DE602004003632T2

DE602004003632T2 - Turbidimetrisches Immuntestverfahren und zugehörige Vorrichtung

Info

Publication number: DE602004003632T2
Application number: DE602004003632T
Authority: DE
Inventors: Tatsurou Kawamura; Keiko Yugawa; Akihito Kamei
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2003-07-09
Filing date: 2004-07-08
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2024-07-09
Also published as: EP1496362B1; US7226777B2; CN1576844A; DE602004003632D1; US20050009102A1; EP1496362A1

Description

HINDERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen turbidimetrischen Immuntest für die Messung der Konzentration eines in einer Probenlösung gelösten Antigens, und insbesondere auf eine turbidimetrische Immununtersuchung für die Messung der Konzentration von in Urin enthaltenem Albumin und die Verwendung einer Vorrichtung dafür.
Herkömmliche Verfahren für die Messung der Konzentration eines Antigens enthalten: Zugabe eines Antikörpers zu einer Probenlösung, der spezifisch an ein in der Probenlösung enthaltenes Antigen bindet, um einen Antigen-Antikörper-Komplex durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion zu erzeugen, welcher die Probenlösung trübt; und Bestimmen der Konzentration des Antigens aus der Trübung der Probenlösung. Die Trübung wird gemessen durch Richten von Licht auf die Probenlösung und dann Nachweis des gestreuten Lichts, das in der Lösung erzeugt wird, oder von durchgelassenem Licht, welches durch die Lösung getreten ist. Wenn die Trübung ansteigt, steigt die Intensität des gestreuten Lichts ebenfalls an, aber die Intensität des Durchlichts nimmt ab.
In dem vorher beschriebenen Verfahren erfolgt die Messung in einem Bereich, in dem die molare Konzentration des Antikörpers größer als die des Antigens ist, und in einem Bereich, in denen sie nahezu gleich sind, spezifischer in einer Prozone A bis B (hiernach als A-B-Bereich bezeichnet) und einer Äquivalenzzone C (hiernach als C-Bereich bezeichnet), wie in der 17 gezeigt. In der 17 steigt die Trübung mit dem Anstieg der Konzentration des Antigens in dem A-B-Bereich an, während die Schwankung der Trübung mit der Konzentration des Antigens in dem C-Bereich gering ist. In der Postzone D nimmt die Trübung mit dem Anstieg der Konzentration des Antigens ab, welches als Prozone-Phänomen bezeichnet wird. Demgemäß wird in dem vorhergehenden Verfahren die Konzentration des Antigens durch Erzeugen einer Kalibrationslinie in dem A-B-Bereich der 17 und sie berechnen aus einem gemessenen Trübungsgrad auf der Grundlage der Kalibrierungskurve berechnet.
Wie vorher beschrieben, sollte für die durchzuführende Messung die Konzentration des Antigens in der Prozone A-B oder der Äquivalenzzone C sein, und daher ist es erforderlich, die Antikörperkonzentration anzuheben. In einem derartigen Fall wird manchmal die Empfindlichkeit in einem unteren Konzentrationsbereich geopfert. Außerdem muss, um zu überprüfen, dass die Konzentration des Antigens tatsächlich nicht in der Postzone D ist, (d.h. Bereich D der 17) ein Verdünnungsschritt der Probenlösung oder ein Schritt der Zugabe einer zusätzlichen Menge an Antikörper erfolgen. In dem Fall der Verwendung einer Probenlösung deren Antigenkonzentration im D-Bereich sein kann, werden zwei Konzentrationen gemäß dem gemessenen Trübungsgraden erhalten. Aus diesem Grund ist es notwendig zu überprüfen, dass die Konzentration des Antigens nicht im D-Bereich ist (siehe US2003-219910 A1 und US2003-100128 A1).
C. Tillyer, Clin. Chem. 36/2, 307312 (1990) offenbart eine Optimierung einer Kalibrierungstechnik mit zwei Parametern, wobei zwei Parameter für die dreidimensionale Kalibrierungsauftragung und relative Empfindlichkeitskurven verwendet werden, welche verwendet werden, um den Arbeitsbereich eines immunturbidimetrischen Tests auf Albumin in Urin zu vergrößern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, die vorhergehenden Problem zu lösen, die bei dem turbidimetrischen Immununtertest auftreten, und den messbarem Konzentrationsbereich für ein Antigen in einer Probenlösung zu vergrößern ohne die Empfindlichkeit in einem unteren Konzentrationsbereich zu opfern. Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist einen turbidimetrischen Immuntest zur Verfügung zu stellen, ohne einen Schritt der Verdünnung einer Probenlösung und ohne einen Schritt der Zugabe einer zusätzlichen Menge an Antikörper für die Überprüfung, dass die Konzentration des Antigens nicht in der Postzone ist, d.h. in dem D-Bereich der 17.
In einer turbidimetrische Immununtersuchung gemäß der vorliegenden Erfindung wird (1) eine Probenlösung, die ein Antigen als das Analyt enthält, zuerst mit einem Reagenz gemischt, das einen Antikörper enthält, der spezifisch an das Analyt bindet, um eine gemischte Lösung zu erhalten. Aufgrund dieser spezifischen Bindungsreaktion wird ein Antigen-Antikörper-Komplex erzeugt, welcher die Trübung der Probenlösung erhöht.
(2) Der Trübungsgrad der erhaltenen Mischlösung wird dann diskret an mehreren Zeitpunkten oder aufeinander folgend gemessen, und dann wird (3) die Korrelation des erhaltenen Trübungsgrades und der verstrichenen Zeit nach dem Mischen bestimmt. (4) Auf der Grundlage der Korrelation wird der maximale Wert des gemessenen Trübungsgrades (S_peak) nachgewiesen, um die verstrichene Zeit zu bestimmen, an welcher der S_peak beobachtet wird (T_peak), und (5) die Konzentration des Analyts wird aus einer Korrelation zwischen S_peak und T_peak bestimmt, wobei in dem letzteren Schritt (5) T_peak, die im Schritt (4) bestimmt wird, mit der T_peak beim maximalen Wert von S_peak in der Korrelation zwischen S_peak und T_peak verglichen wird.
Durch die Durchführung dieser Schritte wird die Variation im Trübungsgrad untersucht, um zu überprüfen, ob das Prozone-Phänomen in der Umlösung mit der Variation auftritt, und die Konzentration des Analyts wird durch die Anwesenheit oder Abwesenheit des Prozone-Phänomens bestimmt.
Der Trübungsgrad im Schritt (2) wird bevorzugt durch Streulicht gemessen und der maximale Wert wird bevorzugt im Schritt (4) nachgewiesen.
In einer anderen Ausführungsform wird die Konzentration des Analyts bevorzugt aus der Korrelation zwischen dem S_peak und der T_peak bestimmt.
In einer anderen Ausführungsform wird die Konzentration des Analyts bevorzugt aus der Korrelation zwischen der verstrichen Zeit T_peak und dem gemessenen Trübungsgrad S(T) nach einer bestimmten Zeitlänge der Zeit T nach dem Mischen bestimmt. In diesem Fall wird T > T_peak erfüllt.
In einer weiteren Ausführungsführungsform wird sowohl S_peak als auch das T_peak, zu der S_peak beobachtet wird, bevorzugt bestimmt durch Bestimmung einer Differentialgleichung dS(T)/dT des gemessenen Trübungsgrades S(T) nach einer bestimmten Zeitlänge T nach dem Mischen und Festsetzen des Punktes, an dem die Polarität der Differentialgleichung umgekehrt wird, als die T_peak und eines gemessenen Trübungsgrads S(T) an dem Zeitpunkt als Speak.
