DE3737649A1 - Verfahren zur bestimmung der lumineszenz von zellkulturen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Lumin­ eszenz von Zellkulturen, wobei diese mit einer lumineszier­ fähigen, die natürliche Lumineszenz verstärkende, ersten Substanz versehen werden, anschließend mit einer, die Lumines­ zenz auslösende, zweiten Substanz behandelt werden, und die Lumineszenz photoelektronisch erfaßt wird, sowie eine Vorrich­ tung zum Durchführen des Verfahrens.

Derartige Verfahren sind u.a. aus B. Becker, et al. "Applica­ tion of Intracellular ATP Determination in Lymphocytes for HLA-typing", Journal of Bioluminescence and Chemieluminescence, Vol. 1, 47-51 (1986) bekannt. Unter Lumineszenz im weiteren Sinne sind alle Emissionen von Strahlungsquanten, vor allem Leuchterscheinungen, zu verstehen, die Stoffe nach quantenhafter Anregung ohne Zuhilfenahme von thermischer Energie zeigen. Bei der sogenannten Biolumineszenz kommt die der Aussendung von Lichtquanten vorausgehende Anregung durch eine enzymatisch gesteuerte Oxidation zustande. Am besten bekannt ist dabei dieser Vorgang beim Leuchtkäfer, im Volksmund auch "Glühwürm­ chen" genannt, bei dem zum Reaktionseintritt Luciferin, Mag­ nesiumionen, ATP (Adenosintriphosphat) und Sauerstoff vorliegen müssen. Das Enzym Luciferase katalysiert die Oxidation des Luciferins, wobei ein Photon ausgesandt wird. Die Zahl der ausgesandten Photonen erlaubt Rückschlüsse auf die Aktivität bzw. Vitalität der Zellen.

Derartige Vorgänge laufen überwiegend nicht unter der von den Glühwürmchen bekannten intensiven Strahlung ab, so daß die Strahlung nicht ausreicht, um direkt gemessen zu werden. In der Lumineszenz-Technologie werden daher in die Organismen bzw. Zellen lumineszierfähige Substanzen als Verstärker eingebracht, die anschließend durch eine auslösende Substanz ggf. unter Mitwirkung eines zelleigenen Enzyms oxidiert werden, wobei dann die Lumineszenz zu beobachten ist. Aus der Intensität der Lumineszenz kann dann auf die Aktivität des Enzyms bzw. der Zellkultur rückgeschlossen werden. Die Lumineszenz bzw. Bio­ lumineszenztechnik hat in den letzten Jahren immer breitere Anwendung gefunden, da eine "Markierung" von Zellen durch lumineszierfähige Substanzen wesentlich einfacher und ungefähr­ licher ist, als beispielsweise die Markierung mit radioaktiven Isotopen.

Bei der Durchführung derartiger Lumineszenz Analyse-Verfahren werden Zellsuspensionen mit den die Lumineszenz verstärkenden Substanzen hergestellt und in diese Suspensionen, die die Lumineszenz auslösenden Substanzen zugefügt. Dabei senden nicht nur die Zellen eine Strahlung aus, sondern auch die in der Lösung noch vorhandene Verstärkersubstanz strahlt selbst. Daraus resultiert ein nachteiliges Signal/Rauschverhältnis zwischen dem von den Zellen ausgesandten Licht und der diese Zellen umgebenden Lösung.

Ferner nachteilig an der Lumineszenz-Technologie ist, daß die abgelösten, in der Suspension aufgeschlämmten Zellen sich in ihrer Morphologie gegenüber den ursprünglich haftenden (adhären­ ten) Zellen unterscheiden. Den Ausgangspunkt der überwiegend zur Zeit verwendeten Zellkulturen bilden Zelltypen, die in situ im Verband wachsen und entsprechende Gewebe bilden. Solche Zellen benötigen, um sich auch in vitro teilen und vermehren zu können, einen Untergrund, auf dem die wachsende Kultur schließlich einen "Rasen" in Form einer Schicht bildet. Löst man eine solche adhärente Zellkulturschicht auf dem üblichen Weg, d.h. enzymatisch von ihrer Unterlage und bringt sie in Suspension, so ändern diese Zellen ihre Morphologie. Sie runden sich dabei ab und nehmen in etwa Kugelform an. Dieser Zustand weicht morphologisch und physiologisch von jenem ab, in dem sich adhärente oder gar in situ wachsende Zellen normalerweise befinden. Dasselbe gilt für Zellinien, die von vornherein als Suspensionskulturen gezüchtet werden. Soll das Verhalten von adhärenten Zellen studiert werden und möchte man dabei brauch­ bare Aussagen im Rahmen der Lumineszenz-Analytik machen, so ist es notwendig, das jeweilige Experiment so zu gestalten, daß man so nahe als möglich an den in vivo-Zustand der verwen­ deten Zellkulturen herankommt. Dies ist gegenwärtig mit der Suspensionstechnologie nicht im ausreichenden Maße erreicht.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Verfahren der eingangs genannten Art derart abzuwandeln, daß Lumineszenz­ analysen an adhärenten Zellkulturen vorgenommen werden können, wobei lediglich das von den Zellen ausgestrahlte Licht erfaßt werden soll, um dadurch direkte Aussagen über die Zellaktivität bzw. -vitalität erhalten zu können. Ferner ist Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur Durchführung eines derartigen Verfahrens zu schaffen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch folgende Verfahrens­ schritte gelöst:

