JPH058385B2 - - Google Patents

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JPH058385B2
JPH058385B2 JP59062082A JP6208284A JPH058385B2 JP H058385 B2 JPH058385 B2 JP H058385B2 JP 59062082 A JP59062082 A JP 59062082A JP 6208284 A JP6208284 A JP 6208284A JP H058385 B2 JPH058385 B2 JP H058385B2
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light
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Aaru Rotsuken Maikeru
Aaru Paakusu Deebitsuto
Aaru Haadei Richaado
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Becton Dickinson and Co
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Description

【発明の詳现な説明】 本発明は詊料内粒子の耇数副次集団サブポピ
ナレヌシペンを識別する方法および装眮に関す
るものであり、さらに具䜓的には、螢光色玠ぞ励
起゚ネルギヌを提䟛するのに利甚できる光源の数
よりも倚い数の各皮螢光色玠を䞀぀の现胞集団の
䞭においお識別しか぀定量化する方法および装眮
に関するものである。
现胞、粒子、などの最近の现胞cytometric
分析は现胞の各皮副次集団䞊の抗原の分垃を怜蚎
するために现胞衚面暙識剀たたは螢光色玠の利甚
を匷調しおいる。被怜现胞はこれらの现胞たたは
粒子䞊の抗原決定基に盞関させるために各皮螢光
色玠をも぀免疫螢光色玠で識別を䞎えられる。こ
こで䜿甚する堎合、「免疫螢光色玠」は䞀般的に
は別の分子ぞ物理的に付着した発色団のこずを蚀
い、これはある暙的ぞの発色団の付着に察しお特
異性を付加するものである。この方法の䞀぀の䟋
は抗䜓たたはホルモンぞの螢光色玠の結合であ
る。このタむプの螢光染色は埓぀お、反応の特異
性が発色団自䜓によ぀お付加される既知染色法ず
党く異なる。この染色法の䞀぀の䟋はいく぀かの
色玠分子のDNAずの反応であり、この堎合、现
胞の内郚芁玠がそれらの现胞の特性を評䟡するた
めに各皮色玠で染色される。
フロヌサむトメトリヌ装眮においお免疫螢光色
玠を䜿甚する際に生ずる困難の䞀぀は䞀぀の詊料
䞭の现胞の䞊の倚様の色玠を怜出する胜力に関す
るものである。粒子、现胞、などを怜出するのに
有甚な珟圚入手可胜なフロヌスルヌサむトメヌタ
ヌは普通には混合物䞭で现胞䞊の二぀の独立色玠
を怜出するために二぀のチダネルを含む。䟋え
ば、免疫螢光色玠のようなそれぞれの螢光チダネ
ルず関連する二぀の现胞衚面暙識で特異的に暙識
した现胞を怜出する二぀の螢光チダネルを含む装
眮が知られおいる。これらの既知装眮においお
は、分析され぀぀ある詊料の䞭の现胞の混合物䞭
で怜出されるべき螢光反応性现胞の各々の皮類に
぀いお、電気回路機構ず螢光怜出噚を含む䞀぀の
完党な螢光チダネルが必芁ずされおきた。それゆ
え、フロヌスルヌサむトメトリヌを䜿甚しお詊料
䞭の现胞の耇数副次集団を怜出するためには、同
数の螢光チダネルが既知の慣甚装眮を䜿甚しお採
甚される。唯䞀の光源䟋えばレヌザヌを甚いる堎
合には、二぀の抗原決定基を順次に評䟡するのに
二重通路方匏を䜿甚できる。しかし、単䞀光源を
二皮の螢光色玠に察する励起源ずしお䜿甚できる
こずは圓業界で知られおきた。䟋えば、フルオレ
セむンずロヌダミンずの䞡方で暙識した现胞は、
䞡方の発色団からの発光がそれらの色玠の発光ス
ペクトルがたずえ重耇するずしおも独立に怜出さ
れるように分析されおきた。単䞀波長がこの二぀
の色玠の励起に䜿甚された。この成瞟はロヌケ
ン、M.R、パヌカヌ、D.R.およびヘルツ゚ンベ
ルグ、L.A.の「螢光掻性化现胞識別噚を䜿甚す
る二色免疫螢光」、The Journal of
Histochemistry and Cytochemistry、25巻、No.
、899−907頁、1977幎に蚘茉されおいる。こ
のような単䞀レヌザヌ光による二皮の色玠の励起
法は、免疫螢光色玠における最近の発展により改
善された。䟋えばフむコ゚リトリンずフルオレセ
むンずを免疫螢光における色玠察ずしお䜿甚する
こずはオヌむらにより「现胞および分子分析甚の
螢光性フむコビリ蛋癜質結合䜓」、The Journal
of Cell Biology、93巻、981−986頁、1982幎
月においお蚘茉されおいる。
しかし、珟圚利甚できるフロヌサむトメトリヌ
装眮は䞀般的には二぀の区別し埗る螢光性暙識を
励起するために二぀のレヌザヌを採甚しおいる。
被怜现胞たたは粒子䞊に暙識化された各々異なる
皮類の免疫螢光色玠を励起させるために甚いられ
る機構は、䞀般には別々の光源䟋えばレヌザ
ヌであるずいう事実は、䞊蚘制玄ず䞀臎する。
埓぀お、ある単䞀詊料䞭で二぀の異なる免疫螢光
色玠を分析たたは定量化するためには、著しく離
れおいる波長においお励起゚ネルギヌを提䟛する
二぀のレヌザヌが通垞䜿甚される。二皮の免疫螢
光色玠を分析するためにそれず同数の二぀のレヌ
ザヌを甚いる装眮は䟋えば米囜特蚱第3826364号
および第4284412号に蚘茉されおいる。ある流路
系においお二぀のレヌザヌを䜿甚するこずは、免
疫螢光ずは関係はないが、パルス−现胞枬光法に
関する第二回囜際シンポゞりム䌚議録線者ゎ
ヌルデ、W.、シナヌマン、J.バツカヌ、T.
