ES2944957T3 - Diferencial de 5 partes de alta exactitud con microscopía holográfica digital y leucocitos intactos de sangre periférica - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método mejorado para la detección sin marcadores de un tipo celular de al menos una célula en un medio utilizando microfluidos y microscopía holográfica digital, así como un dispositivo particular para llevar a cabo el método. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Diferencial de 5 partes de alta exactitud con microscopía holográfica digital y leucocitos intactos de sangre periférica

La presente invención se relaciona con un método mejorado para la detección sin marcadores de un tipo celular de al menos una célula en un medio usando microfluidos y microscopía holográfica digital.

Una parte esencial del diagnóstico in vitro de glóbulos es la diferenciación y el recuento de glóbulos blancos (WBC, por sus siglas en inglés). Los tipos de células de los WBC generalmente se mencionan como linfocitos, monocitos y granulocitos, que se denominan diferenciales de 3 partes de los WBC en el resultado de una prueba hematológica. Los granulocitos se pueden dividir en 3 tipos de granulocitos: neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Por lo tanto, un diferencial de 5 partes se refiere a los 5 tipos principales de glóbulos blancos de la sangre periférica.

Con métodos sin etiquetas, tal como el análisis de dispersión de Mie, usualmente es factible un diferencial de 3 partes, lo que no permite una discriminación de los tipos de granulocitos. La dispersión de Mie de células objetivo individuales en un ángulo bajo y alto usualmente se usa para discriminar un WBC para un diferencial de 3 partes. Para minimizar la dispersión de glóbulos rojos, se realiza la hemólisis de los eritrocitos. Para un resultado diferencial de 5 partes, se requiere un etiquetado adicional del núcleo celular y los gránulos para discriminar eosinófilos y basófilos de neutrófilos. El etiquetado adicional permite una mayor discriminación de los granulocitos para un diferencial de 5 partes basado en mediciones de dispersión y absorción. Este método se puede automatizar y usar en analizadores de hematología que funcionan como citómetros de flujo.

En general, el análisis de hematología se realiza con analizadores de hematología automatizados y, en caso de resultados ambiguos (resultados marcados), se realiza una microscopía de muestras de sangre teñidas con Giemsa en un portaobjetos de microscopio para un diagnóstico diferencial manual. La desventaja de los analizadores de hematología automatizados es el requisito de compuertas definidas para el análisis de datos, lo que lleva a muestras marcadas en los casos en que las patologías llevan a un cambio de la información dispersa más allá de los límites de las compuertas. Además, con un analizador de hematología, el usuario no tiene información de imagen que pueda permitir información diferencial de X de los WBC, tales como agregados de leucocitos plaquetarios o morfologías patológicas.

Existen limitaciones similares para el análisis microscópico de muestras fijas y, por ejemplo, pancromáticamente, de células teñidas en portaobjetos de microscopía, que usualmente se limita al análisis de 100-200 WBC como máximo. Sin embargo, en casos patológicos, las concentraciones de los WBC de interés pueden abarcar más de cinco órdenes de magnitud (0,1-10.000 células/|jL), lo que requiere un gran volumen de sangre para obtener estadísticas suficientes sobre las diferentes poblaciones de los WBC. Además, las muestras teñidas con Giemsa requieren fijación, secado y tinción pancromática de muestras de sangre completa en un portaobjetos de microscopio, es decir, pasos de análisis adicionales.

En general, un amplio rango dinámico de concentración no se puede cubrir por un análisis de frotis de sangre que tiene un bajo poder estadístico. Además, los analizadores de hematología basados en impedancia o análisis de dispersión de Mie no pueden proporcionar información morfológica.

El documento US 5,017,497 usó como base para los recuentos hematológicos una gráfica de dispersión lateral despolarizada contra la polarizada, que discrimina los granulocitos eosinófilos no fijados y no teñidos de los neutrófilos, que también se describe en SHAPIRO, HOWARD M.: “Practical Flow Cytometry”, 4° Ed., pp. 278-9 y Figura 7-2; 3° Ed., pp. 236-7 y Figura 7-2. Sin embargo, en general, la tinción es el método de referencia y se aplica para el diferencial de 5 partes.

Además, se ha descrito la microscopía holográfica digital (DHM, por sus siglas en inglés) con respecto a la discriminación de leucocitos, por ejemplo, en DE 102014200911 A y en DE102014205535 A1; VERCRUYSEE, DRIES et al.: “Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer”, en: Lab Chip., 2015, Vol. 15, pp.

1123: informando de un diferencial de 3 partes con DHM usando células fijadas; y US 2014/0220622 A1: informando sobre la DHM para la diferenciación de leucocitos sin especificar cómo se puede lograr un diferencial de 5 partes.

