CN101180530B - 生物化学物质的分析方法、分析试剂盒和分析装置 - Google Patents
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Abstract
在使用微流路把对象物质捕捉在固相上的分子检测设备中,实现以高灵敏度通过定量发光的分析方法。在具有结合在固相上的探针的流路状设备中,捕捉作为检测对象的生物化学物质,作成用于发光的标记后,使发光试剂流入,光学检测探针附近的发光。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学物质的分析方法。另外,本发明涉及采用作为特异捕捉物质的探测剂把生物化学物质固定在固相的分析设备的生物化学分析装置。
背景技术
从前,为进行生物化学物质的高灵敏检出而采用荧光法。与此前进行的采用放射性同位素的方法相比,由于操作容易,不需要对放射能的安全对策,故其被快速取代。荧光法,可以举出对作为检出对象的生物化学物质直接标记荧光体的方法与间接标记的方法。以荧光免疫检查为例,对作为检出对象的生物化学物质直接标记荧光体,把该荧光标记过的生物化学物质,用固定在固相上的抗体捕捉、加以检出属于前者。所谓互相竞争法也含在该分类中。后者,可以举出对同样的生物化学物质具有亲和性的某种抗体进行荧光标记,进行二次反应的夹层化验等。
另一方面,化学发光法得到发展。当采用化学发光法时,由于不能把激发光的散射作为背景光计测,故可以实现更高灵敏度的计测。在化学发光的场合,当作为检出对象的生物化学物质直接或间接标记酶时,可以举出标记荧光体的场合。在前者的情况下,优选使用过氧化物酶或碱性磷脂酸酶。所谓酶联免疫吸附测定法属于此分类。把捕捉了以微型板壁等作为对象的生物化学物质的抗体加以固定,添加含检出对象物质的溶液。溶液中的检出对象物质通过抗体被捕捉在壁面上,洗去多余的溶液。往其中添加对作为检出对象物质的酶标记抗体,该酶标记抗体结合在检出对象物质上而保留,洗去多余的溶液。最后,装入含有与酶反应的发光试剂的溶液,检出产生的发光。当标记荧光体时, 例如,当作为HPLC检测器应用时,对从HPLC流出的各荧光标记过的分子,使与化学激发剂进行混合反应,被标记过的荧光体发生激发,检测发出的化学光。
作为多项目检测设备,可以举出结合了探针的珠阵列在细管中的技术(下面称作珠阵列)(例如,专利文献1)。另外,使用微流路,把对象物质捕捉在固相上的分子被结合的检测设备也有报告(例如,专利文献2)。
专利文献1:特开平11-243997号公报
专利文献2:特开平11-075812号公报
发明内容
关于化学发光或生物发光等发光检测法,与荧光法比较,由于从对象得到的每单位时间的光子数少,故必需采用高灵敏度测量体系,增加测量时间等措施。
关于珠阵列,一般对检测对象物质进行荧光标记,该荧光标记物质对珠上的探针的捕捉加以荧光检测。有反应速度快的优点,另一方面,来自激发光的散射光或从珠材质产生背景光的可能性存在。另外,对珠阵列采用发光检测时,由于每单位时间产生的光子数少,故必需确保绝对灵敏度,有人设想从珠的发光,通过相邻的珠表面反射,从相邻的珠发光那样进行测量的“串扰”。即使使用微流路,把对象物质捕捉在固相上的分子被结合的检测设备中,有可能产生来自发光的散射光及反射光。
如上所述,本发明的课题是,使用微流路在把对象物质捕捉在固相上的分子被结合的检测设备中,利用溶液的流动以高灵敏度实现定量的发光检测法。另外的课题是,在珠阵列的场合,防止珠间的发光串扰。
本发明提供一种生物化学物质的分析方法,其特征在于,该法具有:结合在固相上的探针,与把标记过的检测对象物质捕捉在探针上的工序,或把未被标记的检测对象物质捕捉在探针上并加以标记的工序;通过液流供给发光试剂的工序;对上述发光试剂与上述标记的反应的部 位附近进行光学检测的工序。
这里的所谓固相,意指至少一部分上固定了探针的固相。作为固相,可以采用粒子(珠)、流路的壁面、流路内设置的突起以及线状构件等。
作为固相的材料,例如,可以举出塑料、金属、无机化合物。作为塑料,可以举出聚乙烯、聚甲基苯乙烯等苯乙烯类树脂;聚丙烯、聚乙烯、聚环烯烃等聚烯烃类树脂;聚碳酸酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙酯等聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯等聚甲基丙烯酸酯等(甲基)丙烯酸类树脂;聚氟代烯烃等氟类树脂;二甲基硅氧烷、二乙基硅氧烷等硅酮类树脂。作为金属,可以举出铁、不锈钢、铜、或这些的合金。作为无机化合物,例如,可以举出玻璃、陶瓷、半导体等。固相材料不限于这些,既可以由1种材料构成,也可以由多种材料构成。从探针对固相的容易性、背景低、容易得到考虑,聚苯乙烯是最优选的。
本发明中使用珠时,作为珠直径,0.1μm~6mm是优选的,更优选0.5μm~1mm,尤其优选0.75μm~500μm,最优选1.0μm~100μm。另外,放入珠的配管,采用与所用珠的直径对应的配管,为珠的直径2倍以下是所希望的。
在发光检测体系中,使发光底物的送液时间与测量时间一致进行测量,可以实现高灵敏度。在这里,发光底物利用从到达固相,例如,珠上的酶的时间至短时间内呈现大的发光峰的现象。通过观测该峰的部分,以高精度分离信号与噪声,进行以高灵敏度进行测量是可能的。另外,采用边流入发光试剂边测量发光的方法,发光试剂处于经常供给的状态,由于酶附近的发光试剂浓度不衰减,故可以抑制发光强度的衰减,稳定地进行长时间测量。通过长时间加合高峰后的信号,也可以以高灵敏度进行稳定测量。当检测对象物质多,捕捉的酶的密度高时,可以抑制通过流动供给发光试剂的发光试剂周边浓度的下降,故可以进行高精度测量。另外,在用光电子倍增管进行扫描加以测量的体系中,设置狭缝,通过把测量对象珠的大小与狭缝的关系进行适当设定,提高分辨能力,故可进行高精度测量。为了判断珠的信号,必需识别多个峰,空间 分辨能力必需达到某种程度。从含测定带区域影响的考察结果可知,与测量时间等对应的适当的狭缝宽度等有限制。另外,还可以采用的方法是,在作为测量对象的珠彼此之间保持间隙,采用大的狭缝宽度,提高灵敏度并且进行珠的识别。