European Press.Ghent、1976幎、39−45頁に
おけるストヌルM.の「フロヌ技法における二
重ビヌムの適甚ず最近の結果」にも蚘茉されおい
る。
具䜓的にいえば、二぀のレヌザヌをフロヌサむ
トメトリヌ装眮においお䜿甚する堎合には、でき
るならば、十分に離れた励起および発行のスペク
トルをも぀色玠、䞊びに十分に離れた䞀次攟射を
も぀レヌザヌが遞ばれるべきである。现胞ぞ結合
させるために䜿甚しおもよくそしお二色二レヌザ
ヌ匏フロヌサむトメトリ分析によく適しおいる免
疫螢光色玠はフルオレセむンずテキサスレツドで
ある。免疫螢光色玠フルオレセむンずテキサスヘ
ツドである。免疫螢光色玠ずしおのテキサスレツ
ドの䜿甚はタむタス、J.Aにより「デナアル パ
ラメヌタヌフロヌ マむクロ螢光枬定研究および
螢光顕埮鏡研究におけるフルオレセむン䜵甚のた
めの芪氎性赀色発行螢光団、テキサスレツド」、
Journal of Immnological Methods、50
1982、193−204に蚘茉されおいる。
励起゚ネルギヌのより良奜な適合性を埗るため
のレヌザヌ利甚法の完党は、第二螢光色玠の励起
スペクトルにかか぀おいるず報告されお来た。二
重レヌザヌフロヌ系における第二レヌザヌずしお
の色玠レヌザヌの䜿甚は第䞉螢光色玠を励起する
発光を提䟛するこのような系はアルント−ゞペバ
ンD.J.らにより、“ Dual Laser Flow Sorter
Utilizing  CW Pumped Dye Laser”
〔Cytometry 、第巻、No.2127−131頁、1980
幎〕に蚘茉されおいる。
しかし、䞍均質现胞集団に぀いおより倚くの研
究がなされるに぀れ、フロヌサむトメヌタヌ䞭の
䞀回通過においお皮、皮、さらにはそれ以䞊
の抗原決定基を研究する必芁性が望たしい䞀぀の
目暙ずな぀おきおいる。
䞉レヌザヌフロヌサむトメヌタヌも報告されお
おり、その堎合には、異なる励起スペクトルをも
぀䞉皮の螢光色玠DNA染色タむプのものが
现胞䞊で怜出された。シナタむンカンプJ.A.らの
「䞉぀のレヌザヌ波長においお励起された単䞀现
胞に぀いおの䞉色螢光枬定」Cytometry、第
巻、No.、226−231頁、1982幎。倚重光源の䜿
甚に関するも぀䞀぀の蚘茉はシダピロH.M.らの
「サむトマツト−コンピナヌタヌ制埡による
倚重レヌザヌ源倚重パラメヌタヌ フロヌ现胞枬
光噚系」Journal of Histochemistry and
Cytochemistry、第25巻、No.、836−844頁、
1977幎に芋出される。しかし、䞊に蚀及したよ
うに、芁請されるこずは、励起゚ネルギヌを䞎え
るのに必芁ずする光源数を最少化し、䞀方、现胞
の倚様集団を分析するこずができるこずである。
この目的に察しお、各々の光源は䞀皮以䞊の螢光
暙識を励起するこずが望たしい。しかし、二぀の
光源を甚いるずきには、䜿甚された免疫螢光色玠
のスペクトル間隙に関しお問題がおこる。怜蚎䞋
の各抗原決定基に぀いお新しい光源を付加するこ
ずの出費ず煩雑さず耇雑さを避けるためには、耇
数の免疫螢光色玠を励起する光源を䜿甚するこず
が最も有利である。
ある詊料混合物から现胞の耇数副次集団を、分
析が行なわれる領域䞭を通る现胞の䞀回通過で怜
出し埗るこずが望たしい堎合が倚く存圚する。こ
のような分析においお怜蚎䞋においお现胞パラメ
ヌタの重耇が存圚する領域における副次集団の評
䟡も可胜ずするこずが望たしい。䟋えば、血液に
぀いおのいく぀かの詊隓を実斜する堎合には、フ
ロヌスルヌサむトメヌタヌ䞭を通る现胞の䞀回通
過においお现胞、现胞および単球の割合を怜
定たたは定量化するこずが望たしい。同様に、癜
血球その他の耇数サブクラスの怜定および定量化
も望たれるかもしれない。明らかに、このこずは
重倧な課題を生じた。詊料混合物から现胞の耇数
副次集団を怜出しか぀たた定量化し埗るこずは望
たしいけれども、レヌザヌのような光源の数およ
びその関連回路機構の数を最少化するこずがさら
に望たしい。このこずを念頭においお、本発明
は、䞀぀の詊料混合物から现胞の耇数の暙識化副
次集団の枬定に望たれる芁請を、螢光信号のいず
れをもほずんど損なうこずなく満たしながら、前
蚘諞問題を解決するこずに向けられおいる。
䞀぀の詊料䞭の粒子の耇数副次集団を識別する
方法は䞀぀の詊料䞭の粒子に遞択的に耇数の異な
る衚面暙識剀で暙識するこずから成る。各暙識剀
は識別できる定量化可胜の暙識特性をも぀おい
る。暙識を付䞎した粒子を䞀回に実質䞊個づ
぀、耇数の怜出領域䞭に順次通し、各々の怜出領
域䞭の粒子䞊の䞀皮たたは䞀皮より倚くの異なる
暙識剀の特性を怜出する。粒子が通過する怜出領
域の数より倚くの暙識剀が怜出される。本発明の
方法は䞊蚘暙識剀の怜出される定量化可胜の特性
に基づいお粒子間の盞異を識別するこずを含む。
本発明のこの面の䞀぀の奜たしい具䜓化におい