Sin embargo, existe la necesidad de un método mejorado y fiable, sin etiquetas, preferiblemente cuantitativo, para discriminar glóbulos blancos en grandes cantidades, particularmente en un rendimiento más alto.

Los presentes inventores optimizaron un enfoque microscópico usando microfluídica para resolver los problemas anteriores y obtener un sistema para monitorear en línea y diferenciar células sanguíneas en muestras de sangre periférica.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la detección sin marcadores de un tipo celular de al menos una célula en un medio de acuerdo con la reivindicación 1.

Otros aspectos y realizaciones de la invención se describen en las reivindicaciones dependientes y se pueden tomar de la siguiente descripción, figuras y ejemplos, sin limitarse a los mismos.

Figuras

Los dibujos adjuntos deben ilustrar realizaciones de la presente invención y transmitir una mejor comprensión de la misma. En conexión con la descripción sirven como explicación de conceptos y principios de la invención. Otras realizaciones y muchas de las ventajas indicadas se pueden derivar en relación con los dibujos. Los elementos de los dibujos no están necesariamente a escala entre sí. Los atributos y los componentes idénticos, funcionalmente equivalentes y que actúan igual se indican en las figuras de los dibujos con los mismos números de referencia, a menos que se indique lo contrario.

La Figura 1 muestra diámetros y volúmenes hidrodinámicos ejemplares de glóbulos blancos de diferentes donadores.

Las Figuras 2 y 3 muestran esquemáticamente las consideraciones de profundidad de campo (DOF, por sus siglas en inglés) con respecto a los glóbulos blancos y su posicionamiento en el flujo de células, con consideraciones para los linfocitos más pequeños en la Figura 2 y para los monocitos más grandes en la

Figura 3. Como se muestra, en promedio, un mínimo de 2/3 del volumen de WBC debe estar dentro del DOF físico, lo que permite preferiblemente una tolerancia en z de aproximadamente ± 2 |jm con respecto al leucocito más pequeño.

Las Figuras 4 y 5 muestran esquemáticamente las consideraciones de posicionamiento de flujo de células y el DOF para glóbulos rojos (RBC, por sus siglas en inglés) que se ajustan a las necesidades de análisis de los WBC. Se logra un efecto de orientación por el flujo laminar.

Las Figuras 6 a 8 muestran imágenes de los WBC adquiridas con sistemas de DHM fuera del eje usando diferentes longitudes de onda, apertura numérica (NA, por sus siglas en inglés) de objetivo e iluminación, y diferentes resoluciones laterales.

En el método, el dispositivo microscópico holográfico digital no está particularmente limitado, y se puede usar cualquier microscopio holográfico digital adecuado. En particular, los microscopios holográficos digitales que pueden reconstruir datos a partir de una imagen son los preferidos para un alto rendimiento.

Para la discriminación sin etiquetas de células, tales como los WBC, tal como un diferencial de 5 partes y más (X-diferencial basado en discriminación adicional de agregados, blastocitos, células apoptóticas; células tumorales, WBC activados, y otros), se aplica la microscopía holográfica digital (DHM). El flujo de trabajo para la clasificación de leucocitos puede ser el siguiente: Las imágenes se obtienen usando microscopía de transmisión, y se registra un patrón de fase de interferencia de un espécimen, es decir, una célula. A partir de la información se reconstruye la imagen de la célula, y se analizan los datos para obtener también información biológica como compartimentos celulares. También se pueden determinar concentraciones de células, absorción, así como información adicional como información de dispersión o fluorescencia, como, por ejemplo, descrito en DE 102014200911 A. La DHM en transmisión o reflexión opcional se puede realizar referencialmente con una configuración de haz común, por ejemplo, como es usado por Natan Shaked/Universidad de Tel Aviv, Ovizio/Bélgica, Anand/Universidad de Baroda. El contraste es el resultado de los efectos de dispersión de cambios sutiles en el índice de refracción entre el medio y las células, así como entre los componentes subcelulares. La información de fase integral y cuantitativa de los componentes subcelulares está relacionada con las mediciones de dispersión de Mie de citometría de flujo.

Sin embargo, el análisis de imágenes con DHM y el flujo de trabajo sin tinción permite realizar análisis hematológicos de células “viables” cercanas a una situación in vivo.

El microscopio holográfico digital funciona con un haz de referencia y un haz de detección que se pueden configurar adecuadamente en diferentes configuraciones, por ejemplo, en el eje, fuera del eje, perpendicular, etc. Preferiblemente, la medición se realiza fuera del eje para que se pueda lograr una configuración de interferencia más simple y robusta, y que la distancia de medición sea corta, minimizando así el ruido. Por lo tanto, de acuerdo con ciertas realizaciones, un haz de referencia y un haz de detección del dispositivo microscópico holográfico digital están fuera del eje. Además, preferiblemente la medición se realiza en modo de transmisión.