• a) Kultivieren der zu untersuchenden Zellkultur auf einem Träger haftend,
• b) Behandeln der auf dem Träger haftenden Zellkultur mit einer lumineszenzfähigen ersten Substanz,
• c) Entfernen der nicht vom am Träger haftenden Zellkultur aufgenommenen ersten Substanz, und
• d) Messen der lediglich von der Zellkultur emittierten Strahlung nach Zugabe der zweiten, die Lumineszenz auslösenden Substanz.

Durch Kultivieren der Zellkultur auf einem Träger haftend, weisen die Zellen eine Morphologie auf, die einem in vivo gewachsenen Verband bzw. Gewebe entspricht. Durch Behandeln der am Träger haftenden Zellen mit der lumineszenzfähigen ersten Substanz, wird diese in die Zellkultur eingebracht, ohne daß dabei die Zellen abgelöst werden, d.h., ohne daß sich deren morphologische oder physiologische Eigenschaften ändern. Die nicht von der Zellkultur aufgenommene erste Substanz kann durch Waschen entfernt werden, so daß, falls die die Strahlung auslösende zweite Substanz zugegeben wird, Strahlung lediglich in den Zellen erzeugt wird. Damit entspricht die ausgestrahlte und somit meßbare Strahlung exakt der Aktivität bzw. Vitalität der Zellen, und die Messung wird nicht durch außerhalb des Zellverbandes entstehende Strahlung verfälscht. Dadurch sind beispielsweise sehr einfache Absolutmessungen möglich, ohne daß beispielsweise das Grundrauschen kompen­ sierende Vergleichsmessungen durchgeführt werden müssen. Bei einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist eine von der Außenwelt abschließbare Kultur­ schalenvorrichtung vorgesehen, in der zumindest ein Träger lösbar unter sterilen Bedingungen aufnehmbar ist, und der zumindest eine aufgenommene Träger ist abwechslungsweise mit Nährlösungen, Waschlösungen, der lumineszenzfähigen ersten Substanz, sowie der die Lumineszenz auslösenden Substanz behan­ delbar. Die zu untersuchende Zellkultur wird auf dem Träger kultiviert und alle weiteren Behandlungsschritte werden dann an der fest am Träger haftenden Zellkultur durchgeführt. Dabei bleiben die morphologischen Eigenschaften durchweg erhalten. Dabei ist es auch ermöglicht, nach einer erfolgten Messung, die auf dem Träger haftende Kultur weiter zu züchten, und ggf. zu einem späteren Zeitpunkt weitere Messungen durchzufüh­ ren.

Mit der auf dem Träger haftenden Zellkultur können außerdem auch Toxizitäts-, Konzentrations-, Wirkungs- und Wirksamkeits­ tests durchgeführt werden. D.h. die adhärente Zell- bzw. Gewebestruktur kann mit toxischen Substanzen verschiedener Konzentrationen versehen werden, die die enzymatische Tätigkeit bzw. die Lumineszenz beeinflussen. Durch Vergleichsmessungen, d. h. Vergleiche zwischen Zellkulturen auf Trägern ohne Gift­ stoffe und solchen mit Giftstoffen, kann sehr einfach der Einfluß derartiger Substanzen mittels dem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. der Vorrichtung durchgeführt werden.

In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird in Schritt a) als Träger ein dünnes Plättchen aus Kunst­ stoff, Glas oder dgl. verwendet, dessen eine Oberfläche mit einem Zellkultur-Monolayer kultiviert wird. Dies hat den Vorteil, daß auf dünnen Plättchen, sogenannte Cover Slips, die Zellen in einer Schicht (sogenannte Monolayer) wachsen können. Durch Konfluenz, d.h. eine dichtest mögliche Anordnung von adhärenten Zellen als Monolayer in einer Kultur, ist eine gleichmäßige dichte einschichtige Zellstruktur auf dem Träger erreicht, die zum einen fest haftend ist und außerdem eine gleichmäßige Strahlungsquelle darstellt. Lumineszenzmessungen mit auf dem Träger haftenden Zellen sind jedoch auch möglich, ohne daß Konfluenz erreicht ist.

