CN105301257A - 一种尿微量白蛋白检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种尿微量白蛋白(mAlb)检测方法，所述检测方法基于胶乳增强免疫比浊法，为液体双试剂，包括试剂R1与R2，所述试剂R1为反应剂，试剂R2为含有白蛋白免疫胶乳颗粒的溶液，其特点在于应用化学方法交联，通过水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使羊抗人白蛋白抗体(也称羊抗人mAlb抗体)与羧化聚苯乙烯胶乳共价交联，形成mAlb抗体胶乳试剂。本试剂灵敏度高，特异性强，试剂配制简单，值得进一步推广使用。

Description

一种尿微量白蛋白检测方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域，提供一种尿微量白蛋白(mAlb)的定量检测方法。

背景技术：

微量白蛋白尿是指在尿中出现微量白蛋白。白蛋白是一种血液中的正常蛋白质，但在生理条件下尿液中仅出现极少量白蛋白。微量白蛋白尿反映肾脏异常渗漏蛋白质。尿微量白蛋白的增高多见于糖尿病肾病、高血压、妊娠子痫前期，是肾损伤的早期敏感指标。无论哪种疾病引起的尿微量白蛋白都是因起始原因不同造成的肾脏固有细胞的损伤，使肾脏固有细胞的结构发生改变，功能随结构的变化而变化，在尿液中的体现。当发现尿微量白蛋白在20mg/L-200mg/L范围内，尿常规尿蛋白的显示为阴性(-)或(+-)，就属于微量白蛋白尿，说明肾脏已经损伤。而当尿中微量白蛋白超过200mg/L时，尿常规测试尿蛋白阳性(+)-(+++)，此时证明机体已有大量白蛋白漏出，可能出现低蛋白血症，肾病发展离不可逆期只有一步之遥，如果不及时进行医治，就会进入尿毒症期。临床检查内容一般包括免疫功能障碍评估，炎症状态监测，心血管风险评估和类风湿性关节炎及链球菌感染等各个方面。

微量白蛋白尿也是整个血管系统改变的征象，并可认为是动脉病变的“窗口”，因为它是肾脏和心血管系统改变的早期指征。

尿微量白蛋白可通过免疫浊度法，免疫荧光法，放射免疫法，酶免疫法等多种方法进行测定。放射免疫法敏感度高，特异性强，但具有放射性污染，试剂保存期短等缺点。国内目前采用最多的尿微量白蛋白检测方法仍为ELISA法，但酶标法的操作步骤多，故重复性较差。白蛋白致敏羧化聚苯乙烯胶乳，建立免疫胶乳凝集抑制试验以测定尿微量白蛋白，具有快速、特异、简便、价廉的优点。

发明内容：

本发明的目的在于，通过化学交联法大量制备mAlb抗体胶乳试剂，以提高尿微量白蛋白检测效率，增强检测准确性。

本发明的技术方案：应用化学方法交联，通过水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使羊抗人mAlb抗体与羧化聚苯乙烯胶乳共价交联，制备mAlb抗体胶乳试剂。具体操作如下：

mAlb抗体胶乳试剂的制备：

1.相关缓冲液的准备

0.01mol/L，PH7.2PBS缓冲液的准备：取800ml去离子水溶解8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.44g磷酸一氢钠和0.24g磷酸二氢钾，0.1％盐酸调PH至7.2，用去离子水定容至1L，15psi湿热灭菌20min。

0.01mol/L，PH7.6PBS缓冲液的准备：取800ml去离子水溶解8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.44g磷酸一氢钠和0.24g磷酸二氢钾，0.1％盐酸调PH至7.6，用去离子水定容至1L，15psi湿热灭菌20min。

2.mAlb抗体胶乳试剂的配制

原料：在粒径为200nm，浓度为10％羧化聚苯乙烯胶乳10ml中，加入0.01mol/L，PH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)10ml，NHS20mg与EDC60mg，室温搅动30min后，37℃恒温水浴反应1小时，2-8℃离心(11000rpm，30min)，倾去上清液，用0.01mol/L，PH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)恢复至原体积。加入500mg/L羊抗人mAlb抗体溶液2.0ml，NHS30mg与EDC120mg，室温搅动30min后，37℃恒温水浴反应2小时，加入0.4mol/L、PH8.2甘氨酸溶液2.0ml反应20min进行淬灭。2-8℃离心(11000rpm，30min)，倾去上清液，用0.01mol/L，PH7.6磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后，用同样的缓冲液配成浓度为1％胶乳试剂，以0.1％(重量体积比)叠氮钠溶液防腐，即为mAlb抗体胶乳试剂。

本检测方法的原理为将羊抗人mAlb抗体交联于胶乳微粒上，与待测尿液样品中的微量白蛋白发生抗原-抗体反应，引起微粒凝集，形成一定的浊度，在340nm波长下，通过同样处理的校准品对照，定量检测出样品中微量白蛋白的含量。

附图说明：

图1：分别采用本发明试剂与市售试剂A，采用奥林巴斯5400全自动生化分析仪，对50份尿液样本(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，并对测定值进行相关分析。其中X轴表示的是本发明试剂的测定值，Y轴表示的是市售试剂A的测定值。相关系数：r²＝0.9960，线性方程为：y＝1.005x+0.041。