La profundidad de campo es preferiblemente de 5,7 jm o menos, más preferiblemente de 4,7 jm o menos, por ejemplo, 3 o 2 jm o menos, particularmente preferiblemente 1,5 jm o menos. Con una profundidad de campo reducida también se puede lograr una buena resolución lateral, lo que facilita la discriminación celular. A una profundidad de campo baja, se pueden observar y discriminar fácilmente más compartimentos celulares en las células, como los gránulos en los glóbulos blancos, lo que permite una mejor discriminación de las células. Además, se puede obtener mejor información adicional, como información de fase, con una profundidad de campo reducida.

El uso de un dispositivo de microfluidos permite así que se detecte el enfoque de las células para que se puedan guiar fácilmente a través de una profundidad de campo reducida para que las células se puedan alinear y discriminar adecuadamente incluso dentro de la profundidad de campo reducida y, por lo tanto, preferiblemente incluso cuantificar, incluso en condiciones de flujo. Una profundidad de campo demasiado alta no logra una tasa de clasificación adecuada incluso usando un programa de aprendizaje automático avanzado. Una apertura numérica más alta del dispositivo microscópico holográfico digital no debe conducir necesariamente a una profundidad de campo mejorada.

De acuerdo con la invención, la imagen se obtiene con una resolución lateral menor a 0,6 |jm, preferiblemente menor a 0,55 jm , más preferiblemente menor a 0,52 jm , en particular 0,5 jm o menos, por ejemplo, 0,45 jm o menos, o incluso 0,4 jm o menos. Con una resolución lateral mejorada se pueden obtener más atributos de la célula detectada, y con ello también una magnitud de información como cambios de fase, etc.

La profundidad de campo y la resolución lateral pueden depender de una serie de factores del dispositivo microscópico holográfico digital, por ejemplo, la distancia focal, la disposición del haz, la apertura numérica NA del objetivo y/o la iluminación, la longitud de onda del haz, los ángulos a los cuales se irradian los haces, etc., y se pueden configurar adecuadamente.

De acuerdo con la invención, la detección se lleva a cabo mientras el medio que comprende al menos una célula fluye a través del dispositivo microfluídico. El flujo no está particularmente limitado siempre que las células pasen a través del dispositivo microscópico holográfico digital a una velocidad que permita tomar una imagen de las mismas que no esté borrosa, que es, por ejemplo, en función del tiempo de iluminación, etc., para obtener una imagen con suficiente contraste. También se debe evitar preferiblemente un flujo que sea demasiado lento para lograr un rendimiento suficiente. El flujo se puede configurar adecuadamente dependiendo de los parámetros del dispositivo microscópico holográfico digital, así como del dispositivo microfluídico, por ejemplo, las dimensiones del canal o canales microfluídicos, las condiciones superficiales de los mismos, etc.

De acuerdo con la invención, el flujo en el dispositivo microfluídico es al menos laminar en una región en donde se obtiene la imagen de al menos una célula. Con un flujo laminar, las células se pueden configurar en una orientación preferible para que se puedan detectar fácilmente. Un flujo laminar se puede ajustar adecuadamente dependiendo de, por ejemplo, dimensiones dentro del dispositivo de microfluidos.

De acuerdo con la invención, el dispositivo microfluídico comprende un microcanal en la zona en donde se obtiene la imagen de al menos una célula, en donde el flujo laminar se produce por al menos un flujo envolvente. Con un microcanal, el flujo se puede configurar y determinar fácilmente, de modo tal que se puede simplificar la cuantificación. Además, un flujo envolvente se puede implementar fácilmente en un microcanal. Preferiblemente, se implementa un flujo envolvente para al menos dos sitios opuestos en el microcanal para lograr un enfoque de las células a detectar. Más preferiblemente, se implementa un flujo envolvente desde dos, particularmente cuatro, preferiblemente perpendiculares, direcciones en el microcanal, particularmente en un microcanal rectangular (por ejemplo, en la parte superior, inferior, izquierda y derecha), para lograr un enfoque y una orientación celular adecuados. Los flujos envolventes se pueden implementar, por ejemplo, flujo de flujos microfluídicos adicionales desde diferentes entradas en comparación con un canal principal. Preferiblemente, la velocidad de la velocidad flujo no difiere demasiado del flujo en el canal principal para evitar turbulencias que podrían cambiar la orientación de la célula. Las velocidades de flujo envolvente se pueden determinar fácil y adecuadamente basadas en las geometrías de los canales, etc.