本发明中的发光检测体系,包括化学发光检测体系与生物发光检测体系。所谓化学发光,意指通过化学反应被激发的分子返回至基态时,作为能量放出光的现象;所谓生物发光,意指通过使用萤火虫或细菌的荧光素酶等生物酶,使发光物质氧化等化学反应进行发光的现象,广义上说有时属于化学发光的范畴。作为化学发光检测体系,可以举出以鲁米诺/过氧化氢作底物的过氧化物酶的化学发光,以作为二氧杂环丁烷衍生物的金刚烷基甲氧基磷酰基二氧杂环丁烷(AMPPD)作为底物的碱性磷酸酯酶的化学发光;通过双-2,4,6-三氯苯基乙二酸酯(oxlate)(TCPO)等过草酸酯衍生物/过氧化氢/8-苯胺基萘磺酸(ANS)等荧光色素类的碱性磷酸酯酶的化学发光等的检测体系,作为生物发光检测体系,例如,可以举出以ATP/荧光素/镁离子作为底物的萤的荧光素酶的生物发光检测体系;对葡糖-6-磷酸脱氢酶以葡糖-6-磷酸/NAD作底物生成的NADH,采用细菌荧光素酶与NADH-FMN-氧化还原酶的发光反应的检测体系;对丙酮酸激酶以ADP与磷酸烯醇丙酮酸作为底物生成的ATP,用萤的荧光素-荧光素酶的发光反应的检测体系等。
作为防止珠之间的发光串扰的课题,不涉及测量的光学设定,对于高灵敏度的多项目检测是重要的。解决该课题的手段之一,在作为测量对象的多个珠之间设置具有遮光性材料的珠。另一解决该课题的手段是,使含发光试剂的溶液折射率接近珠的折射率。当含发光试剂的溶液与理想地配制珠材料,具有实质上相同的折射率时,在珠表面不产生光反射,故可以防止珠间的光反射,即串扰。解决该课题的另一手段是,在测量装置与珠阵列之间插入偏振片。珠表面上的发光,由于发光底物向无规方向发光,当考虑不发生偏光时,相邻的珠反射的串扰,由于s波与p波反射率的不同而发生偏光。因此,通过插入偏振片,串扰成分可被重点遮蔽,结果是产生串扰成分减少。
作为分析方法之一例,其特征在于,具有:向收纳至少一部分上结合了探针的固相的流路,供给含有已被标记的检测对象物质或未被标记的检测对象物质的液体的工序;
把上述已被标记的检测对象物质捕捉在上述探针上的工序或把未被标记的检测对象物质捕捉在探针上并加以标记的工序;
通过液流向上述流路供给用于发光反应的试剂的工序;
对上述用于发光反应的试剂与上述标记反应的部位附近进行光学检测的工序。
作为分析试剂盒之一例,其特征在于,具有:细管;固定探针并且收纳在上述细管中的第1粒子;含有遮光性物质并且收纳在上述细管中的第2粒子;用于发光反应的试剂。
作为分析装置之一例,其特征在于,具有:用于向收纳至少一部分上固定了探针的固相的细管导入和/或导出液体的送液部;
用于收纳试样的第1容器;
用于收纳用于发光反应的试剂的第2容器;和
用于对上述固相的任意部位进行光学检测的检测部,
上述第1容器和上述第2容器与上述送液部连结。
按照本发明,在通过多项目进行发光检测的检测设备中,可以有效实现高灵敏度的定量发光法。特别是采用珠阵列时,珠之间具有更加防止发光串扰的效果。
另外,采用多项目进行发光检测时,在每块微型板等各个孔内添加试剂的方式,可采用以前的方式进行。当为珠阵列时,与这些体系相比,由于含对象物质的溶液及发光物质等可以分别流动,故不需分注等操作,可实现简便而均匀的反应。另外,与微型板不同,反应区域由于不用壁等隔开每个项目,故可采用少的试剂量进行发光检测。
附图的简单说明
图1是本发明一实施方式的流程图。
图2是本发明一实施方式的模拟图。
图3是本发明一实施方式的装置模拟图。
图4是本发明一实施方式的发光测量例与发光试剂送液计时的概略图。
图5是本发明一实施方式的装置模拟图。
图6是本发明一实施方式的发光测量例与发光试剂送液计时的概略图。
图7是本发明一实施方式的装置模拟图。
图8是本发明一实施方式的光学系统扫描与数据的关系模拟图。
图9是本发明一实施方式的狭缝宽度与信号波形的关系模拟图。
图10是本发明一实施方式的装置模拟图。
图11是本发明一实施方式的发光串扰模拟图。
图12是本发明一实施方式的发光串扰与遮光性珠的效果模拟图。
图13是本发明一实施方式的发光串扰与溶液的折射率调整的效果模拟图。
图14是本发明一实施方式的溶液的折射率用丙三醇调整的反射率曲线图。
图15是本发明一实施方式的发光串扰与丙三醇7 0%溶液的效果模拟图。
图16是本发明一实施方式的装置模拟图。
图17是本发明的实施例1、2的实验装置模拟图。
图18是本发明的实施例1的测定结果图。
图19是本发明的实施例2的测定结果图。
图20是本发明的实施例3的实验装置模拟图。
图21是本发明的实施例3的测定结果图。
符号说明
101:毛细管、102:带抗体的珠、103:不带抗体的珠、104:抗甲胎球蛋白抗体、105:甲胎球蛋白、106:HRP标记抗甲胎球蛋白抗体、107:发光试剂、108:发光、109:含甲胎球蛋白的样品溶液、110:洗涤用缓冲液、111:含HRP标记抗甲胎球蛋白抗体106的溶液、112:洗涤用缓 冲液、113:含发光试剂的溶液、114:光测量器、121:珠阵列、121a:珠阵列、121b:珠阵列、121c:珠阵列、121d:珠阵列、122:毛细管、122a:连接部、122b:连接部、122c:连接部、123:注射器、124:注射器泵、125:毛细管、126:阀、127:容器、131:光学纤维、132:与PMT连接的连接器、133:PMT、134:管线、135:电脑、136:粒子(珠)止动器(stopper)、137:连接部(内部密封连接器)、141:珠阵列、142:光学纤维束、143:与PMT连接的连接器、144:检测区域、151:珠阵列、152:物镜、153:成像镜、154:狭缝、155:PMT、156:光学体系、157:管线、158:电脑、201:珠阵列群、202:送液系统、203:溶液保持部及连接切换部、204:照相机镜头、205:CCD照相机、206:管线、207:电脑、208:测量部分、211:发光珠、212:预计不发光的珠、213:毛细管、214:含发光试剂的水溶液、221:遮光性珠、231:直接向着光学系统的光线、232:向相邻的珠的光线、233:调整折射率的溶液、241:偏振片。
具体实施方式
图1是本发明第1实施方式的分析方法的概略流程图。其详细内容依次介绍如下。最初,作为工序(A),对具有捕捉作为检测对象的生物化学物质的抗体,固定在固相上的流路的设备,导入含有检测对象物质的样品溶液。样品导入前,抗体未作任何捕捉。其次,作为下一工序(B),是把导入的样品溶液中的检测对象物质捕捉在固相上抗体的工序。此时既可连续进行样品溶液的送液,也可停止送液等待进行反应。然后,作为其后的工序(C),是洗去剩余的样品溶液,洗涤设备内部的工序。通过洗涤设备内部,作为检测对象的物质,实质上仅存在于用抗体捕捉的部位。然后,作为其后的工序(D),是把含有对检测对象物质具有亲和性,引起发光的酶加以标记的抗体溶液导入设备内部,与检测对象物质反应的工序。该工序是间接标记检测对象物质的工序。作为其后的工序(E),其是把与检测对象物质未反应的固相上未被捕捉的剩余酶标记的抗体加以洗去,洗涤设备内部的工序。通过洗涤设备内部,其后引起发光的酶,实质上存在于检测对象物质的部位,即捕捉了作为检测对象的 生物化学物质的抗体,仅存在于固定固相的部位,在其他场所不引起发光。作为其后的工序(F),与酶反应的发光试剂,流至设备内部,从抗体附近测量发光的工序。引起发光的酶,仅在捕捉检测对象物质处存在,所以固定了捕捉检测对象物质的酶的固相附近的发光,来自检测对象物质的存在。发光量反映了作为检测对象的物质捕捉量,进而反映样品溶液中的检测对象物质量或浓度。作为最后的工序(G),把测量得到的来自发光的测量信号,作为检测结果进行处理的工序。通过该工序,从得到的发光强度推测出检测对象物质量。
