FI104586B - Menetelmä bioaffiniteettireaktion reaaliaikaista seuraamista varten - Google Patents

Description

104586

MENETELMÄ BIOAFFINITEETTIREAKTION REAALIAIKAISTA SEURAAMISTA VARTEN - FÖRFARANDE FÖR REALTIDSUPPFÖLJNING AV EN BIO-AFFINITETSREAKTION

Immunomääritys on vakiintunut biospesifinen määritysmenetelmä ja sen eri sovellutuksia käytetään laajalti rutiini-diagnostiikassa ja tutkimuslaboratorioissa. Toinen bio-spesifisten määritysten ryhmä, joskin vielä kehityksen 5 alaisena oleva, on DNA- ja RNA-hybridisaatiomääritys. Biospesifisissä määrityksissä käytetään yleensä kahta biospesifistä reagenssia, primäärireagenssia ja sekundääri-reagertssia (esim. vasta-ainetta, DNA- tai RNA-koetinta), jotka kumpikin sitoutuvat analyyttimolekyylin spesifisiin 10 determinantteihin muodostaen kolmen molekyylin kompleksin (kerrosrakenteen) ja normaalisti toinen näistä reagensseis-ta on leimattu. Nykyisin käytettyjä leimoja ovat radio-isotoopit, entsyymit, luminoivat leimat ja fluoresoivat leimat. Yleisin näytemateriaali, josta määritykset tehdään, 15 on veren seerumi.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä koskee sellaisia fluoro-metrisiä biospesifisiä määrityksiä, joissa yksi biospesifinen reagenssi on kiinnitetty kiinteänä reaktioalustana toimiviin mikropartikkeleihin. Reaktioalustaa ja siihen 20 sitoutuneita komponentteja nimitetään jäljempänä kiinteäksi « faasiksi. Toinen biospesifinen reagenssi on leimattu fluoresoivalla leimalla ja tätä reagenssia nimitetään jäljempänä yksinkertaisesti myös leimaksi. Määritykset voidaan jakaa toimintaperiaatteeltaan kahteen eri pääryhmään: 1) 25 määritykset, joissa on ylimäärä kiinteään faasiin sidottua . reagenssia ja jota immunologiassa nimitetään immunometri- * seksi määritykseksi ja 2) määritykset, joissa on alimäärä kiinteään faasiin sidottua reagenssia ja jota nimitetään myös kilpailevaksi määritykseksi.

30 Ensimmäinen ryhmä soveltuu analyyttimolekyyleille Ag, joilla on vähintäin kaksi spesifistä determinanttia. Tässä määrityksessä käytetään analyyttiin Ag nähden ylimäärä 104586 .

2 kiinteään faasiin sidottua biospesifistä reagenssia Ab.

Reaktion toisena reagenssina on leimattu reagenssi Ab*.

Kiinteään faasiin sitoutuu komplekseja AbAgAb*. Määrityksen signaalivaste on lineaarinen. Myös DNA- ja RNA-määritykset r 5 suoritetaan tämän saman periaatteen mukaisesti.

Toinen ryhmä soveltuu pienille analyyttimolekyyleille Ag.

Tässä määrityksessä käytetään analyyttiin nähden alimäärä kiinteään faasiin A sidottua biospesifistä reagenssia Ab.

Reaktion toisena reagenssina on leimattu reagenssi Ag*, eli 10 reagenssinä käytetään leimattua analyyttimolekyyliä. Komponentit Ag ja Ag* sitoutuvat kiinteässä faasissa olevaan reagenssiin Ab niiden pitoisuuksien suhteessa ja reaktiota nimitetään kilpailevaksi sidonnaksi. Määrityksen signaali-vaste on epälineaarinen.

15

Edellä esitettyjen kahden pääryhmän lisäksi tämän keksinnön mukainen menetelmä soveltuu erilaisten biomolekyylien Ab ja Ab* välisen reaktiokinetiikan tutkimiseen eli reaktiotuotteen muodostumisen seuraamiseen ajan funktiona. Tällöin 20 yksinkertaisesti seurataan leimatun molekyylin Ab* sitoutumista kiinteässä faasissa olevaan molekyyliin Ab. Edellä käytetyt symboolit Ab, Ag ja Ab* tarkoittavat yleisesti biospesifisiä molekyylejä, eivätkä ne rajoitu immunologisiin vasta-aineisiin ja antigeeneihin.