おは、䞀぀の詊料䞭の现胞を少くずも䞉皮の異な
る免疫螢光色玠で遞択的に暙識するこずを含む。
各々の色玠ずしおは予め決められた実質䞊離れた
発光スペクトルをも぀ものを甚いる。これらの暙
識现胞を䞀回に実質䞊䞀個づ぀、焊点に集められ
た光孊的刺戟の䞭に通し、励起゚ネルギヌを䞎え
お䞀぀たたは䞀぀以䞊の各皮色玠を励起する。暙
識现胞を次に、䞀回に実質䞊䞀個づ぀、焊点に集
めた光孊的刺戟の少くずも䞀぀の他の領域䞭に通
し励起゚ネルギヌを䞎えお各々の他領域においお
䞀぀たたは䞀぀以䞊の異なる色玠を励起し、少く
ずも䞉皮の異なる色玠が䞊蚘第䞀領域ず他の刺戟
領域の通過によ぀お励起されるようにする。異な
る励起色玠によ぀お攟射される螢光が怜出され、
次に现胞の副次集団はそれらの怜出螢光特性ず関
連づけお識別される。
本発明のもう䞀぀の面はある詊料䞭の粒子の耇
数副次集団を識別する装眮である。これらの粒子
は刺戟されるこずが可胜であり、か぀識別および
定量可胜の特性をも぀各皮の衚面識別剀で遞択的
に暙識されおいる。この装眮は暙識粒子を䞀回に
実質䞊䞀個づ぀、流路䞭を移動させる手段を有す
る。この流路䞭を移動する粒子䞊の暙識剀を刺戟
するために耇数個の手段が提䟛される。各刺戟手
段は暙識粒子䞊の䞀皮より倚くの異なる暙識剀の
特性を刺戟するこずができる。刺戟された暙識剀
によ぀お瀺される特性を怜出する手段、および刺
戟された暙識剀の怜出された異なる定量可胜特性
に関連させお粒子間の差異を識別する手段、も存
圚する。
本発明のこの面の䞀぀の奜たしい具䜓化におい
おは、この装眮は、各々予めきめられた実質䞊互
いに離れた発光スペクトルをも぀各皮の免疫螢光
色玠で遞択的に暙識された现胞の耇数副次集団を
識別する。この奜たしい装眮は暙識された现胞を
䞀回に実質䞊䞀個づ぀、流路䞭を移動させる手段
を有する。第䞀の手段は流路に沿぀た光孊的刺戟
の第䞀領域の䞭で䞀皮たたは䞀皮より倚くの螢光
色玠を励起する。第二の手段はこの流路に沿぀た
光孊的刺戟の第二領域䞭で䞀皮たたは䞀皮より倚
くの異なる色玠を励起する。各々の现胞に結合し
おいる各皮の励起された免疫螢光色玠によ぀お攟
出される螢光の量を怜出する手段、および、怜出
された螢光特性に基づいお现胞の副次集団を識別
する手段が蚭けられおいる。
本発明の原理によるず、数倚くの利点ず目的が
達成される。第䞀に、本発明はレヌザヌのような
採甚する光源の数より倚い倚皮類の粒子たたは现
胞の耇数副次集団の怜出ず定量を可胜にする。こ
のようにしお、非垞に倚くの现胞副次集団をフロ
ヌサむトメヌタヌを通る䞀回の通過で枬定するこ
ずができる。なぜならば、本発明はレヌザヌのよ
うな単䞀光源が䞀皮より倚くの免疫螢光色玠等を
励起するこずができるずいう構成を採぀おいるか
らである。識別される特性が提䟛されるよう励起
波長が十分に離れおいるけれども単䞀光源によ぀
お励起されるべきスペクトル範囲は十分に近接し
おいる螢光性衚面暙識を遞択するこずによ぀お、
぀のレヌザヌで励起させる機構に匹敵する二色
免疫螢光結果を埗るこずができる。この方法を採
甚するずきには、単䞀の现胞集団における少くず
も個の異なる免疫螢光色玠を僅か個のレヌザ
ヌを䜿甚するこずによ぀お同時に定量化するこず
が可胜であり、この詊みを個たたは個より倚
くの现胞免疫螢光色玠の怜出ぞ拡匵するこずが可
胜である。
第図は粒子の耇数副次集団に関連する螢光な
らびに流路䞭を流れる粒子の光散乱パラメヌタヌ
の枬定に特に有甚なフロヌサむトメトリ装眮の光
孊的芁玠ず光路の䞀぀の奜たしい具䜓化の抂念図
であり 第図は本発明の原理に埓぀お二぀のレヌザヌ
を組入れたフロヌサむトメヌタヌを通る䞀回通過
によ぀お枬定された、詊料䞭の䞉぀の副次集団の
癜血球の怜出ず定量化のグラフであり、そしお、 第−図は各々怜出された现胞の各螢光パラ
メヌタヌの盞関をプロツトしたグラフである。
本発明は倚くの異なる圢態の具䜓化によ぀お満
足されるが、本発明の奜たしい具䜓化が詳现に図
瀺されか぀本明现曞においお蚘茉される。ただ
し、この開瀺は本発明の原理の䟋瀺ずしお考える
べきものであり、本発明を解説した具䜓䟋を限定
する積りのものではない。本発明の範囲は特蚱請
求の範囲およびそれらず均等のものによ぀お刀断
されるものである。
図面、特に第図に蚀及するず、フロヌサむト
メトリヌ装眮の光孊的芁玠ず粒子の流路芁玠
が描かれおいる。第図の光孊的芁玠ず流通芁玠
は、粒子をその特定的特性に぀いお分析するため
に粒子を䞀぀の液䜓流ずしお䞀回に実質䞊䞀個づ
぀流すため、フロヌサむトメトリ装眮の䞻芁構成
分を衚わしおいる。䟋えば、第図の装眮の諞芁
玠は、カリホルニア州サニベヌルのベクトン・デ
むツキン゜ン・アンド・カンパニヌのFACSシス
テムズ郚門によ぀お補造および販売されおいる
FACS螢光掻性化識別噚の䞭に含たれるであろ
う。FACS现胞識別噚は広範囲の研究所の応甚に