具体实施方式：

实施例

将本发明方法配制成试剂，进行与市售试剂进行性能比较：

试剂为双试剂，包括试剂R1与R2，具体成分如下：

尿微量白蛋白检测试剂的使用：

1)检测仪器：具有340nm波长、37℃恒温装置的生化分析仪。

2)待测样本：尿液，2-8℃可稳定一天，最好为晨尿，离心(3000rpm/min)10分钟待用。

3)测定基本参数：

主波长	340nm	反应温度	37℃
				分析类型	终点法	试剂样品比	20∶1
反应时间	10分钟	校准类型	Logit-4P/Spline

4)具体检测程序：

5)计算结果：样品中mAlb(mg/L)＝Cs×ΔA_T/ΔA_s

式中：ΔA_T以空白管吸光度为对照的样品管吸光度；

ΔA_s以空白管吸光度为对照的校准管吸光度；

Cs校准液中mAlb的浓度

6)参考值范围：0-22.5mg/L。

7)精密度：批内CV≤5％；批间相对极差≤10％。

8)准确度：相对偏差＜10％。

9)线性范围：应达到200mg/L，相关系数r≥0.990。

本发明试剂与市售试剂A的性能指标比较：

1)精密度测定：同一样品连续抽取20次进行测定，计算测定值均数、标准差和变异系数， $\mathrm{CV}=\frac{\mathrm{SD}}{\stackrel{\‾}{X}}$ $\×100\%$

表1精密度检测结果

变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的。表1中本发明试剂的CV值小于市售试剂A，表明本发明方法的精密度优于市售试剂A。

2)线性测定：分别采用本发明试剂与市售试剂A，采用奥林巴斯5400全自动生化分析仪，对50份尿液样本(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，并对测定值进行相关分析(结果见图1，X轴表示的是本发明试剂的测定值，Y轴表示的是市售试剂A的测定值)。相关系数：r²＝0.9960，线性方程为：y＝1.005x+0.041，结果表明本试剂与市售试剂相关性良好。

表2线性相关检测结果

3)稳定性测定：将本发明检测试剂盒分别放置在室温和4℃冰箱，以新鲜配制的15mg/L白蛋白标准品替代样品，每隔1个月测定1次，记录出现凝集所需时间，结果见表3。结果表明，试剂盒在4℃冰箱放置至少7个月以上不会有明显活性丧失，但不宜在室温存放。

表3稳定性检测结果

室温下

出现凝集的时间(min)

4℃下

出现凝集的时间(min)

新配制	1	新配制	1
				存放1个月	2	存放1个月	1
存放2个月	不凝集	存放2个月	1
				存放3个月	不凝集	存放3个月	1
存放4个月	不凝集	存放4个月	1
				存放5个月	不凝集	存放5个月	1
存放6个月	不凝集	存放6个月	1
				存放7个月	不凝集	存放7个月	1

4)特异性测定：选取4种干扰蛋白和葡萄糖进行干扰实验测定，均无抑制效果，表明该试剂盒有良好特异性，结果如表4所示：

表4特异性检测结果

Claims (7)

1.本发明提供一种尿微量白蛋白(mAlb)检测方法，所述检测方法基于胶乳增强免疫比浊法，为液体双试剂，包括试剂R1与R2，所述试剂R1为反应剂，试剂R2为含有白蛋白免疫胶乳颗粒的溶液，其特点在于应用化学方法交联，通过水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使羊抗人白蛋白抗体(也称羊抗人mAlb抗体)与羧化聚苯乙烯胶乳共价交联，制备mAlb抗体胶乳试剂。

2.根据权利要求1所述化学交联方法制备mAlb抗体胶乳试剂，其特征在于所用的羧化聚苯乙烯胶乳粒径为200nm。

3.根据权利要求1所述化学交联方法制备mAlb抗体胶乳试剂，其特征在于羧化聚苯乙烯胶乳与羊抗人mAlb抗体共价交联过程中分别添加水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

4.根据权利要求1所述的化学交联法制备mAlb抗体胶乳试剂，其特征在于包括如下步骤：

1)配制0.01mol/L，PH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，0.01mol/L，PH7.6磷酸盐缓冲液(PBS)。

2)在含有EDC与NHS的缓冲液中，将羊抗人mAlb抗体交联于胶乳微粒上，获得mAlb抗体胶乳试剂。

5.根据权利要求4中步骤2)所述，其特征在于室温反应要求温度为20-25℃，恒温水浴要求温度为37℃。

6.根据权利要求3中步骤2)所述，其特征在mAlb抗体胶乳试剂以0.1％(重量体积比)叠氮钠溶液为防腐剂。

7.根据权利要求1所述，其特征在于样品中mAlb的计算公式为：

样品中mAlb(mg/L)＝Cs×ΔA_T/ΔA_S

式中：ΔA_T以空白管吸光度为对照的样品管吸光度；

ΔA_S以空白管吸光度为对照的校准管吸光度；

Cs校准液中mAlb的浓度。