25 Tavanomaisten määritysmenetelmien ja tutkimusmenetelmien ongelmana on niiden monivaiheisuus. Esimerkiksi hormonin määritys verestä fluorometrisellä immunometrisellä määrityksellä edellyttää yleensä monta työvaihetta: solujen erottaminen seerumista, seerumi-näytteen annostelu ja * ·< 30 laimennus, inkubointi kiinteän faasin kanssa, vapaan fraktion erottaminen pesulla, inkubointi leimatun reagenssin kanssa, vapaan leiman erottaminen pesulla, mittausliuoksen lisääminen ja signaalin mittaaminen.

Solujen erottaminen seerumista on välttämätöntä, koska 35 tavanomaisissa fluorometrisissä menetelmissä hemoglobiinin 3 104586 voimakas valon absorptio haittaa mittausta. Reagenssit on lisättävä kahdessa eri vaiheessa ja välillä on suorittava , vapaan fraktion erottaminen, koska muutoin määrityksen vaste eli tuotteen AbAgAb* pitoisuus kääntyisi laskusuun-5 taan, kun analyytin pitoisuus ylittää kiinteän faasin sitomiskyvyn. Tätä haitallista ilmiötä, joka on mahdollinen ainoastaan silloin, kun kaikki reaktiokomponentit lisätään samanaikaisesti, nimitetään kirjallisuudessa "hook-efektik-si". Vapaa leima on myös erotettava, koska muutoin sen 10 lähettämän signaalin takia sitoutuneen leiman lähettämää signaalia ei saataisi määritetyksi.

Rutiinidiagnostiikassa on tarve yksinkertaisemmasta ja käyttökustannuksiltaan halvemmasta analytiikasta. Tämän keksinnön mukainen uusi fluoresoivilla leimoilla tehtävä 15 biospesifinen määritysmenetelmä on yksivaiheinen eikä välttämättä vaadi leiman erotusta ja soveltuu määrityksen tekemiseen kokoverestä tai muista biologisista suspensioista. Lisäksi tämä keksintö tekee mahdolliseksi bioaf-finiteettireaktion kinetiikan mittaamisen yksinkertaisesti 20 ja reaaliaikaisesti.

Keksinnön tunnusmerkit ilmenevät patenttivaatimuksesta 1. Keksinnön mukaiselle menetelmälle ovat luonteenomaista Φ seuraavat vaiheet: - Valmistetaan etukäteen mikropartikkeleita, jotka pääl-25 lystetään kysymykseen tulevaa analyyttiä sitovalla biospesif isellä primäärireagenssilla.

•

M

• - Biospesifinen sekundäärireagenssi leimataan fluore soivalla molekyylillä F.

- Mikropartikkelien joukkoon lisätään määritettävä näyte 30 ja biospesifinen sekundäärireagenssi, jonka jälkeen alkaa ,· bioaffiniteetin vaikutuksesta mikropartikkelien pinnalla oleviin reagenssimolekyyleihin sitoutua analyyttimolekyylin 4 104586 ja leimatun biospesifisen reagenssin muodostamia komplekseja.

- Mikropartikkelisuspensioon kohdistetaan valonsäde, jonka kohdistustilavuus on diffraktion rajoittama, jonka vuoksi 5 tämä valonsäde voi kohdistua ainoastaan yhteen mikropartik-keliin kerrallaan. Suspension liikkeen vuoksi mikropartik-kelit ajautuvat kohdistustilavuuteen ja siitä ulos. Mikro-partikkelin pinnalla oleva väriaine F virittyy ja sen emission voimakkuus mitataan fotoni-ilmaisimella, jonka 10 antaman sähköisen signaalin voimakkuus ajan funktiona on verrannollinen reaktion etenemisnopeuteen ja ko. analyytin pitoisuuteen. Seuraamalla signaalin kasvua voidaan saada tietoa kineettisistä reaktioparametreistä ja analyytin pitoisuudesta ennenkuin reaktio on saavuttanut päätepisteen 15 eli tasapainon.

Tasakokoisten mikropartikkelien käyttö biospesifisen määrityksen kiinteänä faasina tekee mahdolliseksi bioaffiniteet-tireaktion lyhyessä ajassa. Koska mikropartikkelien pinnalla tapahtuvassa reaktiossa analyyttimolekyylien ja leimat-20 tujen reagenssien keskimääräinen etäisyys on hyvin pieni, voidaan reaktiotasapaino saavuttaa nopeasti ja sen seurauksena syntyy mikropartikkeleiden pinnalla olevien reagenssi- - en yhteyteen leimatusta reagenssistä ja analyytista muodos-

S

tuvia komplekseja.