おいお光散乱ず螢光を基瀎ずしお现胞集団を分析
および分離する。本明现曞においおより特定的に
詳现に蚘茉されか぀FACS现胞識別噚のような噚
具においお具䜓化されるかもしれない光孊的芁玠
およびフロヌ芁玠のほかに、本発明に関連しお有
甚である现胞識別装眮のその他の詳现が米囜特蚱
第3826364号に蚘茉されおいる。本発明は、ある
詊料䞭の粒子の副次集団の固定たたは定量化のた
めに光散乱、粒子容積、螢光あるいは䜕か他の光
孊的パラメヌタヌのいずれを枬定するに拘らず、
倚くの異なるタむプのフロヌサむトメトリヌ装眮
においお有甚であるこずが理解される。本発明の
光孊的芁玠は特に、前述特蚱に蚘茉されおいるよ
うなフロヌサむトメトリヌ装眮における改良の本
質を衚わしおいる。
第図に描く通り、光゚ネルギヌは二぀のレヌ
ザヌおよびによ぀お本発明のフロヌサむ
トメトリヌ装眮に䟛絊される。説明するこの具䜓
化においおは、異なる螢光特性をも぀耇数の異な
るタむプの粒子を怜出および定量化するこずが可
胜であるように、二぀の光源がフロヌサむトメト
リヌ装眮の䞭に提䟛されおいる。しかし、第
図に描く具䜓化においお個のレヌザヌを含め
おいるこずは、単に奜たしいだけであり、か぀説
明し぀぀ある本発明のタむプにおいお個より倚
い光゚ネルギヌ源ず分析芁玠を採甚する䟋瀺的具
䜓化ずしおの圹割を果しおいるにすぎない。
本発明においお、レヌザヌおよびはス
ペクトル範囲が盞互に分離されおいる特定波長に
おいおコヒヌレントな䞀次攟射を生成するように
遞ばれる。䟋えば、レヌザヌは青緑のスペ
クトル領域においお䜜動するように遞ぶこずが奜
たしく、それにより、ある波長の光孊的刺戟によ
぀お照射されるずきに螢光を発する、レヌザヌ
によ぀お発生する光の䞭を通過する粒子ぞ結合
した、螢光色玠が励起されるに至る。本発明に有
甚である䞀぀のこのようなレヌザヌは488ナノメ
ヌタヌnmにおいお䞀次攟射をも぀アルゎン
むオンレヌザヌである。レヌザヌはレヌザヌ
ずは別の離れた波長においお䜜動するように
遞ぶのが奜たしい。レヌザヌの波長の光孊的
刺戟によ぀お照射されるずきに螢光を発する螢光
色玠を自らの䞊に有する粒子はこれらの粒子がレ
ヌザヌによ぀お発生される光の䞭を通過する
ずきに励起されるに至る。レヌザヌの䜜動は
レヌザヌのスペクトル領域ず波長においお実
質的に分離されるように可芖スペクトルの黄赀
領域にわたるものであ぀およい。この芁請を満た
す䞀぀のこの皮のレヌザヌはロヌダミン−色
玠レヌザヌであり、これは600nmにおいお䞀次攟
射をも぀おいる。アルゎンむオンレヌザヌず十分
に離れた䞀次攟射633nmをもちか぀本発明に
おける第二レヌザヌずしお圹立぀もう䞀぀のレヌ
ザヌはヘリりム−ネオンレヌザヌである。ここに
蚘茉した芏準の䞋で利甚し埗る堎合にはその他の
レヌザヌも遞ぶこずができる。二぀のレヌザヌの
波長差は、各々のレヌザヌで励起されるべき少く
ずも二皮の免疫螢光色玠の励起および発光スペク
トルの範囲の倖偎にあるよう実質的に十分である
こずが望たしい。75から100nmあるいはそれ以䞊
の二぀のレヌザヌ間の波長差は今述べた望たしい
結果を可胜にするこずが発芋された。もちろん、
免疫螢光色玠あるいは他の定量可胜の衚面暙識剀
の遞択は、二぀たたはそれより倚くの免疫螢光色
玠が各々のレヌザヌによ぀お䞎えられる光゚ネル
ギヌによ぀お励起され埗るよう、本発明においお
䜿甚するレヌザヌず適合し埗るものでなければな
らない。
レヌザヌおよびから出るず、各々のビ
ヌムおよびはそれぞれ、各ビヌムをその
平行特性を保持しながら広げる暡匏的に瀺される
ビヌム・゚キスパンダヌおよびの䞭を通
぀およい。各ビヌムがビヌム・゚キスパンダヌか
ら出るずきにはこの゚キスパンダヌは本発明の
操䜜にず぀お奜たしいものではあるが必芁なもの
ではないのであるが、各ビヌムは通垞はフロヌ
サむトメトリヌ装眮を小型化する芁請に基づいお
その方向を倉えられねばならない。この目的のた
めに、ビヌムはプリズムずによ぀お
反射され、䞀方、ビヌムはプリズムず
によ぀お反射される。これらのプリズムはすべ
お操䜜䞭に適切にビヌムを䞊べるよう調節可胜に
させおよい。ビヌムずはプリズムを通過
したのち、粒子の流れの䞊に焊点を結ばせるため
にレンズおよびぞ向けられる。レンズ
ずずは採甚する堎合にはフロヌサむトメト
リヌ装眮のタむプに埓぀お遞ばれるが、これらの
レンズは本願ず同䞀出願人による1982幎月25日
付米囜特蚱出願第361672号における蚘茉に埓぀お
遞択しおよい。
レヌザヌビヌムがレンズずを通過する
ず、それらは粒子流䞊ぞ向けられる。本発明
のフロヌサむトメトリヌ装眮内に組蟌たれたノズ
ルは粒子が流䜓流内を流れるのを助
ける。このタむプのノズルの利甚は良く知られお
おり、䟋えば米囜特蚱第1826364号に蚘茉されお
いる。説明し぀぀あるこの装眮においおは、二぀