In einer weiteren Ausführungsform, wenn die im Schritt (4) bestimmte T_peak gleich oder kleiner als T_peak beim maximalen Wert für S_peak in der Korrelation zwischen S_peak und T_peak ist, wird die Konzentration des in der Probenlösung enthaltenen Analyts bevorzugt als gleich oder größer als eine Konzentration des Analyts an dem maximalen Wert von S_peak in einer Korrelation zwischen S_peak, T_peak und der Konzentration bewertet.
Der Analyt ist bevorzugt humanes Serumalbumin.
Der Antikörper ist bevorzugt ein monoklonaler Antikörper. Das Reagenz enthält bevorzugt wenigstens zwei monoklonale Antikörper. Es ist bevorzugt, das wenigstens zwei monoklonale Antikörper spezifisch an verschiedene Stellen des humanen Serumalbumins binden.
Die Probenlösung ist bevorzugt Urin.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Verwendung eines Geräts für einen turbidimetrischen Immuntest für die Durchführung des vorher beschriebenen turbidimetrischen Immuntests.
Das für den turbidimetrischen Immuntest verwendete Gerät gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst: eine Lichtquelle für das Richten von Licht auf die Probenlösung; eine Probenzelle für die Aufnahme der Probenlösung, so dass das Licht durch die Probenlösung dringen kann; einen ersten optischen Sensor für den Nachweis von Durchlicht, das durch die Probenlösung dringt, und/oder einem zweiten optischen Sensor für den Nachweis von Streulicht, das durch die Ausbreitung des Lichts durch die Probenlösung erzeugt wird; eine Mischvorrichtung bzw. einen Mischer für das Mischen der Probenlösung mit dem Reagenz, das einen Antikörper enthält, in der Probenzelle, und einen Computer für die Steuerung des Mischers und für die Analyse von Ausgabesignalen, die von dem ersten optischen Sensor und/oder dem zweiten optischen Sensor ausgesendet werden.
In dem Gerät wird die Konzentration eines in der Probenlösung enthaltenen Antigen aus den Ausgabesignalen ermittelt, die von dem ersten optischen Sensor und/oder dem zweiten optischen Sensor nach dem Mischen der Lösung mit dem Reagenz ausgesendet werden.
Das für einen turbidimetrischen Immuntest verwendete Gerät gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst: eine Lichtquelle für das Richten von Licht auf die Probenlösung; eine Probenzelle für die Aufnahme der Probenlösung; einen ersten optischen Sensor für den Nachweis von Durchlicht, das durch die Probenlösung tritt und/oder einen zweiten optischen Sensor für den Nachweis von Streulicht, das während der Ausbreitung des Lichts durch die Probenlösung erzeugt wird; einen ersten Differentiator für die Differenzierung der Ausgabesignale, die von dem ersten optischen Sensor ausgesandt werden, und/oder einem zweiten Differentiator für die Differenzierung von Ausgabesignalen, die von dem zweiten optischen Sensor ausgesandt werden; eine Mischvorrichtung bzw. einen Mischer für das Mischen der Probenlösung mit dem Reagenz, das einen Antikörper enthält, in der Probenzelle, und einen Computer für die Steuerung des Mischers und für die Analyse der Ausgabesignale von dem ersten optischen Sensor, dem zweiten optischen Sensor, dem ersten Differentiator und/oder dem zweiten Differentiator.
In dem Gerät wird die Konzentration eines in der Probenlösung enthaltenen Antigens aus dem Ausgabesignalen ermittelt, die von dem ersten Differentiator und/oder dem zweiten Differentiator nach dem Mischen der Lösung mit dem Reagenz ausgesendet werden.
Gemäß der Erfindung ist es möglich, den messbaren Konzentrationsbereich für ein in der Probenlösung enthaltenes Antigen ohne einen Verdünnungsschritt oder Ähnliches zu erweitern. Ihre praktische Wirkung wird enorm sein und die Effizienz der Messung und des Tests als auch Einsparungen im Labor können realisiert werden.
Es wird angemerkt, dass der vorher erwähnte Mischer weggelassen werden kann.
Währen die neuartigen Merkmale der Erfindung insbesondere in den beigefügten Ansprüchen festgelegt werden, wird die Erfindung, sowohl hinsichtlich ihrer Organisation als auch ihres Inhalts, zusammen mit anderen Aufgaben und Merkmalen davon aus der folgenden ausführlichen Beschreibung zusammengenommen mit den Zeichnungen besser verstanden und geschätzt werden.
KURZE BESCHREIBUNG VERSCHIEDENER ANSICHTEN DER ZEICHNUNG
Die 1 ist eine Draufsicht, die schematisch ein in den turbidimetrischen Immuntestverfahren verwendetes Gerät der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
Die 2 ist eine schematische Seitenansicht eines Geräts für einen turbidimetrischen Immuntest der 1.
Die 3 ist eine graphische Ansicht, die die Variation in dem Ausgabesignal eines optischen Sensors 5 in der AUSFÜHRUNGSFORM 1 über die Zeit zeigt.
Die 4 ist eine graphische Ansicht, die die Variation in dem Ausgabesignal eines optischen Sensors 5 in der AUSFÜHRUNGSFORM 1 über die Zeit zeigt.
Die 5 ist eine graphische Ansicht, die die Variation in dem Ausgabesignal eines optischen Sensors 5 in der AUSFÜHRUNGSFORM 1 über die Zeit zeigt.
Die 6 ist eine graphische Ansicht, die die Variation in dem Ausgabesignal eines optischen Sensors 5 in der AUSFÜHRUNGSFORM 1 über die Zeit zeigt.
Die 7 ist eine graphische Ansicht, die die Variation in dem Ausgabesignal eines optischen Sensors 5 in der AUSFÜHRUNGSFORM 1 über die Zeit zeigt.
Die 8 ist eine graphische Ansicht, die die Variation in dem Ausgabesignal eines optischen Sensors 5 in der AUSFÜHRUNGSFORM 1 über die Zeit zeigt.
Die 9 ist eine graphische Ansicht, die die Variation in dem Ausgabesignal eines optischen Sensors 5 in der AUSFÜHRUNGSFORM 1 über die Zeit zeigt.
Die 10 ist eine graphische Ansicht, die die Variation in dem Ausgabesignal eines optischen Sensors 5 in der AUSFÜHRUNGSFORM 1 über die Zeit zeigt.
Die 11 ist eine graphische Ansicht, die die Variation in dem Ausgabesignal eines optischen Sensors 5 in der AUSFÜHRUNGSFORM 1 über die Zeit zeigt.
Die 12 ist eine graphische Ansicht, die die Variation in dem Ausgabesignal eines optischen Sensors 5 in der AUSFÜHRUNGSFORM 1 über die Zeit zeigt.
Die 13 ist eine graphische Ansicht, die die Variation in dem Ausgabesignal eines optischen Sensors 5 in der AUSFÜHRUNGSFORM 1 über die Zeit zeigt.
Die 14 ist eine graphische Darstellung, die durch Auftragen der Ausgabesignale aus einem optischen Sensor 5 nach 300 Sekunden als der Trübungsgrad auf der horizontalen Achse und der Konzentrationen der Probenlösungen auf der vertikalen Achse erzeugt wurde.
Die 15 ist eine graphische Darstellung, die durch Auftragen der Konzentrationen der Probenlösungen der 5 bis 13 auf der horizontalen Achse und der maximalen Werte des Trübungsgrades auf der vertikalen Achse erzeugt wurde.
Die 16 ist eine graphische Darstellung, die durch Auftragen der verstrichenen Zeit, wenn der maximale Wert beobachtet wird (T_peak) auf der horizontalen Achse und des maximalen Wertes des Trübungsgrades (S_peak) auf der vertikalen Achse erzeugt wurde.
Die 17 ist eine graphische Darstellung, die die Korrelation zwischen der Antigenkonzentration und dem Trübungsgrad zeigt.
Die 18 ist eine graphische Darstellung, die die Variation in dem Ausgabesignal von einem optischen Sensor 5 über die Zeit zeigt.