25 On tunnettua, että sironnasta ja autofluoresenssista syntyvä taustasignaali voidaan poistaa käyttämällä kaksoisfo-toniviritystä (FI 90175, FI 951040 ja W0 9622531). Uutta : tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä on kuitenkin » » havainto, ettei edes kokoveren tunnetusti voimakas auto-30 fluoresenssi ja valonsironta häiritse mittausta, kun viri- » tyksessä käytetään kaksoisfotoniviritystä. Hemoglobiinin voimakas näkyvän valon absorptio ei myöskään haittaa, koska - lasersäteen aallonpituus on NIR alueella.

] 35 Tässä menetelmässä sitoutuneen ja vapaan leimatun reagens- m 104586 .

5 sifraktion lähettämien signaalien erottaminen toisistaan perustuu siihen, että menetelmässä käytetty kaksoisfo-^ toniviritykseen perustuva fluoresenssin viritys ja ilmaisu pystyvät optisesti erottamaan lasersäteen kohdistuspistees-5 sä olevan mikropartikkelin lähettämän valoemission sen ympäristössä olevan vapaan leimatun reagenssin lähettämästä signaalista, eikä vapaana olevista leimoista synny merkittävää signaalia.

Uutta tämän keksinnön mukaisessä menetelmässä on myös se, 10 että fluoresenssin viritykseen käytettävä lasersäde kohdistetaan suoraan reaktiokyvetin läpinäkyvän seinämän läpi reaktiosuspensioon. Fluoresenssisignaali voidaan saada aina, kun mikropartikkeli ajautuu diffuusion tai nesteen liikkeen takia kohdistustilavuuteen ja siitä pois. Samalla 15 saadaan signaaleja, joiden amplitudi on suoraan verrannollinen kyseessä olevaan mikropartikkeliin sitoutuneiden leimattujen kompleksien määrään eli pystytään seuraamaan reaktion kineettistä edistymistä aina tasapainotilaan saakka. Signaali voimakkuus riippuu myös siitä, millä 20 tavalla satunnaisesti ajautuvat mikropartikkelit leikkaavat kohdistustilavuuden. Tästä huolimatta voidaan bioaffini-teettireaktion edistymistä seurata niiden lähettämän fluoresenssin intensiteetin perusteella riittävällä tarkkuudella, kun mikropartikkeleita havainnoidaan tilastollisesti ' 25 riittävän suuri määrä.

Edellä esitettyjen kahden ominaisuuden vuoksi tämä menetelmä tekee mahdolliseksi nopean yksivaiheisen biospesifisen määrityksen esimerkiksi kokoverinäytteistä ilman erotusta ; ja ilman hook-efektistä aiheutuvan virheellisen analyysi- ’’ 30 tuloksen vaaraa, koska hook-efekti voidaan ennustaa kineet tisen signaalin nousunopeudesta.

Kaksoisfotoniviritys voi syntyä, kun voimakkaan viritysva-lon kohdennuksella saadaan fotonien tiheys tilavuusyksikköä ja aikayksikköä kohti niin suureksi, että kahden fotonin 35 energia absorboituu samaan kromoforiin. Tällöin myös absor- •« 104586 .

6 hoituva energia on kahden fotonin energian summa. Yksittäisen fotonin absorptio väriaineeseen on todennäköisyyslaskennan käsitteiden mukaisesti riippumaton tapahtuma ja useiden fotonien absorboituminen on joukko yksittäisiä, 5 riippumattomia tapahtumia. Yksittäisen fotonin absorboitumisen todennäköisyyttä voidaan kuvata lineaarisella funktiolla, niin kauan kuin viritettävät energiatilat eivät ole kyllästyneet. Kahden fotonin absorptio on epälineaarinen prosessi. Kaksoisfotonivirityksessä väriainemolekyylin 10 virittyminen tapahtuu ainoastaan, kun kumpikin fotoni absorboituu samanaikaisesti. Kahden fotonin absorption todennäköisyys on yksittäisten fotonien absorptiotoden-näköisyyksien tulo. Kahden fotonin aiheuttama emissio on siis neliöllinen prosessi.

15 Mikropartikkelin virittämiseen tarkoitetun optisen järjestelmän ominaisuuksia voidaan kuvata järjestelmän vasteella pistemäiseen valolähteeseen. Pistemäinen valolähde muodostaa diffraktion vaikutuksesta optiselle järjestelmälle ominaisen intensiteettijakauman tarkennuspisteessä (piste-20 vaste). Normalisoituna tämä intensiteettijakauma on todennäköisyysjakauma sille, kuinka pistemäisestä valolähteestä lähteneet fotonit saapuvat tarkennusalueelle. Kaksoisfo-tonitekniikalla virityksen todennäköisyysjakauma on ensim-. .. mäisen fotonin ja toisen fotonin intensiteetti jakaumien 25 normalisoitu tulo. Näin saatu todennäköisyysjakauma on 3-ulotteisessa avaruudessa, eritoten syvyyssuunnassa, selvästi yksittäisen fotonin todennäköisyysjakaumaa rajau-tuneempi. Kaksoisfotonivirityksellä herätetään näin ollen ainoastaan se fluoresenssi, joka syntyy valonsäteen tarken-; 30 nuspisteen selvästi rajatussa 3-ulotteisessa lähiympäris- y tössä.