のレヌザヌビヌム・粒子流の亀点は玄250マむク
ロメヌトル離れおいる。第図においおさらに詳
しく芋られる通り、レヌザヌビヌムは䞀぀の
光散乱チダネルの光孊軞䞊にあり粒子の散乱光怜
出に甚いられる。しかし、ここで述べる光散乱の
芁玠は、光散乱に䟝存しお光ビヌム䞭を通過する
粒子から情報を埗る代衚的なフロヌサむトメトリ
ヌ装眮の姿を完成するために含たれおいるにすぎ
ない。
このように、光ビヌムはノズルから出
る流れの䞭で流れる粒子ず出䌚う最初のビヌ
ムである。その埌、ビヌムは光散乱チダネル
の光孊軞䞊で光散乱遮蔜obscurationバヌ
ず衝突する。散乱された光は、レンズによ
぀お集められお第䞀の絞りの䞭を通り、これ
は集められた散乱光の最倧角床を決定する。第䞀
絞りに続いおビヌムスプリツタヌ鏡があり、
これは入射光のある割合を散乱怜出噚の方ぞ
反射し、入射光の残りを光吞収䜓図瀺せずの
䞊ぞ送る。第二の絞りはレヌザヌビヌム
ず流れずの亀点から来る散乱光のみを通過さ
せる芖野絞りずしお機胜する。フむルタヌを
通過埌、散乱光は怜出噚においお怜出され
る。この怜出噚は呚知の技法に埓぀お流䜓流䞭で
流れる粒子の寞法を評䟡するよう電気的に機胜す
る。
第図に瀺す本発明の具䜓䟋においお、レヌザ
ヌビヌムはたた流れおいる流れに向けら
れるが、しかしその流れの垂盎軞に沿぀おレヌザ
ヌビヌムから垂盎方向に離れおいる。粒子に
よ぀お散乱されたビヌムからの光も光散乱−
チダネル光孊系に入るが、しかし光散乱チダネル
䞭に眮いた遮蔜フむルタヌdielectric filter
によ぀お怜出噚から閉め出されるのが奜たし
い。
螢光チダネルに関しおは、レヌザヌの異なる波
長による照明が、予め定めた実質䞊分離された発
光スペクトルをも぀螢光色玠の連続匏励起に甚い
られる。異なる発光スペクトルをも぀少くずも䞀
぀の、しかし奜たしくは二぀たたはそれより倚く
の免疫螢光色玠は各レヌザヌの光゚ネルギヌによ
぀お提䟛される励起゚ネルギヌによ぀お励起され
る。第図においお芋られるように、二぀の独立
のレヌザヌビヌムは䞀぀の粒子がたずレヌザヌビ
ヌムず亀差し次いでレヌザヌビヌムず亀
差するよう垂盎方向に離れた点においお流れ
ず亀差する。埓぀お、二぀の光孊的信号が粒子が
光ビヌム䞭を通過するこずによ぀お発生される。
信号のこれらの察は粒子が第䞀のビヌム亀点から
第二のビヌム亀点ぞ移動するのに芁する時間だけ
時間的に離れおいるこずが奜たしい。この時間間
隔は信号の察が別々に分析されるこずを可胜に
し、二぀の異なる励起波長においお励起されるず
きの粒子の螢光発光に比䟋する信号を䞎える。粒
子から攟射される螢光信号は入射ビヌム分離さ
けたビヌムからなるの屈折光を阻止するための
遮蔜バヌobscuration barの呚りぞ向けられ
る。螢光信号はすべおレンズにより奜たしく
は特定波長の光のみを通過させる第䞀フむルタヌ
を通しお焊点を結ばされる。
光ビヌムによ぀お励起された粒子から攟射
される螢光は、フむルタヌを通過したのち、
二色性ミラヌず出䌚う。二色性ミラヌの
目的は螢光通路に沿぀お移動する二぀の異なる色
を分離しおそれらを別々に分析するこずができる
ようにするこずである。䟋えば、二色性ミラヌ
は䟋えばレヌザヌによ぀おのみ生成される
光ビヌムによ぀お励起された粒子の異なる色
の波長を分離するために遞ばれる。䟋えば、緑領
域における波長は二色性ミラヌによ぀お透過
され次いで唯䞀色の領域、本䟋の堎合は緑の波長
を透過するよう蚭蚈されたバリダヌ・フむルタヌ
を通る。緑の光は次に螢光怜出噚に入
る。
二色性ミラヌず出䌚う橙色領域の光は二色性ミ
ラヌによ぀お反射され、唯䞀色の領域、本䟋の堎
合には、橙色、の波長を透過するバリダヌ・フむ
ルタヌに送られる。螢光怜出噚は次いで
この橙色光を受ける。
光ビヌムもたた光ビヌムによ぀お励起
されるものずは異なる個たでの螢光色玠を励起
するのに十分な単䞀波長においお励起゚ネルギヌ
を提䟛する。光ビヌムによ぀お励起された粒
子によ぀お攟射される螢光がレンズず第䞀フ
むルタヌを通過したのち、この光は別の二色
性ミラヌず出䌚う。前蚘二色性ミラヌに
関する蚘述ず同じく、第二の二色性ミラヌは
色スペクトルの二぀の異なる領域の波長を分離す
るために遞ばれる。レヌザヌから送られる光
ビヌムによ぀お䞎えられる単䞀励起源の結果
ずしお䟋えば、赀および遠赀倖の信号を発生させ
おもよい。この赀色領域における波長は二色性ミ
ラヌを通過しか぀次に赀色領域のみの波長を
透過するよう蚭蚈されたバリダヌ・フむルタヌ
を通過する。この光は次に螢光怜出噚ぞ向
けられる。遠赀倖領域にある波長は二色性ミラヌ
により反射されおバリダヌ・フむルヌタを通
過し、そしお螢光怜出噚に入る。埓぀お、二
぀のレヌザヌからの光は、各々その波長においお
二぀たたは二぀より倚くの異なる螢光色玠を励起
するこずができるものであり、蚘茉したようなフ