Eine besonders gute Haftung auf der Oberfläche des Trägers ist dadurch erreicht, daß die Zellkultur zunächst auf die Oberfläche des Trägers aufgebracht wird und dieser ein gewisser Zeitraum, vorzugsweise etwa 3 Minuten, gegeben wird, um sich auf der Trägeroberfläche festzusetzen und anschließend eine Nährlösung zugegeben wird. Die "nackte" Zellkultur findet in der kurzen Zeitspanne Kontakt mit der Oberfläche des Trägers und wird dann durch die anschließend vorsichtig aufgebrachte Nährlösung nicht abgespült, so daß ein gezieltes Vermehren nur auf dem Träger stattfindet.

Dies wird besonders vorteilhaft dadurch verwirklicht, daß der Träger waagrecht gehalten ist, die Zellkultur auf die obere Fläche aufgebracht wird und mit der Nährlösung überschichtet wird. Die Vermehrung der Zellen erfolgt im Brutschrank. Nach 2 bis 3 Tagen ist Konfluenz erreicht.

Ein besonders gutes Trennen von aufgebrachter Schicht und Nährlösung wird dadurch erreicht, daß der Träger nachfolgend an Schritt a) in eine Waschlösung eingelegt wird. Dabei besteht zweckmäßigerweise die Waschlösung aus einer phosphatgepufferten Salzlösung. Dies hat den Vorteil, daß die Zellkultur mit einer für sie verträglichen und lebensgerechten Umgebung versorgt ist.

Ein dauerhafter fester Sitz der Schicht am Träger ist auch dadurch gewährleistet, daß bei dem Waschvorgang, die mit der Zellkultur bewachsene Fläche andauernd nach oben weist.

Eine besonders aussagekräftige Lumineszenzmessung ist dadurch ermöglicht, daß nachfolgend an Schritt a) vor Schritt b) eine Kontrolle der auf dem Träger haftenden Zellkultur durchgeführt wird. Die Monolayerschicht auf dem dünnen Plättchen ermöglicht eine Betrachtung beispielsweise durch ein gebräuchliches Lichtmikroskop, ohne daß eine besondere Präparation dafür notwendig ist. Man kann somit vor der eigentlichen Lumineszenz­ messung exakt die Oberflächenbesetzung des Trägers feststellen.

Das Einbringen der lumineszenzfähigen ersten Substanz in die Zellkultur des Trägers, erfolgt besonders schonend und ohne Ablösungsgefahr dadurch, daß in Schritt b) der Träger mit einer die erste Substanz aufweisenden Flüssigkeit überschichtet wird.

Zweckmäßigerweise ist dabei diese erste Substanz Luminol.

Ein besonders günstiges Entfernen der überschüssigen ersten Substanz in Schritt c) ist dadurch erreicht, daß der Träger in eine Waschlösung getaucht und die erste Substanz abgewaschen wird, ohne dabei die anhaftenden Zellen zu lösen.

Ein besonders günstiger, die Aktivität bzw. Vitalität der auf dem Träger haftenden Zellkultur nicht beeinflussender Ent­ fernungsvorgang in Schritt c), ist dadurch erreicht, daß die Waschlösung dieselbe, wie die zum Abwaschen der Nährlösung ist. Dadurch ist erreicht, daß die auf dem Träger haftende Zellkultur auch nach diesem Waschvorgang in demselben für sie verträglichen und lebensnotwendigen Medium aufgenommen ist. Dadurch ist es auch möglich, zwischen den einzelnen Verfah­ rensschritten, beispielsweise bei einer Automatisierung des Verfahrens, gewisse Stauzeiten durch Aufbewahren des Trägers in dieser Lösung zu überbrücken.

Eine besonders exakte und aussagekräftige Messung kann dadurch erreicht werden, daß in Schritt d) der plattenförmige Träger in ein eine Meßlösung aufweisendes Gefäß gestellt wird, wobei die Bewuchsfläche auf das photoelektronische Meßgerät zu ge­ richtet ist. Die "Strahlungsquelle" entspricht somit exakt der mit der Zellkultur bewachsenen Trägeroberfläche, die einen konstanten Abstand zum fotoelektronischen Gerät aufweist, so daß eine besonders einfach zu justierende Meßanordnung er­ möglicht ist.

Besonders vorteilhaft stellt das Meßmedium dasselbe Medium wie das Waschmedium zum Abwaschen der Nährlösung bzw. zum Ab­ waschen der lumineszenzfähigen Substanz dar. Dadurch ist die Zellkultur auch während des eigentlichen Meßvorganges mit der Lösung umspült, mit der sie schon in den vorbereitenden Schritten in Kontakt stand, so daß kein wechselnder Einfluß durch dieses Medium auf die Zellkultur ausgeübt wird.

Bei einem Verfahren, bei dem die Wirkung einer die Zellstruktur beeinflussenden dritten Substanz gemessen werden soll, wird diese besonders vorteilhaft vor Schritt b) mit der anhaftenden Zellkultur in Berührung gebracht und anschließend wird diese Substanz abgewaschen.

