DE2849708A1

DE2849708A1 - Verfahren zur feststellung und quantitativen bestimmung biologisch wichtiger substanzen

Info

Publication number: DE2849708A1
Application number: DE19782849708
Authority: DE
Inventors: John Stephen Alexander; Anthony Keith Campbell; James Stuart Woodhead
Original assignee: Welsh National School of Medicine
Current assignee: Welsh National School of Medicine
Priority date: 1977-11-17
Filing date: 1978-11-16
Publication date: 1979-05-23
Also published as: SE7811630L; GB2095830B; FR2409516B1; CH640061A5; US4478817A; DE2849708C2; FR2409516A1; GB2095830A; CH645725A5; CA1113392A; DE2858792C2

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft Verfahren und eine Vorrichtung zur Lokalisierung und Analyse von Proteinen und anderen biologisch wichtigen Substanzen in der Weise, daß man sie an ein anderes Molekül oder Moleküle bindet, die eine Reaktion unter Emission von.Licht eingehen können. Die gebundene Substanz, die vorliegend als "Lumineszenzreagenz" bezeichnet wird, kann für verschiedene biologische Untersuchungen angewandt werden, wie:

a) Immuno- und Proteinbindungsuntersuchungen

b) für die Umsetzung von Substanzen in vivo und in vitro

c) für die histologische Lokalisierung von Substanzen

d) zur Feststellung von Substanzen, die einer Wiederverteilung in biologischen Systemen unterliegen, oder für Trennverfahren in vitro, z.B. für Zentrifugier- und Chromatographierverfahren sowie für die Elektrophorese.

Der Ausdruck "Lumineszenzreagenz" beschreibt einen Komplex zwischen einem Molekül, das normalerweise keine Lumineszenzreaktion einzugehen vermag, und einem anderen Molekül, das eine solche Reaktion eingehen kann. Eine Lumineszenzreaktion ist eine unter Emission von Licht vor sich gehende Reaktion. Die Menge des "Lumxneszenzreagenzes" wird durch Messung des emittierten Lichts festgestellt, nachdem man die entsprechenden Bedingungen für den Verlauf der Lumineszenzreaktion eingestellt hat. Das Licht kann intensiv oder ganz schwach sein. Seine Ausstrahlung

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muß aber genügend lang dauern, um eine Feststellung und Messung des Lichts zu ermöglichen. Die Lumineszenz ist klar

von der Fluoreszenz und der Phosphoreszenz zu unterscheiden.

Eine Lumineszenzreaktion findet normalerweise zwischen mindestens zwei Molekülen (S und L) mit oder ohne anderen Reaktionsteilnehmern, Cofaktoren, Katalysatoren (D) oder unter dem Einfluß eines physikalischen Auslösemittels statt. L ist die Substanz, die Licht erzeugt, wie Luminol. S ist die Substanz, die sich mit L umsetzt, um einen Anregungszustand zu ergeben, z.B. mit Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid. D stellt, wenn es vorhanden ist, einen Cofaktor dar und/oder einen Katalysator oder ein Auslösemittel, wie ein Enzym, eine Luciferase oder Kaliumferricyanid. Die Umsetzung zwischen L und S führt zur Umwandlung von L in ein angeregtes Molekül L,und die Rückführung dieses angeregten Moleküls in einen nicht angeregten Zustand verursacht die Emission eines Photons. Die Umsetzung zwischen L und S und der Rückgang von L* in den nicht angeregten Zustand kann spontan vor sich gehen,oder die Gegenwart eines Cofaktors oder eines Katalysators D oder eines physikalischen Auslösemittels, wie Temperatur oder Strahlung erfordern. Ein Beispiel für eine solche Reaktion ist die Oxydation von Luminol durch H₂O₂-

Die Katalysatoren und Cofaktoren stellen wie hier oft anorganische Verbindungen dar, können jedoch auch aus biologischen

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Materialien extrahiert sein, wie die Enzymperoxidase, die die Lumineszenzreaktion von Luminol katalysiert.

Die Bildung und Feststellung des "Lumineszenzreagenzes" kann durch die folgenden allgemeinen Reaktionen beschrieben werden:

Die Synthese des "Lumineszenzreagenzes" läßt sich veranschaulichen durch:

A + B + andere Reagenzien und/oder Katalysatoren ^*

AB + andere Produkte

Hierbei bedeutet A die Substanz, die normalerweise nicht zu einer Lumineszenzreaktion fähig ist, B die Substanz, die eine Lumineszenzreaktion eingehen kann,

AB das "Lumineszenzreagenz".

A ist normalerweise, aber nicht immer die interessierende Substanz, die ermittelt oder analysiert werden soll. Sie kann von biologischer oder chemischer Beschaffenheit sein. Zum Beispiel kann sie aus einem Protein, einem Antikörper, einem Antigen, Hapten, einem Hormon, einem Arzneimittel oder einer anderen Substanz von pharmakologischem Interesse bestehen, ein Stoffwechselprodukt, Nukleinsäure oder generell irgendein Makromolekül oder ein nicht polymeres Molekül sein.

B ist normalerweise aber nicht immer die bindende Substanz und hinsichtlich der Lumineszenz und anderen möglichen

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Reaktionen, die das Verfahren beeinträchtigen könnten, im wesentlichen beständig. B kann aus L und/oder S und/oder D ' bestehen und im allgemeinen eine oder mehrere beständige Komponenten eines Mehrfachkomponentenlumineszenzreaqenzes umfassen. Gewöhnlich wird bei der synthetischen Herstellung von AB eine oder mehrere der wesentlichen Komponenten oder Bestandteile weggelassen, so daß die Lumineszenzreaktion durch Zugabe der fehLenden Komponente (n) ausgelöst werden kann.

In einigen Fällen muß nur die Substanz A festgestellt, gemessen oder analysiert werden. Die beständige bindende Substanz B wird dann gewöhnlich in einer frühen Stufe des Verfahrens zu A gegeben, während man die übrige (n) Komponente (n) des Lumineszenzreagenzes erst in dem Augenblick zugibt, wenn das emittierte Licht wahrgenommen werden soll.

