KR20070095306A - 시스템, 조명 서브 시스템 및 형광원에 의해 방출된 형광을증가하는 방법 - Google Patents

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Abstract

시스템, 조명 서브 시스템 및 형광원에 의해 방출된 형광을 증대하는 방법이 제공된다. 입자들의 형광을 측정하도록 구성된 하나의 시스템은 비수직 방향으로 배향된 선형 편광, 원형 편광 혹은 타원형 편광을 가진 빛으로 입자들을 조명하도록 구성된 조명 서브 시스템을 포함한다. 상기 빛의 편광은 형광원에 의해 방출된 형광을 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광된 빛이나 비편광된 빛으로 조명될 때 형광원에 의해 방출된 형광보다 더 밝게 한다. 상기 시스템은 또한 형광원에 의해 방출된 형광에 응답하여 출력 신호를 발생하도록 구성된 검출 서브 시스템을 포함한다.

Description

시스템, 조명 서브 시스템 및 형광원에 의해 방출된 형광을 증가하는 방법{SYSTEMS, ILLUMINATION SUBSYSTEMS, AND METHODS FOR INCREASING FLUORESCENCE EMITTED BY A FLUOROPHORE}
본 발명은 일반적으로 시스템, 조명 서브 시스템 및 형광원에 의해 방출된 형광을 증가하는 방법에 관한 것이다. 어떤 실시예는 형광원이 부착되거나 형광원이 결합된 입자들을 조명하는데 사용되어 형광원에 의해 방출된 형광을 증가시키는 빛의 편광을 변경하는 것에 관한 것이다.
이하 설명과 예시들은 이 섹션에 속한다는 이유로 종래 기술로 인정되는 것은 아니다.
광학 시스템은 바이오 샘플과 같은 다수의 서로 다른 샘플에 대한 측정을 얻는데 사용되어 왔으며 앞으로 더욱 사용될 것이다. 바이오 분석 분야에서 더욱 중요해지는 하나의 특정한 광학 기반 시스템은 유세포 분석기(flow cytometer)이며, 이는 과학자가 비교적 짧은 시간 내에 비교적 큰 수의 분석물에 대한 샘플을 시험하는 것을 허용한다. 모든 광학 시스템에서와 같이, 유세포 분석기의 측정 정확도 는 유세포 분석기를 사용할 때 얻어질 수 있는 신호대 잡음비(SNR)에 많은 부분 의존한다. 특히, SNR이 증가함에 따라 측정 정확도가 증가한다.
유세포 분석기의 광학 설계와 구조는, 따라서, 모든 광학 시스템과 같이, SNR 요건을 고려해 개발되었다. 예를 들어, SNR이 증가될 수 있는 한가지 방법은 측정되는 입자들을 조명하는데 사용되는 광원의 밝기를 증가하는 것이다. 특히, 측정에 이용되는 빛의 양이 증가하면, 일반적으로 측정의 SNR이 증가할 것이다. 이와 같이, 레이저와 같은 높은 세기의 광원은 종종 유세포 분석기에 사용된다. 유세포 분석기의 SNR을 증가하는 다른 방법은 유세포 분석기 내에 포함된 집속 광학계, (샘플로부터 산란되거나 방출되는 빛을 집광하는) 집광계, 및 검출기의 선택 및 구성을 포함할 수 있다. 비록 유세포 분석기가 최초로 도입된 이래로 유세포 분석기의 SNR의 개선이 이루어져왔지만, 최대 가능한 SNR에 대한 추구는 현재 진행 중인 작업이다.
최근에는, 산란 및 형광 측정을 위한 유세포 분석기 내의 유세포를 조명하는데 선형 편광된 빛이 사용된다. 예를 들어, 드 그루쓰 등(de Grooth et al.)의 미국 특허 제5,017,497호 - 참조 문헌으로서 통합되어 여기에 전체가 개시된 것으로 간주되는 - 는 빔 축에 수직한 평면 내의 수직한 각도로 선형 편광된 빛을 사용하는 것을 기술하고 있다. 그러나, 드 그루쓰 등은 "선형 편광된" 빛에 대한 편광율(polarization ratio)의 정의를 제공하고 있지 않다. 또한, 형광 측정을 위한 조명광의 편광 상태의 (예를 들어 타원으로의) 변경은 이전에는 수행되지 않았었다.
형광 염색된 비드 및 형광 염색된 시약과 같은 유세포 분석기 내에서 측정되 는 샘플을 최적화하는 것은 유세포 분석기 측정의 SNR을 증가하는 수단으로서 또한 탐구되어 왔다. 그러나, 유세포 분석기 측정 내의 사용에 이용 가능한 물질은 종종 어느 정도 제한된다. 예를 들어, 그 물질은 시험될 샘플과 공존 가능해야 한다. 다시 말해, 바람직하게는, 비드 및 형광 다이의 물질은 측정되는 샘플을 변경하거나 역으로 그것에 의해 변경되지 않는다. 또한, 그 물질은 바람직하게는 유세포 분석기의 설계와 공존 가능하다. 예를 들어, 바람직하게는, 형광 다이는 유세포 분석기의 적어도 한 개의 광원의 파장에서 여기된다. 또한, 비드의 물질은 바람직하게는 유세포 분석기에 의해 노출될 빛의 파장에 의해 변경되지 않는다. 적어도 이와 같은 이유로, 샘플에 사용될 물질을 변경하는 것보다 유세포 분석기의 구성 및 광학 설계를 변경함으로써 유세포 분석기 측정의 SNR을 증가하도록 노력하는 것이 보다 매력적이고 덜 복잡할 것이다.
따라서, 유세포 분석기나 기타 형광 기반 영상 및/또는 측정 시스템의 한 개 혹은 그 이상의 파라미터를 변경함으로써 시스템, 서브 시스템 및 형광원에 의해 방출된 형광을 증가하는 방법을 개발하는 것은 바람직할 것이다.
다양한 시스템, 조명 서브 시스템 및 방법 실시예의 이하 설명은 첨부된 청구항의 주제를 제한하도록 해석되는 것이 아니다.
실시예는 입자의 형광을 측정하도록 구성된 시스템에 관한 것이다. 그 시스템은 비수직 방향으로 배향된 선형 편광, 원형 편광 혹은 타원형 편광을 가진 빛으로 입자를 조명하도록 구성된 조명 서브 시스템을 포함한다. 형광원은 입자에 부착되거나 합체되어 있다. 빛의 편광은, 주로 수직 방향으로 배향된 (예를 들어, 레이저나 비레이저 광원으로부터의) 선형 편광된 빛이나 (예를 들어, 임의의 광원으로부터의) 비편광된 빛으로 조명될 때 형광원에 의해 방출된 형광보다 형광원에 의해 방출된 형광을 더 밝게 한다. 시스템은 또한 형광원에 의해 방출된 형광에 응답하여 출력 신호를 발생하도록 구성된 검출 서브 시스템을 포함한다.
한 실시예에서, 조명 서브 시스템은 한 개 혹은 그 이상의 레이저를 포함한다. 다른 실시예에서, 조명 서브 시스템은 발광 다이오드(LEDs), 아크 램프, 광섬유 조명이기 및 광벌브로 구성된 그룹에서 선택된 한 개 혹은 그 이상의 비레이저 광원을 포함한다.
한 실시예에서, 편광은 임의 방향에서 100:1보다 작은 편광율(즉, 편광의 준부축에 대한 편광의 준주축의 비)을 가진다. 다른 실시예에서, 비수직 방향에서 100:1보다 큰 편광율을 가진다. 대조적으로, 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광은 100:1보다 큰 편광율을 가지며 주로 수직 방향으로 배향된다. 여기서 선형 편광은 수직 방향에 대한 준주축의 배향에 무관하게 100:1보다 큰 편광율을 가지는 편광 상태인 것으로 정의된다.
수직에 대해 임의 방향으로 배향되고 타원형 편광된 비선형 편광은 100:1보다 작은 편광율을 가지는데, 다른 경우라면, 타원형 편광은 어떤 배향을 가진 선형 편광으로 간주될 것이다. 기술적으로, 모든 편광은 타원형으로 해석될 수 있다. 만약 편광이 이와 같이 정의된다면, 원형 편광은 준주축 및 준부축이 모두 같은 크기를 가진 타원형 편광의 특별한 경우일 것이다. 선형 편광은 또한 준주축과 준부축의 크기가 100:1보다 큰 비율을 가진 타원형 편광의 특별한 경우일 것이다.
일 실시예에서, 형광원은 알-피코에리테린(R-PE)을 포함한다. 다른 실시예에서, 형광원은 유기 혹은 비유기 다이를 포함한다. 어떤 실시예에서, 입자들은 형광을 방출하도록 구성된다. 상기 일 실시예에서, 빛의 편광은 입자에 의해 방출된 형광을, 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광된 빛이나 비편광된 빛으로 조명될 때 입자에 의해 방출된 형광보다 더 밝게 한다.
일 실시예에서, 시스템은 유세포 분석기로서 구성된다. 다른 실시예에서, 시스템은 형광 영상 시스템으로서 구성된다. 상술한 시스템의 각각의 실시예는 여기 설명된 바와 같이 더 구성될 수 있다.
다른 실시예는 측정 시스템에 대한 조명을 제공하도록 구성된 조명 서브 시스템에 관한 것이다. 조명 서브 시스템은 빛을 발생하도록 구성된 광원을 포함한다. 조명 서브 시스템은 또한 측정 시스템에 의해 수행되는 측정 동안 빛이 입자를 조명하기 전에 빛의 편광을 변경하도록 구성된 편광 요소를 포함한다. 변경된 편광은 비수직 방향으로 배향된 선형 편광, 원형 편광 혹은 타원형 편광이다. 형광원은 입자들에 부착되거나 합체된다. 변경된 편광은 형광원에 의해 방출된 형광을 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광된 빛이나 비편광된 빛으로 조명될 때 형광원에 의해 방출된 형광보다 더 밝게 한다.
일 실시예에서, 광원은 한 개 혹은 그 이상의 레이저를 포함한다. 다른 실시예에서, 광원은 LED, 아크 램프, 광섬유 조명이기 및 광 벌브로 구성된 그룹에서 선택된 한 개 혹은 그 이상의 비 레이저 광원을 포함한다. 어떤 실시예에서, 편광 요소는 반파장 지연기(half-wave retarder), 1/4 파장 지연기(quarter-wave retarder), 지연기 스택(retarder stack) 혹은 이들의 어떤 조합을 포함한다.
일 실시예에서, 변경된 편광은 임의 방향에서 100:1보다 낮은 편광율을 가진다. 다른 실시예에서, 변경된 편광은 비수직 방향에서 100:1보다 큰 편광율을 가진다. 다른 실시예에서, 형광원은 R-PE를 포함한다. 다른 실시예에서, 형광원은 유기 혹은 비유기 다이를 포함한다.
일 실시예에서, 측정 시스템은 유세포 분석기로서 구성된다. 다른 실시예에서, 측정 시스템은 형광 영상 시스템으로서 구성된다. 상술한 조명 서브 시스템의 각각의 실시예는 여기 설명된 바와 같이 더 구성될 수 있다.