Gemäß einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem die Wirkung einer die Zellstrukturen beeinflussenden, dritten Substanz gemessen werden soll, kann diese bereits in Schritt a) der Nährlösung zugemischt werden.

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung weist eine von der Außenwelt abschirmbare Kulturschalenvorrichtung auf, in der zumindest ein Träger lösbar unter sterilen Bedingungen aufnehmbar ist, und der zumindest eine Träger ist abwechslungsweise mit Nähr­ lösung, Waschlösung und erster Substanz behandelbar.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der erfin­ dungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, weist der zumindest eine Träger die Form einer dünnen Platte aus Glas, Kunststoff oder dgl. auf, die in waagrechter Position unter eine Fixierleiste einer Kulturschale schiebbar ist, und die Kulturschalenvorrichtung weist mehrere untereinander verbun­ dene Trägeraufnahmebereiche auf. Dadurch können die Träger in der waagrechten Position mit auf der oberen Oberfläche aufgebrachten Kulturschicht gehalten werden, und mehrere derartige Träger gleichzeitig unter gleichen Bedingungen kultiviert werden. Die einzelnen Träger, die mit gleicher und gleichmäßiger Zellkulturschicht versehen sind, können dann mit verschiedenen, beispielsweise toxischen Substanzen behandelt werden, so daß die dann erfolgenden vergleichenden Messungen besonders aussagekräftig sind, da ja von exakt gleichen Zell­ kulturschichten ausgegangen worden ist.

Die Erfindung wird anhand einiger ausgewählter Ausführungsbei­ spiele im Zusammenhang mit der beiliegenden Zeichnung näher beschrieben und erläutert. Es zeigt
die einzige Figur stark schematisiert eine ausgewählte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, die mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt wird.

Die in Fig. 1 schematisch gezeigte Kulturschalte 10 einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, besteht aus einer rechteckigen Kunststoffwanne mit einem diese überlappenden Deckel (hier nicht gezeigt). Der Innenraum ist durch eine nicht über die gesamte Länge durchreichende Längsleiste 12 sowie mehrere davon abstehende Querleisten 14, die sich ebenfalls nicht über die ganze Breite erstrecken, in mehrere Bereiche 18 unterteilt. In dem hier gezeigten Ausführungsbeispiel sind sechs Bereiche 18 gezeigt, in weiteren Ausführungsbeispielen sind zehn solche Bereiche vorgesehen.

Jeder Bereich 18 ist dazu vorgesehen, einen Träger 20 aufzuneh­ men.

Jeder Träger 20 kann dabei unter eine von der Längsleiste 12 etwa mittig zwischen zwei Querleisten 14 ebenfalls in Querrich­ tung vorspringende Fixierleiste 16 geschoben werden, die ausreichend lang ist, einen Träger 20 in einem Bereich 18 zu halten, es jedoch andererseits ermöglicht, einen Träger 20 durch Ergreifen mit einer Pinzette aus einem Bereich 18 heraus­ zuziehen.

In der zuvor angesprochenen Ausführung einer Kulturschale mit zehn Bereichen, weist diese ein inneres Längenmaß von 290 mm und eine Innenbreite von etwa 130 mm auf. Die Längsleiste kann, in Abwandlung der oben beschriebenen Ausführung, auch über die gesamte Schalenlänge verlaufen und diese in zwei abgeschlos­ sene Hälften von jeweils fünf Bereichen teilen. Dadurch wird die Möglichkeit geschaffen, in einem abgeschlossenen System gleichzeitig Versuchs- und Kontrollbedingungen zu schaffen, indem die Zellen einer Reihe mit einer Testsubstanz behandelt werden, die gegenüberliegende Reihe aber unbeeinflußt bleibt. Die lichte Höhe des Innenraums der Kulturschale beträgt 18 mm, die Höhe der Längs- bzw. Querleisten ab Innenboden etwa 15 mm. Die Länge der Fixierleiste beträgt 15 mm und sie ent­ springt aus dem unteren Bereich der Längsleiste knapp oberhalb des Wannenbodens, so daß ein darunter geschobener Träger in der Nähe des Bodens der Kulturschale gehalten ist. Dadurch ist sichergestellt, daß der Träger bei gefüllter Kulturschale stets ausreichend mit Medium bedeckt ist und außerdem das Zellwachstum bei geschlossener Schale unter dem Umkehrmikroskop kontrolliert werden kann. Bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführung mit sechs Bereichen 18, ist der Übersicht halber nur eine Fixierleiste 16 mit darunter eingeklemmten Träger 20 gezeigt, es ist selbstverständlich, daß auch die anderen fünf Bereiche 18 gleichermaßen mit Fixierleisten 16 versehen sind und einen Träger 20 aufnehmen können.

Die Kulturschale 10 ist mit einer Leitung 11 verbunden, über die ein Medium in den Innenraum, wie dies durch einen Pfeil 26 angedeutet ist, eingeführt werden kann.