图2是把第1实施方式的概略表示作为固定检测物质的固相附近的模拟图。对送液装置及测量装置的全部图像说明如下。在本实施方式中,作为具有抗体固定在固相的流路的设备,示出使用珠阵列的例子。珠阵列的概略部分放大图如图2(1)所示。作为用于形成流路的细管,采用毛细管101。在毛细管101的内部,排列结合了捕捉检测对象的抗体的珠102与未结合抗体的珠103。本实施方式中的检测对象,例如为甲胎球蛋白105,例如,抗甲胎球蛋白抗体104被固定在珠102上。毛细管的内径例如是150微米,珠102,103的直径例如是100微米,材质例如是聚苯乙烯。图2(2)示出导入含甲胎球蛋白105的样品溶液109的模拟图。这里的样品溶液假定为50μL,溶液的体积流量每分10μL。接着,如图2(3)所示,示出甲胎球蛋白105在珠102上的抗甲胎球蛋白抗体被捕捉的状况。采用珠阵列,向狭窄的空间强制流入溶液,借此产生湍流,结果是固液间的反应速度升高。由于该效果变得更高,故边流入样品溶液109边进行甲胎球蛋白的捕捉。如下面所示,送液例如采用注射器泵,把样品溶液往复送液使反应。关于送液装置,只要能送液的装置任何一种均可以使用。其他的送液的装置,也可以采用蠕动泵等。反应时间,例如20分钟。图2(4)示出样品溶液109用洗涤缓冲液110洗涤的模拟图。作为洗涤缓冲液110,例如,使用含盐的磷酸缓冲液(pH7.4),采用用30秒流过100μL的条件进行洗涤。除上述缓冲液外,还可以采用碳酸缓冲液、MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)缓冲液、三羟基氨基甲烷(下面称作Tris)-乙二胺四醋酸(下面称作EDTA)缓冲 液、Tris-EDTA-硼酸缓冲液、硼酸缓冲液等通常使用的缓冲液的任何一种均可以采用。另外,所添加的盐,可以采用氯化钠、氯化钾、氯化铵、醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵等盐。采用这种洗涤,在珠102上未捕捉的甲胎球蛋白105,从珠阵列设备中洗去。
图2(5)示出,例如,把含HRP(西洋辣根氧化酶)标记的抗甲胎球蛋白抗体106的溶液111,导入珠阵列的模拟图。作为标记,采用HRP,但在本发明中也可以采用HRP以外的标记酶或酶以外的标记物。作为本发明中使用的标记酶,例如,可以举出过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、蔗糖酶、腺苷三磷酸(下面称作ATP)酶、荧光素酶、水母发光蛋白等。
HRP标记的抗甲胎球蛋白抗体106的浓度假定为100ng/ml,溶液111的体积达到50μL,体积流量达到每分10μL。HRP标记的抗甲胎球α抗甲胎球蛋白105反应,结果被捕捉在珠102上。图2(6)示出,HRP标记的抗甲胎球蛋白抗体溶液111,用洗涤缓冲液112洗涤的模拟图。作为洗涤缓冲液112,例如,使用含盐的磷酸缓冲液(pH7.4),以30秒钟流过100μL的条件洗涤。通过该洗涤,珠102上未捕捉的剩余的HRP标记的抗甲胎球蛋白抗体106,从珠阵列设备中洗去。
最后,图2(7)示出,使含有用于发光反应的试剂107的溶液113流至珠阵列,测量发光108的模拟图。作为用于发光反应的试剂107,当用酶标记时,含有与所用酶对应的底物。作为底物,例如,可以举出鲁米诺、二氧杂环丁烷、过草酸酯、葡萄糖、β-D-半乳糖、葡萄糖-6-磷酸、光泽精、抗坏血酸磷酸酯、腺苷三磷酸、荧光素或这些的衍生物、钙离子等。另外,用于发光反应的试剂,也可以采用过氧化氢、叔丁基氢过氧化物等包含烷基氢过氧化物的过酸等氧化剂、碘氧苯等含有氧的添加剂氧化剂。用于发光反应的试剂,还可以含有发光增敏剂。作为发光增敏剂,例如,可以举出4-碘苯酚、4-溴苯酚、4-氯苯酚、4-苯基苯酚、苯酚吲哚、2-氯-4-苯基苯酚、4-(2′-噻吩基)苯酚、4-(2′-苯并噻唑基)苯酚、4-[4′-(2′-甲基)噻唑基]苯酚、4-[2′-(4′-甲基)噻唑基]苯酚、4-(4′-噻唑基)苯酚、4-(2′-苯并噻唑基)苯酚、4-[4′-(2′-(3′- 吡啶基)噻唑]苯酚、吩噻嗪-N-丙基磺酸盐、3-(10-吩噻嗪基)-n-丙基-磺酸盐、3-(10-吩噻嗪基)-丙基磺酸盐、对-羟基苯丙酸等苯酚衍生物、6-羟基苯并噻唑、4-(4-羟基苯基)噻唑等噻唑衍生物,二乙基苯胺等。
例如,采用HRP标记酶时,用于发光反应的试剂,作为底物,可以采用鲁米诺或其衍生物,或光泽精/过氧化氢等氧化剂;作为发光增敏剂,可以采用4-碘苯酚、4-[4′-(2′-甲基噻唑基]苯酚、4-[2′-(4′-甲基)噻唑基]苯酚、4-(4′-噻唑基)苯酚、4-[4′-(2′-(3′-吡啶基))噻唑]苯酚、4-(2′-噻吩基)苯酚、吩噻嗪-N-丙基磺酸盐、苯酚靛酚等,优选采用4-[4′-(2′-甲基)噻唑基]苯酚或4-[2′-(4′-甲基)噻唑基]苯酚。
在本发明中,还可以采用其他标记物、用于发光反应的试剂的组合物。可以举出,例如作为化学发光检测体系,作为标记酶采用葡糖氧化酶、作为用于发光反应的试剂,采用葡萄糖/双-2,4,6-三氯苯基草酸酯(TCPO)等过草酸酯衍生物/8-苯胺基萘磺酸(ANS)等荧光色素、或葡萄糖/异鲁米诺/微过氧化物酶(m-POD)的体系;作为标记酶,采用碱性磷酸酯酶(ALP)、作为用于发光反应的试剂,采用金刚烷基甲氧基磷酰基苯基二氧杂环丁烷(AMPPD)等二氧杂环丁烷衍生物的体系;作为标记酶,采用β-D-半乳糖酶,作为用于发光反应的试剂,采用邻-硝基苯基-β-D-半乳糖/半乳糖脱氢酶/NAD+/NADH、或葡萄糖/葡萄糖氧化酶(GOD)/异鲁米诺/m-POD、乳糖/GOD/TCPO/ANS体系;作为标记酶,采用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,作为用于发光反应的试剂,采用葡萄糖-6-磷酸/NAD(P)+/NAD(P)H体系;作为标记酶,采用蔗糖酶,作为用于发光反应的试剂,采用蔗糖/光泽精/OH-体系等。作为生物发光检测体系,可以举出,作为标记酶,采用荧火虫荧光素酶,作为用于发光反应的试剂,采用ATP/荧光素/镁离子的体系;作为标记酶,采用ALP,作为用于发光反应的试剂,采用荧光素-O-磷酸酯/ATP体系;作为标记酶,采用乙酸激酶,作为用于发光反应的试剂,采用乙酰基磷酸酯/醇脱氢酶(ADP)/荧光素/荧光素酶的体系;作为标记酶,采用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,作为用于发光反应的试剂,采用葡萄糖-6-磷酸/NAD/细菌荧光素酶/NADH-FMN- 氧化还原酶的体系;作为标记酶,采用丙酮酸激酶,作为用于发光反应的试剂,采用ADP/磷酸烯醇丙酮酸/荧火虫荧光素/荧光素酶的体系等。