In anderen Fällen soll die Substanz A mit einer anderen Substanz C umgesetzt werden, wobei sowohl A oder C von Interesse sein können und ermittelt oder analysiert werden sollen. Die Umsetzung kann dann wie folgt veranschaulicht werden:

nAB + C s> C (AB) η

wobei C die mit A reagierende, normalerweise kein Licht emittierende Substanz ist,

η = die Anzahl der Moleküle an AB, die sich mit C vereinigt. Für die Analyse wird C(AB)η oder die Abnahme von nAB aus der anfänglichen Anzahl von AB Molekülen gemessen.

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Zur endgültigen Bestimmung des "Lumineszenzreagenzes" kann die Umsetzung wie folgt geschrieben werden:

AB + weggelassene Komponente (L, S oder D) oder physikalisches

Auslösemittel ^ Produkt + Licht.

Die Menge emittiertes Licht (Lumineszenz) kann in direkte Beziehung zu der dem Reaktionsgemisch zugefügten Konzentration an AB gesetzt werden.

Das zur Zeit populärste Mittel zur Markierung von Proteinen

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ist ein radioaktives Isotop, wie I. Bei dieser Methode wird die Menge der AB-Umsetzung mit C durch Messung der Radioaktivität ermittelt. Radioaktive Reagenzien haben drei Hauptnachteile. Erstens, das Verfahren der Markierung erfordert die Anwendung stark radioaktiver und damit potentiell gefährlicher Reagenzien. Zweitens, die Lebensdauer der radioaktiv markierten Substanz ist oft verhältnismäßig kurz, nicht nur, weil das radioaktive Isotop kontinuierlich zerfällt, sondern auch, weil die radioaktiv markierten Proteine oft unbeständig sind. Drittens, es ist oft schwierig, Proteine in ausreichender Weise zu markieren, um sie zu einem empfindlichen und rasch feststellbaren Reagenz zu machen. Die Lumineszenzmessung ist nicht nur stark empfindlich, sondern läßt sich auch sehr rasch durchführen. Die Messung erfordert nur Sekunden im Gegensatz zur Messung der Radioaktivität, die gewöhnlich mehrere Minuten erfordert. Die covalente oder nicht covalente Bindung von Substanzen, die normalerweise nicht zu einer Lumineszenzreaktion befähigt sind, an Substanzen, die eine solche Reaktion eingehen können, liefert ein Reagenz, das

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schnell in sehr geringen Mengen gemessen werden kann.

Eine Substanz, die zur Herstellung eines "Lumineszenzreagenzes" und damit zur Markierung verwendet werden kann, sollte vorzugsweise vier Erfordernisse erfüllen:

a) Sie sollte befähigt sein, eine Lumineszenzreaktion einzugehen,

b) sie sollte sich unter Bildung eines Reagenzes, das verhältnismäßig beständig ist, an die Substanz binden lassen, die normalerweise kein Licht emittiert,

c) sie sollte nach der Bildung des Reagenzes noch fähig sein, eine Lumineszenzreaktion einzugehen,

d) sie sollte die Eigenschaften des Moleküls, an das sie gebunden ist, nicht wesentlich ändern.

Generell ausgedrückt, betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Ermittlung, Analyse, quantitativen Feststellung oder Lokalisierung einer Substanz, bei dem die Substanz oder eine assoziierte Substanz durch Bindung an eine oder mehrere Komponenten, die eine Lumineszenzreaktion eingehen können, markiert wird, worauf die Lumineszenzreaktion ausgelöst und das emittierte Licht wahrgenommen und gemessen und/oder aufgezeichnet wird, um über die interessierende Substanz Informationen zu erhalten. Vorzugsweise wird bei der Bindung der Substanz ein Lumineszenzreagenz gebildet.

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Die Reaktion kann chemisch mit einem chemischen Reagenz oder Katalysator, oder durch Veränderung des pH-Wertes, oder 'physikalisch, z.B. durch Anwendung von Wärme oder Bestrahlung, ausgelöst werden. Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das Lumineszenzreagenz mindestens zwei chemische Komponenten, mit oder ohne Cofaktor oder Katalysator, und die bindende oder Markierungskomponente umfaßt eine unvollständige Anzahl der Komponenten oder Elemente, so daß die Lumineszenzreaktion durch nachfolgende Zugabe der wesentlichen fehlenden Komponente (n) oder Elemente ausgelöst wird.

In jedem Fall ist (sind) die Markierungskomponente (n) für die Umsetzung vorzugsweise beständig und verändern die Substanz, an die sie gebunden sind, nicht wesentlich.

Vorzugsweise ist die interessierende oder gebundene Verbindung ein Protein, ein Antikörper, ein Antigen, Hapten/ ein Hormon, ein Stoffwechselprodukt, Nukleinsäure oder ein Steroid. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Lumineszenzreagenz Antikörper, die an ein lumineszierendes Material gebunden sind. Die so markierten Antikörper werden vorzugsweise verwendet, um die entsprechenden Antigene aufzufinden, zu analysieren und quantitativ festzustellen. Vorzugsweise sind mindestens 60 % und insbesondere mindestens 80 % der Antikörper im Lumineszenzreagenz biologisch wirksam, d.h. sie vermögen die entsprechenden Antigene zu binden.

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D.ie gebundenen bzw. markierten Antikörper können dadurch hergestellt werden, daß man ein die Antikörper enthaltendes Medium, wie Serum, vorzugsweise in fester Phase mit den entsprechenden Antigenen in Berührung bringt, um eine Antikörner-Antigen-Bindung herbeizuführen, bevor oder nachdem die Bindung eingetreten ist, eine lumineszierende Substanz zufügt und anschließend die markierten bzw. gebundenen Antikörper von den Antigenen trennt. Die Antigene binden nur die für sie spezifischen Antikörper, und die nachfolgende Dissoziation ergibt lumineszierende Antikörper mit hoher biologischer Wirksamkeit. Die Dissoziation kann durch Einstellung des pH-Wertes des Systems oder durch eine Reduktionsreaktion herbeigeführt werden. Aufgrund der Selektivität der Antigen-Antikörper-Reaktion erhält man "gereinigte" markierte Antikörper. Die Antigene werden vorzugsweise an ein in fester Phase vorliegendes Immuno-Adsorptionsmittel gebunden. Die lumineszierende Substanz kann dem die Antikörper enthaltenden Medium zugegeben werden, bevor oder nachdem dieses Medium mit den Antigenen in Kontakt gebracht wurde. Das Ergebnis ist das gleiche, insofern, als die nicht an die Antigene gebundenen Komponenten des Mediums ausgewaschen werden können und so einen markierten Antigen-Antikörper-Komplex zurücklassen, aus dem die markierten Antikörper dissoziiert werden können. Diese Art der Reinigung ist als immunologische Reinigung bekannt und, wenn das Antigen ein Immunoglobulin ist, kann es zur Herstellung markierter Anti-Immunoglobuline verwendet werden, die in immunologischen Untersuchungen als Universalreagenzien eingesetzt werden können.