ロヌサむトメトリヌ装眮においお詊料の唯䞀回の
通過の間にその詊料䞭の粒子の怜出ず定量化を可
胜にする。
螢光怜出噚およびはそれ
ぞれ四぀の分離された緑、橙、赀および遠赀倖の
光路を奜たしくは受けるように提䟛されおいる。
これらの螢光怜出噚は光孊的信号を電気的信号ぞ
倉換する䜎ノむズ光電子倍増管などであ぀およ
い。第図には瀺されおいないけれども、これら
の電気信号は次にフロヌサむトメトリヌ装眮の゚
ロクトロニクスに電気的に送られ、ここで分析た
たは他の目的のために凊理される。各皮のデむス
プレヌ、情報の提瀺、蓄積たたは蚘録化をこのフ
ロヌサむトメトリヌ装眮の䞭に準備しおよい。同
様に、特異的な特性をも぀粒子は米囜特蚱第
3826364号が教瀺する技法に埓぀お分離され識別
されおよい。
本発明の操䜜をここで単に説明の目的のために
以䞋の䟋ず関連しお述べる。この䟋はある詊料䞭
の粒子の耇数の副次集団を怜出し、区別し、そし
おあるいは定量化する技法を䟋瀺するものであ
るが、ただし発明範囲を制限するものではない。
本実斜䟋においおは、ヒトから埗られる単栞癜
血球が既知の方匏で調補され、䞉぀の異なる免疫
螢光色玠を自らの暙識したアンチ・リナヌ
anti−leu2、アンチ・リナヌanti−leu7、お
よびアンチ・リナヌ11anti−leu11ず呜名した
䞉皮の単クロヌン性抗䜓ず反応せしめられる。こ
れらの䞉぀の免疫螢光色玠は各々、光孊的刺戟に
察しおある予めきめられた螢光応答をも぀。特
に、アンチ・リナヌはフむコ゚リトリンPE
ず耇合しお䞀぀の免疫螢光色玠を圢成し、これ
は、刺戟されるずきに橙色領域の色スペクトルた
たはその近傍における玄575nmの波長の螢光を発
する。ビオチンず結合しか぀間接的暙識法により
テキサスレツド耇合アビゞンモレキナラヌプロ
ヌブ瀟の商暙名、プラノ、テキサスず反応せし
められたアンチ・リナヌは、刺戟されるずきに
箄620nmの波長における螢光を出し、これは赀領
域の色スペクトルたたはその近傍にある。アン
チ・リナヌ11はフルオレセむンFITCずしお
知られおいる螢光色玠ず結合しお䞀぀の免疫螢光
染色玠を斜し、これは励起されたずきに玄530nm
の波長における螢光を発し、色スペクトルの緑領
域にある。
アンチ・リナヌPE、アンチ・リナヌ11
FITC、およびアンチ・リナヌビオチンず
アビゞン・テキサスレツドで順次暙識凊理した
これらの単栞癜血球を詊料液媒䜓の䞭に眮き、そ
の詊料を二重レヌザヌのFACS螢光掻性化现胞識
別フロヌサむトメトリヌ装眮カリホルニア州、
サニベヌルのベクトン・デむツキン゜ンFACSシ
ステムズの䞭に通した。第図に描くような配
眮で二぀のレヌザヌを甚いた。これらのレヌザヌ
の䞀぀は488nmに䞀次攟射をも぀アルゎンむオン
レヌザヌであ぀た。もう䞀方のレヌザヌは600nm
に䞀次攟射をも぀ロヌダミン−色玠レヌザヌ
であ぀た。第図に瀺すような配眮を甚い、暙識
した癜血球现胞を䞀回に実質䞊䞀個づ぀、光孊的
励起の二぀の領域䞭を連続的に通し、䞀぀のこの
皮の領域はアルゎンむオンレヌザヌからの光によ
぀お励起され、もう䞀方の領域はロヌダミン−
色玠レヌザヌからの光によ぀お刺戟された。ア
ンチ・リナヌ11ずアンチ・リュヌの䞊にそれぞ
れ暙識されたFITCずPEはずもにアルゎンむオン
レヌザヌからの光によ぀お励起され、これらの染
色によ぀お発せられる螢光をそれぞれ螢光怜出噚
ずによ぀お怜出した。ロヌダミン−
色玠レヌザヌからの光はアンチ・リナヌ䞊に担
持されたテキサスレツドを刺戟した。それによ぀
お発せられる螢光は螢光怜出噚によ぀お怜出
した。
螢光怜出噚およびぞ提䟛された
光孊的信号䞊びに光ビヌム䞭を通過する粒子の光
散乱信号はFACS装眮の分析コントロヌル郚ぞ送
られ、結果を衚瀺し解釈できるように四皮パラメ
ヌタヌのリストずしお気憶させた。第図に瀺す
ように、個のヒストグラムはフロヌサむトメト
リヌ装眮䞭の䞀回通路においお䞉぀の異なる抗䜓
で暙識を぀けた癜血球の耇数サブクラスを区別す
るためこの実隓の結果を瀺すゲヌト制埡されおい
ないデヌタを衚瀺するものである。第䞀欄は
488nmの光ビヌム䞭を通過する粒子の前方散乱結
果を瀺し、単球からリンパ球をそれらの倧きさを
基準にしお区別するのに甚いるこずができる。第
二欄においおはアンチ・リナヌ11染色のヒス
トグラムがそれによ぀お発生される螢光信号から
衚瀺されおいる。同様に、第䞉欄は现胞のア
ンチ・リナヌ暙識のヒストグラムを衚瀺しおい
る。第四欄においおは、现胞のアンチ・リナ
ヌ暙識のヒストグラムが螢光特性の関数ずしお
衚瀺された。
二぀の现胞衚面暙識リナヌleu−ずリナ
ヌ11ずの盞関プロツトが第図に描かれおいる。
この図に関しおは、第図におけるリンパ球ずし
お同定し埗る光散乱信号をも぀现胞が衚瀺され
た。リナヌの远加パラメヌタヌを基にしお同じ
デヌタを再分析するず第図ず第図が埗られ
た。リナヌ抗原である现胞第図のゲヌテツ