Preferiblemente, las células son enfocadas por el flujo en el microcanal de modo tal que las células son guiadas en la mitad de la profundidad de campo del dispositivo microscópico holográfico digital.

De acuerdo con ciertas realizaciones, el microcanal comprende al menos una superficie, preferiblemente al menos dos superficies perpendiculares a un frente de onda de un haz de referencia y/o detección del dispositivo microscópico holográfico digital.

De acuerdo con ciertas realizaciones, las superficies del microcanal perpendiculares a un frente de onda de un haz de referencia y/o de detección del dispositivo microscópico holográfico digital son esencialmente planas. Esto puede evitar perturbaciones y/o reflexiones de los frentes de onda del haz de referencia y/o del haz de detección, facilitando el análisis de señales y la reconstrucción de imágenes, así como la obtención de información adicional como información de fase esencialmente sin ajustes en los cálculos debido a tales perturbaciones. reflexiones, etc.

De acuerdo con ciertas realizaciones, el campo de visión del dispositivo microscópico holográfico digital es como máximo 1,0 veces el ancho del dispositivo microfluídico en una región en donde se obtiene la imagen de al menos una célula.

Según la invención, la al menos una célula es una célula sanguínea, en particular un glóbulo blanco. Con el presente método y dispositivo, se pueden discriminar en particular los glóbulos blancos, es decir, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, linfocitos y/o monocitos, además en particular los cinco tipos de glóbulos blancos, lo que permite un diferencial de 5 partes. Pero también se pueden detectar y discriminar otras células como eritrocitos, plaquetas y agregados celulares, de modo tal que se pueda lograr un análisis de todas las células sanguíneas.

Al no estar dentro del alcance de la invención reivindicada, la determinación del tipo de célula se puede realizar con la ayuda de un programa de aprendizaje automático, en donde se pueden usar varias imágenes en diferentes orientaciones de varios tipos de células de referencia para entrenar el programa.

En particular, para realizar análisis de imágenes para la diferenciación de los WBC, se usan técnicas basadas en aprendizaje automático. En tales técnicas, el análisis se realiza generalmente en dos fases principales: fase de entrenamiento y fase de prueba.

En la fase de entrenamiento, se usa un subconjunto de imágenes para entrenar un clasificador para diferenciar los diferentes tipos de células. La entrada al modelo de entrenamiento es un conjunto de imágenes que representan cada categoría de célula a determinar y la etiqueta correspondiente a cada imagen. El proceso de entrenamiento apunta a construir un modelo que maximice la probabilidad de una etiqueta en particular dada la imagen correspondiente.

El resultado del proceso de entrenamiento es el modelo de clasificación.

En la fase de prueba, el modelo se usa para clasificar datos no vistos, es decir, la entrada en la fase de prueba consiste en el modelo de clasificación y la imagen de entrada (con etiqueta desconocida), y la salida es la etiqueta de clasificación que representa la célula, por ejemplo, el tipo de WBC.

A continuación, se explica cómo se puede realizar la preparación de datos para el entrenamiento a modo de ejemplo para el caso de discriminación de glóbulos blancos, aunque la presente invención no se limita a un análisis de glóbulos blancos solamente, y posteriormente se proporcionan detalles a modo de ejemplo del entrenamiento y de la prueba.

Primero, se puede usar una canalización de preprocesamiento para preparar los parches de entrenamiento para el paso de entrenamiento del clasificador. Se puede iniciar ajustando el umbral de la imagen para capturar los puntos brillantes que tienen muchas probabilidades de ser células. Después de la umbralización, el análisis de componentes conectados se puede aplicar a la salida de la umbralización. Para cada componente conectado, se puede calcular el tamaño del componente y se puede rechazar el componente si el tamaño está por debajo o por encima de los umbrales predefinidos t1 y t2. Los componentes rechazados serán excluidos del entrenamiento y de la prueba. Los parches (un parche es una caja rectangular que incluye el componente conectado), incluidos los componentes restantes, se pueden usar para entrenar un clasificador.

De acuerdo con la invención, la determinación del tipo de célula de al menos una célula se lleva a cabo usando una red de aprendizaje profundo. Con una red de aprendizaje profundo de este tipo, la orientación de las células en el dispositivo de microfluidos se puede tener en cuenta fácilmente para la diferenciación celular, especialmente cuando se miden muestras más complejas como sangre periférica o muestras derivadas de la misma, por ejemplo, fracciones de sangre total, sangre periférica, etc.

Por lo tanto, la red de aprendizaje profundo no está particularmente limitada.