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Ein markierter Antikörper ist von Natur aus ein Immunoglobulin. In den meisten Fällen können diese gegen Antigene, wie Proteinhormone, Haptene oder andere Moleküle gerichtet werden. In besonderen Fällen können Immunoglobuline selbst als Antigene verwendet werden, z.B. verhält sich Kaninchen IgG (ein Immunoglobulin) wie ein Antigen, wenn es Schafen injeziert wird. Der erzeugte Antikörper bindet Kaninchen IgG, einschließlich spezifischer in Kaninchen erzeugter Antikörper. Zum Beispiel kann Alphafoetoprotein (AFP) dadurch quantitativ bestimmt werden, daß man markierten Kaninchenantikörper an AFP bindet. Alternativ kann AFP dadurch quantitativ bestimmt werden, daß man es zuerst mit nicht markiertem Kaninchen-AFP Antikörper umsetzt und dann den gebildeten Komplex durch die Aufnahme von markiertem Schaf—(anti-Kaninchen IgG) Antikörper feststellt. Dieses indirekte Verfahren hat den Vorteil, daß viele immunologische Testsysteme Kaninchenantikörper anwenden. Anstatt sie einzeln zu markieren, kann markierter Schaf-(antiKaninchen IgG) Antikörper als "Universalreaktionsmittel" verwendet werden. Andere bevorzugte Universalreagenzien sind Antikörper für Meerschweinchen IgG, Schaf IgG, Ziegen IgG und Esel IgG, da Antiseren gegen bestimmte Moleküle in diesen Arten erzeugt werden können. Die am häufigsten verwendeten Universalreagenzien sind jedoch Schaf-(anti-Kaninchen IgG) und Schaf-(anti-Meerschweinchen IgG). Das "gereinigte" markierte Antikörperpräparat ist außerordentlich beständig, insbesondere, wenn es bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 8 und einer Temperatur

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unter O C, vorzugsweise von etwa -20 C, aufbewahrt wird. Es hat eine Lebensdauer von vielen Monaten. Gegenüber den Radioisotopen, die aufgrund ihrer kontinuierlichen Zersetzung nur eine begrenzte Lebensdauer haben, ist dies von großem Vorteil. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die Radioisotopen Proteine zerstören, während dies die Lumineszenzmarkierungsmittel nicht tun. Markierte Antikörper können für die folgenden Hormone und Proteine erhalten werden:Insulin, Wachstumshormon, Parathyroidhormon, Follikel stimulierendes Hormon, luteinierendes Hormon, Thyroid stimulierendes Hormon, adrenocorticotrophes Hormon, Glucagon, Prolactin, calcitonin, Alpha-Ferritin, Alphafoetoprotein, Humanimmunoglobulin G (IgG), Kaninchen IgG, Schaf IgG, Meerschweinchen IgG, Esel IgG, die Humanimmunoglobuline E und M und Zellenoberflächenantigene. Markierte Antikörper für Haptene können ebenfalls hergestellt werden. Sie binden Arzneimittel oder cyclische Nucleotide. Die von diesen Hormonen, Proteinen und Haptenen abgeleiteten Antikörper sind besonders wertvoll für die rasche Durchführung immunologischer Untersuchungen. Diese Untersuchungen werden zweckmäßig unter Anwendung sogenannter immunoradiometrischer oder "Doppeltests"durchgeführt.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein die interessierende Substanz, z.B. Antigene, enthaltendes Medium mit Antikörpern in Berührung gebracht, so daß die Antikörper die Substanz selektiv binden, worauf das Bindungsprodukt mit

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durch lumineszierende Stoffe markierten Antikörpern in Kontakt gebracht und eine Lumineszenzreaktion ausgelöst wird, so daß der Grad der erzeugten Lumineszenz die Menge der interessierenden Substanz angibt.

Vorzugsweise wird die interessierende Substanz an Antikörper auf einer festen Phase gebunden, die aus Zellulosepulver oder der Wandung des Reaktionsgefäßes bestehen kann, z.B. einem Glas- oder Kunststoffrohr. Andere Substanzen des Mediums werden nicht durch die Antikörper gebunden und können so ausgewaschen werden.

Diese "doppelte" Technik ist besonders wirksam, wenn man an Schaf-(anti-Kaninchen IgG) Antikörper gebundenes Luminol oder ein Luminolderivat als Lumineszenzmarkierungsmittel verwendet. Die Wirksamkeit dieses mit Luminol markierten Antikörpers wird durch 9-monatige Lagerung bei -2O°C nicht beeinträchtigt.

Die Vielzahl der erfindungsgemäß verwendbaren Lumineszenzmarkierungsmittel ist außerordentlich groß.

Die erfindungsgemäßen Lumineszenzmarkierungsmittel können zweckmäßig in zwei Klassen unterteilt werden, nämlich in

1) chemische Lumineszenzmarkierungsmittel und

2) biologische Lumineszenzmarkierungsmittel.

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Chemische Lumineszenzmarkierungsmittel umfassen anorganische oder organische Moleküle, die unter Erzeugung von Licht mit . anderen Molekülen reagieren können. Diese Substanzen können aus biologischen Materialien extrahiert sein, sind aber in diesem Fall in ihrer natürlichen Umgebung normalerweise nicht an der Emission von Licht beteiligt. Die Lumineszenzreaktion unter Verwendung chemischer Lumineszenzmarkierungsmittel wird durch Zugabe eines bzw. mehrerer geeigneter Reagenzien ausgelöst.