含有用于发光反应的试剂107的溶液113的体积流量定为每分钟10μL,连续流动10分钟以上。发光108,系HRP标记的抗甲胎球蛋白抗体106上的HRP与用于发光反应的试剂107反应而产生的,故发光仅在珠102附近发生。即,HRP,通过用于捕捉检测对象的珠上固定的抗体、该抗体上捕捉的检测对象、在该检测对象上捕捉的HRP标记的抗甲胎球蛋白抗体106,结合在珠上,在作为标记的HRP附近引起发光,结果,在一种珠102表面的附近发生。该发光108,用光测量器114测量。关于光测量器114的详细情况将在下面介绍。
图3是第1实施方式的装置概略图。以图2中说明的珠阵列121作为中心,其两侧配管为毛细管125与毛细管122。珠阵列的一侧,通过毛细管122,与注射器123连接。通过注射器泵124动作,抽吸注射器123的活塞,结果是可向珠阵列121内部送液。在珠阵列121的另一端,配置毛细管125,其前端部通过阀126,与多个容器127连接。对该多个容器127的每个,分别放入图2的前段说明中介绍的样品溶液、洗涤缓冲液、HRP标记抗体溶液等,也可用作废液贮槽。对各个容器127的存取,通过操作阀126来进行。在珠阵列121中的发光,通过光学纤维131进行测量。光学纤维131的一个端部,通过图中省略记载的XY台,与珠阵列121中的发光珠相邻地设置。另外,光学纤维131的另一个端部,通过PMT(光电倍增管)的连接器132,与PMT133连接。通过该设定,用光学纤维131集光的珠阵列121的发光,导至PMT133进行测量。来自PMT133的信号,通过导线134输出至数据处理装置的电脑135。在该电脑135进行数据处理。
图4(A)是第1实施方式的发光测量结果例,图4(B)是此时的发光试剂送液时间及送液量的概略图。从时间0开始测量,在这个时点,由于还未传送发光试剂溶液,故不测量发光。信号强度推移至背景水平,达到一定值。在发光试剂导入开始时,含发光试剂的溶液以每分10μL 的体积流量送液,以后连续送液。因发光引起的信号强度,记录一旦达到高的峰后马上降低。降低后的发光强度非常缓慢地衰减。该最初的高的峰的峰宽度达到1秒左右或更低。该时间的特异峰的出现,是与发光有关的特异现象。采用原来的方法时,发光试剂放入容器后,固定在发光测量装置中测量发光,该时间的特异峰未能观察到。边使用于发光反应的试剂流动边在引起发光的部位测量发光,借此,可以检测该时间的特异的峰。通过测量该时间的特异峰,可瞬时进行S/N的高速测量。另外,作为该结果是,可用少的发光试剂量进行测量。另外,也可以高灵敏度的测定。另外,边使用于发光反应的试剂流动边测量发光的方法中,由于发光试剂处于经常供给的状态,酶附近的发光试剂浓度不发生衰减,故可以抑制发光强度的衰减,稳定地进行长时间测量。通过长时间加合高的峰后的信号,也可以以高灵敏度进行稳定测量。例如,把从PMT133的输出,以取样间隔1微秒取得,该数字数据用电脑135加合,与进行1点取样相比,可以得到SN比高的结果。当信号衰减少而可以忽视时,可以认为与加合的点数的1/2相乘的结果成比例,SN比提高。当检测对象物质捕捉多、酶密度高时,通过流动供给发光试剂,可以抑制发光试剂周边浓度的降低,故可进行高精度测量。
该时间出现特异峰的现象,可解释、理解如下。在发光试剂导入的最初时间,由于此前的峰上的酶的周边没有的发光试剂一口气挤压酶的周边,故发光加大。此瞬间,酶的周边发光试剂浓度,与导入的发光试剂浓度相同,实质上最大。当一旦开始反应时,在珠表面附近的薄的液膜区域,发光试剂被消化,发光试剂浓度降低。因此,一旦达到峰值时的发光强度降低。此后,伴随着流动所运送的发光试剂扩散到先前的薄液膜的速度与表面的发光试剂被消化的速度达到平衡时,结果是可以观察到几乎一定的发光强度。含发光试剂的溶液流动时,与溶液不流动的停止场合相比,由于该薄的液膜的厚度小,扩散距离短,是有利的。当然,由于通过边流动边逐渐供给发光试剂,故也可以防止通过发光试剂的消化引起的发光试剂的体积浓度降低,即使长时间测定也有利。当然,一旦在发光试剂流入后,也可以停止发光试剂溶液的送液,可以实现发 光的检测。当在该场合导入发光试剂时,通过与发光测量同时进行,可以实现有利的测量。
在本实施方式中采用珠阵列,但又不限于采用珠阵列。捕捉了作为检测对象的生物化学物质的探针固定在固相上的流路,在具有该流路的设备中,通过测量该探针的固定区域附近来进行发光检测的体系,一般可以采用。另外,在本实施方式中,可采用抗体固定的珠,进行蛋白质的夹层分析,但又不限于此。
固定的探针,一般是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、另外,具有腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿苷、肌苷的人工核酸,或核酸衍生物,只要是这些或肽、糖肽、蛋白质、糖蛋白质、多糖或化学合成聚合物等能补足互补分子的物质,就是优选的,但又不限于这些。
采用核酸探针时,适于对核酸检测,另外采用蛋白质作为探针时,也可用于抗体检查、抗原检查等,例如,适于食品变应性检查、变应性特异IgE检查、感染症检查、化学物质特定检查、污染物质检查等。另外,糖-外源凝集素反应或、受体等也可用作探针。也可利用DNA-蛋白质的相互作用进行探针的设计,另外,对酶-底物反应,例如对生物素-抗生物素蛋白反应等也适应。