De nuevo se muestra de forma ejemplar el uso de redes de aprendizaje profundo para los glóbulos blancos, a los que, sin embargo, el presente método no se limita.

Para construir un clasificador para el aprendizaje, se puede usar cualquier clasificador, por ejemplo, también métodos de detección más recientes como una arquitectura Espacio Marginal Aprendizaje Profundo (MSDL, por sus siglas en inglés) desarrollada por GHESU FLORIN C. et al.: “Marginal space deep learning: Efficient architecture for detection in volumetric image data”, en: MICCAI, 2015, pp. 710-718; y ZH^e N^g YEFENG et al.: “Four chamber heart modeling and automatic segmentation for 3-D cardiac CT volumes using marginal space learning and steerable features”, en: IEEE Transactions on Medical Imaging, Vol. 27, No. 11, pp. 1668-1681,2008, para realizar una clasificación de 5 tipos para glóbulos blancos. Si bien la mayoría de los métodos de clasificación de aprendizaje automático crean clasificadores por pares, MSDL es inherentemente un clasificador multietiqueta. Por lo tanto, la red convolucional se puede entrenar directamente para el problema de clasificación multietiqueta. Por ejemplo, se pueden usar 500 células para el entrenamiento, por ejemplo, 100 para cada categoría, y el resto de células para pruebas.

Para esta aplicación, se puede usar una red neuronal convolucional de autocodificador (CNN, por sus siglas en inglés) o cualquier otra red adecuada para entrenar el clasificador de aprendizaje de espacio marginal (MSL, por sus siglas en inglés). La estructura del mismo puede ser, por ejemplo, una red neuronal de avance con una (o más) capa oculta, usada como un codificador automático (AE, por sus siglas en inglés). Ignorando el término de sesgo, las capas de entrada y salida tienen el mismo número de nodos.

El objetivo de tales codificadores automáticos es aprender una función de transferencia entre la capa de entrada (atributos que representan las imágenes) y la capa de salida (las etiquetas de la imagen). Si la capa oculta tiene un tamaño igual o mayor que la capa de entrada, potencialmente, un AE puede aprender una transformación de identidad. Para prevenir una solución tan trivial, previamente, se configura un AE con una capa oculta con menos nodos que la entrada. Recientemente, se propusieron codificadores automáticos de eliminación de ruido (DAE, por sus siglas en inglés) para obtener una representación más significativa de la entrada. Un determinado porcentaje (por ejemplo, 50 %) de los nodos de entrada se pueden elegir aleatoriamente para perturbarlos (por ejemplo, establecer el valor en cero), y el DAE puede reconstruir el vector de entrada original dada una observación contaminada. Con el DAE, la capa oculta puede tener más nodos que la entrada para lograr una representación demasiado completa. Después de entrenar un AE, la capa de salida se puede descartar y se puede apilar otro AE usando la respuesta de activación de la capa oculta ya entrenada como entrada para el nuevo AE. Este proceso se puede repetir para entrenar y expandir una red capa por capa. Después del entrenamiento previo, la salida de las capas ocultas se puede tratar como atributos de imagen de alto nivel para entrenar un clasificador. Alternativamente, se pueden adicionar una o más capas para la salida de destino y toda la red se puede refinar usando retro-propagación.

Se puede extraer una gran cantidad de funciones usando el aprendizaje automático. Estos atributos no corresponden necesariamente con las características físicas de cada célula, pero pueden desempeñar un papel esencial en la diferenciación de las células.

Para ilustrar cómo el aumento del número de características afectaría la exactitud de la clasificación, se pueden hacer diagramas de dispersión que ilustren, por ejemplo, la diferenciación de los WBC basada en dos atributos y tres atributos (datos no mostrados).

En tal caso, el diagrama de dispersión 2D muestra que los monocitos son casi separables de los linfocitos usando el área de superficie proyectada de la célula. Por otro lado, los basófilos son casi separables de los eosinófilos usando la altura óptica promedio. Sin embargo, los eosinófilos y los neutrófilos se superponen basados en el diagrama de dispersión 2D y no se pueden separar fácilmente, lo que está parcialmente relacionado con el hecho de que las poblaciones de neutrófilos muestran una alta heterogeneidad.

Al adicionar la función de diámetro celular, en el diagrama de dispersión 3D, la separabilidad de los eosinófilos y los neutrófilos se vuelve mucho mejor.

Esta es solamente una demostración de cómo adicionar más funciones ayudaría a mejorar la capacidad de diferenciar entre los diferentes tipos de células. El uso de la tecnología de aprendizaje profundo que extrae todos los atributos posibles de las imágenes puede, por ejemplo, permitir un buen diferencial de cinco partes para los diferentes glóbulos blancos.