Das Auslösemittel kann ein oxydierendes Mittel, vorzugsweise in einem alkalischen Medium, oder ein Katalysator sein. Ein bevorzugter chemischer Lumineszenzmarkierungsstoff ist eine Verbindung der allgemeinen Formel (I)(a) oder (I)(b)

(D (b)

C.- bis

in denen R₁, R_ und R, Wasserstoff, gegebenenfalls substituierte

- oder Alkenylgruppen, Amino-, substituierte Amino-, Carboxyl- oder Hydroxylgruppen bedeuten, R. und R₅ jeweils die gleiche Bedeutung wie R^, R„ oder R₃ haben oder eine Diazobindung, eine Hemi-dicarboxylatbindung oder eine

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Amidbinching, ein organisches Säurehalogenid oder eine Isothiocyanatgruppe darstellen, mit der Maßgabe, daß min-• destens einer der Substituenten R- bis R₁- eine Amino- oder substituierte Aminogruppe ist. Vorzugsweise ist die Verbindung Luminol (R.. bis R₃ sind jeweils Wasserstoff) .

Vorteilhaft bedeuten R₄ und R_ jeweils durch Hemisuccinat, Aminoethyl oder Chloracetyl substituierte Aminogruppen.

Ein wichtiger Vorteil der Verbindungen der Formel (I) ist, daß sie leicht mit Antikörpern, z.B. über Peptidbindungen, Brücken bilden können. Die Bindung an Peptide kann dadurch bewirkt werden, daß man eine Kupplung mit gemischten Anhydriden, Carbodiimid, Suberimidat oder Hemisuccinat herbeiführt. Andere bevorzugte chemische Lumineszenzmarkierungsstoffe sind

(i) Lophin und dessen Derivate, d.h. Verbindungen der allgemeinen Formel (II)

(II)

in der R,, R_n und R₀ jeweils gegebenenfalls substituierte

Phenylreste darstellen,

(ii) Lucigenin und dessen Derivate, d.h. Verbindungen der allgemeinen Formel (III):

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(HI)

in der R„, R₁₀/ R₁₁ und R₁₂ jeweils die gleiche Bedeutung haben wie R₁, R , R₃, R. und R₁. in der allgemeinen Formel (I)

(iii) Verbindungen der allgemeinen Formel (IV)

(IV)

in der R₁-. und R₁₄ jeweils die gleiche Bedeutung haben wie R₁, R„, R-., R. und R₁- in der allgemeinen Formel (I)

(iv) trans-Azodicarboxylate der allgemeinen Formel (V)

in der R₁ ^ und R₁₆ jeweils Wasserstoff oder niedere Alkylreste sind

(v ) Oxalatester der allgemeinen Formel (VI)

in der R₁₇ und R₁₃ jeweils niedere Alkylreste bedeuten,

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(vi) Pyrogallol.

Bevorzugte Auslösemittel sind Wasserstoffperoxid, Kaliumpermanganat, Kaliumferricyanid oder Sauerstoff in Gegenwart von Dimethylsulfoxid. Katalysatoren aus biologischen Quellen, wie Enzyme, können ebenfalls als Auslösemittel verwendet werden. Ein bevorzugter Katalysator ist Peroxidase.

Beispiele für Umsetzungen unter Verwendung von Luminol, die zur Emission von Licht führen, sind: O

Υ^Λ + HpOp + K,Pe(CN)_r + OH

hv (Licht)

2. Luminol +

oxydiertes Luminol + hv(Licht)

3. Luminol +

+ Peroxidase

oxydiertes Luminol + hv(Licht)

Die Lumineszenzreaktion kann auch durch eine Veränderung des pH-Wertes oder der physikalischen Bedingungen, wie durch die Temperatur, die Polarität des Lösungsmittels und durch Strahlungen, z.B. durch Röntgenstrahlen, Gammastrahlen und Teilchen von radioaktiven Isotopen ausgelöst werden.

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Biologische Luitiineszenzmarkierungsstoffe sind Komponenten, die an einer Reaktion unter Erzeugung von Licht teilnehmen, wobei mindestens eine der Komponenten aus einem biologischen Material extrahiert und in ihrer natürlichen Umgebung bei der Erzeugung von Licht beteiligt ist. Dies schließt Reaktionen ein, die mit synthetischen Verbindungen der gleichen oder einer ähnlichen Struktur durchgeführt werden und die synthetisiert wurden, um die natürlich auftretende Verbindung nachzuahmen.

Bevorzugte biologische Lumineszenzmarkierungsstoffe sind (i) FirefIy-L uciferin und dessen Derivate der allgemeinen Formel (VII)

^CVII)

in der X₁, X₂, X₃ und X. jeweils die gleiche Bedeutung haben wie R₁, R~, R-., R. und R^ in der allgemeinen Formel (I).

(ii) Coelenteratchromophore der allgemeinen Formel (VIII)

(VIII)

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in der X₁-, X_fi und X_ jeweils die gleiche Bedeutung haben wie R., R-, R-,, R₄ und R₁- in der allgemeinen Formel (I) oder

CK₁.

3 ; ^i

OH₁

sind.

Im allgemeinen sind alle beständigen Lucifern- und Coelen-

teratderivate geeignet.

Eine große Anzahl der mit biologischen Lumineszenzmarkierungsstoffen durchgeführten Reaktionen erfordert Sauerstoff. Ein Beispiel hierfür ist wie folgt:

Luciferin + andere Cofaktoren + O (L) (D)

(S)

Oxyluciferin + andere Produkte + Licht.

Die Reaktion wird durch ein Enzym katalysiert, das als Luciferase bekannt ist. Für die Umsetzung können auch andere oxydierende Mittel, wie sie bei Verwendung chemischer Lumineszenzmarkierungsstoffe eingesetzt werden, verwendet werden.