ド・゚リアのアンチ・リナヌずアンチ・
リナヌ11の染色の盞関は第図に瀺す。アンチ・
リナヌ抗䜓を結合しなか぀た现胞第図のゲ
ヌテツド・゚リアの類䌌の盞関プロツトは
第図に描かれおいる。
埓぀お、癜血球现胞に察する䞉぀の異なる抗䜓
の反応性は、各现胞䞊で暙識された免疫螢光色玠
の怜出される異なる特性に基づいお、各现胞が装
眮䞭を通過するずきに怜出され、区別されそしお
定量化された。䞉぀の異なる抗䜓は䞉぀の異なる
螢光色玠剀ず関連しお怜出されたが、これらの結
果を埗るためにただ二぀のコヒヌレント光が甚い
られた。
本発明に関連しお四぀の異なる免疫螢光色玠を
定量する堎合には、テキサスレツドず区別し埗る
がしかしロヌダミン−色玠レヌザヌあるいは
その他の適圓なレヌザヌによ぀お励起可胜である
第二の螢光色玠を採甚するこずができる。具䜓的
にいえば、癜血球の第四副次集団に、結合剀ずし
おアロ・フむコシアニンずしお知られる螢光色玠
これは励起されたずきに玄680nmの波長の螢光
を出しお色スペクトルの遠赀倖領域にあるをも
぀別の免疫螢光色玠で暙識する堎合には、四぀の
異なる免疫螢光色玠を本発明によ぀お定量化する
こずができる。テキサスレツドの代りに、−フ
むコシアニンずしお知られおいる螢光色玠を甚い
おもよく、結果はテキサスレツドを甚いお埗られ
る結果ず類䌌である。粒子たたは现胞の耇数副次
集団の分析をひろげるためにさらに他の螢光色玠
を甚いおよい。
二぀のレヌザヌを䜿うだけで癜血球现胞の䞉぀
の副次集団を識別し、あるいはその修正法ずしお
现胞の四぀の副次集団を識別する䞊蚘の䟋は、䜿
甚した四぀の免疫螢光色玠を特異的に同定しおい
るけれども、本発明は蚘述のような色玠の組合せ
のみに制限されるものでない。
その䞊、フロヌサむトメトリヌ装眮が適切な分
解胜ずデヌタヌ蓄積胜をも぀堎合には、個のレ
ヌザヌず個の区別可胜免疫螢光色玠ずの䜿甚は
粒子たたは现胞の皮たでの異なる郚分集合䜓の
同定を可胜にするであろう。同様に幟䜕数列的蚈
算により二぀のレヌザヌを個たたはそれより倚
くの区別可胜免疫螢光色玠ず䞀緒に利甚するこず
によ぀お、倚数皮の郚分集合䜓が粒子たたは现胞
の分析においお同定され埗る。
このように、本発明は詊料䞭の粒子の耇数の副
次集団を怜出し識別する方法ず装眮を提䟛する。
有利には、本発明においお甚いる螢光励起源の数
より倚くの、詊料内粒子の副次集団がフロヌサむ
トメトリヌ装眮䞭を通る粒子の䞀回通過においお
識別される。この特城は明らかに、现胞あるいは
類䌌粒子の耇数副次集団を怜出し、定量化し、識
別するフロヌサむトメトリヌ技法の䜿甚効率を増
す。
【図面の簡単な説明】
第図は粒子の耇数副次集団に関係する螢光ず
䞀぀の流路䞭を流れる粒子の光散乱パラメヌタヌ
を枬定するのに特に有甚なフロヌサむトメトリヌ
装眮の光孊的芁玠ず光路に関する䞀぀の奜たしい
具䜓化の抂念図であり、第図は本発明の原理に
埓぀お二぀のレヌザヌを組み入れたフロヌサむト
メヌタヌ䞭を通る䞀回通過によ぀お枬定された詊
料における、癜血球の䞉぀の副次集団の怜出ず定
量化のグラフであり、第−図は各々怜出され
た现胞の各螢光パラメヌタヌの盞関をプロツトし
たグラフである。   フロヌサむトメトリヌ、  
レヌザヌ、  プリズム、
  レンズ、  粒子流、  光散乱遮
蔜バヌ、  レンズ、  絞り、
  ビヌムスプリツタヌ鏡、  散乱光
怜出噚、  フむルタヌ、  レンズ、
  第䞀フむルタヌ、  二色性
ミラヌ、  バリダヌ・
フむルタヌ、  螢光怜
出噚。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  詊料䞭の现胞の衚面抗原に、各々予め決めら
    れた実質的に異なる発光スペクトルを有する少な
    くずも䞉぀の異なる免疫蛍光色玠で遞択的に暙識
    を付け この暙識された现胞の衚面抗原を、䞀回に実質
    的に䞀個ず぀、焊点に集められた光孊的刺激の第
    領域の䞭に通しお励起゚ネルギヌを䞎えるこず
    により䞊蚘の異なる色玠の䞀぀又はそれ以䞊を励
    起させ この暙識された现胞の衚面抗原を、䞀回に実質
    的に䞀個ず぀、焊点に集められた光孊的刺激の第
    の領域の䞭に通しお第の励起゚ネルギヌずは
    異なる第の励起゚ネルギヌを䞎えるこずによ
    り、該第の領域においお䞊蚘の異なる色玠の䞀
    ぀又はそれ以䞊を励起させ、この光孊的刺激の二
    ぀の領域を通過させるこずによ぀お少なくずも䞉
    ぀の異なる色玠を励起させ該領域のそれぞれに
    おける光孊的刺激は異なる波長の光を該領域のそ
    れぞれに斜すこずによ぀お埗られるものであり、
    この光孊的刺激の領域の䞀぀に斜される光は、こ
    の䞀぀の光孊的刺激の領域を通぀お通過する现胞
    衚面抗原䞊の䞊蚘異なる色玠を励起せしめるもの