추가적인 실시예는 입자들에 부착되거나 합체된 형광원에 의해 방출된 형광을 증가하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 측정 동안 빛이 입자를 조명하기 전에 빛의 편광을 변경하는 것을 포함한다. 변경된 편광은 비수직 방향으로 배향된 선형 편광, 원형 편광 혹은 타원형 편광이다. 일 실시예에서, 변경된 편광은 임의 방향에서 100:1보다 낮은 편광율을 가진다. 다른 실시예에서, 변경된 편광은 비수직 방향에서 100:1보다 큰 편광율을 가진다. 상술한 방법의 각각의 실시예는 여기 설명된 다른 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 장점들은 양호한 실시예들의 이하 상세한 설명과 첨부된 도면을 통해 본 기술 분야의 기술자에게 명백해질 것이다.
도1은 유세포 분석기를 위한 광학 구성의 일 예의 사시도이다.
도2는 유세포 분석기를 위한 광학 구성의 일 실시예의 사시도이다.
도3-6은 빛의 편광을 변경하지 않은 것과 빛의 편광을 변경한 것 모두에 대해, 빛으로 입자를 조명함으로써 얻어진 데이터를 기술한 그래프이다.
도7-8은 입자의 형광을 측정하도록 구성된 시스템의 다양한 실시예의 단면도이다.
본 발명은 다양한 변경과 대안적 형태로 이루어질 수 있으며, 그 특정 실시예는 도면으로 예시되어 보여지고 여기서 상세히 설명될 것이다. 도면은 축척에 맞지 않을 수 있다. 그러나, 도면과 상세한 설명은 본 발명을 개시된 특정 형태로 제한하도록 의도된 것이 아니며, 오히려, 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 정신 및 범위에 속하는 모든 변형, 균등 및 대안을 포함하도록 의도된 것임을 이해해야 한다.
이하 설명은 일반적으로 시스템, 조명 서브 시스템, 및 형광원을 조명하는데 사용되는 광 빔의 편광 상태 및/또는 방향 (즉, 타원 편광의 정도)을 변경함으로써 알-피코에리테린(R-PE)과 같은 형광원으로부터 증가된 형광을 얻는 방법에 관한 것이다.
비록 여기서 실시예는 입자들에 대해 기술하고 있지만, 시스템, 조명 서브 시스템 및 방법은 마이크로 구체(microspheres), 폴리스틸렌 비드(polystyrene beads), 마이크로 입자(microparticles), 금 나노 입자(gold nanoparticles), 양자 닷(quantum dots), 나노 닷(nanodots), 나노 입자(nanoparticles), 나노 쉘(nanoshells), 비드(beads), 마이크로 비드(microbeads), 라텍스 입자(latex particles), 라텍스 비드(latex beads), 형광 비드(fluorescent beads), 형광 입자(fluorescent particles), 컬러 입자(colored particles), 컬러 비드(colored beads), 티슈(tissue), 세포(cells), 미생물(micro-organisms), 유기 물질(organic matter), 혹은 임의의 비유기 물질(non-organic matter)에 사용될 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 입자들은 분자 반응을 위한 비클로 기능할 수 있다. 적합한 마이크로 구체, 비드 및 입자는 풀턴(Fulton)의 미국 특허 제5,736,330호, 챈들러 등(Chandler et al.)의 미국 특허 제5,981,180호, 풀턴의 미국 특허 제6,057,107호, 챈들러 등의 미국 특허 제6,268,222호, 챈들러 등의 미국 특허 제6,449,562호, 챈들러 등의 미국 특허 제6,514,295호, 챈들러 등의 미국 특허 제6,524,793호, 및 챈들러의 미국 특허 제6,528,165호에 기술되어 있으며, 이들은 참조로서 결합되어 여기에 전체가 개시된 것으로 간주된다. 여기에 기술된 시스템, 조명 서브 시스템 및 방법은 이 특허에서 기술된 마이크로 구체, 비드 및 입자 중 하나와 함께 사용될 수 있다. 또한, 유세포 분석에 사용되는 마이크로 구체는 텍사스 오스틴에 소재한 루미넥스 코포레이션(Luminex Corporation)과 같은 제조명으로부터 얻어질 수 있다. 여기서 용어 "입자", "비드" 및 "마이크로 구체"는 상호 교환적으로 사용된다.
비록 어떤 실시예는 여기서 레이저에 관한 것으로 기술되지만, 시스템, 조명 서브 시스템 및 방법 실시예는 한 개 혹은 그 이상의 레이저 및/또는 한 개 혹은 그 이상의 비 레이저 광원과 함께 사용될 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 이들 비 레이저 광원은 발광 다이오드(LEDs), 아크 램프, 광섬유 조명이기, 광 벌브, 및 이 기술 분야에서 공지된 임의의 다른 적합한 비 레이저 광원을 포함한다. 임의의 코히런트, 일부 코히런트 또는 비 코히런트 광원은, 여기에 기술된 것과 같이 구성될 수 있는 적합한 광 필터 및/또는 편광 요소에 의해, 선택된 편광 상태 및/또는 방향을 가지도록 조절 혹은 변경될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
도면을 살펴보면, 도면은 축척에 맞도록 도시되지 않았음을 알 수 있다. 특히, 도면의 구성 요소들 중 일부의 크기는 그 구성 요소의 특징을 강조하기 위해 상당히 과장되어 있다. 유사하게 구성될 수 있는 둘 이상의 도면에 도시된 구성 요소는 동일한 참조 번호를 사용해 표시되었다.
통상적으로 유세포 분석기는 유세포 내에 포함된 샘플을 조명하도록 선형 편광된 레이저 빔을 사용한다. 유세포 분석기에서 사용되는 대부분의 레이저에 의해 발생된 빛은 100:1의 최소 편광율로 선형 편광된다. 실제 레이저에 의해 발생된 선형 편광된 빛은 편광율이 100:1에서 800:1을 넘는 것까지 현저히 다양하다. 편광율은 타원형 편광의 축 성분들의 크기의 비율을 기술한다. 광파는 두 개의 수직한 파동 성분들로 수학적으로 모델링될 수 있다. 이들 두 개의 수직 파동들의 상대적 위상에 따라, 결과적인 순시 편광 상태 벡터는 광파가 한 파장을 진행하는 동안 타원을 그릴 것이다. 편광율은 타원형 편광의 (준주축 성분에 수직한) 준부축 성분의 크기에 대한 준주축 성분의 크기의 비율이다. 따라서, 용어 "선형 편광된"은 절대적인 용어가 아니라 상대적 용어이며, 최소 100:1을 초과하는 편광율을 가진 선형 편광된 광빔 - 그러나 이 값은 실제에 있어 현저히 변할 수 있다 - 을 지칭한다. 준주축의 방향은 편광의 방향을 정의할 것이다.
실험 데이터는 소정의 위상 지연을 레이저 빔에 인가하는 것이 그 레이저 빔으로 조명될 때 어떤 형광원에 의해 방출된 형광의 양을 현저히 증가시킴을 보여주었다. 형광원에 의해 방출된 형광을 증가할 수 있는 위상 지연은 레이저 빔의 편광 상태를 변경된 편광 상태로 변경한다. 이 변경된 편광 상태는 수직에 대해 소정 각의 방향을 가진 선형 편광, 원형 편광 혹은 타원형 편광을 포함할 수 있다. 타원형 편광의 방향은 수직 방향과 떨어진 중요한 성분을 가질 수 있다.
용어 "수직"혹은 "수직 방향"은 서로 다른 측정 시스템에 대해 서로 다르게 정의될 수 있다. 예를 들어, 유세포 분석기에서, 주로 수직 방향으로 배향된 편광이란 입자가 조명되는 지점에서 유세포 분석기를 통한 입자의 흐름에 실질적으로 평행한 준주축을 가진 편광으로서 여기서는 일반적으로 정의된다. 이와 같이, 레이저는 임의 위치와 방향으로 배열될 수 있고, 거울의 사용 등을 통해, 빔은 경로가 정해지고, 반사되고, 지향되어 빔이 입자에 충돌할 때 빔의 편광이 선택된 방향을 가지도록 한다. 이 경우, 편광의 방향은, 입자에 부딪히는 빛의 편광 상태가 선택된 방향을 가지는 한, 조명 경로를 따라 변할 수 있다.
형광 영상 시스템 ("플레이트 리더")에서, 입자들은 기판 위에서 실질적으로 고정된 위치들을 가질 수 있다. 따라서, 이 시스템에서, 수직 방향은 입자들의 흐 름에 대해 정의될 수 없다. 여기서 더 기술되는 어떤 영상 측정 시스템에 대해, 빛은 입자들이 위치한 평면에 대해 실질적으로 수직한 각도로 지향될 수 있다. 이 시스템에서, 입자가 조명되는 지점에서, 빛의 편광 벡터는 방향에 무관하게 이 평면에 실질적으로 평행하게 될 것이다. 이와 같이, 편광의 방향은 측정 시스템의 상이한 축이나 평면에 대해 정의될 수 있다. 이 구조에서, 입사광의 편광 방향은 소정의 형광 다이에 의한 형광 빛의 "주된" 편광 성분 (또는 방향)에 기여할 것이다. 루미넥스 칼리브레이션 비드에 사용되는 칼리브레이터 다이와 같은 다이는 작고 선형적이다. 이 다이는 입사광의 편광을 형광 빛에서 현저하고 측정 가능한 정도로 재생한다. 만약 이 형광 빛이 편광 빔 분할기를 사용해 분할된다면, 입사광의 편광에 정렬된 선형 편광된 형광 빛은 빔 분할기의 방향에 따라 편광 빔 분할기를 통과하거나 이것에 의해 반사될 것이다. 만약 이 편광 빔 분할기가 빔 분할 평면이 형광 빛의 선형 편광에 평행하도록 배향된다면, 수직 입사의 입사광으로 플레이트 리더 배열에 대해 선형 편광된 입사광을 정의하는 기하 구조가 될 것이다. 어떤 경우라도, 광원에 의해 방출된 빛의 편광은 (임의 방향으로 배향된) 선형일 수 있고 여기에서 설명된 실시예에 따라 편광 방향을 변경하거나 편광 상태를 원형이나 (임의 방향으로 배향된) 타원형으로 변경하는 것에 의해 변경될 수 있다.
선택적으로 형광 영상 측정 시스템은 빛이 입자들을 유지하는 플레이트의 평면에 대해 비스듬하거나 비수직인 경사각으로 그 입자들을 지향하도록 배열될 수 있다. 이 배열에서, 입사광의 편광 방향은 편광의 준주축이 입사 평면에 실질적으로 평행할 때 수직인 것으로 정의될 수 있다. 입사 평면은 입사광, 반사광, 및 광 학 평면을 넘어 매체를 통하거나 이것을 향해 부분적으로 혹은 전체적으로 전송되는 (또는 만약 표면 매체가 비전송질인 경우 전송되는) 임의 광을 포함한다. 그러면 이 편광은 주로 "P" 편광이 될 것이다.