Bei einigen, die Emission von Licht bewirkenden Komponenten trifft dieses Schema jedoch nicht zu. Einige der erfindungs-

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gemäßen Umsetzungen werden durch Zugabe geeigneter Cofaktoren ausgelöst. Ein Beispiel hierfür ist die Zugabe von Calciumionen zu den Photoproteinen, die aus einer Anzahl von Coelenteraten isoliert werden:

2+

Ca

andere Katione

wobei X₅, Xg und X₇ die für die allgemeine Formel (VII) angegebene Bedeutung haben. Erfindungsgemäß kann jede, eine Lumineszenzreaktion eingehende Komponente als Markierungsstoff für ein "Lumineszenzreagenz" verwendet werden. Ein chemischer Lumineszenzmarkierungsstoff kann eine organische Verbindung, wie Luminol, ein anorganisches Ion oder Molekül, oder ein Katalysator, wie das Enzym Peroxidase sein. In ähnlicher Weise kann ein biologischer Lumineszenzmarkierungsstoff ein Luciferin oder Luciferase, ein Strukturanaloges eines Luciferins oder einer der folgenden Cofaktoren sein:

1. Firefly

2. Bakterien

3. Fungi

ATP

NADH FMNH

R.CHO, wobei R eine aliphatische Gruppe ist

NADH NADPH

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Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Menge des Lumineszenzreagenzes (AB) normalerweise dadurch bestimmt, daß man eine Probe in ein Röhrchen gibt, eine oder mehrere Komponenten oder das Auslösemittel für die Lumineszenzreaktion wegläßt und dann die Umsetzung physikalisch oder chemisch durch Zugabe der fehlenden Komponente (n) oder des Katalysators auslöst. Das emittierte Licht kann festgestellt oder quantitativ unter Verwendung einer Standardmeßvorrichtung ermittelt werden, z.B. einer Photoverstärkungszelle, deren ausgesandte Signale festgestellt oder von einer Aufzeichnungsvorrichtung, einem Oszilloskop oder Skalar aufgezeichnet werden. In einigen Fällen kann das Licht auch mit dem bloßen Auge festgestellt oder von einer photographischen Platte oder einem Bildverstärker aufgenommen werden, insbesondere wenn eine Information über die Position erforderlich ist, z.B. bei histologischen Untersuchungen eine Information über die Position der maximalen Lichtintensität, oder der Farbe, oder der Intensität in Bezug auf einen Standard.

Die Erfindung umfaßt die Anwendung des "Lumineszenzreagenzes" auf eine Vielzahl von Verfahren, insbesondere auf die folgenden vier wichtigen analytischen Verfahren:

1) Immunologische und Proteinbindungsuntersuchungen Dieses analytische Verfahren ist üblich und umfaßt normalerweise die Umsetzung des zu analysierenden Moleküls (A) mit dem bindenden Protein (C), das im Falle immunologischer Unter-

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suchungen ein Antikörper ist.

Das wesentliche Merkmal dieser analytischen Methode besteht darin, daß es notwendig ist, das an den Antikörper gebundene A vom freien A oder den gebundenen Antikörper vom freien Antikörper zu trennen. Die Umsetzung läßt sich quantitativ durchführen, wenn man entweder den Antikörper, A, oder ein anderes Molekül, das mit den freien oder gebundenen Anteilen reagieren kann, nach der Trennung markiert. Das Markierungsmittel ist entweder ein chemisches oder biologisches Lumineszenzmarkierungsmittel, wie oben angegeben. Ein Beispiel für diesen Untersuchungstyp ist die oben beschriebene "doppelte Technik".

2) Umwandlung

Es gibt viele Situationen, in denen es notwendig ist, die Umwandlung eines Moleküls in vivo oder in vitro quantitativ zu verfolgen. Das Molekül kann biologischen Ursprungs oder eine pharmakologische Verbindung sein. Um die Umwandlung dieser Substanzen zu messen, wird eine kleine Standardmenge der mit einem chemischen oder biologischen lumineszierenden Stoff markierten Substanz wie oben angegeben zu dem die nicht markierte Substanz enthaltenden Medium gegeben. Die Umwandlung der Substanz kann dann dadurch gemessen werden, daß man den Verlust an markierter Substanz feststellt.

3) Histologische Lokalisierung von Substanzen

Um eine Substanz innerhalb oder außerhalb einer Zelle unter

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Verwendung eines "Lumineszenzreagenzes" zu lokalisieren wird das entsprechende Reagenz, z.B. ein markierter Antikörper, .zu einem Gewebepräparat gegeben und nach dem Waschen unter einem Mikroskop untersucht. Das "Lumineszenzreagenz" wird dann mit dem Auge oder unter Verwendung einer Verstärkungsvorrichtung festgestellt. Das Bild kann dann photographiert werden.

4) Feststellung von Substanzen, die einer Wiederverteilung unterliegen.

In einer Reihe von biologischen Systemen und bei in vivo Trennverfahren, z.B. beim Zentrifugieren, Chromatographieren und der Elektrophorese ist es notwendig, eine Substanz zu verfolgen, die einer Wiederverteilung unterliegt. Dies-geschieht dadurch, daß man dem Ausgangspräparat eine geringe Standardmenge der mit einem chemischen oder biologischen lumineszierenden Stoff markierten Substanz zugibt. Die Verteilung der Substanz kann dann durch Verfolgung der Verteilung des "Lumineszenzreagenzes" festgestellt werden.

Die Erfindung ist auch von beträchtlichem Wert für die Untersuchung von insbesondere kleinen Molekülen in einem homogenen System. Diese Untersuchungen haben den Vorteil einer raschen Analyse, ohne daß eine Trennstufe erforderlich ist.

Bei der herkömmlichen radioimmunologischen Technik wird ein

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Antigen mit einer begrenzten Menge eines bindenden Reagenzes, d.h. eines Antikörpers, umgesetzt. Der Anteil des gebundenen Antigens ist der zugefügten Konzentration umgekehrt proportional. Die Umsetzung wird durch Zugabe einer Spurenmenge von markiertem Antigen verfolgt. Ein wesentliches Merkmal dieser Technik besteht darin, daß gebundenes Antigen von nicht gebundenem Antigen getrennt werden kann.