Bei der Durchführung des Verfahrens wird auf einen eingelegten Träger 20 mittels einer Pipette 22 eine Zellkultur, bestehend aus Mäusefibroblasten der Linie L 929, wie dies durch den Pfeil 24 angedeutet ist, aufgebracht. Der Innenraum der Kul­ turschale 10 ist dabei leer. Soll die Zellkultur unter sterilen Bedingungen aufwachsen, so ist auf der Kulturschale 10, der hier nicht gezeigte Deckel aufgebracht und der Innenraum wurde zuvor mit den bereits eingebrachten Trägern 20 sterilisiert. Der (hier nicht gezeigte) Deckel wird dann unter Sterilbedin­ gungen abgenommen. Mittels der Pipette 22 wird anschließend die Zellsuspension auf den Träger 20 aufpipettiert. Es wird anschließend etwa 3 Minuten gewartet, bis die Zellen Kontakt auf der Oberfläche gefunden haben, dann wird über die Leitung 11 ein Nährmedium zugeführt, wobei die Menge so bemessen wird, daß das Nährmedium die Oberfläche des Trägers 20 überdeckt. Je nach Nährmedium wird bereits nach einem, spätestens nach zwei Tagen Konfluenz auf dem Träger 20 erreicht. Konfluenz bedeutet eine dichtest mögliche Anordnung von haftenden, bzw. adhärenten Zellen, als Monolayer in Kultur.

Ein derart mit einer Zellkultur 28 an adhärenten Zellen bewach­ sener Träger 20, auch Cover Slip (CS) genannt, wird mit einer Pinzette vorsichtig aus der Kulturschale 10 entnommen und in eine weitere Kulturschale 30 eingelegt, die im Prinzip gleich wie die Kulturschale 10 aufgebaut ist, so daß insoweit gleiche Bezugszeichen verwendet werden. Die Kulturschale 30 ist dabei mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS = phosphate buffered saline) gefüllt, die als Waschlösung zum Abwaschen der Nährlösung von der Zellkultur 28 dient. Der Träger 20 wird dabei derart unter die Fixierleiste 16 der Kulturschale 30 geschoben, daß die mit der Zellkultur 28 bewachsene Ober­ fläche nach oben weist. Durch vorsichtiges Schwenken der Kulturschale 30 oder des Trägers 20 wird die adhärente Zell­ fläche gewaschen. Der Waschgang kann auch dadurch erfolgen, daß der PBS-Waschpuffer durch die Kulturschale 30 durchgeführt wird, wie dies durch die Pfeile 32 bzw. 34 angedeutet ist. Dadurch, daß die Längs- bzw. Querleisten 12 bzw. 14 sich nicht über die gesamte Kulturschale 30 ausbreiten, können mehrere Träger gleichzeitig (d.h. im hier gezeigten Ausführungsbeispiel sechs Träger 20) gespült werden.

Vor einer weiteren Behandlung wird die geschlossene Kulturschale 30 unter ein Lichtmikroskop 36 geschoben, um den Aufbau und die Struktur der Zellkultur 28 zu kontrollieren. Dabei wird festgestellt, ob tatsächlich Konfluenz erreicht ist, und ob auch lediglich die gewünschte Kultur sich auf dem Träger 20 angesiedelt hat.

Die Größe der Kulturschale 30 ist dabei derart, daß sie direkt in gängige Lichtmikroskope mit Umkehrvorrichtung eingeführt werden kann, so daß diese Kontrolltätigkeit unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden kann.

In einem weiteren Verfahrensschritt wird der mit adhärenten Zellen versehene Träger 20 aus der Kulturschale 30 entnommen und in eine weitere Kulturschale 40, die was die Ausmaße bzw. die Raumaufteilung betrifft, gleich aufgebaut ist, wie die zuvor beschriebenen Kulturschalen 10 bzw. 30.

Auch hier wird der Träger 20 mit der mit adhärenten Zellen versehenen Fläche nach oben gerichtet unter eine Fixierleiste 16 geschoben.

Die Kulturschale 40 wird anschließend mit einer 0,01%igen Lösung von Luminol (3-Aminophthalsäurehydrazid) derart gefüllt, daß die bewachsene Oberfläche des Trägers 20 überschichtet wird. Dabei kann die Luminollösung, wie dies durch einen Pfeil 42 angedeutet ist, vollautomatisch in die Zellkulturschale 40 eingeführt werden, so daß auch diese Behandlung auch wieder unter sterilen Bedingungen ablaufen kann.

Die Luminol-Einwirkzeit beträgt etwa 1 bis 3 Minuten. Je nach Zellkultur bzw. Versuchsbedingungen können selbstverständlich auch andere Luminol-Konzentrationen verwendet werden.