일 실시예에 따르면, 따라서, 입자들에 부착되거나 합체된 형광원에 의해 방출된 형광을 증가하는 방법은 측정 동안 빛이 입자들을 조명하기 전에 빛의 편광을 변경하는 것을 포함한다. 변경된 편광은 비수직 방향으로 배향된 선형 편광, 원형 편광 혹은 타원형 편광이다. 일 실시예에서, 변경된 편광은 임의 방향에서 100:1보다 작은 편광율을 가진다. 다른 실시예에서, 변경된 편광은 비수직 방향에서 100:1보다 큰 편광율을 가진다. 대조적으로, 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광은 100:1보다 큰 편광율을 가지고 수직 방향으로 배향된다. 비수직 방향으로 배향된 선형 편광 (즉, 비수직 방향으로 배향된 준주축을 가진 선형 편광)은100:1보다 큰 편광율을 가지지만 수평 편광에 대한 수직 편광의 비율은 100:1보다 작다. 선형 편광의 방향에 무관하게, 편광율은 100:1보다 크다. 다시 말해, 선형 편광의 방향이 주어지면, 준주축에 직교하는 편광 성분에 대한 준주축 편광 성분의 비율은 100:1보다 크다.
타원형 편광되거나 임의 방향으로 배향된 비선형 편광은 100:1보다 작은 편광율을 가지나, 다른 경우, 타원형 편광은 어떤 방향을 가진 선형 편광으로 간주될 것이다. 기술적으로, 모든 편광은 타원형으로 지칭될 수 있다. 만약 편광이 이와 같이 정의된다면, 원형 편광은 준주축 및 준부축이 같은 크기를 가지는 타원형 편광의 특별한 경우가 될 것이다. 또한 선형 편광은 준주축과 준부축이 100:1보다 큰 비율을 가지는 타원형 편광의 특별한 경우가 될 것이다.
어떤 실시예에서, 형광원은 R-PE를 포함한다. 다른 실시예에서, 형광원은 유기 또는 비유기 다이를 포함한다. 유기 또는 비유기 다이는 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 다이를 포함할 수 있는데, 예시들은 위에서 참조로 통합된 특허들에 포함되어 있다. 형광원은 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 방법으로 입자들에 부착되거나 합체될 수 있다. 형광원은 입자들의 분류나 식별 (예: 입자들이 속한 집단의 서브 세트의 식별)을 위해 사용된다. 선택적으로, 형광원은 입자들의 표면에서 발생된 반응의 식별, 결정 또는 정량화를 위해 사용될 수 있다.
상술한 방법의 각각의 실시예는 여기에서 설명되는 임의의 다른 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상술한 방법의 각각의 실시예는 여기서 설명된 임의의 조명 서브 시스템이나 시스템에 의해 수행될 수 있다. 더욱이, 상술한 방법의 각각의 실시예는 여기서 설명된 다른 실시예의 모든 장점을 가진다.
상술한 테크닉은 주로 선형 편광된 빛의 빔을 발생하는 레이저를 사용하여 입자를 조명하도록 구성된 기존의 유세포 분석기에 적용될 수 있다. 기존의 유세포 분석기에 사용되는 하나의 광학 배열이 도1에 도시되어 있다. 도1에 도시된 바와 같이, 광학 배열은 레이저나 해당 기술 분야에서 알려진 적합한 광원인 광원(10)을 포함한다. 광원은 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광된 빛을 생성하도록 배열된다. 특히, 광원(10)에 의해 생성된 빛(12)은 선형이고 주로 수직 방향 (즉, 큐빗(16)을 통한 입자들의 흐름(도시 생략)에 실질적으로 평행한 방향)으로 배향된 편광(14)을 가진다.
빛(12)은 그 빛이 큐빗(16)을 통해 흐르는 입자들을 조명하도록 그 큐빗을 향한다. 빛(12)은 또한 광원(10)과 큐빗(16) 사이에 배치된 집속 렌즈와 같은 한 개 혹은 그 이상의 광학 부품(도시 생략)에 의해 큐빗(16)에 집속될 수 있다. 입자나, 입자에 부착된 물질, 혹은 입자에 결합된 물질에 의해 방출 및/또는 산란된 빛은 집광계(18)에 의해 집광된다. 집광계(18)는 집광된 빛을 검출기(20)로 향하게 하도록 배열된다. 검출기(20)는 집광계(18)에 의해 집광된 방출 및/또는 산란된 에 응답하여 출력 신호를 발생한다. 큐빗(16), 집광계(18) 및 검출기(20)는 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 구성 요소를 포함할 수 있다.
도2에 도시된 유세포 분석기 광학 배열의 실시예에서, 도1에 도시된 광학 배열은, 조명의 편광 상태가 위상 지연에 의해, 예를 들어, 타원형 혹은 원형 편광된 상태로 변형되어 R-PE와 같은 형광원에 의해 방출된 형광을 증가시키거나, 가능하다면 심지어 최대화시키도록 변형된다. 도1에 대해 상술한 것과 같이 배열된 도2에 도시된 구성 요소는 간략화를 위해 여기서 더 기술하지 않겠다.
도2에 도시된 광학 배열 실시예는 측정 시스템을 위해 조명을 제공하도록 구성된 조명 서브 시스템을 포함한다. 특히, 도1에 도시된 광학 배열처럼, 도2에 도시된 광학 배열은 광원(10)을 포함한다. 광원(10)은 상술한 것과 같이 빛(12)을 발생하도록 구성된다. 일 실시예에서, 광원(10)은 레이저이다. 레이저는 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 레이저일 수 있다. 또한, 광학 배열은 둘 이상의 레이저(도시 생략)를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 광원(10)은 LED, 아크 램프, 광섬유 조명이기 및 광 벌브로 구성된 그룹에서 선택된 비 레이저 광원이다. 광원은 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 광원을 포함할 수 있다. 또한, 도2에 도시된 광학 배열은 둘 이상의 비 레이저 광원(도시 생략)을 포함할 수 있다. 더욱이, 광학 배열은 한 개 혹은 그 이상의 레이저와 한 개 혹은 그 이상의 비 레이저 광원을 포함할 수 있다.
도1에 도시된 광학 배열과는 다르게, 도2에 도시된 광학 배열은 광원(10)과 큐빗(16) 사이에 배열된 편광 요소(22)를 포함한다. 편광 요소(22)는 측정 시스템에 의해 수행되는 측정 중에 빛이 입자(도2에서 도시 생략)를 조명하기 전에 빛(12)의 편광을 변경하도록 구성된다. 다시 말해, 편광 요소(22)는 빛(12)의 편광 상태 및/또는 방향을 변경하도록 빛의 광로 내에 배치된다. 예를 들어, 도2에 도시된 바와 같이, 편광 요소(22)를 통과한 빛(24)은 편광(14)이 배향된 방향과 다른 방향으로 배향된 타원형 편광으로 도시된 변경된 편광(26)을 가진다. 그러나, 변경된 편광(26)은 비 수직 방향으로 배향된 선형 편광, 원형 편광 혹은 (수직에 대해 임의 방향으로 배향된) 타원형 편광이 될 수 있다. 변경된 편광은 임의 방향에서 100:1보다 작은 편광율을 가질 수 있다. 선택적으로, 변경된 편광은 비 수직 방향에서 100:1보다 큰 편광율을 가질 수 있다. 대부분의 레이저가 (선형 편광된 빛을 발생하도록 구성될 때) 다양한 선형 편광율을 가지므로, 편광 요소(22)에 의해 빛(12)에 인가되는 소정 양의 위상 지연은 레이저마다 다를 수 있고 시스템 정렬시 선택될 수 있다.
여기 설명된 실시예에서, 따라서, 지연판, 편광 지연기, 또는 다른 편광 요소나 여기에 기술된 다른 편광 요소들의 조합과 같은 편광 요소는 광원(예: 레이 저)과 조명 타겟(예: 유세포 분석기인 경우 측정되는 입자) 사이에 위치해 광 빔(예: 선형 편광된 빔)의 편광을 변경한다. 어떤 실시예에서, 편광 요소는 반파장 지연기, 1/4파장 지연기, 지연기 스택과 같은 위상 지연 기능들의 조합을 가지도록 구성된 편광 요소, 광원(10)에 의해 발생된 빛의 편광을 변경하는데 사용될 수 있는 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 다른 광학 요소, 혹은 이들의 조합을 포함한다. 이 지연기는, 만약 집속 광학계(도시 생략)가 조명 서브 시스템에 포함된다면, 집속 광학계 앞 또는 뒤의 조명 경로 내에 위치할 수 있다. 또한, 비록 시스템 및 조명 서브 시스템 실시예가 한 개의 편광 요소를 포함하는 것으로 여기서 기술되었더라도, 시스템 및 조명 서브 시스템은 일련의 편광 요소들이 광원에 의해 발생된 광 빔의 편광을 변경하도록 조명 경로 내에 위치한 둘 이상의 편광 요소(도시 생략)를 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
형광원(도시 생략)는 큐빗(16)을 통해 흐르는 입자들에 부착되거나 합체된다. 형광원은 R-PE를 포함할 수 있다. 선택적으로, 형광원은 유기 혹은 비유기 다이를 포함할 수 있다. 유기 혹은 비유기 다이는 해당 기술 분야에서 알려진 적합한 다이를 포함할 수 있다. 형광원은 여기 기술된 것과 같이 더 구성될 수 있다. 변경된 편광은 바람직하게는 형광원에 의해 방출된 형광이 주소 수직 방향으로 배향된 (예컨대 레이저 또는 비 레이저 광원으로부터의) 선형 편광된 빛이나 (예컨대 임의의 광원으로부터의) 비편광된 빛으로 조명될 때 형광원에 의해 방출된 형광보다 더 밝게 되도록 한다. 다시 말해, 편광 요소(22)는 빛(12)의 편광율 및/또는 방향 (또는 편광의 상대 위상)을 선택된 편광 상태 및/또는 방향으로 변경시키며, 이는 타겟 형광원의 측정된 형광 방출을 증가시킨다.
추가적인 실시예에서, 입자 자체가 형광을 방출하도록 구성된다. 그 일 실시예에서, 입자들을 조명하는 편광 요소(22)로부터 나온 빛의 편광은 입자들에 의해 방출된 형광이 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광된 빛이나 비편광된 빛으로 조명될 때 입자들에 의해 방출된 형광보다 더 밝게 되도록 한다. 상술한 바와 같이, 빛(12)의 편광의 상대 위상을 변경하는 것은 비수직 방향을 가진 선형 편광, 원형 편광, 혹은 수직에 대해 임의 각도로 배향된 타원형 편광과 같은 변경된 편광 상태 및/또는 방향을 야기한다.