Eine homogene Untersuchungsmethode ist so angelegt, daß eine Eigenschaft des markierten Antigens bei der Umsetzung mit dem Antikörper verändert wird. Es läßt sich somit die Umsetzung verfolgen, ohne daß eine Trennung der gebundenen von der nicht gebundenen Fraktion notwendig ist. Bei einer Markierung mit Radioisotopen ist dieser Weg nicht gangbar. In einem homogenen Test verursacht das Licht, das von einem Antigen (oder Antikörper) das mit einem lumineszierenden Stoff markiert ist, emittiert wird, daß das von einem Antikörper (oder Antigen), der mit einem fluoreszierenden Molekül markiert ist, emittierte Licht eine abweichende Wellenlänge hat. Die Verwendung eines entsprechenden Filters in der Analysiervorrichtung führt somit zur Messung von Licht aus der Fluoreszenz, die von der Antigen-Antikörper Reaktion herrührt. Das System ist homogen, weil es nicht nötig ist, nicht umgesetztes Antigen von der Probe zu trennen, da seine Emission eine größere Wellenlänge hat und daher nicht registriert wird.

Die Erfindung stellt somit auch eine Methode zur Durchführung eines homogenen Tests zur Verfügung, bei dem eine mit einem

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lumineszierenden Stoff markierte Substanz mit einem Antikörper oder Antigen umgesetzt wird, die mit einem fluoreszierenden Stoff markiert sind, worauf eine Lumineszenzreaktion ausgelöst wird und die Energie aus der Lumineszenzreaktion den fluoreszierenden Stoff auf dem Antikörper oder Antigen so anregt, daß eine Wellenlängenverschiebung in der Lichtemission oder eine Veränderung in der Quantenausbeute auftritt.

Vorzugsweise ist der Antikörper oder das Antigen mit Fluorescein markiert. Die Lumineszenzreaktion wird zweckmäßig durch Zugabe von Peroxidase ausgelöst.

Die zu untersuchende Substanz ist vorteilhaft ein Hapten und umfaßt die folgenden Substanzen: cyclische Nucleotide (cyclisches AMP, cyclisches GMP und cyclisches CMP), 25-Hydroxycholecalciferol, 1,25-Dihydroxycholecalciferol, Thyroxin, Trijodthyronin, Progesteron, Östradiol, Östriol, Testosteron, Aldosteron, Cortisol, Glycocolsäure, Taurocolsäure, Barbiturate, Salicylate, Phenitoin, Morphin, Heroin, Methotrexat und Digoxin.

Die bevorzugten chemischen lumineszierenden Markierungsstoffe für die Haptene, insbesondere Thyroxin, sind Oxalatester.

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Beispiele

1. Anregung von Luminol-Schaf-(anti-Kaninchen IgG) Ein Lumineszenzreagenz wird durch Kupplung des Diazoniumsalzes von Luminol an Schaf-(anti-Kaninchen IgG) Antikörper hergestellt. Die Lumineszenzreaktion wird durch Anregung des Reagenzes mit Sauerstoff in Gegenwart von Alkali ausgelöst, worauf Licht einer Wellenlänge von 400 bis 500 mm emittiert und mit einer Photon-Zählvorrichtung gemessen wird.

Die Lichtemission aus dem Reagenz nach der Anregung verläuft außerordentlich rasch. Es sind weniger als 2 Sekunden erforderlich, um das vorhandene Luminol exakt zu messen.

2. Immunologische Untersuchung von Parathyroidhormon unter Verwendung von mit Luminol markierten Antikörpern

a) Allgemeine Methode

Eine Methode zur Messung der Konzentration von Parathyroidhormon in menschlichem Serum ist bekannt (Woodhead und Mitarbeiter, British Medical Bulletin, Band 30, Seiten 44 - 49,

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1974). Bei dieser Methode werden mit I markierte Antikörper verwendet.

b) Herstellung der mit Luminol markierten Antikörper Die chemische Grundreaktion besteht in der Diazotierung zwischen Luminol und Antikörpern für menschliches Parathyroidhormon. 2 mg Luminol werden bei O⁰C in 1 ml n HCl suspendiert. Dann werden 10 mg NaNO „ zugefügt und die Lösung

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wird etwa 3 Minuten leicht gemischt. Darauf wird der pH-Wert mit NaOH auf 8,0 bis 9,0 eingestellt. 2 ml einer Lösung von 'Antikörpern für menschliches Parathyroidhormon, die an menschliches Parathyroidhormon auf Aminocellulose (Immunadsorptionsmittel) gebunden sind, in 0,2 m Natriumborat, pH 8,2, werden dann zugefügt. Nachdem diese Mischung etwa 16 Stunden bei 4 C inkubiert wurde, wird das Immunadsorptionsmittel 4 χ mit Boratpuffer ausgewaschen. Dann wird das Immunadsorptionsmittel 3 χ mit 0,9 %igem (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid gewaschen. Die mit Luminol markierten Antikörper werden mit einem Puffer vom pH 2 eluiert.

c) Untersuchung von Parathyroidhormon (PTH) Diese wird in ähnlicher Weise durchgeführt wie eine immunoradiometrische Untersuchung, mit der Abweichung, daß die Anti-

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körper nicht mit I sondern mit Luminol markiert werden.

PTH Standards (0,08 bis 50 mg/ml) werden in NIGP hergestellt (20,6 g Natriumbarbiton, 10 g NaCl, 1 g Natriumazid, 2 g menschliches Serum Albumin, 40 mg Meerschweinchen ^-Globulin, nicht immun, auf 2 Liter aufgefüllt und mit 1,0 η HCl auf pH 8,0 eingestellt). 100,ul jedes Standards werden in vierfacher Ausfertigung in Beckman -Polyäthylenröhrchen (EET 23) gegeben. 50,ul der zu untersuchenden Probe werden in ähnliche Röhrchen gegeben, und es werden 50,ul NIGP Puffer zugefügt. Dann werden 10,ul des "Lumineszenzreagenzes" (mit Luminol markierter PTH Antikörper) zugesetzt. Nach dem Vermischen werden die Röhrchen 3 Tage bei 4°C inkubiert. 50 ,ul PTH ImAd

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(covalent an Zellulose gebundenes PTH) werden darauf zugegeben. Nach 2o Minuten werden die Röhrchen 1 Minute zentrifugiert und 9o μΐ der überstehenden Flüssigkeit werden durch Untersuchung auf Luminol auf das "Lumineszenzreagenz" untersucht.

d) Untersuchung des "Lumineszenzreagenzes" 9o μΐ der überstehenden obigen Flüssigkeit werden zu 9oo μΐ n/1o NaOH gegeben, dann werden 1ομ1 Η,,Ο- zugefügt und das Röhrchen wird vor eine Photoverstärkungsröhre gebracht. Die in den ersten "Io Sekunden nach der Zugabe von 1 ml von 1-molarem K-Fe(CN), festgestellten Gesamtzählungen werden gegen die PTH-Konzentration aufgezeichnet. Die Werte der Proben können dann von dieser Standardkurve abgelesen werden.