Die 19 ist eine graphische Darstellung, die die Variation in dem Ausgabesignal von einem optischen Sensor 5 über die Zeit zeigt.
Die 20 ist eine graphische Darstellung, die die Variation in dem Ausgabesignal von einem optischen Sensor 5 über die Zeit zeigt.
Die 21 ist eine graphische Darstellung, die die Variation in dem Ausgabesignal von einem optischen Sensor 5 über die Zeit zeigt.
Die 22 ist eine graphische Darstellung, die durch Auftragen der Ausgabesignale aus einem optischen Sensor 5 nach 300 Sekunden als der Trübungsgrad auf der horizontalen Achse und der Konzentrationen der Probenlösungen auf der vertikalen Achse erzeugt wurde. Die 23 ist eine Draufsicht, die schematisch ein in den turbidimetrischen Immuntestverfahren verwendetes Gerät der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
Die 24 ist eine graphische Darstellung, die die Variation von SC45 (angegeben durch eine gepunktete Linie) und die von SC90 (angegebenen durch eine durchgängige Linie) gegen die Zeit zeigt.
Die 25 ist eine graphische Darstellung, die Korrelation zwischen T_peak und der Konzentration zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wird zunächst eine Beschreibung eines herkömmlichen turbidimetrischen Immuntest zusammen mit dem durch die vorliegende Erfindung gelösten Problemen gegeben. Ein turbidimetrischer Immuntest unter Verwendung eines in den 1 und 2 gezeigten Geräts wird hier beschrieben. Die 1 ist eine Draufsicht, die schematisch die Struktur eines in einem herkömmlichen turbidimetrischen Immuntest zu verwendenden Gerätes und eines turbidimetrischen Immuntests gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. Die 2 ist eine Seitenansicht eines optischen Systems der 1. Eine Probenzelle 1, die in den 1 und 2 gezeigt wird, ist ein rechtwinkliger Aluminiumbehälter, mit einer Öffnung oben.
Glasplatten, die als optische Fenster dienen, sind an beiden Seiten der Probenzelle 1 eingebettet, so dass Licht von einer Glasplatte zu der anderen Glasplatte durch eine in der Probenzelle 1 enthaltene Probenlösung treten kann. Eine Strecke in der Ausbreitungsrichtung des Lichts in der Probenzelle 1, d.h. ein Abstand zwischen den optischen Fenstern, wird durch einen Pfeil A dargestellt und eine Strecke senkrecht zu der Ausbreitungsrichtung des Lichts wird durch einen Pfeil B dargestellt. Hierbei wird eine Erläuterung für den Fall von A = 0,75 cm und B = 0,4 cm gegeben.
Ein Einlass 2 mit einem Durchmesser (innerer Durchmesser) von 0,1 cm ist an der Seitenfläche ohne optisches Fenster der Probenzelle 1 angeordnet, wie aus der 1 ersichtlich. Das Zentrum des Einlasses 2 ist in einem Abstand x von dem Boden der Probenzelle 1 und einem Abstand z von einem der optischen Fenster angeordnet, wie in der 2 gezeigt.
Die Zufuhrrichtung eines Reagenz, die durch einen Pfeil 10 angezeigt wird, ist parallel zu dem optischen Fenster und senkrecht zu der optischen Achse des im Wesentlichen parallelen Lichts 4, welches im Folgenden beschrieben wird. Eine Anordnung wie diese erzeugt, in der Lösung der Probenzelle 1 einen Schnittpunkt, wo eine Zufuhrachse, die sich aus dem Zentrum des Einlasses 2 zu der Zufuhrrichtung erstreckt, und die optische Achse des im Wesentlichen parallelen Lichts einander schneiden. Hier ist x = 0,15 cm und y = 0,1 cm.
Dieses Gerät enthält als eine Lichtquelle ein Halbleiterlasermodul 3 für die Aussendung von im Wesentlichen parallelen Licht 4 mit einer Wellelänge von 780 nm, einer Intensität von 3,0 mW und einem Strahldurchmesser von 0,12 cm. Die optische Achse dieses im Wesentlichen parallelen Lichts 4 ist parallel zum Boden der Probenzelle 1 und wird in einem Abstand von 0,4 cm vom Boden angeordnet, was bedeutet, dass die optische Achse und der Einlass 2 nahezu in der gleichen Höhe vom Boden angeordnet sind.
Ein optischer Sensor 5 detektiert Streulicht 11, das während der Ausbreitung des im Wesentlichen parallelen Lichts 4 durch die Probenlösung erzeugt wird. Eine Mischvorrichtung 6 spritzt ein Reagenz in eine Probenlösung in der Probenzelle 1 durch den Einlass 2 ein. Ein Computer 7 analysiert die Ausgabesignale, die von dem optischen Sensor 5 ausgesendet werden, und steuert die Mischvorrichtung 6.
In der 1 bezeichnet das Bezugszeichen 8 schematisch einen Strudel, der auftritt, wenn das Reagenz aus dem Einlass 2 eingespritzt wird. Das Bezugszeichen 9 zeigt die Oberfläche der Probenlösung an, wobei der niedrigste Punkt davon in einem Abstand von h von dem Boden der Probenzelle 1 angeordnet ist.
In dieser Probenzelle 1 sind die Ecken der inneren Wände gekrümmt. Mit anderen Worten sind, technisch die Winkel der Ecken nicht rechtwinklig, so dass die Probenzelle 1 etwa 0,23 ml eine Flüssigkeit aufnehmen kann, wenn h = 8 cm ist. Die Oberfläche der Probenlösung hierin, welche durch das Bezugszeichen 9 bezeichnet wird, meint den niedrigsten Punkt der Oberfläche der Probenlösung. Gemäß dieser Definition ist in dieser Ausführungsform die Zufuhrrichtung parallel zu der Oberfläche der Probenlösung.
Es wird nun eine Beschreibung des Vorgehens für die Bestimmung der Konzentration an humanem Serumalbumin angegeben, das im Urin enthalten ist, in dem Fall der Verwendung des vorher beschriebenen Geräts, und von Urin als eine Probenlösung.
Zuerst wird Urin, mit einer bestimmten Konzentration an humanen Serumalbumin von nicht mehr als 0,03 mg/dl, als das Lösungsmittel vorbereitet. Humanes Serumalbumin wird zu diesem Verdünnungsmittel gegeben, um Probenlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen zuzubereiten: 1 mg/dl, 3 mg/dl, 5 mg/dl, 10 mg/dl, 15 mg/dl, 20 mg/dl, 30 mg/dl, 50 mg/dl und 100 mg/dl.
Um ein neutrales Reaktionssystem zu formulieren, wird eine MOPS-Pufferlösung mit einem pH von 7,4 unter Verwendung von 0,05 M von MOPS (Morpholinpropansulfonsäure) und 4 Gew.-% Polyethylenglycol 6000 zubereitet.
Ein polyklonaler Antikörper gegen humanes Albumin vom Kaninchen wird in 0,05 M einer wässrigen MOPS-Lösung mit einem pH von 7,4 gelöst, um ein Reagenz mit einer Antikörperkonzentration von 2,5 mg/dl zuzubereiten (wässrige Antikörperlösung).
Dann werden 9 μl der Probenlösung mit einer humanen Serumalbuminkonzentration von 0 mg/dl (d.h. der oben als das Verdünnungsmittel verwendete Urin) in die Probenzelle 1 eingeführt. Nachfolgend werden 145 μl der MOPS-Pufferlösung in die Probenzelle 1 eingeführt, gefolgt durch Rühren. Es ist zu bemerken, das der hier verwendete Urin als ein Urin betrachtet werden sollte, im Wesentlichen eine Konzentration an humanem Serumalbumin von 0 mg/dl hat, da kein humanes Serumalbumin dazu gegeben wird.