일 실시예에서, 도2에 도시된 광학 배열은 유세포 분석기로서 구성되는 측정 시스템을 위한 조명을 제공하는데 사용된다. 도2에 도시된 광학 배열은 유세포 분석기에 현재 사용되는 다른 광학 구성들에 비해 많은 장점을 가진다. 예를 들어, 형광원에 의해 방출된 형광을 증가시키기 위해, 편광 지연판(polarization waveplate)과 같은 편광 요소만이 광학 배열의 조명 경로에 삽입된다. 이와 같이, 현재 사용되는 유세포 분석기의 광학 배열은 신호대 잡음비의 현저한 증가와 이에 따른 유세포 분석기의 정확도를 달성하도록 실질적으로 단순한 방식으로 변경될 수 있다. 또한, 어떤 실시예에서, 도2에 도시된 광학 배열은 여기서 더 기술된 영상 시스템과 같은 형광 영상 시스템으로서 구성되는 측정 시스템을 위한 조명을 제공하도록 구성될 수 있다. 이 실시예는 도2에 도시된 광학 배열의 장점도 가질 것이다. 더욱이, 도2에 도시된 광학 배열은 형광원에 의해 방출된 형광의 측정을 수행하고 여기서 기술된 실시예에 의해 제공되는 높은 신호 대 잡음비를 활용할 임의의 측정 시스템에 사용될 수 있다. 도2에 도시된 광학 배열은 여기서 기술되는 바와 같이 더 구성될 수 있다.
최적의 형광원 흡수/방출로 귀착되는 조명의 편광에 인가된 위상 지연의 정확한 양은 예를 들어 유세포 분석기 특성(예: 광원의 파장이나 다른 특성)과 형광원의 특성에 따라서 변할 수 있다. 결과는 아래(예컨대 표1) 제시되며, 이것은 루미넥스 코포레이션으로부터 상업적으로 이용 가능한 루미넥스 LX 100 유세포 분석기 내에서 532nm의 조명을 사용하는 R-PE에 의한 측정된 형광 방출의 증가를 증명한다.
여기서 설명된 시스템, 조명 서브 시스템 및 방법은 증가된 형광을 달성하는 특정 메커니즘에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다 (즉, 형광 신호 응답의 증가는 증가된 흡수 메커니즘에 의해 야기되고/야기되거나 부분적으로는 보다 효율적인 방출 및/또는 방출 검출에 의해 야기될 수 있다). 그러나, 수 개의 가능한 메커니즘들이 아래에 기술된다.
LX 100 유세포 분석기에 사용되는 형광 리포터 다이는 R-PE이다. R-PE 분자는 비교적 크고 240,000 Daltons의 분자량을 가진다. 이들 분자들이 다른 분자들을 통해(즉, 반응 생성물을 통해) 입자들에 부착되므로, 각 R-PE 분자는 입자의 표면에서 이격된 그들의 "중심"을 가지는 것으로 간주될 수 있다. R-PE 분자의 적어도 하나의 외측 단부는 입자로부터 떨어져 그것의 중심을 넘어 상당한 거리에 있을 것이다.
상기 입자가 식염제와 같은 액체의 움직이는 컬럼 내에 포함될 때, 입자들은 수 백 내지 수 천 개의 액체 분자들 - 그들 각각이 압력하에 있는 - 에 의해 액체 운동의 방향으로 운반되거나 "밀쳐진다." 이 압력은 액체의 운동의 원인이다. 또한, 이 압력의 일정한 인가는 입자에 부착된 R-PE 분자들의 다수 (혹은 적어도 일부)가 액체 유동의 방향을 향한 방향으로 배향되도록 한다 (즉, 분자들은 상방을 향해 "휘어진다"). 이 방향은, 마이크로 구체의 전체 표면을 가로질러 위치한 모든 R-PE 분자들에 대해 합쳐질 때, 순 방향 벡터로 귀결된다. 이 방향 벡터는 어떤 편광 상태 및/또는 방향이 조명에 최적인지에 영향을 줄 수 있다.
표준 루미넥스 칼리브레이션 및 제어 입자는 스퀘레인 다이(squaraine dye) 중 하나인 칼리브레이션 다이에 부착되거나 이를 포함한다. 이 칼리브레이션 다이는 R-PE와 같은 방식으로 조명 빔의 편광 상태에 의해 영향을 받지 않는다. 이 비반응성은 칼리브레이션 다이가 합성 다이 - 비교적 작고 형태 인자로 "평평하고" (또는 선형적이고) 입자들의 내부를 통해 임의적으로 분포됨 - 라는 사실에 기인할 것이다. 따라서, 입자들 전역에서 칼리브레이션 다이 분자들의 순 방향은 없다. 따라서, 만약 칼리브레이션 다이 분자들의 흡수 쌍극자 모멘트가 서로 결합된다면, 순 결과는 영에 근사하게 될 것이다. 또한, 칼리브레이션 다이가 작은 선형 분자이므로, 칼리브레이션 다이는 다른 편광 상태를 가진 빛에 대해서 보다 선형 편광된 빛에 대해 보다 효과적으로 반응하려는 경향이 있을 수 있다.
다른 메커니즘 역시 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광된 빛이나 비편광된 빛과는 다른 빛으로 조명될 때 R-PE에 의해 방출된 형광의 관찰된 증가에 기여할 수 있다. 예를 들어, 다른 모든 단백질처럼 R-PE는 헬리컬 혹은 카이럴 구조를 가진다. 이 헬리컬 혹은 카이럴 구조는 조명의 타원형 편광의 정도의 대응하는 변화에서 기인한 R-PE의 응답성(즉, 측정된 형광 방출)의 변화에 대해 부분적으로 책임이 있을 수 있다. R-PE와 같은 단백질은 아미노산들로 이루어지는데, 이들은 종종 광학적 활성화 물질로서 입력되는 빛에 그들이 미치는 영향과 결과적으로 산란된 빛의 편광 상태의 관점에서 "회전한다." 흡수 발색단(chromophore), 그들의 순 쌍극자 모멘트 및 그들의 카이럴 구조의 조합은 형광원에 의한 빛의 가장 효과적인 흡수로 귀결될 조명의 방향 및 편광 상태를 결정하도록 평가될 수 있다.
여기에서 기술된 형광 증가를 위한 다른 잠재적 메커니즘은 R-PE에서 발생하는 포스터 공진 에너지 전이(Foerster Resonance Energy Transfer: FRET)이다. R-PE는 다중 흡수 발색단을 가지고 있어 넓은 흡수 스펙트럼으로 귀결된다. 그러나 R-PE는 비교적 좁은 방출 스펙트럼을 가지고 있어 단일 방출 발색단을 표시한다. 방출 발색단은 FRET를 통해 흡수 발색단으로부터 에너지를 얻는다. 이 프로세스는 형광 발색단이 광자를 방출할 때까지 계속된다. 인접한 발색단 사이의 FRET는 그 발색단들의 진동 쌍극자 모멘트들이 상호 비교적 가깝게 근사하고 그 쌍극자 모멘트들의 전기장을 통해 에너지 전이가 일어날 때 발생한다 (즉, FRET 프로세스 중에는 광자가 방출되지 않는다). R-PE에서, 흡수 발색단은 광자를 방출하지 않으나, 흡수된 에너지를 이웃한 발색단으로 전이시킨다. 편광 상태 및/또는 조명의 방향의 변화는 초기 흡수 발색단에만 영향을 미치는 것이 아니라 가능하게는 인접한 발색단들 사이의 쌍극자 모멘트를 정렬함으로써 FRET 프로세스의 효율성을 증가시킨다.
또한, 원형 편광된 (혹은 타원형 편광된) 빛은 순 각운동량을 가지고 있는 반면, 선형 편광된 빛은 순 각운동량을 갖고 있지 않다. 원형 편광된 빛은 전기장에 의해 발생되는 힘에 응답하여 흡수 물질 내의 전자가 부분적인 원형 (혹은 타원형) 운동을 하도록 한다. 이 운동은 순 각운동량을 여기된 전자들에 분배하는 반면, 선형 편광된 빛은 여기된 전자에 순 각운동량을 분배하지 않는다. 전자들에 분배되는 각운동량은 흡수 발색단의 쌍극자 모멘트와 광 진행 방향에 대한 원형 (혹은 타원형) 편광의 선성 (우선성 혹은 좌선성)에 따른다. 이 순 각운동량 전이는 조명 편광의 타원성이 변할 때 R-PE 흡수의 증가를 설명할 수 있는 부가적 메커니즘이다.
형광원에 의해 방출되는 증가된 형광을 생성하도록 조명의 편광을 변경하는 것은 유세포 분석기는 물론 여기서 더 기술되는 형광 영상 시스템과 같은 다른 종류의 형광 기반 장치에서 넓은 응용을 가질 수 있다. 특히, 이 테크닉은 R-PE의 측정된 평균 형광 강도 (MFI) 응답을 증가시킬 수 있다.
실험 데이터는 여기에 더 기재되고 그것은 다양한 레이저를 사용해 얻어진 것이다. 여기에 포함된 실험 데이터 전부는 본 발명의 실시예를 기술하거나 제한하지 않는다는 점을 이해해야 한다. 형광 응답은 MFI 단위로 측정된다. 루미넥스 코포레이션에 의해 제공된 10-플렉스 비드 세트가 실험을 위해 사용되었다. 이 비드 세트는 칼리브레이션 다이로 염색된 두 비드들, R-PE 부착된 비드 및 다이를 갖지 않은 블랭크 비드를 포함한다. 각 비드는 그 비드에 대한 MFI와 무관한 고유 지역 번호(예: 9-R-PE)로 식별된다. 10-플렉스는 레이저에 의해 발생된 빛의 편광의 변경 없이 유세포 분석기를 사용하여 각 레이저에 대해 10회 측정되었다. 이 데이터 세트는 칼리브레이션 다이와 R-PE 모두에 대한 베이스라인 데이터를 형성하였다.
532nm에서 π/2 상대 지연을 제공하는 지연판은 레이저와 레이저 집속 렌즈 사이에 위치하였다. 종래 실험에 기초하여, 지연판의 빠른 축의 각도는 수직에 대해 약 40도로 설정되었다. 이 배열은 선형 편광된 조명을 타원형 편광된 조명으로 변화시켰다. 추가적인 광학 정렬 없이, 10-플렉스는 유세포 분석기에 의해 재측정되었고, 데이터는 수집되었다. 이 배열에서, R-PE의 MFI 응답은 증가하였고, 칼리브레이션 다이의 R-PE 응답은 감소하였다. 장치는 재교정되었고, 10-플렉스는 10회 재측정되었다. 이 데이터는 칼리브레이션 다이 응답에 대해 R-PE 응답의 MFI 증가의 양을 제공한다. 표1에 표시된 데이터는 이 응답을 묘사한다.
표1에서, "편광 광학계 무"는 데이터가 조명의 편광을 변경함 없이 상술한 대로 측정되었음을 표시한다. 제1세트의 "1/4 파장 지연판@40도" 데이터는 조명의 편광을 변경하도록 상술한 지연판을 사용하여 측정된 데이터이다. 제2세트의 "1/4 파장 지연판@40도" 데이터는 장치의 재교정 후에 조명의 편광을 변경하도록 상술한 지연판을 사용하여 측정된 데이터이다.