图5示出第2实施方式的装置概略。与图3说明的装置相比,变更了珠阵列和光学纤维发生。图5所示的珠阵列141,相当于图2所示的珠阵列121形成多个(在这里为4个)连接的形状,各个珠部分,全部设置在口径大的光学纤维束142正下方。光学纤维束142的口径,与作为测量对象的珠配置的区域同等或比它大是优选的,至少在该构成中,该光学纤维束142的口径是,与对应于1个珠阵列中的测定项目的珠外径、即探针被固定化的检测对象珠外径(多数情况下,多个珠外径加合的总长度)同等或比它大。因此,可以准确检测作为测量对象的珠。连接部分122a、b、c的内体积,假定分别为约10μL。相当于珠阵列121的各自珠阵列121a、b、c、d中,分别含有固定了各自不同的抗体,例如抗甲胎球蛋白抗体、抗CA19-9抗体、抗CEA抗体、抗PSA抗体的珠。 光学纤维束142通过光学纤维束与PMT连接的连接器143,与PMT133连接。其他与图2的装置设定同样。
图6(A)是第2实施方式的发光测量结果例的模拟图,图6(B)是此时的发光试剂送液时间及送液量的概略图。与第1实施方式同样的反应同样进行,在本实施方式中,样品溶液中例如含甲胎球蛋白、CA19-9、CEA、PSA,目的在于检测它们。HRP标记抗体溶液,采用含有对4种物质的HRP标记抗体的溶液。从时间0开始测量,在该时点,由于未传送发光试剂,故不测量发光。信号强度推移到如背景水平原样的一定值。在发光试剂导入开始时,含发光试剂的溶液以每分10μL的体积流量送液,以后连续送液。与第1实施方式同样,发光产生的信号强度,记录一时的高峰。然后,在约1分钟间隔观察合计4个峰。这些峰认为分别为固定抗甲胎球蛋白抗体、抗C-19抗体、抗CEA抗体、抗PSA抗体的珠附近的发光。由于相当于珠阵列121的珠阵列间配管的内体积为约10μL,故可以从含发光试剂的溶液的流速,预测该溶液到达各个珠阵列的时间,这里的到达时间每个各珠阵列分别错开约1分钟,可这样进行解释。因此,采用一台光检测器边送发光试剂边进行测量,设定不使该光检测器移动的装置,可有效简便价廉地实现多个项目检测。
图7示出第3实施方式的装置简图。采用光学体系扫描进行多项目检测的体系来进行。多个项目探针固定珠与探针非固定珠交叉并排的珠阵列151,与第1实施方式同样的送液体系连接。珠阵列151的一侧,与通过毛细管122设置在注射器泵124上的注射器123连接。在珠阵列151的另一端,配置毛细管125,其前端部通过阀126与容器127连接。各个容器127的存取,通过操作阀126来进行。从珠阵列151中的多个珠的发光,通过光学体系156扫描分别测量。光学体系156对珠阵列151作相对移动。物镜152,例如使用焦点距离9mm、开口数0.46的物镜,成像镜153例如采用焦点距离180mm的成像镜。此时的倍率与焦点距离之比达到20倍。狭缝154设置在通过物镜152与成像镜153设定的光学体系的成像面上。以珠阵列151中的100微米珠为例,在其假像面上形成直径2mm图像。狭缝154切取珠图像,对珠阵列 151的长度方向实质上垂直的方向,具有长度方向的长方形状。下面的所谓狭缝的宽度,不是狭缝的实际尺寸,而用乘以倍率的反比例的值表示。例如,当狭缝宽20微米时,是本来的100微米的珠图像在横向达到分割成1/5的狭缝宽度。PMT155设置在狭缝154的紧后面,通过狭缝154的光被全部接收。在这里,示出受光面使用8mm直径的PMT的例子。PMT155通过导线157与作为数据处理装置的电脑158连接。采用通过该设定的光学体系156集光的珠阵列151的发光,导入PMT155,用电脑158输出信号。
图8示出第3实施方式中的光学体系扫描与得到的数据的关系的概略图。图8(A)是像面中假想的珠阵列与狭缝的关系概念图。示出对珠直径100微米,设定狭缝宽度10微米的例子。长方形狭缝,相当于从珠图像切取的部分(图中白的部分)的发光,通过PMT测量。图8(B)概念地示出扫描经过时间对应于珠配置位置的关系,示出其位置与发光强度的对应图。含狭缝的光学体系,在珠阵列的长度方向通过扫描,从珠阵列的珠的发光通过狭缝,作为具有位置分辨能力的波形被测量。如狭缝宽大,则通过的光量增多,故可以得到高的信号强度,但由于从各个珠的发光彼此重叠,故难以正确测量。另外,当扫描速度过大时,对PMT测定带区域产生影响,波形变钝。具体地说,与每个珠的扫描时间相比,当PMT测定带区域的倒数(可用秒的单位表示)相同或长时,从某个特定珠的发光,即使用PMT接收光,其信号在与扫描珠时相等或以上的时间扩展,故珠彼此难以区别。因在,扫描速度优选设定在使测定带区域的倒数比每个珠的扫描时间充分小的区域。
图9是模拟表示第3实施方式中的狭缝宽度与信号波形关系的模式图。作为扫描时间,例如,每个珠达到5秒。第3实施方式中表示的装置测定带区域,当为约2.5Hz时,因带区域对波形变钝影响小的例子。用于发光反应的试剂,边流入珠阵列中,边同时用光学体系进行扫描进行该珠阵列的测量。图9(A)示出50μm的狭缝宽度(珠直径的50%左右)。此时,由于狭缝宽度大到某一程度,故可得到大的信号。反之,当狭缝处于珠一端进行扫描时,由于还可以拾取相邻的珠的发光,故从 各个珠的发光具有难以正确区分的倾向。图9(B)示出10μm的狭缝宽度(珠直径的10%左右)。可区分从各个珠的发光,但由于狭缝宽度变小,则有信号强度变小,灵敏度降低的倾向。图9(C)示出大到80μm的狭缝宽度(珠直径的80%左右),并且,在多个珠的排列中,作为发光检测对象的珠一个一个地配置的情况。由以上可知,测量中未使用的至少1个珠进入测量的珠之间,被检测的珠间距离增加,可以明确进行珠间分离。另外,加上这样的珠的配置,进一步加大狭缝宽度,也可以增加信号强度。即,作为结果,可有效实现高灵敏度高分辨能力的测量。
图10示出第4实施方式的装置概略图。与第1到第3实施方式不同,由于是使用CCD照相机的光学体系,故一次可对多个珠阵列进行测量。在这里,可以对多个项目采用探针固定的珠与、探针未固定的珠或遮光性珠交叉并排的珠阵列。珠阵列成束的珠阵列群201为中心,在其两侧连接送液体系202、溶液保持部(未图示)及连接切换部203。所谓送液体系,意指向各个珠阵列具有送液功能的部分,如图3所示,可以采用注射器对每个珠阵列进行连接的体系或采用泵的体系。溶液保持部及连接切换部203,对容纳反应溶液或洗涤液等的容器部分与具有向此溶液的切换功能的部分,如图3所示,并排配置容器,分别与阀门连接的体系等也可以采用。送液体系202、溶液保持部及连接切换部203都具有使含用于发光反应的试剂的溶液分别流入珠阵列群201中的功能。该珠阵列群201通过照相机镜头204用CCD照相机205进行测量。照相机镜头204,例如,使用F值0.95、焦点距离50mm的镜头,图像倍率设定在相同倍数。珠阵列中的100微米珠在CCD照相机205的受光面上以100微米大小投影。CCD照相机205通过线路206与作为数据处理装置的电脑207连接,在CCD照相机205中得到的图像,用该电脑207显示被处理的数据。这里使用的CCD照相机,什么样的照相机都可以采用。