Ejemplos

La presente invención se describirá ahora en detalle con referencia a varios ejemplos de la misma. Sin embargo, estos ejemplos son ilustrativos y no limitan el alcance de la invención.

Se han llevado a cabo pruebas de discriminación celular en sangre con EDTA (por sus siglas en inglés) obtenida de donantes sanos usando diferentes configuraciones, particularmente en los glóbulos blancos (WBC).

En primer lugar, se ha usado un contador Coulter como método de referencia. La Figura 1 muestra los diámetros hidrodinámicos d (y el volumen celular V) para diferentes números N de los WBC (basófilos (BA, por sus siglas en inglés), eosinófilos (EO, por sus siglas en inglés), monocitos (MO, por sus siglas en inglés), neutrófilos (NE, por sus siglas en inglés), linfocitos (LY, por sus siglas en inglés), y en general sangre periférica mononuclear células (PBMC, por sus siglas en inglés)) de 4 donadores diferentes obtenidas con el contador Coulter, que indica qué profundidad focal se requiere para obtener imágenes de todo el volumen de la célula (a una apertura numérica baja (NA)) o solamente una porción de la célula (a una NA alta) por DHM. El corte se debe medir idealmente a través del centro de la célula, particularmente con una alta probabilidad de obtener imágenes del núcleo rico en contraste. Esta es una tarea no trivial que tiene células en una superficie de sustrato debido a las variaciones de los diámetros de las células y el respectivo ajuste de enfoque con una nA de moderada a alta. En una solución microfluídica con un enfoque celular apropiado en una corriente laminar con flujos envolventes, los centros de los WBC se alinean entre sí independientemente de sus diámetros celulares.

Por lo tanto, una configuración con un microcanal rectangular con un ancho de canal y una profundidad de 50 |jm y flujos envolventes en los cuatro lados se usó posteriormente para obtener imágenes usando diferentes microscopios holográficos digitales. Se fijó un flujo laminar en el microcanal para la observación en línea de los WBC. La imagen de DHM cubre generalmente todo el ancho del microcanal y, en varios casos, un área aún mayor, por ejemplo, 130 jm X 130 jm . La DHM se llevó a cabo con una configuración de transmisión en una configuración común fuera del eje con diferentes NA y longitudes de onda de iluminación. Dado que un analizador de hematología automatizado necesita realizar análisis de glóbulos rojos (RBC) y de WBC, se hicieron las siguientes consideraciones para las imágenes de DHM con respecto al análisis celular y la orientación celular en el microcanal en una configuración de análisis automatizado.

Para un analizador de DHM de alto rendimiento con un sistema de transferencia de muestras de microfluidos, se debe encontrar una compensación para lograr un alto rendimiento de clasificación de los WBC e información cuantitativa sobre los RBC. Además, el sistema debe ser lo suficientemente flexible para adaptarse a ligeros cambios de posicionamiento de las células sanguíneas en una corriente de microfluidos. Por último, la orientación de los RBC preferiblemente debe ser perpendicular al eje óptico, aunque el aprendizaje profundo de redes también permite el análisis de células orientadas en ángulos después de un entrenamiento correspondiente que incluye imágenes de dichas células en un ángulo.

Las figuras 2 a 5 muestran la situación esquemática de una solución fluídica con respecto al tamaño y morfología de las células sanguíneas, así como su posicionamiento dentro del flujo de células. En general, uno está interesado en una condición microfluídica que permita analizar tanto los glóbulos rojos como los glóbulos blancos. Se observa una condición favorable con un DOF de aproximadamente 5 jm que se puede ajustar de forma idéntica al espesor del flujo de la muestra en un canal de microfluidos con flujos laminados (flujo envolvente-muestra-flujo envolvente en dirección z, es decir, a lo largo del haz de observación). La Figura 2 muestra consideraciones para diferentes diámetros de glóbulos blancos, con monocitos que tienen un diámetro de aproximadamente 15 |jm o menos, mientras que los linfocitos usualmente tienen un diámetro de aproximadamente 5 jm o más. Para estas células, se puede lograr un DOF de aproximadamente 5 jm con una NA objetivo de 0,55 (por ejemplo, una lente de 40x) e iluminación a una longitud de onda de 530 nm, lo que permite una resolución lateral de aproximadamente 0,5 jm . La Figura 3 muestra en una vista lateral el posicionamiento en un microcanal con flujo envolvente inferior y superior S, con F que muestra la dirección del flujo, y los cambios en el enfoque axial de las células en el microcanal, y su efecto en la observación de células con diferentes DOF de 5 y 1 jm , respectivamente. En esta imagen, se asume una altura de flujo de muestra de 5 jm en un canal de 50 jm . Como se puede ver, es ventajoso un buen enfoque de las células en el microcanal, especialmente con un DOF más pequeño. Con flujo laminar, se puede lograr un flujo de muestra aproximadamente bidimensional.