Figure 112007047479406-PCT00001
도3 내지 도6에 도시된 플롯은 조명 경로 내에 위치한 상술한 지연판 없이 상술한 비드 세트의 여섯 R-PE 비드에 대해 측정된 평균 MFI와, 지연판이 조명 경로 내에 위치하고 시스템이 재교정된 후에 여섯 R-PE 비드에 대해 측정된 평균 MFI를 나타낸다. 도3 내지 도6에 도시된 플롯은 서로 다른 장치에서 서로 다른 레이저를 사용해 생성되었다. 여섯 R-PE 비드는 이것들에 부착된 가변 양의 R-PE을 가진다.
도3에 도시된 데이터는 캘리포니아 산호세 소재의 JDS 유니페이스 코포레이션으로부터 상업적으로 이용 가능한 모델 No. 4602-010-0485 레이저를 사용해 얻어졌다. 플롯 28은 조명 경로 내에 위치한 지연판 없이 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI를 나타낸다. 플롯 30은 지연판이 조명 경로 내에 위치하는 동안 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI를 나타낸다. 도3에 도시된 바와 같이, 조명 경로 내에 위치한 지연판 없이 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI는 지연판이 조명 경로 내에 있는 동안 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI보다 더 낮다. 따라서, 각각의 비드에 대해 측정된 평균 MFI는 지연판이 측정 중에 비드를 조명하는 빛의 편광을 변경하는데 사용될 때 더 높다. 또한, 도3의 플롯 32에 도시된 바와 같이, 각각의 비드에 대해 측정된 평균 MFI의 증가 %는 비드마다 어느 정도 다르나, 각각의 비드에 대해 측정된 평균 MFI의 증가 %는 상당하다 (예: 24.0% 이상). 따라서, 도3에 도시된 플롯은 R-PE에 의한 형광 방출에서 비드가 편광 유도된 응답을 보임을 나타낸다.
도4에 도시된 데이터는 JDS 유니페이스 코포레이션으로부터 상업적으로 이용 가능한 모델 No. 4602-010-0485 레이저를 사용해 얻었다. 플롯 34는 조명 경로 내에 위치한 지연판 없이 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI를 나타낸다. 플롯 36은 지연판이 조명 경로 내에 위치하는 동안 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI를 나타낸다. 도4에 도시된 바와 같이, 조명 경로 내에 위치한 지연판 없이 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI는 지연판이 조명 경로 내에 위치하는 동안 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI보다 더 낮다. 따라서, 각각의 비드에 대해 측정된 평균 MFI는 지연판이 측정 중에 비드를 조명하는 빛의 편광을 변경하는데 사용될 때 더 높다. 또한, 도4의 플롯 38에 도시된 바와 같이, 각각의 비드에 대해 측정된 평균 MFI의 증가 %는 비드마다 어느 정도 다르나, 각각의 비드에 대해 측정된 평균 MFI의 증가 %는 상당하다 (예: 20.0% 이상). 따라서, 도4에 도시된 플롯은 R-PE에 의한 형광 방출에서 비드가 편광 유도된 응답을 보임을 명확히 나타낸다.
도5에 도시된 데이터는 JDS 유니페이스 코포레이션으로부터 상업적으로 이용 가능한 모델 No. 4602-010-0485 레이저를 사용해 얻어졌다. 플롯 40은 조명 경로 내에 위치한 지연판 없이 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI를 나타낸다. 플롯 42는 지연판이 조명 경로 내에 위치하는 동안 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI를 나타낸다. 도5에 도시된 바와 같이, 조명 경로 내에 위치한 지연판 없이 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI는 지연판이 조명 경로 내에 위치하는 동안 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI보다 더 낮다. 따라서, 각각의 비드에 대해 측정된 평균 MFI는 지연판이 측정 중에 비드를 조명하는 빛의 편광을 변경하는데 사용될 때 더 높다. 또한, 도5의 플롯 44에 도시된 바와 같이, 각각의 비드에 대해 측정된 평균 MFI의 증가 %는 비드마다 어느 정도 다르나, 각각의 비드에 대해 측정된 평균 MFI의 증가 %는 상당하다 (예: 22.0% 이상). 따라서, 도5에 도시된 플롯은 R-PE에 의한 형광 방출에서 비드가 편광 유도된 응답을 보임을 명확하게 나타낸다.
도6에 도시된 데이터는 캘리포니아 산타클라라 소재의 코히런트 인코포레이티드로부터 상업적으로 이용 가능한 COMPASS 215M-15 레이저를 사용해 얻어졌다. 플롯 46은 조명 경로 내에 위치한 지연판 없이 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI를 나타낸다. 플롯 48은 지연판이 조명 경로 내에 위치하는 동안 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI를 나타낸다. 도6에 도시된 바와 같이, 조명 경로 내에 위치한 지연판 없이 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI는 지연판이 조명 경로 내에 위치하는 동안 각 비드에 대해 측정된 평균 MFI보다 더 낮다. 따라서, 각각의 비드에 대해 측정된 평균 MFI는 지연판이 측정 중에 비드를 조명하는 빛의 편광을 변경하는데 사용될 때 더 높다. 또한, 도6의 플롯 50에 도시된 바와 같이, 각각의 비드에 대해 측정된 평균 MFI의 증가 %는 비드마다 어느 정도 다르나, 각각의 비드에 대해 측정된 평균 MFI의 증가 %는 상당하다 (예: 17.0% 이상). 따라서, 도6에 도시된 플롯은 R-PE에 의한 형광 방출에서 비드가 편광 유도된 응답을 보임을 명확하게 나타낸다.
여기 설명된 방법은 중요한 변형 없이 (예를 들어, 한 개 이상의 편광 요소의 조명 경로로의 삽입) 기존의 LX100 유세포 분석기 장치에서 수행될 수 있으며 임의의 유세포 분석기에서 용이하게 실행될 수 있다. 이 테크닉은 또한 다른 광학 요소들에 영향을 주지 않고 현재의 유세포 분석기 장치로 용이하게 결합될 수 있다.
도7은 입자들의 형광을 측정하도록 구성된 시스템의 일 실시예를 도시한다. 도7에 도시된 측정 시스템은 여기에서 설명된 실시예에 따라 구성된 조명 서브 시스템을 포함한다. 도7에 도시된 시스템의 실시예는 유세포 분석기로서 구성된다. 도7에서, 측정 시스템은 입자들(54)이 흐르는 큐빗(52)의 단면을 통하는 평면을 따라 도시된 것이다. 일 실시예에서, 큐빗은 표준 유세포 분석기에서 사용되는 표준 용융 석영 유리(fused-silica)가 될 수 있다. 그러나, 다른 임의의 적합한 형태의 관측 혹은 전달 챔버도 분석용 샘플을 전달하는데 사용될 수 있다.
시스템은 비수직 방향으로 배향된 선형 편광이나, 원형 편광이나, 타원형 편광을 가진 빛으로 입자들(54)을 조명하도록 구성된 조명 서브 시스템을 포함한다. 형광원(도시 생략)은 입자들(54)에 부착되거나 합체되어 있다. 빛의 편광은 형광원에 의해 방출된 형광이 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광된 빛이나 비편광된 빛으로 조명될 때 형광원에 의해 방출된 형광보다 더 밝게 한다.
조명 서브 시스템은 광원(56)을 포함한다. 일 실싱예에서, 광원(56)은 레이저이다. 레이저는 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 레이저가 될 수 있다. 또한, 조명 서브 시스템은 둘 이상의 레이저(도시 생략)를 포함할 수 있다. 광원은 청색광이나 녹색광과 같은 하나 이상의 파장을 가진 빛을 방출하도록 구성될 수 있다. 다른 실시예에서, 조명 서브 시스템은 LED, 아크 램프, 광섬유 조명기 및 광벌브로 구성된 그룹으로부터 선택된 한 개 이상의 비레이저 광원을 포함한다. 비레이저 광원은 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 비레이저 광원을 포함할 수 있다. 이와 같이, 조명 서브 시스템은 둘 이상의 광원을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 광원은 서로 다른 파장 혹은 파장 대역 (예: 청색광 및 녹색광)을 가진 빛으로 입자들을 조명하도록 구성될 수 있다. 어떤 실시예에서, 광원은 서로 다른 방향에서 입자를 조명하도록 구성될 수 있다. 또한, 조명 서브 시스템은 한 개 이상의 레이저 및/또는 한 개 이상의 비레이저 광원을 포함할 수 있다. 광원(56)은 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 광원을 포함할 수 있다.
조명 서브 시스템은 또한 광원(56)에 의해 발생된 빛의 광로 내에 배치된 편광 요소(58)를 포함한다. 편광 요소(58)는 반파장 지연기, 1/4파장 지연기, 지연기 스택, 여기서 기술된 다른 적합한 편광 요소 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다. 편광 요소(58)는 측정 시스템에 의해 수행되는 측정 중에 빛이 입자들(54)을 조명하기 전에 빛의 편광을 변경하도록 구성되어 있다. 예를 들어, 광원은 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광된 빛이나 비편광된 빛을 발생하도록 구성될 수 있다. 변경된 편광은 비수직 방향으로 배향된 선형 편광이거나, 원형 편광이거나, 타원형 편광이다. 일 실시예에서, 변경된 편광은 임의 방향에서 100:1보다 작은 편광율을 가진다. 다른 실시예에서, 변경된 편광은 비수직 방향에서 100:1보다 큰 편광율을 가진다. 또한, 비록 도7에 도시된 시스템이 광원(56)과 큐빗(52) 사이의 광로 내에 배치된 한 개의 편광 요소를 포함하고 있지만, 시스템은 광원(56)과 큐빗(52) 사이의 광로에 배치된 두 개 이상의 편광 요소(도시 생략)를 포함할 수 있다. 편광 요소는 입자들(54)이 선택된 편광 상태 및/또는 방향의 빛으로 조명되도록 직렬 연결되어 광원(56)에 의해 발생되는 빛의 편광을 변경할 수 있다.
편광 요소(58)를 나온 빛은 큐빗을 통해 흐르는 입자들을 조명한다. 조명은 입자들이나 이것들에 부착되거나 합체된 형광원이 한 개 이상의 파장이나 파장 대역을 가진 형광 빛을 만들게 한다. 또한, 편광 요소를 나온 빛의 변경된 편광은 형광원에 의해 방출되는 형광이 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광된 빛이나 비편광된 빛으로 조명될 때 형광원에 의해 방출되는 형광보다 더 밝게 되도록 한다. 일 실시예에서, 형광원은 R-PE를 포함한다. 다른 실시예에서, 형광원은 유기 혹은 비유기 다이를 포함한다. 유기 혹은 비유기 다이는 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 다이를 포함할 수 있다.
어떤 실시예에서, 입자들(54) 자신이 형광을 방출하도록 구성된다. 그 일 실시예에서, 편광 요소(58)를 나온 빛의 편광은 입자들에 의해 방출되는 형광을 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광된 빛이나 비편광된 빛으로 조명될 때 입자들에 의해 방출되는 형광보다 더 밝게 한다.