3. Umwandlung - Umwandlung von Albumin in einem Leberhomogenat Mit Luminol markiertes Rinderserum Albumin (RSA) wird wie in Beispiel 2 für die Antikörper für PTH beschrieben hergestellt. Ein Homogenat von Rattenleber (2:1 Gewicht/Volumen) wird in 15o mMol KCl, 2 mMol MgCl₂, 1 mMol Mercaptoäthanol, 2o mMol Tris-(hydroxymethyl)-methylamin, pH 7,4 hergestellt. 1 ml Proben werden in Luckam LP3-Kunststoffröhrchen gegeben, 1o μΐ Proben von RSA, die mit Luminol markiert sind, + 1o μΐ nicht markiertes RSA (o,o1 bis 1oo mg/ml) werden zugefügt und die Röhrchen werden bis zu 6o Minuten bei 37⁰C inkubiert. Nach einer bestimmten Zeit wird das Albumin durch Zugabe eines gleichen Volumens von gesättigtem (NH.)

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der Niederschlag gewaschen und in 0,5 ml n/50 NaOH wieder gelöst. 100,ul Proben werden für die Untersuchung des ■"Lumineszenzreagenzes" entnommen, wie in Beispiel 2 für die mit Luminol markierten Antikörper beschrieben ist·. Der Abfall in der Lumineszenz des Niederschlages stellt ein Maß für den Abbau des Albumins dar.

4. Histologische Lokalisierung - Lokalisierung von Antigenen auf Erythrocyten

Antikörper für menschliche Erythrocyten werden mit Luminol wie in Beispiel 2 für die Antikörper für PTH beschrieben markiert. 10,ul dieses "Lumineszenzreagenzes" werden zu 1 ml 0,9%igem

(Gewicht/Volumen) NaCl gegeben, der 10 menschliche Erythrocyten enthält. Nach 30 Minuten langer Inkubation bei 37°C werden die Zellen zentrifugiert und 3 χ mit 0,9%igem (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid gewaschen. Die Zellen werden dann auf einem Mikroskop-Objektträger ausgestrichen und unter einem Lichtmikroskop mit einem Bildverstärker festgestellt. 1 mMol KMnO. wird zur Stimulierung der Lumineszenz des Luminols zugefügt. Zellen mit an sie gebundenen Antikörpern (und demzufolge Antigenen auf ihrer Zelloberfläche) emittieren Licht, das durch den Bildverstärker sichtbar gemacht und dann photographiert wird. Die Antigene enthaltenden Zellen können dann durch Vergleich der Photographie mit einer unter Phasenkontrast aufgenommenen Photographie lokalisiert werden.

5. Verteilung von Zellmembranantigenen während der Fraktionierung von Rattenadipocyten

Antikörper für Rattenadipocyten werden wie in Beispiel 2 für

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die Antikörper für PTH beschrieben mit Luminol markiert.

10,ul Proben des "Lumineszenzreagenzes" werden zu 1 ml einer

Lösung gegeben, die 144 mMol Na , 5,9 mMol K , 1,2 mMol M<i ' ,

2,6 mMol Ca²⁺, 128,9 mMol Cl", 1,2 mMol SO₄ ²", 1,2 mMol HPO ~²,

C *"7

25 mMol HCO₃ , 4 % RSA 2/Volumen, pH 7,4 und 10 bis 10 Rattenadipocyten enthält. Nach 30 Minuten langer Inkubation bei 37°C wird die Suspension zentrifugiert, und die Zellen werden 3 χ gewaschen. Die Zellen werden dann in 5 ml einer Lösung von 150 mMol KCl, 2 mMol MgCl₃, 1 mMol Mercaptoäthanoi, 20 mMol tris, pH 7,4 homogenisiert. Dann führt man eine übliche Differentialzentrifugation durch, worauf die 500 g, 10.000 g, 100.000 g Niederschläge und die 100.000 g überstehende Flüssigkeit gesammelt werden. Von jeder Fraktion werden 100 ,ul Proben auf Luminol· untersucht, wie in Beispiel· 2 beschrieben. Ein Vergieich der Menge Luminol· jeder Fraktion mit derjenigen auf den ganzen Zellen ermöglicht eine quantitative Feststellung der Menge an Ze^membranantigenen in jeder erhaltenen Fraktion.

6. Doppeluntersuchung von Al·phafoetoprotein unter Verwendung von mit Luminol· markierten Antikörpern

Eine Immunogiobu^nfraktion eines Antiserums für Aiphafoetoprotein (AFP) wird durch Natriumsuif atf ä^ung hergeste^t. Die Antikörper für AFP enthaitende Fä^ung wird covalent unter Verwendung von Glutaraldehyd an ein Siianderivat von Borsiiikatgias in Form von Reaktionsröhrchen gebunden. AFP enthaitende Proben

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werden 3 Stunden in den Röhrchen inkubiert. Während dieser Zeit verbindet sich das AFP mit den Antikörpern. Antikörper für AFP, die mit Luminol markiert sind, werden wie für die PTH'-Untersuchung beschrieben, hergestellt und dann zugegeben. Nach der Inkubation über Nacht werden die Röhrchen geleert und 2 χ in phosphatgepufferter (0,05 Mol, pH 7,4) Kochsalzlösung gewaschen, die 0,1 % Rinderserum Albumin enthält. Die Röhrchen werden zu der Photon-Zählvorrichtung gebracht und die Licht emittierende Reaktion wird wie bei der PTH-Untersuchung ausgelöst. Die Menge emittiertes Licht ist eine Funktion der Menge an vorhandenem Luminol und damit der Konzentration an AFP in den Proben.