Con tal configuración, en promedio, mínimo 2/3 del volumen de WBC está dentro del DOF físico, lo que permite una tolerancia en z de ± 2 jm con respecto al leucocito más pequeño.

Se pueden hacer consideraciones similares a las de las Figuras 2 y 3 para los eritrocitos E, como se muestra en las Figuras 4 y 5. Una vez más, se puede lograr un DOF de aproximadamente 5 jm con una NA objetivo de 0,55 (por ejemplo, una lente 40x) e iluminación a una longitud de onda de 530 nm, lo que permite una resolución lateral de aproximadamente 0,5 jm , que también se supone en esta imagen. Para los eritrocitos, se asumen dimensiones de ~ 6 jm x 2 jm con la forma habitual de los mismos mostrada en sección transversal.

Además, también se indica la influencia de la observación de tales células en un ángulo con un glóbulo rojo que pasa a un ángulo. Se logra un efecto de orientación por un flujo laminado con una velocidad de flujo envolvente mayor que la velocidad del flujo de la muestra.

Las Figuras 6 a 8 muestran imágenes ejemplares de diferentes tipos de WBC adquiridas con la NA de objetivo, la NA de iluminación, y la longitud de onda de iluminación variables correspondientes a diferentes profundidades físicas de campos y resoluciones laterales.

En la Figura 6, las imágenes de transmisión reconstruidas en la fila superior e inferior se muestran para basófilos (BA), eosinófilos (EO), monocitos (MO), neutrófilos (NE) y linfocitos (LY) en una NA objetivo de 1,3, una NA de iluminación de 0 (onda plana), una coherencia baja a una longitud de onda de 532 nm y una profundidad de campo de ~ 1 jm .

Las imágenes de los mismos tipos de células se muestran en la Figura 7 con una NA objetivo de 0,55, una NA de iluminación de 0,4, una coherencia baja a una longitud de onda de 530 nm, y una profundidad de campo de ~ 4 jm . En la Figura 8, las imágenes se observaron con una NA objetivo de 0,55, una ⁿA de iluminación de 0 (onda plana), una baja coherencia a una longitud de onda de 650 nm, y una profundidad de campo de ~ 6 jm .

Como se puede ver en las Figuras 6 a 8, el patrón de imagen se vuelve rico en atributos debido a las estructuras subcelulares, principalmente debido al núcleo y los gránulos, lo que aumenta la tasa de clasificación de los tipos de WBC con una profundidad de campo (DOF) decreciente y una resolución lateral creciente.

La Tabla 1 muestra las tasas de clasificación para las clasificaciones diferenciales de 3 y 5 partes de los glóbulos blancos dependiendo de la apertura numérica (NA), y la longitud de onda de iluminación con un aumento del objetivo fijo de 40x usando luz condensada e iluminación de onda plana. El entrenamiento del algoritmo de diferenciación se realizó con muestras de sangre de 5 donadores sanos. El índice de difracción del medio, una solución amortiguadora de PBS (por sus siglas en inglés), fue de 1,334.

Tabla 1: Clasificación lograda de los WBC con diferentes configuraciones de DHM

En la tabla, el diferencial de 3 partes (diferencial de 3 partes) se refiere a una diferenciación de linfocitos, monocitos y granulocitos, mientras que el diferencial de 5 partes (diferencial de 5 partes) se refiere a una diferenciación de linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos, y basófilos.

Para lograr una precisión general > 75 %, se necesita una profundidad física de campo (DOF) de < 5,7 jm (que corresponde a la altura de corte de las células enfocadas). Se han observado exactitudes generales > 85 % a un DOF < 4,7 |jm.

Se observa una discriminación por pares de células de eosinófilos y basófilos de hasta 100 %, lo que es único para una metodología sin etiquetas. Estas altas exactitudes se obtuvieron independientemente de la longitud de onda de la fuente de luz con células no fijadas y sin teñir, que se han enriquecido a > 90 % por el agotamiento negativo usando la separación celular inmunomagnética (las células de interés no están etiquetadas y permanecen en suspensión después del agotamiento de las células no deseadas etiquetadas magnéticamente). Para obtener información sobre la morfología de los leucocitos nativos “in vivo", las muestras de sangre con EDTA (por sus siglas en inglés) no deberían tener una antigüedad superior al máximo de 24 horas. En este caso se puede mantener la calidad para el entrenamiento del algoritmo de imagen. Para los resultados de diferencias de 5 y 3 partes mostrados en los ejemplos, el tiempo desde la extracción de sangre hasta la formación de imágenes por DHM siempre fue inferior a 8 horas.