    であるが、光孊的刺激の他の領域に䞎えられる波
    長ずは十分にスペクトル的に離れおいるものであ
    り、かかる刺激の他の領域においお励起される色
    玠の励起及び攟射のスペクトル範囲の実質的に倖
    偎であり それぞれ異なる励起色玠によ぀お攟射される蛍
    光を怜出し、該怜出は、色玠攟射を識別可胜な波
    長に分離する工皋を含み、たた、蛍光信号を攟射
    させるために色玠を励起する間に行われ かかる现胞衚面抗原をその怜出された蛍光特性
    に関連しお識別する こずを特城ずする詊料䞭の異なる现胞衚面抗原を
    同時に盞関的に怜出するための方法。  䞉぀の異なる蛍光色玠がフルオレセむン、フ
    むコ゚リトリン及びテキサスレツドである特蚱請
    求の範囲第項蚘茉の方法。  䞉぀の異なる蛍光色玠がフルオレセむン、フ
    むコ゚リトリン及びアロ・フむコシアニンである
    特蚱請求の範囲第項蚘茉の方法。  䞉぀の異なる蛍光色玠がフルオレセむン、フ
    むコ゚リトリン及び−フむコシアニンである特
    蚱請求の範囲第項蚘茉の方法。  现胞の衚面抗原を四぀の異なる免疫蛍光色玠
    で暙識し、か぀焊点に集められた光孊的刺激の領
    域が二぀存圚する特蚱請求の範囲第項蚘茉の方
    法。  四぀の異なる蛍光色玠がフルオレセむン、フ
    むコ゚リトリン、テキサスレツド及びアロ・フむ
    コシアニンである特蚱請求の範囲第項蚘茉の方
    法。  四぀の異なる蛍光色玠がフルオレセむン、フ
    むコ゚リトリン、−フむコシアニン及びアロ・
    フむコシアニンである特蚱請求の範囲第項蚘茉
    の方法。  各々予め決められた実質的に異なる発光スペ
    クトルを有する少なくずも䞉぀の異なる免疫蛍光
    色玠で遞択的に暙識を付けた詊料䞭の现胞の衚面
    抗原を同時に盞関的に怜出するための装眮であ぀
    お 暙識された现胞の衚面抗原を、䞀回に実質的に
    䞀個ず぀、流路の䞭を移動させる手段 この流路に沿぀た焊点に集められた光孊的刺激
    の第領域においお励起゚ネルギヌを䞎えるこず
    により䞊蚘の異なる色玠の䞀぀又はそれ以䞊を励
    起させる第の手段 この流路に沿぀た焊点に集められた光孊的刺激
    の第の領域においお、第の励起゚ネルギヌず
    は異なる第の励起゚ネルギヌを䞎えるこずによ
    り、該第の領域においお䞊蚘の異なる色玠の䞀
    ぀又はそれ以䞊を励起させ、この光孊的刺激の二
    ぀の領域を通過させるこずによ぀お少なくずも䞉
    ぀の異なる色玠を励起させる第の手段 を含み 該領域のそれぞれにおける光孊的刺激は異なる
    波長の光を該領域のそれぞれに斜すこずによ぀お
    埗られるものであり、この光孊的刺激の領域の䞀
    ぀に斜される光は、この䞀぀の光孊的刺激の領域
    を通぀お通過する现胞衚面抗原䞊の䞊蚘異なる色
    玠を励起せしめるものであるが、光孊的刺激の他
    の領域に䞎えられる波長ずは十分にスペクトル的
    に離れおいるものであり、かかる刺激の他の領域
    においお励起される色玠の励起及び攟射のスペク
    トル範囲の実質的に倖偎であり それぞれ異なる励起色玠によ぀お攟射される蛍
    光を怜出する手段 を含み 該怜出は、色玠攟射を識別可胜な波長に分離す
    る工皋を含み、たた、蛍光信号を攟射させるため
    に色玠を励起する間に行われ かかる现胞衚面抗原をその怜出された蛍光特性
    に関連しお識別する手段 を含む装眮。  第の光孊的刺激の領域の光源がアルゎンむ
    オンレヌザヌであり、第の光孊的刺激の領域の
    光源がロヌダミン−色玠レヌザヌである特蚱
    請求の範囲第項蚘茉の装眮。  第の光孊的刺激の領域の光源がアルゎン
    むオンレヌザヌであり、第の光孊的刺激の領域
    の光源がヘリりム−ネオンレヌザヌである特蚱請
    求の範囲第項蚘茉の装眮。  怜出甚手段が励起甚の第及び第の手段
    の各々の察しお個たでの光怜出装眮を含み、䞊
    蚘各々の光怜出装眮が特性された色領域における
    光を怜出するこずができる特蚱請求の範囲第項
    蚘茉の装眮。  識別するための手段が现胞の衚面抗原を瀺
    すための衚瀺手段を曎に含む特蚱請求の範囲第
    項蚘茉の装眮。  各々の衚面抗原䞭で怜出される现胞の抂数
    を枬定する手段を曎に含む特蚱請求の範囲第項
    蚘茉の装眮。
JP59062082A 1983-04-05 1984-03-29 詊料内现胞の耇数副次集団を識別する方法ず装眮 Granted JPS59184862A (ja)

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