어떤 실시예에서, 시스템은 광원으로부터의 빛을 입자나 흐름 경로 상에 집속하도록 구성된 한 개 이상의 렌즈(도시 생략)을 포함할 수 있다. 한 개 이상의 렌즈는 광원(56)과 편광 요소(58) 사이 혹은 편광 요소(58)와 큐빗(52) 사이의 광로 내에 위치할 수 있다.
입자로부터 전방으로 산란되는 빛은 접이 거울(62)이나 다른 적합한 광 지향 요소에 의해 검출 시스템(60)으로 향할 수 있다. 선택적으로, 검출 시스템(60)은 전방으로 산란되는 빛의 경로 내에 직접 위치할 수 있다. 이와 같이, 접이 거울이나 다른 광 지향 요소는 시스템 내에 포함되지 않을 수 있다. 일 실시예에서, 전방으로 산란되는 빛은, 도7에 도시된 것처럼, 광원(56)에 의한 조명 방향으로부터 약 180도의 각도로 입자들에 의해 산란되는 빛일 수 있다. 전방으로 산란되는 빛의 각도는 광원으로부터의 입사광이 검출 시스템의 광감응성 표면에 충돌하지 않도록 조명 방향으로부터 정확히 180도가 아닐 수 있다. 예를 들어, 전방으로 산란되는 빛은 조명 방향으로부터 180도 보다 작거나 큰 각도로 입자들에 의해 산란되는 빛(예: 약170도, 약175도, 약185도 또는 약190도의 각도로 산란되는 빛)일 수 있다.
조명 방향으로부터 약 90도의 각도로 입자들에 의해 산란되는 빛도 집광될 수 있다. 입자들에 의해 산란되는 빛도 - 혹은 선택적으로 - 임의 각도 혹은 방향에서 집광될 수 있다. 일 실시예에서, 이 산란된 빛은 한 개 이상의 빔 분할기나 색선별 거울에 의해 두 개 이상의 광 빔으로 분할될 수 있다. 예를 들어, 조명 방향에 대해 약 90도의 각도로 산란되는 빛은 빔 분할기(64)에 의해 서로 다른 두 광 빔으로 분할될 수 있다. 서로 다른 두 광 빔은 서로 다른 네 개의 광 빔을 생성하도록 빔 분할기(66, 68)에 의해 다시 분할될 수 있다. 각각의 광 빔은 한 개 이상의 검출기를 포함할 수 있는 서로 다른 검출 시스템을 향할 수 있다. 예를 들어, 네 개의 광 빔 중 하나는 검출 시스템(70)을 향할 수 있다. 검출 시스템(70)은 입자들에 의해 산란되는 빛을 검출하도록 구성될 수 있다.
검출 시스템(60) 및/또는 검출 시스템(70)에 의해 검출되는 산란된 빛은 일반적으로 광원에 의해 조명되는 입자들의 부피에 비례할 수 있다. 따라서, 검출 시스템(60) 및/또는 검출 시스템(70)의 출력 신호는 조명 영역이나 검출 윈도우에 있는 입자들의 직경을 결정하는데 사용될 수 있다. 또한, 검출 시스템(60) 및/또는 검출 시스템(70)의 출력 신호는 함께 고정되어 있거나 근사적으로 동일한 시각에 조명 영역을 통해 지나가는 한 개 이상의 입자를 식별하는데 사용될 수 있다. 따라서, 상기 입자들은 다른 샘플 입자들과 칼리브레이션 입자들로부터 구별될 수 있다.
시스템은 또한 형광원에 의해 방출된 형광에 응답하여 출력 신호를 발생하도록 구성된 검출 서브 시스템을 포함한다. 예를 들어, 나머지 세 개의 광 빔은 검출 시스템(72, 74, 76)을 향할 수 있다. 검출 시스템(72, 74, 76)은 형광원이나 입자 자신에 의해 방출된 형광을 검출하도록 구성될 수 있다. 각각의 검출 시스템은 서로 다른 파장이나 서로 다른 범위의 파장의 형광을 검출하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 검출 시스템 중 하나는 녹색 형광을 검출하도록 구성될 수 있다. 검출 시스템 중 다른 하나는 황-주황색 형광을 검출하도록 구성될 수 있고, 나머지 검출 시스템은 적색 형광을 검출하도록 구성될 수 있다.
어떤 실시예에서, 분광 필터(78, 80, 82)는 검출 시스템(72, 74, 76)에 각각 결합될 수 있다. 분광 필터는 검출 시스템이 검출하도록 구성된 것과는 다른 파장의 형광을 차단하도록 구성될 수 있다. 또한, 한 개 이상의 렌즈(도시 생략)는 각각의 검출 시스템에 광학적으로 결합될 수 있다. 렌즈는 산란된 빛이나 방출된 형광을 검출기의 광감응성 표면으로 집속하도록 구성될 수 있다.
검출기의 출력 전류는 여기에 충돌하는 형광 빛에 비례하고 전류 펄스로 귀결된다. 전류 펄스는 전압 펄스로 변환되고, 저역 통과 필터링된 후, A/D변환기(도시 생략)에 의해 디지털화될 수 있다. 디지털 신호 처리기(DSP)와 같은 프로세서(84)는 펄스 아래의 영역을 통합하여 형광의 크기를 표시하는 숫자를 제공한다. 도7에 도시된 것처럼, 프로세서(84)는 전송 매질(86)을 통해 검출기(70)에 결합될 수 있다. 프로세서(84)는 또한 전송 매질(86)이나 A/D 변환기와 같은 한 개 이상의 다른 요소들(도시 생략)을 통해 간접적으로 검출기(70)에 결합될 수 있다. 프로세서는 유사한 방식으로 다른 시스템의 다른 검출기에 결합될 수 있다. 프로세서(84)는 여기에서 기술된 것과 같이 더 구성될 수 있다.
어떤 실시예에서, 형광원이나 입자들에 의해 방출되는 형광으로부터 생성되는 출력 신호는 입자들의 정체와 입자들의 표면에서 발생되거나 발생하는 반응에 대한 정보를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 두 개의 검출 시스템의 출력 신호는 입자들의 정체를 결정하는데 사용될 수 있고, 다른 검출 시스템의 출력 신호는 입자들의 표면에서 발생되거나 발생하는 반응을 결정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 검출기와 분광 필터의 선택은 측정되는 반응 및/또는 입자에 통합되거나 속박되는 다이(즉, 반응에 관여하는 반응 물질에 통합되거나 속박되는 다이)나 형광원의 종류에 따라 변할 수 있다.
샘플 입자의 정체를 결정하는데 사용되는 검출 시스템(예: 검출 시스템(72,74))은 APD, PMT 또는 다른 종류의 광검출기일 수 있다. 입자들의 표면에서 발생되거나 발생하는 반응을 식별하는데 사용되는 검출 시스템(예: 검출 시스템(76))은 PMT, APD 또는 다른 종류의 광검출기일 수 있다. 측정 시스템은 여기서 기술된 바와 같이 더 구성될 수 있다.
비록 도7의 시스템이 서로 다른 다이 특성을 가진 입자들을 구별하기 위한 두 개의 서로 다른 검출 윈도우를 가진 두 개의 검출 시스템을 포함하게 도시되었지만, 이 시스템은 두 개를 초과하는 검출 윈도우(즉, 세 개의 검출 윈도우, 네 개의 검출 윈도우 등)를 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 이와 같은 실시예에서, 시스템은 다른 검출 윈도우를 가진 추가적인 검출 시스템과 추가적인 빔 분할기를 가질 수 있다. 또한, 분광 필터 및/또는 렌즈는 각각의 추가적인 검출 시스템에 결합될 수 있다.
다른 실시예에서, 시스템은 입자들의 표면에서 반응되는 서로 다른 재료들을 구별하도록 구성되는 두 개 이상의 검출 시스템을 포함할 수 있다. 서로 다른 반응 물질 재료는 입자들의 다이 특성과는 다른 다이 특성을 가질 수 있다.
여기에서 설명된 바와 같이 (예를 들어, 한 개 이상의 편광 요소를 시스템의 조명 경로에 삽입하는 것에 의해) 구성될 수 있는 측정 시스템의 추가적인 예시는 미국 특허 챈들러 등의 제5,981,180호, 챈들러의 제6,046,807호, 챈들러의 제6,139,800호, 챈들러의 제6,366,354호, 챈들러의 제6,411,904호, 챈들러 등의 제6,449,562호, 및 챈들러 등의 제6,524,793호에 기술되어 있고, 이들은 여기에 참조 문헌으로 마치 전부가 개시된 것처럼 통합된다. 여기에 기술된 측정 시스템은 이들 특허에 기술되어 있는 것처럼 더 구성될 수도 있다. 도7에 도시된 시스템은 다른 시스템과 실시예에 대해 여기에 기술된 것처럼 더 구성될 수 있다. 또한, 도7에 도시된 시스템은 여기에 기술된 다른 실시예의 모든 장점을 가진다.
입자들의 형광을 측정하도록 구성된 시스템의 다른 실시예는 도8에 도시되어 있다. 도8에 도시된 시스템은 샘플의 다중 분석물 측정과 같은 응용에 사용될 수 있다. 시스템의 이 실시예는 형광 영상 시스템으로 구성된다. 시스템은 비수직 방향으로 배향된 선형 편광이나, 원형 편광이나, 타원형 편광을 가진 빛으로 입자들을 조명하도록 구성된 조명 서브 시스템을 포함한다. 형광원은 입자들에 부착되거나 합체된다. 빛의 편광은 형광원에 의해 방출되는 형광을 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광된 빛이나 비편광된 빛으로 조사될 때 형광원에 의해 방출되는 형광보다 더 밝게 한다.
일 실시예에서, 조명 서브 시스템은 광원(88)을 포함한다. 광원(88)은 임의의 적합한 LED, 레이저, 아크 램프, 광섬유 조명기, 광벌브, 백열 전구, 또는 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 광원과 같은 한 개 이상의 광원을 포함할 수 있다. 또한, 조명 서브 시스템은 한 개 이상의 광원(도시 생략)을 포함할 수 있는데, 이들 각각은 적어도 하나의 파장이나 적어도 하나의 파장 대역의 빛을 발생하도록 구성된다. 도8에 도시된 시스템에서의 사용을 위한 광원의 적합한 조합의 일 예는 두 개 이상의 LED이다 (그러나 이에 한정되지 않음).
한 개를 초과하는 광원에 의해 발생되는 빛은 빔 분할기(도시 생략)나 해당 기술 분야에서 알려진 적합한 광학 요소에 의한 공통 조명 경로로 결합되어 광원으로부터의 빛이 입자들로 동시에 향할 수 있게 한다. 선택적으로, 영상 서브 시스템은 반사 거울과 같은 광학 요소(도시 생략)과, 어느 광원이 입자를 조명하는데 사용되느냐에 따라 광학 요소를 조명 경로로 움직이거나 그것으로부터 움직여 나오도록 구성된 장치(도시 생략)를 포함할 수 있다. 이와 같이, 광원은 서로 다른 파장이나 파장 대역의 빛으로 입자들을 시계열적으로 조사하는데 사용될 수 있다. 광원은 또한 기판 아래로부터 보다 위로부터 기판을 조명할 수 있다.