Nach Ablauf der Einwirkungszeit wird der Träger 20 aus der Kulturschale 40 entnommen und in eine weitere Kulturschale 50 überführt, in der eine auf etwa 37°C erwärmte PBS-Waschpuffer­ lösung eingebracht ist, und in der das überschüssige, d.h. nicht von der Zellkultur 28 aufgenommene Luminol abgewaschen wird. Dieser Vorgang kann wiederum, wie zuvor beschrieben, durch Schwenken der Kulturschale 50 bzw. des Trägers 20 oder auch, wie in Fig. 1 gezeigt, durch Durchströmen der Kulturschale 50 mit dem PBS-Waschpuffer, wie dies durch die Pfeile 52 bzw. 54 angedeutet ist, durchgeführt werden.

Der Träger 20 ist nun so präpariert, daß er der eigentlichen Messung zugeführt werden kann.

Dazu wird der Träger 20 in eine Quarzküvette 60 eingebracht, die mit vertikal verlaufenden Führungsrillen 62 versehen ist, zwischen die der Träger 20 eingeschoben werden kann.

Die Führungsrillen 62 sind dabei in der Nähe einer Rückwand 63 der Küvette 60 angeordnet. Die mit Zellen bewachsene Ober­ fläche des Trägers 20 ist dabei auf eine Vorderseite bzw. Vorderwand 65 der Küvette 60 zu gerichtet.

Die Küvette 60 ist mit einem Meßmedium gefüllt, das im vor­ liegenden Fall wiederum dieselbe phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ist, die bereits zuvor beschrieben wurde und als Wasch­ lösung diente.

Auf dem Boden der Küvette liegt ein mit Teflon überzogenes Ma­ gnetstäbchen, ein sogenannter Rührfisch, das über eine hier nicht gezeigte, unterhalb der Küvette angeordnete Rührvorrich­ tung in Drehung versetzt wird, um das Meßmedium zu rühren. Durch den Rührvorgang wird die die Lumineszenz auslösende Substanz sofort und gleichmäßig mit den Zellen in Kontakt gebracht. Die Meßküvette 60 weist eine Länge von 40 mm, eine Breite bzw. Höhe von 50 mm auf und faßt in etwa 100 ml Flüssig­ keit. Die Küvette wird in einer lichtdicht abgeschirmten, hier nicht gezeigten Meßkammer auf einem Sockel, der auf einer drehbaren Scheibe steht, deponiert. Die Meßkammer weist dabei folgende Innenmaße auf: Länge und Breite jeweils etwa 290 mm, Höhe etwa 265 mm. Im Abstand von der Küvette ist ein Photomul­ tiplier 68 angeordnet, der von der Küvette 60 kommende Strahlung, wie dies durch ein Pfeil 66 angedeutet ist, erfaßt. Die lichtempfindliche Kathode des Photomultipliers ist dabei auf -30°C gekühlt. Die einfallenden Photonen werden durch den Photomultiplier 68 in Spannungsimpulse umgewandelt, die von einer nachgeschalteten Elektronik 70 verstärkt und durch einen angeschlossenen Computer 72 gespeichert und verarbeitet werden können. Die Ergebnisse können graphisch oder numerisch durch einen Drucker 74 mittels eines Ausdrucks 76 ausgedruckt werden.

Bei der eigentlichen Messung wird nach einer je nach Fragestel­ lung beliebig langen Vorlaufzeit, während der das Meßobjekt, d.h. die adhärenten Zellen auf dem Träger 20 unbeeinflußt bleibt, 1 ml einer 1%igen Peroxidase-Lösung über eine lichtdichte Zuleitung von außen, wie dies durch den Pfeil 64 angedeutet ist, in die in der Meßkammer befindliche Küvette 60 injiziert. Die Peroxidase löst die Oxidationsreaktion des Luminols aus, die mit einer Lichtemission verbunden ist, d.h. es tritt jetzt die zu messende Lumineszenz auf. Die Strahlungsintensität ist abhängig von der durch die adhärenten Zellen des Trägers 20 aufgenommenen Menge an Luminol, die wiederum in Abhängigkeit von der Aktivität bzw. Vitalität der Zellen steht. Dadurch können direkt aus der Strahlungsintensität Rückschlüsse auf die Aktivität bzw. Vitalität der Zellen gezogen werden.

Die Meßzeit kann beliebig lange gewählt werden. Da jedoch die meßbare Photonen-Emission relativ schnell abklingt, ist es sinnvoll, die Meßzeit auf maximal 5 Minuten zu beschränken, wobei die Vorlaufzeit etwa höchstens 2 Minuten betragen soll.

Gemessen wird (in counts per second = cps) die Anfangsintensität und die Kinetik der Photonen-Emission nach Zugabe von Peroxi­ dase. Es können auch andere geeignete Enzyme bzw. Enzymgruppen verwendet werden.

In dem zuvor beschriebenen schematischen Verfahrensablauf wurde die Präparation lediglich der Zellkultur beschrieben, so daß die letztendliche Messung Aussagen über die Zellkultur als solche gibt.