Der Computer 7 beginnt zu diesem Zeitpunkt mit dem Auslesen der Signale, die von dem optischen Sensor 5 gesendet werden. 18 zeigt die Variation des Ausgabesignals von dem optischen Sensor 5 über die Zeit seit dem Beginn. Die horizontale Achse stellt die verstrichene Zeit nach dem Beginn der Aufzeichnung des Ausgabesignals dar, und die vertikale Achse stellt das Ausgabesignal (hiernach als "SC90" bezeichnet) von dem optischen Sensor 5 in der 18 dar. "SC90" hat seinen Namen daher, weil Streulicht, das sich 90 Grad relativ zu der Ausbreitungsrichtung des im Wesentlichen parallelen Lichts 4, des in der Probenlösung gestreuten Lichts ausbreitet, durch den optischen Sensor 5 nachgewiesen wird.
Nach Verstreichen von 5 Sekunden steuert der Computer 7 den Mischer 6, wie etwa eine Pipettiervorrichtung oder Pumpe, um 40 μl des Reagenz (wässrige Antikörperlösung) aus dem Einlass 2 in die Probenzelle 1 für etwa 3 Sekunden zu injizieren.
Der Fluss des injizierten Reagenz versperrt den optischen Pfad des im Wesentlichen parallelen Lichts 4, während eines Zeitraums von etwa 3 Sekunden vom Beginn der Injektion des Reagenz (d.h. von 5 Sekunden nach der Injektion der Pufferlösung), um die Intensität und die Ausbreitungsrichtung des durch Lichts zu stören, welches in weit schwankenden Ausgabesignalen des optischen Sensors 5 resultiert. Der Bereich, in welchem die Ausgabesignale wie vorher beschrieben, variieren, wird durch das schraffierte Muster in der 18 angezeigt.
Ebenso werden die Probenlösungen mit unterschiedlichen humanen Serumalbuminkonzentrationen (1 mg/dl, 3 mg/dl, 5 mg/dl, 10 mg/dl, 15 mg/dl, 20 mg/dl, 30 mg/dl, 50 mg/dl und 100 mg/dl) dem gleichen Vorgehen unterzogen, wie vorher beschrieben.
Die 19 bis 21 zeigen die Variationen in dem Ausgabesignal von dem optischen Sensor 5 mit der Zeit für jede der Probenlösungen mit entsprechenden humanen Serumalbuminkonzentrationen von 3 mg/dl, 10 mg/dl und 100 mg/dl. Ähnlich wie in der 18 wird der Bereich, in welchem die Ausgabesignale weit variieren, durch das Schraffierte Muster in den 19 bis 21 angegeben.
Wie aus den 18 bis 21 offensichtlich, sind die Ausgabesignale des optischen Sensors 5, welche die Trübung anzeigen, nach 300 Sekunden gesättigt. Auf der Grundlage des Vorhergehenden wird ein in der 22 gezeigter Graph erzeugt durch Auftragen der Ausgabesignale von dem optischen Sensor 5 als der Trübungsgrad auf die vertikale Achse und der Konzentration der Probenlösungen auf der horizontalen Achse.
Es ist aus der 22 ersichtlich, dass der Konzentrationsbereich zwischen 0 bis 30 mg/dl zu dem A-B-Bereich der 17 entspricht, das um 50 mg/dl dem C-Bereich davon entspricht, und dass um 100 mg/dl dem D-Bereich davon entspricht.
In der 22 kann die Konzentration durch Erzeugen einer Kalibrationskurve unter Verwendung von Trübungsgraden in den Konzentrationsbereich von 0 bis 30 mg/dl bestimmt werden.
Wenn jedoch die Probenlösung eine Konzentration von etwa nicht weniger als 50 mg/dl hat, kann aufgrund des Prozone-Phänomens die Konzentration nicht eindeutig nur aus dem Trübungsgrad nach einem bestimmten Zeitraum nach Mischen der Probenlösung mit dem Reagenz bestimmt werden. Wenn z.B. der Trübungsgrad (Ausgabesignal von dem optischen Sensor 5 nach 300 Sekunden) 7,5 ist, ist es schwierig zu identifizieren, ob die Konzentration der Probenlösung entweder etwa 20 mg/dl oder 50 bis 100 mg/dl ist.
Es ist daher notwendig, auf irgendeine Art und Weise zu überprüfen, dass die Probenlösung eine Konzentration an humanem Serumalbumin von nicht mehr als 50 mg/dl hat. Mit anderen Worten ist der in dem vorher beschriebenen Verfahren messbare Konzentrationsbereich für das Antigen in der Probenlösung auf nicht mehr als 50 mg/dl beschränkt.
Mit Blick auf das Vorhergehende hat die vorliegende Erfindung die Aufgabe der Lösung des vorher beschriebenen, mit dem turbidimetrischen Immuntest verbundenen Problems und des Ausweitens des messbaren Konzentrationsbereichs für ein Antigen in einer Probenlösung, ohne die Empfindlichkeit in einem niedrigen Konzentrationsbereich zu opfern. Die vorliegende Erfindung hat die weitere Aufgabe einen turbidimetrischen Immuntest zur Verfügung zu stellen, ohne einen Schritt des Verdünnens einer Probenlösung und ohne einen Schritt der Zugabe einer zusätzlichen Menge eines Antikörpers zur Überprüfung, dass die Konzentration des Antigens nicht in der Postzone ist, d.h., dass die Konzentration davon nicht in dem D-Bereich der 17 ist.
Um genauer zu sein, werden die vorhergehenden Probleme, die aus dem Prozone-Phänomen resultieren, in dem turbidimetrischen Immuntest der vorliegenden Erfindung durch das Durchführen der Schritte vermieden:

(1) Mischen der Probenlösung und des Reagenz, um eine gemischte Lösung zu ergeben;
(2) Messen des Trübungsgrades des gemischten Lösung diskret zu mehreren Zeitpunkten oder fortlaufend;
(3) Bestimmen einer Korrelation zwischen den gemessen Trübungsgraden und der nach dem Mischen verstrichenen Zeit; und
(4) Nachweisen des maximalen oder minimalen Wertes des gemessenen Trübungsgrades (S_peak) auf der Grundlage der vorher erwähnten Korrelation, um die verstrichene Zeit zu bestimmen, zu der S_peak beobachtet wird (T_peak)

AUSFÜHRUNGSFORM 1
Diese Ausführungsform ist ein Beispiel der Bestimmung der Konzentration von Albumin in Urin unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch an humanes Serumalbumin bindet und von Urin als die Probenlösung.
In dem turbidimetrischen Immuntest ist es entscheidend, dass ein Antigen und ein Antikörper durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion aggregieren. Mit anderen Worten sollten ein Antigen und ein Antikörper aneinander binden, um gebundene Substanzen zu erzeugen, welche zwischen Antikörpermolekülen der gebunden Substanzen vernetzt werden, um größere Teilchen (Antigen-Antikörper-Komplex) zu erzeugen. Demgemäß sind wenigstens zwei unterschiedliche Antikörper mit unterschiedlichen Bindungsstellen an das Antigen notwendig.
Der Antigen-Antikörper-Komplex sollte eine Teilchengröße haben, die groß genug ist, um den maximalen oder minimalen Wert des gemessenen Trübungsgrades anzuzeigen. Die Größe variiert in Abhängigkeit von verschiedenen Bedingungen, ist aber bevorzugt nicht weniger als etwa 25 μm.
Aus diesem Grund wird ein polyklonaler Antikörper typischerweise in turbidimetrischen Immuntests verwendet. Es wurde jedoch gefunden, dass selbst wenn ein durch Mischen einer Mehrzahl von monoklonalen Antikörpern mit verschiedenen Bindungsstellen zubereitetes Reagenz verwendet wird, das Antigen und die Antikörper aggregieren, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu erzeugen, und die Konzentration des Antigens kann durch den turbidimetrischen Immuntest bestimmt werden. Überdies wurde eine Ausweitung des messbaren Konzentrationsbereiches durch Beobachtung des Übergangsphänomens der Trübung erzeugt durch Mischen einer Probenlösung mit einem Reagenz ausgeweitet, das eine Mehrzahl von monoklonalen Antikörpern mit unterschiedlichen Bindungsstellen enthält, gefolgt durch die Analyse davon.