광원은 입자들이나 그것들에 결합되거나 합체된 입자들이 형광을 방출하게 할 파장 또는 파장 대역에서 빛을 제공하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 파장 또는 파장 대역은 형광원, 형광 다이, 또는 입자들에 합체 및/또는 입자들의 표면에 결합되는 다른 형광 물질을 여기하도록 선택될 수 있다. 이와 같이, 파장 또는 파장 대역은 입자들이 입자들의 분류에 사용되는 형광을 방출하도록 선택될 것이다. 또한, 파장이나 파장 대역은 형광원, 형광 다이, 또는 입자들의 표면 위의 반응물을 통해 입자들에 결합되는 다른 형광 물질을 여기하도록 선택될 수 있다. 이와 같이, 파장이나 파장 대역은 입자들이 입자들의 표면에서 발생된 반응을 검출 및/또는 정량화하는데 사용되는 형광을 방출하도록 선택될 수 있다.
조명 서브 시스템은 또한 광원(88)에 의해 발생된 빛의 광로 내에 배치된 편광 요소(90)를 포함한다. 편광 요소(90)는 반파 지연기, 1/4파 지연기, 지연기 스택, 이들의 조합, 또는 여기에 기술된 임의의 다른 편광 요소나 편광 요소들의 조합을 포함할 수 있다. 편광 요소(90)는 시스템에 의해 수행되는 측정 중에 빛이 입자들(92)을 조명하기 전에 빛의 편광을 변경하도록 구성되어 있다. 변경된 편광은 비수직 방향으로 배향된 선형 편광이거나, 원형 편광이거나, 타원형 편광이다. 일 실시예에서, 변경된 편광은 임의 방향에서 100:1보다 작은 편광율을 가진다. 다른 실시예에서, 변경된 편광은 비수직 방향에서 100:1보다 큰 편광율을 가진다.
변경된 편광은 바람직하게는 형광원에 의해 방출되는 형광을 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광된 빛이나 비평광된 빛으로 조사될 때 형광원에 의해 방출되는 형광보다 더 밝게 되도록 한다. 일 실시예에서, 형광원은 R-PE를 포함한다. 다른 실시예에서, 형광원은 유기 혹은 비유기 다이를 포함한다. 유기 혹은 비유기 다이는 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 다이를 포함할 수 있다. 어떤 실시예에서, 입자 자신이 형광을 방출하도록 구성된다. 일 실시예에서, 빛의 편광은 입자들에 의해 방출되는 형광을 주로 수직 방향으로 배향된 선형 편광된 빛이나 비편광된 빛으로 조사될 때 입자들에 의해 방출되는 형광보다 더 밝게 되도록 한다.
도8에 도시된 바와 같이, 조명 서브 시스템은 입자들(92)이 고정된 기판(96)으로 편광 요소(90)로부터의 빛을 향하게 하도록 구성되는 광학 요소(94)을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 광학 요소(94)는 조준 렌즈(collimating lens)일 수 있다. 그러나, 광학 요소(94)는 편광 요소(90)로부터의 빛을 기판(96) 상으로 결상하는데 사용될 수 있는 임의의 다른 적합한 광학 요소를 포함할 수 있다. 또한, 비록 광학 요소가 도8에서는 한 개의 광학 요소로 도시되어 있지만, 광학 요소(94)는 한 개를 초과하는 굴절 요소를 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 더욱이, 비록 도8에서 광학 요소(94)가 굴절 광학 요소로서 도시되었지만, 한 개 이상의 반사 및/또는 회절 광학 요소가 (가능하게는 한 개 이상의 굴절 광학 요소와 조합하여) 편광 요소(90)로부터의 빛을 기판(96) 상에 결상하는데 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 도8에서 비록 광학 요소(94)가 실질적으로 입사 각도에 수직한 각도에서 편광 요소(90)로부터의 빛을 기판(96) 상에 결상하는 것으로 도시되어 있지만, 시스템은 입사 각도에 비스듬한 각도에서 기판(96)으로 빛을 향하게 하도록 구성될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
더욱이, 비록 편광 요소(90)가 광원(88)과 광학 요소(94) 사이의 광로에 위치하는 것으로 도시되었지만, 편광 요소(90)는 선택적으로 광학 요소(94)와 기판(96) 사이의 광로에 위치할 수 있다. 또한, 비록 도8에 도시된 시스템은 광원(88)과 기판(96) 사이의 광로에 배치된 한 개의 편광 요소를 포함하지만, 시스템은 광원(88)과 기판(96) 사이의 광로에 배치된 한 개를 초과하는 편광 요소를 포함할 수 있다. 편광 요소는 입자들(92)이 선택된 편광 상태 및/또는 방향의 빛으로 조명되도록 직렬로 연결되어 광원(88)에 의해 발생되는 빛의 편광을 변경할 수 있다.
입자들(92)은 상술한 임의의 입자들을 포함할 수 있다. 기판(96)은 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 기판을 포함할 수 있다. 기판(96) 위에 고정된 입자들은 영상 챔버(도시 생략)나 조명 서브 시스템에 대한 기판(96)이나 입자들(92)의 위치를 유지하는 임의의 다른 장치에 배치될 수 있다. 기판(96)의 위치를 유지하는 장치는 이미징 전에 (예컨대, 조명을 기판 상에 집속하도록) 기판의 위치를 변경하도록 구성될 수도 있다.
기판 상의 입자들의 고정은 자기 인력, 진공 필터판 또는 해당 기술 분야에서 알려진 다른 적합한 방법을 사용해 수행될 수 있다. 이미징을 위해 마이크로 구체를 위치시키는 방법 및 시스템의 예시는 2004년 11월 11일에 출원된 펨프셀(Pempsell)의 미국 출원 제60/627,304호에 개시되어 있으며, 이것은 참조 문헌으로서 여기에 마치 전체가 개시된 것처럼 통합되어 있다. 입자 고정 방법 자체는 여기에 기술된 방법 및 시스템에 특별히 중요한 것은 아니다. 그러나, 입자들은 바람직하게는 입자들이 수 초가 소요될 수 있는 검출기 통합 기간 중에 인지 가능할 정도로 움직이지 않도록 고정한다.
도8에 도시된 시스템은 형광원에 의해 방출되는 형광에 응답하여 출력 신호를 발생하도록 구성된 검출 서브 시스템을 또한 포함한다. 예를 들어, 도8에 도시된 바와 같이, 검출 서브 시스템은 광학 요소(98)와 색선별 빔 분할기(100)를 포함할 수 있다. 광학 요소(98)는 기판(96)과 그 위에 고정된 입자들(92)로부터 빛을 집광 및 평행 시준하고 빔 분할기(100)로 빛을 향하게 하도록 구성되어 있다. 광학 요소(98)는 광학 요소(94)에 대해 상술한 바와 같이 더 구성될 수 있다. 빔 분할기(100)는 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 빔 분할기를 포함할 수 있다. 빔 분할기(100)는 빛의 파장에 기초해 광학 요소(98)로부터의 빛을 서로 다른 검출기로 향하게 하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 제1 파장 혹은 파장 대역을 가진 빛은 빔 분할기(100)에 의해 통과될 수 있고, 제1과는 다른 제2 파장 혹은 파장 대역을 가진 빛은 빔 분할기(100)에 의해 반사될 수 있다.
검출 서브 시스템은 광학 요소(102)와 검출기(104)를 포함할 수 있다. 빔 분할기(100)에 의해 통과된 빛은 광학 요소(102)를 향할 수 있다. 광학 요소(102)는 빔 분할기에 의해 통과된 빛을 검출기(104)로 집속하도록 구성된다. 검출 서브 시스템은 광학 요소(106)와 검출기(108)를 더 포함할 수 있다. 빔 분할기(100)에 의해 반사된 빛은 광학 요소(106)을 향할 수 있다. 광학 요소(106)는 빔 분할기에 의해 반사된 빛을 검출기(108)로 집속하도록 구성될 수 있다. 광학 요소(102, 106)는 광학 요소(104)에 대해 상술한 바와 같이 구성될 수 있다.
검출기(104, 108)는 예컨대 전하 결합 소자(CCD) 검출기나, 예를 들어 CMOS 검출기, 2차원 광감응성 요소 어레이, 시간 지연 통합(TDI) 검출기 등과 같은 해당 기술에서 알려진 임의의 다른 적합한 영상 검출기를 포함할 수 있다. 어떤 실시예에서, 2차원 CCD 영상 어레이와 같은 검출기는 실질적으로 전체 기판이나 기판 상에 고성된 입자들의 이미지를 동시에 얻는데 사용될 수 있다. 시스템에 포함된 검출기의 수는 각 검출기가 파장들이나 파장 대역들 중 하나에서 이미지를 발생하는데 사용되도록 관심 있는 파장들이나 파장 대역들의 수와 같을 수 있다.
검출기에 의해 발생된 각각의 이미지는 광학 대역 통과 요소(도시 생략)이나 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 다른 적합한 광학 요소 - 빔 분할기로부터 검출기에 이르는 광로 내에 위치한다 - 를 사용해 분광학적으로 여파될 수 있다. 각 캡쳐된 이미지에 대해 서로 다른 필터 "대역"이 사용될 수 있다. 이미지가 얻어지는 각 파장 또는 파장 대역에 대해 검출 파장 중심 및 폭은, 입자 분류나 리포터 신호에 사용되는지 여부에 따라, 관심 있는 형광 방출에 부합될 수 있게 얻어진다.
이와 같이, 도8에 도시된 시스템의 검출 서브 시스템은 서로 다른 파장이나 파장 대역에서 동시에 다중 이미지를 발생하도록 구성되어 있다. 비록 도8에 도시된 시스템은 두 개의 검출기를 포함하지만, 시스템은 두 개를 초과하는 검출기 (예: 세 개의 검출기, 네 개의 검출기 등)를 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 상술한 바와 같이, 각각의 검출기는 서로 다른 파장이나 파장 대역에서 동시에 빛을 서로 다른 검출기로 향하게 하는 한 개 이상의 광학 요소를 포함함으로써 서로 다른 파장이나 파장 대역에서 동시에 이미지를 생성하도록 구성될 수 있다. 또한, 비록 도8에 도시된 시스템이 복수의 검출기를 포함하고 있더라도, 시스템은 한 개의 검출기를 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 단일 검출기는 복수의 파장이나 파장 대역에서 시계열적으로 이미지를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 서로 다른 파장이나 파장 대역의 빛은 시계열적으로 기판을 향할 수 있고, 각각의 서로 다른 파장이나 파장 대역으로 기판의 조명 중에는 서로 다른 이미지가 생성될 수 있다. 다른 예시에서, 단일 검출기를 향하는 빛의 파장이나 파장 대역을 선택하는 서로 다른 필터가 서로 다른 파장이나 파장 대역에서 시계열적으로 이미지를 생성하도록 (예를 들어, 이미징 경로로 서로 다른 필터를 넣거나 그 경로로부터 그것을 뺌으로써) 변형될 수 있다.