Dies ist aber nur ein kleiner Anwendungsbereich des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens. Ein weiteres Hauptanwendungsgebiet ist die Untersuchung der Toxizität von Verbindungen, die mit der Zellkultur in Verbindung gebracht wurden. Das bedeutet, toxische Substanzen vermindern die Aktivität bzw. Vitalität der Zellkulturen, was bei einer Lumineszenzmessung zu einer verminderten Photonen-Emission führt.

Soll die Wirkung einer toxischen Substanz auf die Zellkultur 28 getestet werden, so sind verschiedene Möglichkeiten gegeben, diese toxische Substanz einwirken zu lassen.

Eine erste Möglichkeit besteht darin, einen Träger 20, nachdem er aus der Kulturschale 30 entnommen wurde, d.h. nachdem die Bewuchsdichte mit einem Mikroskop 36 überprüft wurde, und bevor er in die Kulturschale 40 mit Luminol eingebracht wird, in eine weitere, hier nicht gezeigte, gleich ausgebildete Kulturschale einzubringen, in der er dann mit der Lösung der zu testenden Substanz überschichtet wird. Die Einwirkzeit richtet sich nach der angenommenen Toxizität bzw. nach der entsprechenden Fragestellung. Beim Testen beispielsweise der Toxizität von Methanol auf die zuvor genannte Mäusefibroblasten der Linie L 929 wurden Einwirkzeiten zwischen 1 bis 5 Minuten gewählt, wobei verschiedene Konzentrationen an Methanol (100, 90, 80, 70, 40, 10 und 1%) getestet wurden. Nach Ablauf der Einwirkzeit wird der Träger 20 wiederum, wie zuvor beschrieben, in PBS-Puffer gewaschen und danach in die Kulturschale 40 zum Überschichten mit Luminol gegeben.

Im eigentlichen Meßvorgang werden dann in der Küvette 60 einmal die Zellkultur 28 ohne Einfluß der toxischen Substanz Methanol gemessen und anschließend die mit den verschiedenen Konzentra­ tionen behandelten weiteren Proben.

Durch die Abnahme der jeweiligen Photoemission kann dann der Einfluß bzw. die Toxizität ermittelt werden.

Die Messungen sind deshalb besonders aussagekräftig, da die Züchtung der adhärenten Zellen auf den Trägern 20, wie dies zuvor in Zusammenhang mit den Kulturschalen 20 bzw. 30 be­ schrieben wurde, unter exakt gleichen Bedingungen möglich ist, so daß dann lediglich die Parameter der verschiedenen Toxizitätmengen bzw. Einwirkzeiten zu berücksichtigen sind.

Diese Verfahrensweise eignet sich als Schnelltest zur Bestimmung von Wirkungs- bzw. Toxizitätsgrenzen der eingesetzten Testsub­ stanzen, z.B. von Umweltgiften, Arzneistoffen o. dgl.

Eine weitere Möglichkeit zum Einbringen der zu testenden Substanzen besteht darin, diese bereits bei der Anzucht der Zellen diesen beizumischen. Dabei wird die Testsubstanz dem Nährmedium zugemischt, das, wie zuvor beschrieben, im ersten vorbereitenden Schritt der Kulturschale 10 über die Leitung 11 zugeführt wird. Die durchgeführten Emissionsmessungen geben dann aussagekräftige Informationen darüber, welchen Einfluß diese Substanzen auf die Wachstumsrate bzw. die Vitalität der Zellkulturen ausüben. Diese Möglichkeit bietet sich insbesondere für längerfristige bzw. Langzeittests an und vor allem für die Bestimmung von Wirkungs- bzw. Toxizitätsgrenzen hochver­ dünnter Testsubstanzen.

Bei der Emissionsmessung wird dann die Anfangsintensität und die Kinetik der Photonen-Emission nach Zugabe der Peroxidase gemessen. Der Vergleich von vitalen (d.h. unbeeinflußten) Zellen zu toxisch beeinflußten Zellen (hier verschiedene Konzentrationen an Methanol) ergibt eine unterschiedliche Anfangsintensität, wobei die Strahlungsintensität der vitalen Zellen jeweils deutlich höher liegt als diejenige von Zellen, die geschwächt bzw. abgetötet wurden. Es konnte auch bei abgetöteten Zellen noch eine gewisse Strahlung gemessen werden, die damit erklärt werden kann, daß nicht alle Proteine von abgetöteten Zellen sofort denaturieren und daher noch gewisse Mengen an Luminol binden können.

Das zuvor anhand der schematischen Darstellung von Fig. 1 beschriebene Verfahren bediente sich in den einzelnen Behand­ lungsschritten verschiedener Kulturschalen 10, 30, 40, 50. Diese Aufteilung in verschiedene Schalen ist insbesondere für wissenschaftliche Untersuchungen, die mit verschiedenen zahlreich variierten Versuchsbedingungen ablaufen sollen, geeignet.