Ein spezifisches Beispiel wird im Folgenden unter Verwendung der 1 bis 22 angegeben. Die 1 bis 2 sind exakt die gleichen wie in der vorher beschriebenen herkömmlichen Technologie verwendeten, und das Gerät wird in der gleichen Art und Weise wie vorher beschrieben, betrieben. In dieser Ausführungsform wird die Konzentration an humanem Serumalbumin in Urin unter Verwendung des Geräts und von Urin als der Probenlösung bestimmt.
Ähnlich wie bei der herkömmlichen Technologie wurde Urin mit einer bestimmten Konzentration an humanem Serumalbumin von nicht mehr als 0,03 mg/dl als das Verdünnungsmittel vorbereitet. Humanes Serumalbumin wird zu dem Verdünnungsmittel gegeben, um Probenlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen zuzubereiten: 3 mg/dl, 5 mg/dl, 10 mg/dl, 30 mg/dl, 50 mg/dl, 100 mg/dl, 150 mg/dl, 250 mg/dl, 300 mg/dl und 500 mg/dl.
Für die Zubereitung einer Pufferlösung für den Erhalt eines neutralen Reaktionssystems wurde, ähnlich wie in der herkömmlichen Technologie, MOPS verwendet, und seine Konzentration und der pH der Pufferlösung wurden auf die typischerweise verwendeten eingestellten. Eine MOPS-Pufferlösung mit einem pH von 7,4 mit 0,05 M MOPS und 4 Gew.-% Polyethylenglycol 6000 wurde zubereitet.
Dann wurden drei Sorten (AHSA1, AHSA2 und AHSA3) von monoklonalen Antikörpern von der Maus, die spezifisch an verschiedenen Bindungsstellen des humanen Serumalbumins binden, zubereitet. RHSA1, AHSA2 und AHSA3 sind monoklonale Antikörper, die von Zelllinien produziert werden, die bei der International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology unter den Eintragungsnummern FERM BP-8308, FERM BP-8309 und FERM BP-7938 hinterlegt wurden.
Die drei Sorten von monoklonalen Antikörpern wurden in der vorher zubereiteten MOPS-Pufferlösung in einem molaren Verhältnis von 1:1:8 (molare Konzentration von AHSA1: die von AHSA2: die von AHSA3) gelöst, um ein Reagenz (wässrige Antikörperlösung) zu ergeben. Die Gesamtkonzentration der drei Antikörper war 2,4 mg/dl.
In der gleichen Art und Weise wie in der herkömmlichen Technik wurden 9 μl der Probenlösung mit unterschiedlichen Konzentrationen an humanem Serumalbumin (0 mg/dl, 3 mg/dl, 5 mg/dl, 10 mg/dl, 30 mg/dl, 50 mg/dl, 100 mg/dl, 150 mg/dl, 250 mg/dl, 300 mg/dl und 500 mg/dl) in die Probenzelle 1 eingeführt. Nachfolgend wurden 145 μl des Reagenz' in die Probenzelle eingebracht, gefolgt durch Rühren. Es ist zu bemerken, dass die Probenlösung mit einer Konzentrationen an humanem Serumalbumin von 0 mg/dl Urin war, der oben als das Verdünnungsmittel verwendet wurde und zu dem kein humanes Serumalbumin zugegeben wurde, so dass er als eine Probe angesehen werden sollte, mit im Wesentlichen einer humanen Serumalbuminkonzentration von 0 mg/dl.
Der Computer 7 beginnt damit, Ausgabesignale aufzuzeichnen, die von dem optischen Sensor 5 zu diesem Zeitpunkt ausgesendet werden. Die 3 bis 13 zeigen Variationen in dem Ausgabesignal von dem optischen Sensor 5 über die Zeit seit dem Beginn für jede der Probenlösungen. Die horizontale Achse stellt die verstrichene Zeit nach dem Beginn der Aufzeichnung des Ausgabesignals und die vertikale Achse stellt das Ausgabesignal (hiernach als "SC90" bezeichnet) von dem optischen Sensor 5 in den 3 bis 13 dar. Nach Verstreichen von 5 Sekunden steuert der Computer 7 den Mischer 6 um 40 μl des Reagenz' (wässrige Antikörperlösung) von dem Einlass 2 in die Probenzelle 1 für etwa 3 Sekunden zu injizieren.
Während eines Zeitraums von etwa 3 Sekunden vom Beginn der Injektion des Reagenz' (d.h. von 5 Sekunden nach der Injektion der Pufferlösung) versperrt der Fluss des injizierten Reagenz den optischen Weg des im Wesentlichen parallelen Lichts 4, und stört die Intensität und die Ausbreitungsrichtung des Durchlichts, und daher werden die Ausgabesignale von dem optischen Sensor 5 weit schwanken. Der Bereich, in welchem die Ausgabesignale weit schwanken, wird durch das schraffierte Muster in den 3 bis 13 angezeigt.
In den 3 und 4, die die Korrelation zwischen der verstrichenen Zeit nach Zugabe des Reagenz und dem Ausgabesignal von dem optischen Sensor 5 für die Probenlösungen mit Konzentrationen von 0 und 3 mg/dl zeigen, stiegen die Ausgabesignale monoton an und waren auf einem bestimmten Niveau nach 300 Sekunden gesättigt.
Ungleich den vorhergehenden zwei graphischen Darstellungen stiegen in den 5 bis 13 für Probenlösungen mit Konzentrationen von 5 mg/dl, 10 mg/dl, 30 mg/dl, 50 mg/dl, 100 mg/dl, 150 mg/dl, 250 mg/dl, 300 mg/dl und 500 mg/dl die Ausgabesignale von dem optischen Sensor 5 abrupt zu einem Maximum nach Zugabe des Reagenz an und nahmen dann monoton ab. Nach 300 Sekunden war das Ausgabesignal bei einem bestimmten Niveau gesättigt.
Ein in der 14 gezeigter Graph wurde durch Auftragen der Ausgabesignale des optischen Sensors 5 nach 300 Sekunden der Probenlösungen mit Konzentrationen von 0 mg/dl, 3 mg/dl, 5 mg/dl, 10 mg/dl, 30 mg/dl, 50 mg/dl, 100 mg/dl, 150 mg/dl, 250 mg/dl, 300 mg/dl und 500 mg/dl, als dem Trübungsgrad auf der vertikalen Achse und den Konzentrationen auf der Probenlösungen auf der horizontalen Achse erzeugt. Es ist aus der 14 deutlich, dass der Konzentrationsbereich zwischen 0 bis 50 mg/dl dem A-B-Bereich der 17 entspricht, das um 100 mg/dl dem C-Bereich darin entspricht, und dass nach 150 mg/dl dem D-Bereich darin entspricht.
In der 14 kann die Konzentration durch Konstruktion einer Kalibrationskurve unter Verwendung von Trübungsgraden dem Konzentrationsbereich von 0 bis 50 mg/dl bestimmten werden. Wenn die Probenlösungen eine Konzentration von nicht weniger als etwa 100 mg/dl hat, kann jedoch aufgrund des Prozone-Phänomens die Konzentration nicht eindeutig nur aus dem Trübungsgrad nach einem bestimmten Zeitraum nach Mischen der Probenlösungen mit dem Reagenz bestimmt werden. Wenn zum Beispiel der Trübungsgrad (Ausgabesignal des optischen Sensors 5 nach 300 Sekunden) 2,4 ist, ist es schwierig zu identifizieren, ob die Konzentration der Probenlösung entweder etwa 30 mg/dl oder 150 bis 250 mg/dl ist. Es ist daher notwendig, auf irgendeine Weise zu überprüfen, dass die Probenlösung eine Konzentration an humanem Serumalbumin von nicht mehr als 100 mg/dl hat. Mit anderen Worten, ist in dem vorher beschriebenen Verfahren der messbare Konzentrationsbereich des Antigens in der Probenlösung auf nicht größer als 100 mg/dl beschränkt.