도8에 도시된 검출 서브 시스템은, 따라서, 관심 있는 몇 개의 주파수에서 입자들(92)의 형광 방출을 표시하는 복수의 혹은 일련의 이미지를 생성하도록 구성된다. 또한, 시스템은 입자들의 형광 방출을 표시하는 복수의 혹은 일련의 디지털 이미지를 프로세서(예: 프로세싱 엔진)에 공급하도록 구성될 수 있다. 일 실시예에서, 시스템은 프로세서(110)를 포함할 수 있다. 프로세서(110)는 검출기(104, 108)로부터 이미지 데이터를 얻도록(예: 수신) 구성될 수 있다. 예를 들어, 프로세서(110)는 해당 기술에서 알려진 임의의 적합한 방법으로 (예를 들어, 검출기 중 하나를 프로세서에 각기 결합시키는 전송 매질(도시 생략)을 통해, 검출기 중 하나와 프로세서를 결합시키는 예컨대 아날로그-디지털 변환기와 같은 한 개 이상의 전자 요소(도시 생략)를 통해 등) 검출기(104, 108)에 결합될 수 있다.
바람직하게, 프로세서(110)는 입자들의 분류와 입자들의 표면에서 발생하는 반응에 대한 정보와 같은 입자들(92)의 한 개 이상의 특성을 결정하도록 이미지를 처리하고 분석하도록 구성된다. 한 개 이상의 특성은 각 파장이나 파장 대역에 대한 각 입자에 대한 형광 크기에 대한 엔트리로 된 데이터 어레이와 같은 임의의 적합한 포맷으로 프로세서에 의해 출력될 수 있다.
프로세서(110)는 통상적인 퍼스널 컴퓨터, 메인프레임 컴퓨터 시스템, 워크스테이션 등에 공통적으로 포함되는 것과 같은 프로세서일 수 있다. 일반적으로, 용어 "컴퓨터 시스템"은 메모리 매체로부터의 명령을 실행하는 한 개 이상의 프로세서를 가진 임의의 장치도 포함하도록 넓게 정의될 수 있다. 프로세서는 임의의 다른 적합한 기능성 하드웨어를 사용해 구현될 수 있다. 예를 들어, 프로세서는 펌웨어, 필드 프로그램 가능한 게이트 어레이(FPGA), 또는 예컨대 고속 집적 회로(VHSIC) 하드웨어 기술 언어(VHDL)와 같은 고도의 프로그램 언어로 "작성된" 시퀀스 로직을 채용한 다른 프로그램 가능한 로직 장치(PLD) 내의 고정된 프로그램을 가진 DSP일 수 있다. 다른 예시에서, 프로세서(110)에서 실행 가능한 프로그램 명령(도시 생략)은 C#(적합하다면 C++의 섹션), 액티브X 컨트롤즈, 자바빈즈, 마이크로소프트 파운데이션 클래스("MFC"), 또는 요구되는 다른 기술이나 방식으로 코딩될 수 있다. 프로그램 명령은 다른 여러 가지 중에서도 공정 기반 기술, 요소 기반 기술 및/또는 객체 지향 기술을 포함하는 다양한 방법들 중 하나에 구현될 수 있다.
도8에 도시된 시스템은 다른 시스템과 실시예에 대해 여기서 기술된 것과 같이 더 구성될 수 있다. 또한, 도8에 도시된 시스템은 여기 기술된 다른 실시예의 모든 장점을 가진다.
상술한 바와 같이, 도7-8에 도시된 시스템은 시스템의 조명 경로 내에 배치된 한 개 이상의 편광 요소를 포함한다. 또한, 상술한 바와 같이, 도7-8에 도시된 시스템은 한 개 이상의 광원을 포함할 수 있다. 어떤 실시예에서, 광원 중 일부는 입자들에 결합된 서로 다른 물질들로부터 형광을 여기시키는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 제1 광원은 분류 다이를 위한 여기 소스로서 사용될 수 있고, 제2 광원은 리포터 다이를 위한 여기 소스로 사용될 수 있다). 이와 같이, 각각의 광원에 의해 발생되는 빛의 편광은 독립적으로 변경될 수 있고, 이에 의해, 각각의 광원에 의해 여기되는 물질의 형광을 증가시킨다. 예를 들어, 여기에 기술된 편광 요소와 같은 편광 요소는 각각의 광원의 조명 경로 내에 위치할 수 있고, 만약 광원에 의해 발생되는 광빔이 공통의 조명 경로로 결합된다면, 편광 요소는 광빔을 결합하는 광학 요소의 업스트림 조명 경로 내에 배치될 수 있다. 이와 같이, 입자들을 조명하는 각 광빔의 편광은 시스템에 의해 수행되는 각각의 (또는 적어도 한 개를 초과하는) 형광 측정의 크기를 증가(최대화도 가능)하도록 개별적으로 변경 및 제어될 수 있다.
본 발명의 다양한 양태들의 다른 변경 및 대안은 당업자가 이 설명을 참조하면 자명할 것이다. 예를 들어, 시스템, 조명 서브 시스템, 및 형광원에 의해 방출되는 형광을 증가하는 방법이 제공된다. 따라서, 이 설명은 오직 묘사하는 것으로 해석되어야 하며, 당업자에게 본 발명을 수행하는 일반적인 방식을 가르치는 것을 목적으로 한다. 여기에 보여지고 설명된 발명의 형태는 현재 양호한 실시예로 받아들여져야 한다. 여기에 묘사되고 설명된 구성 요소들이나 재료들은 대체될 수 있고, 발명의 어떤 특징들은 개별적으로 활용될 수 있는데, 이 모든 것들은 본 발명의 이 설명의 혜택을 입은 후의 당업자에게 자명할 것이다. 후술하는 청구항에서 기술되는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어남 없이 여기에 설명된 구성 요소에 변화를 줄 수 있다.

Claims (23)

  1. 입자들의 형광을 측정하도록 구성된 시스템에 있어서,
    상기 시스템을 통한 상기 입자들의 흐름에 비평행한 방향을 가진 선형 편광이나, 원형 편광이나, 타원형 편광을 가진 빛으로 상기 입자들을 조명하도록 구성된 조명 서브 시스템으로서, 주로 등방성의 형광원은 상기 입자들에 부착되거나 합체되어 있고, 상기 빛의 편광은 상기 주로 등방성의 형광원에 의해 방출되는 형광이 상기 시스템을 통한 상기 입자들의 흐름에 평행한 방향으로 주로 배향된 선형 편광된 빛이나 비편광된 빛으로 조명될 때 상기 주로 등방성의 형광원에 의해 방출되는 형광보다 더 밝게 하는, 상기 조명 서브 시스템과,
    상기 형광원에 의해 방출되는 상기 형광에 응답하여 출력 신호들을 발생하도록 구성된 검출 서브 시스템을 포함하는 형광 측정 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조명 서브 시스템은 한 개 이상의 레이저를 포함하는, 형광 측정 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조명 서브 시스템은 발광 다이오드, 아크 램프, 광섬유 조명기 및 광벌브로 구성된 그룹에서 선택된 한 개 이상의 비레이저 광원을 포함하는, 형광 측정 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 상기 편광은 100:1보다 작은 편광율을 가지는, 형광 측정 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 상기 편광은 100:1보다 큰 편광율을 가지는, 형광 측정 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 상기 주로 등방성의 형광원은 R-피코에리테린(R-phycoerytherin)을 포함하는, 형광 측정 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 상기 주로 등방성의 형광원은 유기 또는 비유기 다이를 포함하는, 형광 측정 시스템.
  8. 제1항에 있어서, 유세포 분석기(flow cytometer)로서 더 구성되는 형광
    측정 시스템.
  9. 측정 시스템을 위한 조명을 제공하도록 구성된 조명 서브 시스템에 있어서,
    빛을 발생하도록 구성된 광원과,
    상기 측정 시스템에 의해 수행되는 측정 중에 상기 빛이 입자들을 조명하기 전에 상기 빛의 편광을 변경하도록 구성된 편광 요소로서, 상기 변경된 편광은 원형 편광이나 타원형 편광인, 상기 편광 요소를 포함하는 조명 서브 시스템.
  10. 제9항에 있어서, 상기 광원은 한 개 이상의 레이저를 포함하는, 조명 서브 시스템.
  11. 제9항에 있어서, 상기 광원은 발광 다이오드, 아크 램프, 광섬유 조명기 및 광벌브로 구성된 그룹에서 선택된 한 개 이상의 비레이저 광원을 포함하는, 조명 서브 시스템.
  12. 제9항에 있어서, 상기 편광 요소는 반파장 지연기, 1/4파장 지연기, 지연기 스택 또는 이들의 조합을 포함하는, 조명 서브 시스템.
  13. 제9항에 있어서, 상기 편광 요소는 100:1보다 작은 편광율을 가진 편광된 빛을 발생하도록 구성되는, 조명 서브 시스템.
  14. 제9항에 있어서, 상기 형광은 R-피코에리테린(R-phycoerytherin)을 포함하는, 조명 서브 시스템.
  15. 제9항에 있어서, 상기 형광은 유기 또는 비유기 다이를 포함하는, 조명 서브 시스템.
  16. 제9항에 있어서, 상기 측정 시스템은 유세포 분석기로서 구성되는, 조명 서브 시스템.
  17. 제9항에 있어서, 상기 측정 시스템은 형광 영상 시스템으로서 구성되는, 조명 서브 시스템.
  18. 입자들에 부착되거나 합체되어 있는 주로 등방성의 형광원에 의해 방출된 형광을 증가하는 방법에 있어서,
    측정 중에 빛이 상기 입자들을 조명하기 전에 상기 빛의 편광을 변경하는 단계로서, 상기 변경된 편광은 상기 입자들을 유지하는 평면과 상기 빛에 의해 정의되는 입사 평면에 대해 비평행한 방향을 가진 선형 편광이거나, 원형 편광이거나, 타원형 편광이고, 상기 빛의 편광은 상기 주로 등방성의 형광원에 의해 방출되는 형광이 상기 입사 평면에 주로 평행하게 배향된 선형 편광된 빛이나 비편광된 빛에 의해 조명될 때 상기 주로 등방성의 형광원에 의해 방출되는 형광보다 더 밝게 하는, 상기 편광 변경 단계를 포함하는 형광 증가 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 변경된 편광은 100:1보다 작은 편광율을 가지는, 형광 증가 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 변경된 편광은 100:1보다 큰 편광율을 가지는, 형광 증가 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 검출 서브 시스템은 상기 입자들의 조명 방향에 대해 약 60도보다 큰 각도로 위치하는, 형광 측정 시스템.
  22. 제9항에 있어서, 상기 비편광된 빛을 집속하도록 상기 광원과 상기 편광 요소 사이에 배치된 광학 요소를 더 포함하는 조명 서브 시스템.
  23. 제9항에 있어서, 상기 편광 요소는 직렬로 배열된 복수의 편광 요소들 중 하나이고, 상기 복수의 편광 요소들은 원형 편광이나 타원형 편광을 가지도록 상기 비편광된 빛을 편광시키는데 집합적으로 사용되는, 조명 서브 시스템.
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