7. Homogene Untersuchung von cyclischem AMP Ein Antikörper für cyclisches AMP (oder GMP) wird wie in den Beispielen 2 und 3 mit Luminol markiert. Cyclisches Succinyl AMP (oder GMP) wird mit Fluorescein markiert. Der markierte Antikörper wird mit dem markierten cyclischen AMP (oder GMP) bei pH 7,4 im Reaktionsröhrchen umgesetzt. Peroxidase (10 mU) und Wasserstoffperoxid (VmMoI) werden zugegeben und die Lichtemission bei 540 mm wird gemessen. Emission bei dieser Wellenlänge kann nur von der mit Fluorescein markierten Komponente herrühren, die an den Antikörper gebunden ist. Nicht gebundener Antikörper emittiert bei einer anderen Wellenlänge (d.h. bei 460 rai]L

Das vom Luminol emittierte Licht wird am wirksamsten vom

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Fluorescein absorbiert, wenn die beiden Moleküle nahe beieinander sind, d.h.weniger als 1OQ 8. Die Wellenlängenverschiebung tritt somit nur auf, wenn das markierte cyclische AMP und der Antikörper miteinander verbunden sind. Die gleiche Reaktion kann durchgeführt werden, wenn das cyclische AMP mit Luminol und der Antikörper mit Fluorescein markiert ist.

sch/cm

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Feststellung, Analyse, quantitativen Bestimmung oder Lokalisierung einer .Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß man die Substanz oder eine assoziierte Substanz durch Bindung an eine oder mehrere Komponenten, die eine Lumineszenzreaktion einzugehen vermögen, markiert, dann die Lumineszenzreaktion auslöst und das emittierte Licht aufnimmt und mißt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lumineszenzreaktion chemisch mit einem chemischen Reagenz oder Katalysator auslöst.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lumineszenzreaktion durch ein Oxydationsmittel, gegebenenfalls unter alkalischen Bedingungen, einen Katalysator oder eine Veränderung des pH-Wertes auslöst.

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4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das markierte Produkt mindestens zwei chemische Komponenten umfaßt, mit oder ohne Cofaktor oder Kataiysator, die Markierungskomponente eine unvoilständige Anzahl· von Bestandteilen aufweist und die Lumineszenzreaktion durch nachfoigende Zugabe der wesentlichen fehienden Bestandteiie ausgelöst wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lumineszenzreaktion physikalisch ausgelöst wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungskomponeinte (n) beständig ist (sind) und die Substanz, an die sie gebunden werden, nicht wesentlich verändern.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bindende (markierende) Komponente ein Protein, ein Antikörper, ein Antigen, Hap ten, ein ilormon, ein Stoffwechseiprodukt, tlukleinsäure oder ein Steroid ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6 zur Durchführung immunologischer Untersuchungen, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper oder Antigene mit der (n) Komponente (n) des Lumineszenzreagenzes markiert.

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9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6 zur Untersuchung eines Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß man das Protein oder eine Standardsubstanz mit der (n) Komponente (n) des Lumineszenzreagenzes markiert.
10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6- zur Messung der Umwandlung biologisch interessierender Substanzen in vivo oder in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Substanz mit der (n) Komponente (n) des Lumineszenzreagenzes markiert.
11. Verfahren nach Anspruch 1 bis.6, dadurch gekennzeichnet, daß man histologisch zu lokalisierende Substanzen markiert.
12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die markierende (n) Komponente (n) des Lumineszenzreagenzes aus chemischen oder biologischen lumineszierenden Komponenten bestehen.
13. Verfahren zur Herstellung eines Lumineszenzreagenzes, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antikörper enthaltendes Medium unter Bildung eines Antikörper-Antigen Komplexes mit entsprechenden Antigenen in Berührung bringt, vor oder nach der Bildung des Komplexes eine lumineszierende Markierungskomponente zufügt und anschließend die markierten

. ■ Antikörper von den'Antigenen dissoziiert.

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14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Antigene an ein in fester Phase vorliegendes Immuno-Adsorptionsmittel bindet.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß

man das in fester Phase vorliegende Immuno-Adsorptionsmittel zur Reinigung von Antikörpern verwendet, die zuvor in Lösung durch Kontakt mit einer chemischen oder biologischen lumineszierenden Verbindung markiert wurden.
16. Verfahren zur Feststellung und quantitativen Bestimmung einer Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das die Substanz, z.B. ein Antigen enthaltende Medium mit Antikörpern in Kontakt bringt, das Produkt aus selektiv gebundener Substanz und Antikörpern mit markierten Antikörpern, nämlich Schaf-(anti-Kaninchen IgG),Schaf-(antiMeerschweinchen IgG), Meerschweinchen IgG, Schaf IgG, Ziegen IgG oder Esel IgG in Berührung bringt, eine Lumineszenzreaktion auslöst und die Lumineszenz mißt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Substanz an Antikörper auf fester Phase gebunden wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase aus Zellulosepulver oder der Wandung eines Reaktionsgefäßes besteht.

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19. Verfahren zur Feststellung und quantitativen Bestimmung einer Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine mit einer lumineszierenden Komponente markierte Substanz mit einem Antikörper oder Antigen umsetzt, die mit einer fluoreszierenden Komponente markiert sind, und eine Lumineszenzreaktion auslöst, so daß die Energie aus der Lumineszenzreaktion die fluoreszierende Komponente auf dem Antikörper oder dem Antigen unter Erzeugung einer Wellenlängenverschiebung in der Lichtemission oder einer Veränderung in der Quantenausbeute anregt.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Substanz aus einem Hapten besteht.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Hapten ein cyclisches Nucleotid (cyclisches AMP, cyclisches GMP, cyclisches CMP), 25-Hydroxycholecalciferol, 1,25-Dihydroxycholecalciferol, Thyroxin, Trijodthyronin, Progesteron, Östradiol, Östriol, Testosteron, Aldosteron, Cortisol, Glykocolsäure, Taurocholsäure, ein Barbiturat, ein Salicylat, Phenitoin, Morphin, Heroin, Methotrexat oder Digoxin ist.
22. Verfahren nach Anspruch 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das Antigen mit Fluoreszin markiert sind.

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23. Verfahren nach Anspruch 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lumineszenzreaktion durch Peroxidase oder Wasserstoffperoxid auslöst.

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