Wie vorher angegeben, kann ähnlich zu der herkömmlichen Technik die Konzentration manchmal nicht eindeutig nur aus dem Trübungsgrad nach einem bestimmten Zeitraum nach dem Mischen der Probenlösung mit dem Reagenz aufgrund des Prozone-Phänomens bestimmt werden (14). Der messbare Konzentrationsbereich des Antigens ist beschränkt.
Wie oben angegeben, wurde das vorübergehende Phänomen der Trübung nach Mischen der Probenlösung mit dem Reagenz wie folgt analysiert. Die 15 wurde zunächst durch Auftragen der Konzentrationen der Probenlösungen der 5 bis 13 auf die horizontale Achse und der maximalen Werte des Trübungsgrades (S_peak) auf der vertikalen Achse erzeugt.
Die 16 wurde dann durch Auftragen der verstrichenen Zeit, zu der der maximale Wert beobachtet wurde (T_peak), auf der horizontalen Achse und des maximalen Wertes des Trübungsgrades (S_peak) auf der vertikalen Achse erzeugt. Die Zahlen neben jedem der Punkte in der 16 zeigen die Konzentration (mg/dl) an. Es ist aus der 16 offensichtlich, dass mit dem Ansteigen der Konzentration die verstrichene Zeit, zu der der maximale Wert beobachtet wurde, kürzer wurde, und wenn die Konzentration nicht weniger als 100 mg/dl ist, ist die verstrichene Zeit asymptotisch zu etwa 18 Sekunden.
Es wurde gefunden, dass der messbare Konzentrationsbereich für das Antigen in der Probenlösung durch Nutzung der 16 zusätzlich zu jener der 14 ausgeweitet werden kann. Wenn z.B. der Trübungsgrad (Ausgabesignal von dem optischen Sensor 5 nach 300 Sekunden) 2,4 ist, ist es schwierig zu identifizieren, ob die Konzentration des Antigens in der Probenlösung entweder etwa 30 mg/dl oder 150 bis 250 mg/dl ist. Mit der Verwendung der 16 zusätzlich zu der 14, ist es jedoch möglich, die Konzentration zu identifizieren und zu bestimmen. Genauer gesagt, wenn die verstrichene Zeit, zu der der maximale Wert beobachtet wird, etwa 35 Sekunden ist, kann die Konzentration als 30 mg/dl bestimmt werden. Wenn die verstrichene Zeit, wenn der maximale Wert beobachtet wird etwa 18 Sekunden ist, kann die Konzentration als 150 bis 250 mg/dl bestimmt werden. Wie gerade beschrieben, kann die Konzentration eindeutig aus der Korrelation zwischen dem Trübungsgrad nach einem bestimmten Zeitraum nach Mischen der Probenlösung mit dem Reagenz (14) und der verstrichen Zeit, zu der der maximale Wert beobachtet wird (T_peak), bestimmt werden. In dem hier angegebenen Beispiel wurde der messbare Konzentrationsbereich für das Antigen in der Probenlösung erfolgreich ausgeweitet.
Wie vorher beschrieben, wurde die Bestimmung der Konzentration des Antigens in der Probenlösung erzielt durch Bestimmung der Korrelation zwischen dem maximalen Wert des gemessenen Trübungsgrades (S_peak) und der verstrichenen Zeit, zu der der maximale Wert beobachtet wurde (T_peak), und dann Bestimmung der Korrelation zwischen der verstrichenen Zeit T_peak und dem gemessenen Trübungsgrad S(T) nach einer bestimmten Zeitlänge T nach dem Mischen.
Wenn die Konzentration nur 0 oder 3 mg/dl ist, existiert jedoch der maximale Wert für den gemessenen Trübungsgrad nicht. Ein derartiger Fall wird als in dem A-B-Bereich (d.h. der Prozone) der 17 angenommen. Daher kann die Konzentration eindeutig nur aus der gemessenen Trübung S(T) nach einem bestimmten Zeitraum T bestimmt werden.
Hierbei ist es bevorzugt, dass die Zeit T die Beziehung T > T_peak erfüllt. Wenn die Beziehung erfüllt ist, wird die Reproduzierbarkeit verbessert. Außerdem ist die Zeit T die Zeit, zu der S gesättigt ist. Andererseits ist es ebenfalls bevorzugt, dass die Zeit T die Beziehung T < T_peak erfüllt. Wenn diese Beziehung erfüllt ist, kann eine Konzentration in einer kürzeren Messzeit bestimmt werden.
In dieser Ausführungsform wurde der Trübungsgrad durch den Nachweis von Streulicht gemessen, aber kann ebenfalls durch den Nachweis von Durchlicht gemessen werden. In diesem Fall sollte S_peak der minimale Wert der Durchlichtintensität sein, und T_peak sollte die verstrichene Zeit sein, zu der der minimale Wert beobachtet wird, um den gleichen Effekt wie vorher zu erzielen, da die Trübung umgekehrt zu der Intensität des Durchlichts variiert.
Außerdem ist es ebenfalls möglich, die Verlässlichkeit der Messung durch den Nachweis sowohl des Streulichts als auch des Durchlichts und Vergleich der erhaltenen Ergebnisse zu verbessern.
AUSFÜHRUNGSFORM 2
Es wird eine Beschreibung einer zweiten Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die 15 gegeben. In dieser Ausführungsform wird ein Beispiel zur Bestimmung der Konzentration unter Verwendung der 15 und 16 gezeigt.
Wenn z.B. der maximale Wert des Trübungsgrades 5,5 ist, ist es schwierig aus der 15 allein zu identifizieren, ob die Probenlösung eine Konzentration von entweder etwa 30 mg/dl oder 150 bis 250 mg/dl hat, aber durch die zusätzlich Verwendung der 16 zu der 15 kann die Konzentration identifiziert und bestimmt werden. Genauer gesagt, wenn die verstrichene Zeit, zu der der maximale Wert beobachtet wird (T_peak) in diesem Fall etwa 35 Sekunden ist, kann die Konzentration als 30 mg/dl bestimmt werden. Wenn die verstrichene Zeit, zu der der maximale Wert beobachtet wird (T_peak) etwa 18 Sekunden ist, kann die Konzentration als 150 bis 250 mg/dl bestimmt werden.
Wie gerade beschrieben, kann die Konzentration eindeutig aus der Korrelation zwischen dem maximalen Wert (S_peak) des Trübungsgrades nach einem bestimmten Zeitraum nach Mischen der Probenlösung mit dem Reagenz (15) und der verstrichenen Zeit, zu der der maximale Wert beobachtet wird (T_peak). bestimmt werden. In einem hier angegebenen Beispiel wurde der messbare Konzentrationsbereich für das Antigen in der Probenlösung erfolgreich auf 500 mg/dl ausgeweitet.
Diese Ausführungsform ist vorteilhafter als die AUSFÜHRUNGSFORM 1 bei der Beschleunigung der Messung, da die Konzentration unmittelbar bestimmt werden kann, nachdem der maximale Wert des Trübungsgrades nachgewiesen wird. In dem Fall jedoch, dass die Konzentration so niedrig ist, dass der maximale Wert nicht vorhanden ist, sollte die Konzentration durch den Trübungsgrad nach einem bestimmten Zeitraum bestimmt werden. Eine enorme Wirkung kann unter Verwendung dieser Ausführungsform zusammen mit AUSFÜHRUNGSFORM 1 erhalten werden.