图11是第4实施方式中的珠发光的串扰的例子图。图11(A)是图像一部分的放大模拟图,图11(B)是表示每个珠观察到的发光强度的规格化曲线图。测定时间假定5分钟。图11(A)反映的是100微米聚 苯乙烯(PS)珠的例子。在发光的珠211(No.3)的两侧,配置预测不发光的珠212(No.1,2,4,5)。在毛细管213中,含有珠211与212,在其空间流入含发光试剂的水溶液214。含发光试剂的水溶液214,在该图11(A)中,从左侧送液。发光的珠211的发光强度作为100为标准,与光强度比较的结果如图11(B)所示。从该曲线可知,即使是估计未发光的珠,也测量到发光约3%左右的强度。这对于正确的测定是不希望的。特别是对于发光强度预测有很大不同的多项目检测,采用该排列的珠进行时,只发光小的项目也产生大的误差。作为从预测不发光的珠测量光的重要原因,影响最大的是从发光珠211的发光,照射预想不发光的珠212,通过散射及折射的情况进行测量的串扰现象。
图12是关于第4实施方式中的珠的发光串扰,把遮光性珠夹在中间时的例子图。图12(A)示出其结构。把遮光性珠221插在发光珠211与不发光珠212之间。在这里,作为遮光性珠221,是遮光性物质混合的粒子,例如可以利用100微米的MnO2粒子混合在聚苯乙烯中而制成的珠。另外,也可以采用把黑、蓝、红等着色粒子或着色胶乳、金属粒子、显示遮光性的物质加以混合,或用其他材质的物质包含的粒子等显示遮光性的物质的任何材质的物质。最优选的是光的透过性显著低的黑色粒子,对材质不限。即,如用聚苯乙烯包含黑色粒子,则可以提供既保持遮光性又具有用于最佳固定化的表面。图12(B)是图像的放大模拟图,图12(C)表示对每个珠观察到的发光强度加以标准化的图。测定时间假定为5分钟。通过夹住该遮光性珠221,则No.1位置的珠发光强度从2.8%大幅降至0.9%,而No.5位置的珠发光强度从3.2%大幅降至1.2%。遮光性珠221,遮住发光珠211的发光,具有使串扰量降低的效果。
本实施方式中使用的采用鲁米诺类发光,发光波长约420nm,作为遮光性珠的材料特性,只要能遮住该波长的材料就没有问题。人们考虑采用混合了铁素体的塑料珠、混合黑色颜料的塑料珠或蒸镀金的珠等。另外,在这里,对仅夹住1个100微米珠的体系进行了考察,但又不限于此,例如,30微米或其以下的遮光性珠也采取几个,即使在这样体系内 也可期待同样的效果。
图13是关于第4实施方式中珠发光的串扰,模拟表示溶液折射率调整时的效果图。图13(A)是未进行折射率调整时的模拟图。从发光珠211的发光,可以举出直接向着光学体系的方向的光线231与向着相邻珠的光线232。例如,含有用于发光反应的试剂的水溶液214的折射率在1.33附近,如以珠的材质聚苯乙烯为例,其折射率为1.58。因此,向着相邻珠的光线232,在珠212的表面受散射或折射的影响,因此,作为向着光学体系方向的结果是,可以观察到作为向不发光的珠212的串扰。图13(B)是理想的进行折射率调整时的模拟图。溶液233的折射率,当调整至与聚苯乙烯相同的折射率时,向着相邻珠的光线232在珠212表面不受散射或折射的影响。因此,通过散射或折射产生的串扰可抑制到0。即,溶液形成与珠的折射率相近似的折射率,可使串扰减少。采用不利用酶的化学激发的化学发光时,由于有机溶剂的选择宽度大,折射率的调整更简便。另外,上述聚苯乙烯的折射率为1.58,而将珠的材质制成具有的折射率低的物质时,例如,折射率为1.47的玻璃时,可在低范围内调整溶液的折射率,更容易防止串扰。
图14是关于第4实施方式中珠发光的串扰,对于溶液折射率采用丙三醇调整时的效果,从反射率的观点进行验证的图。使水溶液折射率发生较大变化,并且对酶反应影响小的物质有丙三醇。丙三醇水溶液的折射率,随着其相对重量浓度(重量%)的增加,从1.33增大到1.47。串扰以垂直方向的光反射率为代表进行评价,把丙三醇的浓度为0%时的反射率和100%时的反射率以反射率比表示分别计算、制成曲线。当珠为聚苯乙烯(PS)时,水溶液中的反射率为0.74%。当丙三醇浓度提高时,由于折射率差变小,反射率也减少。例如,当丙三醇达到50%时,反射率比下降至50%,得到充分的效果。此时的折射率差为0.18。当丙三醇浓度大于80%时,由于粘度大幅上升,有可能对实际送液产生不良情况。即,当珠为聚苯乙烯时,丙三醇浓度为50%以上80%以下的范围是所希望的。当珠为玻璃时,对水溶液的反射率为0.25%,是聚苯乙烯的1/3,另外,当丙三醇浓度仅仅达到30%时,反射率比为49%,达到一半以下。 即,当珠为玻璃时,丙三醇浓度为30%以上80%以下的范围是所希望的。如珠阵列中考虑采用一般的珠方案时,一般根据上述条件,丙三醇浓度为30%以上80%以下的范围是所希望的。在此示出丙三醇的情况,但只要采用能使折射率变化的溶剂即可,但又不限于此。
珠的折射率为nb、溶液的折射率为ns时的反射率,当用界面的垂直方向反射率k表示时,则存在k=(nb-ns)2/(nb+ns)2的关系。丙三醇溶液时的丙三醇的范围,如上所述,30%以上80%以下的范围是所希望的。当为其他溶液时,珠的折射率与溶液的折射率小者是优选的,从以后的考察认为,如实际达到0.2左右时有充分的效果。上述反应率公式,以溶液的折射率ns作为解,则为ns=nb*[(1+k)/(1-k)+{(1+k)2/(1-k)2-1}]。珠的材质为聚苯乙烯时,nb=1.58,玻璃时为1.47。作为发光试剂,不进行任何折射率调整时的反射率为k0时,如反射率达到一半,则有充分的效果,作为k,考虑用0.5×k0代替也可。此时的溶液折射率ns,珠分别为聚苯乙烯及玻璃时计算达到1.40及1.37。珠折射率之差达到0.18及0.10。一般的树脂折射率比玻璃的折射率高,当考虑采用聚苯乙烯以外的树脂珠时,如折射率差为0.2左右或以下,则具有充分的效果。
图15是第4实施方式中的珠发光的串扰,含有用于发光反应的试剂的溶液的含丙三醇浓度调整达到70%时的例子图。此时的溶液233的折射率为1.43。其他的构成如图11相同,珠采用折射率1.58的聚苯乙烯。图15(A)为图像放大的模拟图,图15(B)为对每个珠观察到的发光强度加以标准化表示的图。测定时间为5分钟。把用于发光反应的试剂的溶液调整至丙三醇浓度70%,借此,未发光的珠212的发光强度,从对发光有贡献的珠211的发光量的0.7%抑制到1.0%。其与未调整折射率时相比,达到约1/4的值,大幅降低。通过使溶液的折射率达到接近珠的折射率,具有使预测不发光的珠212的串扰降低的效果。