€

Kun väriaine viritetään kaksoisfotonivirityksellä, vähenee valon sironta kohdennuspisteen ympäristöstä ja optisista komponenteista huomattavasti verrattuna normaaliin virityk-35 seen. Edelleen kaksoisfotoniviritys vähentää tausta- fluoresenssin syntymistä näytteessä kohdennuspisteen uiko- 7 104586 puolella, näytteen ympäristössä ja optiikassa. Koska virittävä valonsäde on kohdennettava mahdollisimman pieneksi - pisteeksi, kaksoisfotoniviritys sopii parhaiten pienien näytetilavuuksien tai rakenteiden tarkasteluun, mistä on 5 kysymys myös tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä.

Kaksoisfotonivirityksen etu on myös siinä, että esim. ultraviolettialueella tai sinisellä alueella tapahtuvaan viritykseen voidaan käyttää näkyvää tai lähi-infrapuna-alu-een (NIR) valoa. Samoin voidaan näkyvällä alueella tapahtu-10 va viritys tehdä NIR-alueella olevalla valonsäteellä. Koska valolähteen aallonpituus on huomattavasti pidempi kuin väriaineen emission aallonpituus, voidaan valolähteen aallonpituudella ja sen ympäristössä syntyvä sironta ja mahdollinen autofluoresenssi vaimentaa alipäästösuodattimia 15 käyttämällä tehokkaasti (vähintään 10 kertalukua) ja estää pääsemästä fluoresenssiemission ilmaisimelle. Punasolujen aiheuttama valon absorptio NIR-alueella on erittäin pieni eikä ja olemme myös havainneet, että esimerkiksi viritysva-lo 1064 nm allonpituudella ei herätä hematoprofyriinien 20 fluoresenssia ja tämän johdosta punasolujen aiheuttama taustafluoresenssi ei ole merkittävä, vaikka niitä on huomattava määrä mikropartikkelisuspension joukossa.

•j Useimmiten kaksoisfotoniviritys vaatii korkeatehoisten ultralyhyitä pulsseja tuottavien laserlaitteiden käyttöä.

25 Suorittamissamme kokeissa olemme havainneet, että kaksois-fotonivirityksellä ja lyhytikäisillä fluoresoivilla leimoilla voidaan saavuttaa erittäin hyvä signaali-tausta-suh-de ja herkkyys. Esimerkkeinä lyhytikäisistä kaksoisfo-_ ' toniviritykseen sopivista fluoresoivista väriaineista 30 voidaan mainita coumariinin ja rodamiinin johdannaiset.

Tämän keksinnön mukaan mikropartikkeleiden mittaus suoritetaan suoraan optisella ikkunalla varustetusta reaktiokyve-tistä, ja mittaus voi olla kineettinen eli mittauksen ; aikana seurataan kompleksien muodostumista mikropartikkelin 35 pinnalle. Tällöin mikropartikkelit ajautuvat lasersäteen 8 104586 kohdistuspisteeseen esim. diffuusioon perustuvan liikkeen takia. Mittauksen nopeuttamiseksi kyvetissä oleva suspensio voidaan panna myös muulla tavalla liikkeeseen tai kyvettiä voidaan liikuttaa tai pyörittää sopivalla nopeudella.

5 Mikropartikkelit ajautuvat kohdistuspisteeseen satunnaisesti ja kohdistuspisteeseen ajautuvien mikropartikkelien määrä riippuu liikkeen nopeudesta ja mikropartikkelien pitoisuudesta. Riittävä lukumäärä mikropartikkeleita tunnistetaan ja analysoidaan tilastollisesti riittävän tarkan 10 tuloksen saamiseksi. Mittaustulokset suhteutetaan standar-dinäytteillä suoritettuihin mittauksiin, joiden perusteella lopputulokset lasketaan.