AUSFÜHRUNGSFORM 3
Es wird eine Beschreibung einer dritten Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung in Bezugnahme auf die 16 gegeben. Wie aus der 16 ersichtlich, kann, wenn die verstrichene Zeit zu der der maximale Wert beobachtet wird (T_peak) nicht weniger als ein gegebener Wert T₀ (T₀ ≠ 18 Sekunden in der 16) ist die Konzentration eindeutig nur aus T_peak bestimmt werden. In Zusammenfassung, wenn die verstrichene Zeit (T_peak) nicht größer als ein gegebener Wert T₀ ist, kann die Konzentration als gleich oder größer als ein gegebener Wert Co (Co ist 100 mg/dl in der 16) bestimmt werden. Umgekehrt kann, wenn die verstrichene Zeit (T_peak) nicht weniger als ein angegebener Wert T₀ ist, die Konzentration aus der 16 gelesen werden, mit anderen Worten, sie kann gemäß T_peak in der 16 bestimmt werden. Diese Ausführungsform ist ebenfalls vorteilhafter als AUSFÜHRUNGSFORM 1 bei der Beschleunigung der Messung, da die Konzentration unmittelbar nach dem der maximale Wert des Trübungsgrads nachgewiesen wird, bestimmt werden kann.
In dem Fall, wo die Konzentration so niedrig ist, dass der maximale Wert nicht vorhanden ist, sollte jedoch die Konzentration durch den Trübungsgrad nach einem bestimmten Zeitraum bestimmt werden. Eine enorme Wirkung kann durch die Verwendung dieser Ausführungsform zusammen AUSFÜHRUNGSFORM 1 erzielt werden.
AUSFÜHRUNGSFORM 4
Es wird eine Beschreibung einer vierten Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die 23 gegeben. Die 23 zeigt eine weitere Ausführungsform eines Geräts für den turbidimetrischen Immuntest, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Die durch die Bezugszeichen 1 bis 11 angegebenen Strukturelemente in der 23 sind die gleichen wie die durch die Bezugszeichen 1 bis 11 in der 1 angegebenen. Das Bezugszeichen 12 ist ein Differentiator für die Differenzierung der Ausgabesignale aus einem optischen Sensor 5. Die Ausgabesignale aus dem Differentiator werden durch einen Computer 7 analysiert. Dies Gerät kann den maximalen Wert mit hoher Genauigkeit und Geschwindigkeit erkennen, weil der maximale Wert festgesetzt wird wenn das Zeichen des Ausgabesignals des Differentiators 12 sich umkehrt.
Wie vorher beschrieben, ist es gemäß dieser Ausführungsform möglich die Konzentration des Antigens mit hoher Geschwindigkeit zu bestimmen, wenn eine Probenlösung mit einem Antigen in einer geringen Konzentration verwendet wird, weil ein geringerer maximaler Wert schnell erkannt werden kann.
Damit das Ausgabesignal des optischen Sensors 5, das die Intensität des Streulichts bezeichnet durch SC90 darstellt, seinen maximalen Wert wie vorher beschrieben, zeigen kann, sollte der durch die spezifische Bindung zwischen dem Antigen und den Antikörpern erzeugte Antigene/Antikörper-Komplex eine höhere Teilchengröße als eine gegebene Teilchengröße haben.
Dies ist eng mit der Tatsache verbunden, dass die Intensität des Streulichts in Abhängigkeit von der Ausbreitungsrichtung des Streulichts variiert. Wenn die Teilchengröße der in der Lösung suspendierten Teilchen verglichen zu der Wellenlänge des anregenden Lichts, welches dem im Wesentlichen parallelen Licht 4 entspricht, gering genug ist, genauer gesagt, wenn die Teilchengröße nicht größer als 1/20 der Wellenlänge ist, hängt die Verteilung der Streulichtintensität nicht von seiner Ausbreitungsrichtung ab.
Mit Ansteigen der Teilchengröße steigt die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts an. Das vorwärts gestreute Licht meint hierin Licht, das in Richtungen gestreut wird, die nicht größer als 90 Grad zu der Ausbreitungsrichtung des anregenden Lichts sind. Ebenfalls bedeutet ein Anstieg in der Teilchengröße des Antigen-Antikörper-Komplexes eine geringere Teilchenkonzentration.
Aus dem Vorhergehenden ist klar, dass SC90 einmal ansteigt, wenn der Antigen-Antikörper-Komplex mit dem Voranschreiten der Antigen-Antikörper-Reaktion wächst. Wenn der Antigen-Antikörper-Komplex weiter wächst und seine Teilchengröße groß wird, sinkt jedoch SC90, da die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts ansteigt und die Teilchengröße sinkt, was bedeutet, dass der maximale Wert beobacht werden kann.
Dieses Phänomen wird unter Bezugnahme auf die 24 beschrieben. Die vertikale Achse links stellt die Intensität des Streulichts dar, das sich in einem Winkel von 45 Grad zu der Ausbreitungsrichtung des im Wesentlichen parallelen Lichts 4 ausbreitet, in dem in der Lösung erzeugten Streulichts.
Dies ist das Ausgabesignal, das von dem optischen Sensor 5 ausgesendet wird, wenn der optische Sensor 5 der 1 so angeordnet ist, dass er das Streulicht nachweisen kann, das sich in einem Winkel von 45 Grad zu der Ausbreitungsrichtung des im Wesentlichen parallelen Lichts 4 des in der Lösung erzeugten Streulichts ausbreitet, welches hiernach als SC45 bezeichnet wird. Deas SC45 in dem Fall einer Konzentration an Albumin von 10 mg/dl wird in der 24 durch eine gepunktete Linie angezeigt.
Andererseits wird das Signal für SC90 in dem vorher angegebenen Fall durch eine durchgezogene Linie in der 24 angegeben, welche der 6 entspricht. Die Bedingungen für die Messung der gepunkteten und durchgezogenen Linien sind die gleichen wie die für die 6. Nebenbei bemerkt sind die absoluten Werte der vertikalen Achse, die SC45 darstellt, willkürlich und entsprechen nicht der 6. Es ist aus der 24 offensichtlich, dass SC45 kontinuierlich für 300 Sekunden ansteigt, was anzeigt, dass der Antigen-Antikörper-Komplex weiter wächst.
In diesem Fall, in dem das Gerät der 1 und die vorher beschriebene Antikörper-Kombination verwendet werden, war die Teilchengröße nicht weniger als 25 μm, wenn der maximale Wert für SC90 beobachtet wurde.
In der vorhergehenden AUSFÜHRUNGSFORM 3 wurde ein Graph, der die Korrelation zwischen dem Scheitelpunkt (Peak) für SC90 und der verstrichenen Zeit angibt, in der 16 gezeigt, aber es ist ebenfalls möglich, die Konzentration eindeutig nur aus T_peak unter Verwendung eines Graphen zu bestimmen, der die Korrelation zwischen T_peak und der in der 25 gezeigten Konzentration zeigt.
Der turbidimetrische Immuntest gemäß der vorliegenden Erfindung kann geeigneterweise für analytische Untersuchungen von Urin verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, den messbaren Konzentrationsbereich für ein in einer Probenlösung enthaltenes Antigen auszuweiten, ohne einen Schritt der Verdünnung oder Ähnliches. Die praktische Wirkung wird enorm sein und die Effizienz von Messung und Tests als auch Laboreinsparungen können verwirklicht werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung in Bezug auf die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, ist zu verstehen, dass eine derartige Offenbarung nicht als beschränkend zu interpretieren ist. Verschiedene Veränderungen und Modifikationen werden ohne Zweifel für die Fachleute offensichtlich sein, an welche sich die vorliegende Erfindung richtet, nachdem sie die vorhergehende Offenbarung gelesen haben. Demgemäß ist beabsichtigt, dass die beigefügten Ansprüche so interpretiert werden, dass sie alle Veränderungen und Modifikationen abdecken, welche in den Umfang der Erfindung fallen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Ausweitung des messbaren Konzentrationsbereichs für ein Antigen in einer Probenlösung erzielt werden, ohne einen Schritt der Verdünnung oder Ähnliches. Die Konzentration eines in einer Probenlösung enthaltenen Antigens wird aus dem maximalen Wert und/oder dem minimalen Wert des Trübungsgrades nachgewiesen, der bei der Beobachtung des vorübergehenden Trübungsphänomens, der verstrichenen Zeit, zu der der maximale und/oder minimale Wert beobachtet wird, und dem Trübungsgrad nachgewiesen wird.