在本实施方式中,采用珠阵列,但对采用珠阵列的场合未作限定。在具有捕捉了作为检测对象的生物化学物质的探针固定在固相的流路的设备中,发光检测在处于该探针的附近进行测量的体系中,由于一般 引起串扰问题,故本实施方式有效。
图16表示第4实施方式中利用偏振片降低串扰的装置概略。除图10所示的装置结构外,是在珠阵列群201与CCD照相机205之间设置偏振片241的装置。从珠阵列201的发光,由于发光底物向着无规方向发光,故考虑不用偏光,关于通过相邻的珠反射的串扰,由于s波及p波的反射率不同,考虑用偏光。因此,通过安装偏振片241,降低影响串扰的成分。该法与采用图12至图15中描述的遮光性粒子的体系或进行溶液折射率的调整体系相比,结构非常简单而且价廉,对于进行串扰的降低是有利的。
实施例
实施例1
实验中使用的装置概略图示于图17。另外,反应按图1的流程图进行。
把93μm的聚苯乙烯珠(JSR(株)制造,聚苯乙烯制造的标准粒子DYNOSPHERES,型号SS-922P)悬浮液10滴(约1mL),放入1.5mL的エツペンドルフ管中,用台式小型离心机(ミリポア社チビタン、製造トミ一精工),分离珠与上清液,用移液管除去上清液后,添加用碳酸缓冲液(NaHCO3 3.0g、Na2CO3 1.5g、水1L、pH9.6)调整过的10μg/mL抗IgE抗体(Bethyl社制造,Goat Anti-Human IgE-affinity Purified型号A80-108A)1mL,放置一夜,进行固定。然后,除去上清液,添加碳酸缓冲液进行搅拌,再用台式离心机分离上清液与珠,除去上清液。该洗涤操作进行3、4次。用ブロツクエ一スTM(销售商大日本制药(株),制造商雪印乳业(株)),进行1小时封闭。
另外地制作用ブロツクエ一スTM仅进行封闭处理的、未固定有抗IgE抗体的珠(下面,称作空白珠)。
外径375μm、内径150μm的熔融(フユ一ズド)硅石毛细管(GLサイエンス社制造)切成10cm,中心部分用燃烧法使表面的聚酰亚胺剥离,设置观察窗,在其部分上依次并列空白珠10个、抗IgE抗体固定的 珠1个、空白珠10个。两端用直径50μm的SUS304不锈钢线((株)ニラコ制造,型号751107)加以固定。采用该设备,采用图17的装置进行反应、检测。各毛细管的连接采用内连接器(GLサイエンス社制造,适用内径250~530μm)进行。
开始,采用50μL的ブロツクエ一スTM,以流速100μL/min进行往返送液(10次往返),使反应10分钟(流路封闭)。
其次,用磷酸缓冲液(和光纯药工业(株)制造,磷酸缓冲液生理食盐粉末(1L中NaH2PO4 0.35g、Na2HPO4 1.28g、NaCl 8g)、pH7.4,下面简称PBS)稀释的1ng/mL IgE(Bethyl社制造,Human IgE Cal ibrator,型号RC80-108)50μL,以流速100μL/min进行往返送液(20次往返),使反应20分钟。
把PBS以流速100μL/min,在一方向挤压流动,洗涤4分钟。用PBS稀释的1000ng/mL HRP标记抗IgE抗体(Bethyl社制造,GoatAnti-Human IgE-HRP Conjugate)50μL,以流速100μL/min进行往返送液(20次往返),使反应20分钟。PBS以流速100μL/min向一方向挤压流动,洗涤4分钟。
在图18中,作为HRP的发光底物,采用SuperSignal WestFemto(PIERCE社制造)显示发光的测量结果。作为用于发光反应的试剂,当添加上述发光底物时(320秒附近),可得到来自发光的峰。积算100秒时,其值为5.5,同样的实验,当为0ng/mL IgE时(无IgE)的值为2.3。
实施例2
实验中使用的装置概略图示于图17。另外,反应按图1的流程图进行。
把93μm的聚苯乙烯珠(JSR(株)制造,聚苯乙烯制造的标准粒子DYNOSPHERES,型号SS-922P)悬浮液10滴(约1mL),放入1.5mL的エツペンドルフ管中,用台式小型离心机(ミリポア社チビタン、製造トミ一精工),分离珠与上清液,用移液管除去上清液后,添加把雪松花粉提取 物用PBS调整至50μg/mL的溶液1mL,放置一夜,进行雪松花粉提取物抗原固定。然后,除去上清液,添加碳酸缓冲液进行搅拌,再用台式离心机分离上清液,除去上清液。该操作进行3,4次。添加ブロツクエ一スTM(销售商大日本制药(株),制造商雪印乳业(株))1mL,进行1小时封闭。
用ブロツクエ一スTM只进行封闭处理的、未固定雪松花粉提取物抗原的珠(下面,称作空白珠),另外进行制造。
设备上采用在3.0cm×4.0cm×0.15cm尺寸的聚甲基丙烯酸甲酯上加工成内径110μm×110μm沟的芯片。芯片的开放部分用同样材质的厚度50μm的膜进行层压堵塞。在芯片上依次并列空白珠10个、雪松抗原固定的珠1个、空白珠10个。芯片两端为防止珠流出,设置坝结构,对侧形成锥状结构,插入外径375μm、内径50μm的熔融硅石毛细管(GLサイエンス社制造),防止珠流出。各毛细管的连接采用内连接器(GLサイエンス社制造,适用内径250~530μm)进行。
开始,采用50μL的ブロツクエ一スTM,以流速100μL/min进行往返送液(10次往返),使反应10分钟(流路封闭)。
用PBS调整的100ng/mL小鼠单克隆抗Cryj1抗体((株)林原生物化学研究所制造,AB-Cedar Pollen AllergenCryj1,(026)(mo)(M),Affin)50μL,以流速100μL/min进行往返送液(20次),使反应20分钟。PBS以流速100μL/min向一方向挤压流动,洗涤4分钟。用PBS调整的1000ng/mL HRP标记抗小鼠IgG抗体(Dako制造,Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP型号P0447)50μL,以流速100μL/min进行往返送液,使反应20分钟。PBS以流速100μL/min向一方向挤压流动,洗涤4分钟。
实施例3
实验中使用的装置概略图示于图20。对于250μm的PS珠(Polysciecnce制造,粒径范围250~300μm),用经过PBS调整的10μg/mL的HRP标记抗Aldolase抗体(ROCKLAND社制造,Anti-Aldolase,Rabbit Muscle,Goat-Poly,HRP型号200-1341),在终夜冷藏库内进行固定。
