所述多个偏振组件共同用于使所述非偏振光偏振以具有圆偏振或椭圆偏振。

Claims (23)

1.一种被配置成测量粒子的荧光的系统，包括：
被配置成用具有在非垂直方向上定向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振的光照明所述粒子的照明子系统，其中荧光团被附着或包含于所述粒子中，并且其中，所述光的偏振导致由所述荧光团发射的荧光比在用在主要为垂直的方向上定向的线偏振光或非偏振光照明时由所述荧光团发射的荧光更明亮；以及
被配置成响应于由所述荧光团发射的荧光来生成输出信号的检测子系统。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述照明子系统包括一个或多个激光器。
3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述照明子系统包括选自由发光二极管、弧光灯、光纤发光器和灯泡组成的组的一个或多个非激光光源。
4.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述偏振具有沿任何方向小于100∶1的偏振比。
5.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述偏振具有沿非垂直方向大于100∶1的偏振比。
6.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述荧光团包括R-藻红蛋白。
7.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述荧光团包括有机或非有机染料。
8.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述粒子被配置成发射荧光，且其中所述光的偏振导致由所述粒子发射的荧光比在用在主要为垂直的方向上定向的线偏振光或非偏振光照明时由所述粒子发射的荧光更明亮。
9.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述系统还被配置为流式细胞器。
10.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述系统还被配置为荧光成像系统。
11.一种被配置成向测量系统提供照明的照明子系统，包括：
被配置成生成光的光源；以及
被配置成在由所述测量系统执行的测量期间在所述光照明粒子前改变所述光的偏振的偏振组件，其中所述经改变的偏振是在非垂直方向上定向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振，其中荧光团被附着或包含在粒子中，并且其中所述经改变的偏振导致由所述荧光团发射的荧光比在用在主要为垂直的方向上定向的线偏振光或非偏振光照明时由所述荧光团发射的荧光更明亮。
12.如权利要求11所述的照明子系统，其特征在于，所述光源包括一个或多个激光器。
13.如权利要求11所述的照明子系统，其特征在于，所述光源包括选自由发光二极管、弧光灯、光纤发光器和灯泡组成的组的一个或多个非激光光源。
14.如权利要求11所述的照明子系统，其特征在于，所述偏振组件包括半波延迟器、四分之一波延迟器、延迟器组或其某一组合。
15.如权利要求11所述的照明子系统，其特征在于，所述偏振具有沿任何方向小于100∶1的偏振比。
16.如权利要求11所述的照明子系统，其特征在于，所述经改变的偏振具有沿非垂直方向大于100∶1的偏振比。
17.如权利要求11所述的照明子系统，其特征在于，所述荧光团包括R-藻红蛋白。
18.如权利要求11所述的照明子系统，其特征在于，所述荧光团包括有机或非有机染料。
19.如权利要求11所述的照明子系统，其特征在于，所述测量系统被配置为流式细胞器。
20.如权利要求11所述的照明子系统，其特征在于，所述测量系统被配置为荧光成像系统。
21.一种用于增加由附着或包含在粒子中的荧光团发射的荧光的方法，包括在测量期间在光照明粒子前改变所述光的偏振，其中所述经改变的偏振是在非垂直方向上定向的线偏振、圆偏振或椭圆偏振。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述经改变的偏振具有沿任何方向小于100∶1的偏振比。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述经改变的偏振具有沿非垂直方向大于100∶1的偏振比。
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