Claims

Turbidimetrischer Immuntest für die Quantifizierung einer Konzentration eines Analyts in einer Probenlösung durch Mischung der Probenlösung, die ein Antigen als das Analyt enthält, mit einem Reagenz, das einen Antikörper enthält, der spezifisch an das Analyt bindet, und Nachweis von Signalen, die die Trübung darstellen, die durch einen Antigen-Antikörper-Komplex verursacht wird, der durch die spezifische Bindungsreaktion erzeugt wird, und wobei der turbidimetrische Immuntest die Schritte umfasst: (1) Mischen der Probenlösung und des Reagenz', um eine gemischte Lösung zu ergeben; (2) Messen des Trübungsgrades der gemischten Lösung zu einzelnen Zeitpunkten oder fortlaufend; (3) Bestimmen einer Korrelation zwischen den gemessenen Trübungsgraden und der nach dem Mischen verstrichenen Zeit; (4) Nachweisen des maximalen Wertes der gemessenen Trübungsgrade (S_peak) auf der Grundlage der Korrelation, um die verstrichene Zeit zu bestimmen zu der S_peak beobachtet wird (T_peak), in dem Fall, dass S_peak in der Korrelation beobachtet wird; und (5) Bestimmen der Konzentration des Analyts aus einer Korrelation zwischen dem S_peak und der T_peak wobei der Schritt (5) den Schritt des Vergleichs zwischen der in dem Schritt (4) bestimmten T_peak mit der T_peak an dem maximalen Wert von S_peak in der Korrelation zwischen dem S_peak und der T_peak umfasst.
Turbidimetrischer Immuntest nach Anspruch 1, wobei der Trübungsgrad in dem Schritt (2) durch Streutlicht gemessen wird, und der Maximalwert in dem Schritt (4) nachgewiesen wird.
Turbidimetrischer Immuntest nach Anspruch 1, wobei, wenn die in Schritt (4) nachgewiesene T_peak größer als die T_peak bei dem maximalen Wert von dem S_peak in der Korrelation zwischen dem S_peak und der T_peak ist, die Konzentration des Analyts in dem Schritt (5) aus dem gemessenen Trübungsgrad S(T) nach einer bestimmten Zeitlänge T nach dem Mischen unter Verwendung einer Korrelation zwischen der Konzentration und dem S(T) bestimmt wird.
Turbidimetrischer Immuntest nach Anspruch 1, wobei, wenn die in dem Schritt (4) bestimmte T_peak größer als T_peak bei dem maximalen Wert von dem S_peak in der Korrelation zwischen dem S_peak und der T_peak ist, die Konzentration des Analyts in dem Schritt (5) von dem S_peak, nachgewiesen in dem Schritt (4), unter Verwendung einer Korrelation zwischen der Konzentration und dem S_peak bestimmt wird.
Turbidimetrischer Immuntest nach Anspruch 1, wobei, wenn die in dem Schritt (4) bestimmte T_peak größer als die T_peak bei dem maximalen Wert von dem S_peak in der Korrelation zwischen dem S_peak und der T_peak ist, die Konzentration des Analyts in dem Schritt (5) aus der in dem Schritt (4) bestimmten T_peak unter Verwendung einer Korrelation zwischen der Konzentration und dem T_peak bestimmt wird.
Turbidimetrischer Immuntest nach Anspruch 1, wobei sowohl S_peak als auch die T_peak wenn der S_peak beobachtet wird, bestimmt werden durch: Bestimmung einer Differenzialgleichung dS(T)/dT des gemessenen Trübungsgrades S(T) nach einer bestimmten Zeitlänge T nach dem Mischen; und Festsetzen des Punktes an dem die Polarität der Differenzialgleichung umgekehrt wird als die T_peak und eines gemessenen Trübungsgrads S(T) an dem Zeitpunkt als Speak
Turbidimetrischer Immuntest nach Anspruch 1, wobei, wenn die in dem Schritt (4) bestimmte T_peak gleich oder kleiner als T_peak bei dem maximalen Wert des S_peak in der Korrelation zwischen dem S_peak und der T_peak ist, die Konzentration des in der Probenlösung enthaltenen Analyts als gleich oder größer als eine Konzentration des Analyts an dem maximalen Wert des S_peak in einer Korrelation zwischen dem S_peak der T_peak und der Konzentration bewertet wird.
Turbidimetrischer Immuntest nach Anspruch 1, wobei der Analyt humanes Serumalbumin ist.
Turbidimetrischer Immuntest nach Anspruch 8, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, das Reagenz wenigstens zwei monoklonale Antikörper enthält, und diese wenigstens zwei monoklonalen Antikörper spezifisch an verschiedenen Bindungsstellen des humanen Serumalbumins binden.
Turbidimetrischer Immuntest nach Anspruch 9, wobei die Probenlösung Urin ist.
Verwendung eines Geräts für einen turbidimetrischen Immuntest für die Durchführung des turbidimetrischen Immuntest nach Anspruch 1, wobei das Gerät umfasst: eine Lichtquelle für das Richten von Licht auf die Probenlösung; eine Probenzelle für die Aufnahme der Probenlösung, so dass das Licht durch die Probenlösung dringen kann, und für das Mischen der Probenlösung mit einem Reagenz, das einen Antikörper enthält; einen ersten optischen Sensor für den Nachweis von Durchlicht, das durch die Probenlösung dringt, und/oder einem zweiten optischen Sensor für den Nachweis von Streulicht, das durch die Ausbreitung des Lichts durch die Probenlösung erzeugt wird; und einen Computer für die Analyse von Ausgabesignalen, die von dem ersten optischen Sensor und/oder dem zweiten optischen Sensor ausgesendet werden, wobei die Konzentration eines Antigens, das in der Probenlösung enthalten ist, aus den Ausgabesignalen bestimmt wird, die von dem ersten optischen Sensor und/oder dem zweiten optischen Sensor nach dem Mischen der Lösung mit dem Reagenz ausgesendet werden.
Verwendung eines Gerätes für einen turbidimetrischen Immuntest für die Durchführung des turbidimetrischen Immuntest nach Anspruch 1, wobei das Gerät umfasst: eine Lichtquelle für das Richten von Licht auf die Probenlösung; eine Probenzelle für die Aufnahme der Probenlösung, so dass das Licht durch die Probenlösung dringt, und für das Mischen der Probenlösung mit einem Reagenz, das einen Antikörper enthält; einen ersten optischen Sensor für den Nachweis von Durchlicht, das durch die Probenlösung tritt und/oder einen zweiten optischen Sensor für den Nachweis von Streulicht, das während der Ausbreitung des Lichts durch die Probenlösung erzeugt wird; einen ersten Differentiator für die Differenzierung der Ausgabesignale, die von dem ersten optischen Sensor ausgesandt werden, und/oder einem zweiten Differentiator für die Differenzierung von Ausgabesignalen, die von dem zweiten optischen Sensor ausgesandt werden; und einen Computer für die Analyse der Ausgabesignale von dem ersten Differentiator und/oder dem zweiten Differentiator, wobei die Konzentration eines in der Probenlösung enthaltenen Antigens aus den Ausgabesignalen ermittelt wird, die von dem ersten Differentiator und/oder dem zweiten Differentiator nach dem Mischen der Lösung mit dem Reagenz ausgesendet werden.