对于上述珠用黑色珠(DukeScience制造,粒径50μm,型号BK050T每几个夹住两侧,再在两侧,把未作任何固定的250μm PS珠在外径450μm、内径320μm的熔融硅石毛细管(GLサイエンス社制造)中并排排列。
两端用直径50μm的SUS304不锈钢线((株)ニラコ制造,型号751107)加以固定。
用于发光反应的试剂,采用HRP发光底物SuperSignal WestFemto(PIERCE社制造),把发光底物安装在注射器泵中,向珠阵列送液。开始送液,积算5分钟的结果是,取得珠阵列设备上的线路图,对像点显示强度的曲线示于图21。
把空白珠用HRP标记抗Aldolase抗体固定化珠夹住的状态,作为比较。
结果是,在检测对象的珠用遮光珠夹住时,可以防止向相邻的珠泄漏光。
Claims (26)
1.生物化学物质的分析方法,其特征在于,该方法具有:向收纳至少一部分上结合了探针的固相的流路,供给含有已被标记的检测对象物质或未被标记的检测对象物质的液体的工序,其中上述固相为多个粒子,上述多个粒子包含遮光性粒子与固定上述探针的检测对象粒子,在上述检测对象粒子与其他上述检测对象粒子之间配置至少1个上述遮光性粒子;
把上述已被标记的检测对象物质捕捉在上述探针上的工序或把未被标记的检测对象物质捕捉在探针上并加以标记的工序;
通过液流向上述流路供给用于发光反应的试剂的工序;以及
对上述用于发光反应的试剂与上述标记反应的部位附近进行光学检测的工序。
2.权利要求1中记载的分析方法,其特征在于,在把上述已被标记的检测对象物质捕捉在上述探针上的工序或把未被标记的检测对象物质捕捉在上述探针上并加以标记的工序中,通过往返送液,供给含已被标记的检测对象物质或未被标记的检测对象物质的液体。
3.权利要求1中记载的分析方法,其特征在于,上述标记为酶,上述用于发光反应的试剂含有与所用的酶对应的底物。
4.权利要求3中记载的分析方法,其特征在于,上述酶为过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、蔗糖酶、腺苷三磷酸酶、荧光素酶或水母发光蛋白,上述底物为鲁米诺、二氧杂环丁烷、过草酸酯、葡萄糖、β-D-半乳糖、葡萄糖-6-磷酸、光泽精、抗坏血酸磷酸酯、腺苷三磷酸、荧光素或它们的衍生物、或钙离子。
5.权利要求4中记载的分析方法,其特征在于,用于上述发光反应的试剂还含有氧化剂或氧添加剂。
6.权利要求3中记载的分析方法,其特征在于,上述酶为过氧化物酶,上述底物为鲁米诺或鲁米诺衍生物,用于上述发光反应的试剂还含有氧化剂或氧添加剂。
7.权利要求6中记载的分析方法,其特征在于,上述氧化剂为含过氧化氢或烷基过氧化氢的过酸。
8.权利要求3中记载的分析方法,其特征在于,用于上述发光反应的试剂还含有发光增敏剂。
9.权利要求1中记载的分析方法,其特征在于,上述固相为粒子,上述附近为上述粒子附近。
10.权利要求1中记载的分析方法,其特征在于,上述检测工序与通过液流供给用于上述发光反应的试剂的工序同时进行。
11.权利要求1中记载的分析方法,其特征在于,在上述检测工序中通过偏振片进行光学检测。
12.权利要求1中记载的分析方法,其特征在于,在上述检测工序中,使包含狭缝的光学系统与上述固相在上述流路的长度方向作相对移动,进行光学检测。
13.生物化学物质的分析方法,其特征在于,该方法具有:向收纳至少一部分上结合了探针的固相的流路,供给含有已被标记的检测对象物质或未被标记的检测对象物质的液体的工序;
把上述已被标记的检测对象物质捕捉在上述探针上的工序或把未被标记的检测对象物质捕捉在探针上并加以标记的工序;
通过液流向上述流路供给用于发光反应的试剂的工序;以及
对上述用于发光反应的试剂与上述标记反应的部位附近进行光学检测的工序,
上述固相为粒子,上述附近为上述粒子附近,供给上述流路的含有用于上述发光反应的试剂的溶液的折光率与上述粒子的折光率之差在0.2左右以下。
14.生物化学物质的分析方法,其特征在于,该方法具有:向收纳至少一部分上结合了探针的固相的流路,供给含有已被标记的检测对象物质或未被标记的检测对象物质的液体的工序;
把上述已被标记的检测对象物质捕捉在上述探针上的工序或把未被标记的检测对象物质捕捉在探针上并加以标记的工序;
通过液流向上述流路供给用于发光反应的试剂的工序;以及
对上述用于发光反应的试剂与上述标记反应的部位附近进行光学检测的工序,
上述固相为粒子,上述附近为上述粒子附近,供给上述流路的含有用于上述发光反应的试剂的溶液含有浓度为30%以上80%以下的范围的甘油。
15.分析试剂盒,其特征在于,具有:细管;固定探针并且收纳在上述细管中的第1粒子;含有遮光性物质并且收纳在上述细管中的第2粒子;和用于发光反应的试剂。
16.权利要求15中记载的分析试剂盒,其特征在于,上述第2粒子对通过上述发光反应产生的发光的波长具有遮光性。
17.权利要求15中记载的分析试剂盒,其特征在于,用于上述发光反应的试剂包含鲁米诺、二氧杂环丁烷、过草酸酯、葡萄糖、β-D-半乳糖、葡萄糖-6-磷酸、光泽精、抗坏血酸磷酸酯、腺苷三磷酸、荧光素或它们的衍生物、或钙离子。
18.权利要求17中记载的分析试剂盒,其特征在于,用于上述发光反应的试剂还含有氧化剂或氧添加剂。
19.权利要求15中记载的分析试剂盒,其特征在于,用于上述发光反应的试剂含有鲁米诺或其衍生物,以及氧化剂或氧添加剂。
20.权利要求19中记载的分析试剂盒,其特征在于,上述氧化剂为含有过氧化氢或烷基过氧化氢的过酸。
21.权利要求15中记载的分析试剂盒,其特征在于,用于上述发光反应的试剂还含有发光增敏剂。
22.分析装置,其特征在于,该装置具有:
用于向收纳至少一部分上固定了探针的固相的细管导入和/或导出液体的送液部,其中上述固相为多个粒子,上述多个粒子包含固定了上述探针的多个第1粒子和在上述多个第1粒子的各个间配置的并且未固定上述探针的多个第2粒子;
用于收纳试样的第1容器;
用于收纳用于发光反应的试剂的第2容器;和
用于对上述固相的任意部位进行光学检测的检测部,
上述第1容器和上述第2容器与上述送液部连结。
23.权利要求22中记载的分析装置,其特征在于,上述固相为粒子,上述检测部是一个端部设置在测定对象的上述粒子附近的光纤维。
24.权利要求22中记载的分析装置,其特征在于,上述送液部具有使多根上述细管分别连结的连接部。
25.权利要求22中记载的分析装置,其特征在于,上述检测部相对上述细管作相对移动。
26.权利要求22中记载的分析装置,其特征在于,在上述细管与上述检测部之间的位置上具有偏振片。
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