La Tabla 2 destaca las principales diferencias morfológicas de los WBC que se pueden usar para discriminar entre células. Por lo tanto, se espera que los componentes subcelulares que cambian el índice de refracción afecten el grosor óptico “físico”.

Tabla 2: Diferencias morfológicas de WBC

La Tabla 3 muestra las tasas de clasificación usando diferente profundidad de campo (DOF), como se menciona anteriormente, y logrando así una resolución diferente. En ambos casos, solo se enfoca una porción de los WBC.

Tabla 3: Tasas de clasificación de leucocitos con un objetivo 40x y una NA de 0,55

La novedad de la invención con respecto a la configuración usando microcanales y DHM, y el entrenamiento adicional de algoritmos, es cuádruple: En primer lugar, se puede realizar un análisis diferencial de 5 partes sin etiquetas basado en imágenes de glóbulos blancos en lugar de realizar una tinción permanente de Giemsa para etiquetar los leucocitos.

En segundo lugar, el uso de la tecnología de aprendizaje profundo proporciona un rico dominio de atributos para su uso en la clasificación en comparación con los analizadores de hematología convencionales, que dependen principalmente de la dispersión de luz ortogonal y frontal.

En los sistemas de aprendizaje profundo, las capas ocultas pueden extraer atributos de las imágenes de entrada. Los atributos de bajo y alto nivel se extraen basados en la composición de las capas ocultas. Tales atributos pueden ser tan simples como las intensidades de la imagen y sus estadísticas y pueden ser más complejas, tal como la formación de bordes, esquinas, etc.

Además, se puede extraer una gran número de atributos. Estos atributos no corresponden necesariamente con las características físicas de cada célula, pero pueden desempeñar un papel esencial en la diferenciación de las células.

En tercer lugar, se puede observar una alta exactitud de diferenciación de leucocitos (> 75 %) con un DOF < 5,7 jm y un límite de resolución lateral de < 0,6 jm , lo que establece las condiciones límite para la NA objetivo y la longitud de onda usada para obtener imágenes de las células.

Por último y más importante, los leucocitos pueden estar en una condición nativa in vivo, por ejemplo, una muestra de sangre estabilizada con EDTA almacenada a temperatura ambiente que no tenga más de un día. No es necesario realizar fijación ni tinción, pero los leucocitos se visualizan directamente en plasma sanguíneo o en un amortiguador isotónico.

Esta es una configuración que es compatible con un flujo de trabajo de alto rendimiento (típicamente 60 s/muestra y una estadística en todos los WBC desde ~ 2 |j L)).

Lo más importante en comparación con el estado de la técnica es la posibilidad de discriminar granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos), que usualmente no se puede lograr con ningún otro método sin etiquetas (por ejemplo, microscopía de 2 fotones, microscopía de contraste de fase convencional, microscopía regular basada en valores de intensidad, análisis de hematología por dispersión de Mie, o análisis de impedancia) en la actualidad.

Claims (4)

REIVINDICACI0NES

1. Un método para la detección sin marcadores de un tipo celular de al menos una célula en un medio, en donde al menos una célula es una célula sanguínea, que comprende

hacer fluir un medio que comprende al menos una célula en un dispositivo de microfluidos,

obtener una imagen de al menos una célula en el dispositivo de microfluidos por un dispositivo microscópico holográfico digital, en donde la imagen se obtiene con una profundidad de campo menor a 6 |jm y una resolución lateral menor a 0,6 |jm, y determinar el tipo de célula de al menos una célula,

en donde la determinación del tipo de célula de al menos una célula se lleva a cabo usando una red de aprendizaje profundo, en donde la detección se lleva a cabo mientras el medio que comprende al menos una célula fluye a través del dispositivo de microfluidos, y

en donde el flujo en el dispositivo de microfluidos es al menos laminar en una región en donde se obtiene la imagen de al menos una célula, y en donde el dispositivo de microfluidos comprende un microcanal en la región en donde se obtiene la imagen de al menos una célula, en donde el flujo laminar es producido por al menos un flujo envolvente.

2. El método de la reivindicación 1, en donde las superficies del microcanal perpendiculares a un frente de onda de un haz de referencia y/o detección del dispositivo microscópico holográfico digital son esencialmente planas.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el campo de visión del dispositivo microscópico holográfico digital es como máximo 1,0 veces el ancho del dispositivo microfluídico en una región en donde se obtiene la imagen de al menos una célula.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el glóbulo es un glóbulo blanco.