Tälle keksinnölle on myös luonteenomaista, että tässä esitetty mikrofotometrinen mittausjärjestelmä pystyy opti-15 sesti erottamaan mikropartikkeleiden pinnasta lähtevän valoemission mikropartikkelien ympäristössä olevasta liuoksesta lähtevästä valoemissiosta. Tämä erottelukyky perustuu siihen, että kun reaktioliuos on sopivasti laimennettu, sopii fotoni-ilmaisimen kohdennusalueeseen kerrallaan vain 20 yksi mikropartikkeli ja liuoksessa olevien vapaiden leimattujen reagenssien tai punasolujen aiheuttama taustasig-naali on vähäinen. Optisella erottelulla saavutetaan riittävä vapaan ja sidotun fraktion erottelukyky ilman kemial-lista tai fysikaalista erotusta, mutta mikäli on välttämä- -m 1 25 töntä, erottelua voidaan tehostaa millä tahansa tunnetulla erotusmenetelmällä kuten pesulla, suodatuksella tai sentri-fugoinnilla.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä ja siihen tarvittava ' laitteisto voidaan toteuttaa käytännössä monella eri taval- ' v 30 la. Keksinnössä on kuitenkin oleellista havainto, että kohdistamalla lasersäde suoraan reaktiosuspensioon, voidaan v seurata reaktion edistymistä, ja että punasolut samoin kuin muutkaan solut eivät aiheuta mitattavaa taustasignaalia : riippumatta siitä ovatko nämä solut kohdistuspisteessä tai • 35 sen ulkopuolella. Fluoresenssi-ilmaisin voidaan aktivoida ainoastaan kaksoisfotoniviritykseen käytettävän laserpuls- 9 104586 sin ajaksi, jolloin virityspulssien väliaikoina tulevat fotoniemissiot eivät tule mitatuiksi. Samoin fotoni-ilmaisin voidaan aktivoida ainoastaan sillä hetkellä, kun mikro-partikkeli on kohdistustilavuudessa. Tieto mikropartikkelin 5 ajautumisesta kohdistustilavuuteen saadaan esimerkiksi lasersäteen aallonpituudella syntyvän sironnan perusteella, joka mitataan parhaiten konfokaalisella sirontailmaisimel-la. Veren solujen aiheuttama sirontasignaali on kertalukuja heikompi, koska niiden taitekerroin on huomattavasti mikro-10 partikkelien taitekerrointa pienempi. Solun aiheuttamaa sirontaa ja taustafluoresenssia voidaan edelleen vähentää puhkaisemalla solukalvot isotoonisella liuosmediumilla, jolloin soluneste ja hemoglogiini (hematoporfyriini) laimenevat mittaussuspensioon.

15 Tämän keksinnön mukainen kaksoisfotonivirityksen käyttöön perustuva menetelmä voidaan tehdä myös moniparametriseksi WO-patenttijulkaisun 9622531 esittämällä tavalla. Silloin käytetään mikropartikkeleita, jotka on jaettu useihin eri 20 luokkiin, jotka on päällystetty eri analyyttejä sitovilla primäärireagensseilla. Tällöin on mittauslaitteen valmistuskustannusten kannalta erityisen merkityksellistä se, että partikkelin tunnistamiseen käytettävä viritysvalo ja analyytin määrää osoittavan leiman F kaksoisfotoniviritys .. 25 voidaan suorittaa samalla lasersäteellä, jonka aallonpituus on punaisella tai NIR-alueella.

Alan ammattimiehelle on selvää, että keksinnön erilaiset sovellutusmuodot voivat vaihdella jäljempänä esitettävien patenttivaatimusten puitteissa.

. : 30 V 1 t

Claims (2)

10 104586

1. Menetelmä biomolekyylin ja sille spesifisen fluoresoivalla merkkiaineella leimatun reagenssimolekyylin välisen bioaffinitettireaktion kinetiikan reaaliaikaista seuraamista ja mittaamista varten biologisissa nesteissä 5 tai suspensioissa käyttäen mikropartikkeleita bioaf-finiteettireaktion kiinteänä faasina, jolloin NIR-aallonpituudella toimiva lasersäde kohdistetaan biologiseen nesteeseen tai suspensioon, johon on lisätty bios-pesifisellä reagenssilla päällystettyjä mikropartikkeleita, 10 ja mikropartikkeleihin sitoutuvien leimojen fluoresenssi herätetään kaksoisfotonivirityksen avulla, tunnettu siitä, että biologinen neste tai suspensio, johon lasersäde kohdistetaan, on reaktiosuspensio, jossa mikropartikkelit ajautuvat satunnaisesti lasersäteen kohdistustilavuuteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että tieto mikropartikkelin ajautumisesta kohdistustilavuuteen saadaan kaksoisfotoniviritykseen käytetyn lasersäteen aallonpituudella syntyvän sironnan perusteella, joka mitataan konfokaalisella sirontailmaisimella. , « :: • I · i a M i 11 104586