Soll das Verfahren zur routinehaften Messung der Einflüsse bestimmter Substanzen auf Zellkulturen gemessen werden, bei­ spielsweise die Einwirkung eines Giftes oder Medikamentes auf menschliche Zellen, so kann anstatt der verschiedenen Kul­ turschalen nur eine einzige verwendet werden, in der dann die einzelnen Schritte aufeinanderfolgend durchgeführt werden. Wie zuvor beschrieben, sind die Kulturschalen 10, 30, 40 und 50 jeweils gleich aufgebaut gewesen, so daß die darin ablaufen­ den Tätigkeiten auch in einer einzigen Kulturschale durchgeführt werden können. Dabei ist die Kulturschale dann mit entsprechen­ den Anschlüssen versehen, durch die nacheinanderfolgend die Nährlösung beim Kultivierungsvorgang, anschließend die diversen Waschlösungen bzw. Luminollösungen zugeführt bzw. abgeführt werden können. Es ist dann nur noch erforderlich, den für die Messung fertig präparierten Träger in eine Meßküvette zu überführen, wobei auch dieser Vorgang vollautomatisch bzw. unter sterilen Bedingungen ablaufen kann, so daß eine voll­ automatische Durchführung des Verfahrens mit der erfindungs­ gemäßen Vorrichtung möglich ist.

Nach Beenden einer Lumineszenzmessung haftet die Zellkultur 28 weiterhin am Träger 20, so daß es möglich ist, diesen Träger nach der Messung wieder aus der Küvette 60 herauszunehmen, beispielsweise mit dem Phosphatpuffer abzuwaschen und erneut in eine Nährlösung oder Pufferlösung zu geben, d.h. die Zell­ kultur ist nach einer Emissionsmessung nicht verloren, sondern kann zu weiteren Untersuchungszwecken verwendet werden oder auch lediglich aufbewahrt werden.

Claims (19)

1. Verfahren zur Bestimmung der Lumineszenz von Zellkul­ turen, wobei diese mit einer lumineszierfähigen, die natürliche Lumineszenz verstärkende, ersten Substanz versehen werden, anschließend mit einer, die Lumineszenz auslösende, zweiten Substanz behandelt werden, und die Lumineszenz photoelektronisch erfaßt wird, ge­ kennzeichnet durch,

• a) Kultivieren der zu untersuchenden Zellkultur auf einem Träger haftend,
• b) Behandeln der auf dem Träger haftenden Zellkultur mit der lumineszenzfähigen ersten Substanz,
• c) Entfernen der überschüssigen, nicht von der am Träger haftenden Zellkultur aufgenommenen ersten Substanz, und
• d) Messen der lediglich von der Zellkultur emittierten Strahlung nach Zugabe der zweiten, die Lumineszenz auslösenden Substanz.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß in Schritt a) als Träger ein dünnes Plättchen aus Kunststoff, Glas o. dgl. verwendet wird, dessen eine Oberfläche mit einem Zell­ kultur-Monolayer kultiviert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß auf die Oberfläche des Trägers zunächst nur die Zellkultur aufgebracht wird und dieser ein gewisser Zeitraum, vorzugsweise etwa 3 Minuten, gegeben wird, und anschließend eine Nährlösung zugegeben wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Träger waagrecht gehalten ist, daß die Zellkultur auf die obere Fläche aufgebracht wird, und daß der Träger mit der Nährlösung überschichtet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger nachfolgend an Schritt a) in eine Waschlösung eingetaucht wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Waschlösung eine phosphatgepufferte Salzlösung ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß die mit der Zellkultur bewachsene Fläche des Trägers jeweils nach oben weist oder senkrecht eingetaucht wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß nachfolgend an Schritt a), jedoch vor Schritt b), eine Kontrolle der auf dem Träger haftenden Zellkultur durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) die auf dem Träger haftende Zellkultur mit einer die lumineszenzfähige erste Substanz aufweisenden Flüssigkeit überschichtet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die erste Substanz Luminol oder eine andere, die Lumineszenz hervorrufende und/oder verstärkende Substanz ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c) der Träger in eine Waschlösung getaucht und in dieser die erste Substanz abgewaschen wird, soweit sie nicht von den Zellen gebunden wurde, ohne dabei die adhärenten Zellen zu lösen.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch ge­ kennzeichnet, daß bei dem Waschvorgang der plattenförmige Träger waagrecht mit der Zellkultur­ schicht nach oben gerichtet oder senkrecht eingetaucht wird.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Waschlösung dieselbe wie die zum Abwaschen der Nährlösung ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt d) ein plattenförmiger Träger in ein eine Meßlösung aufweisendes Gefäß gestellt wird, wobei die mit der Zellkultur bewachsene Fläche auf ein photoelek­ tronisches Meßgerät zu gerichtet ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Meßlösung dasselbe Medium ist, wie das Waschmedium zum Abwachen der Nähr­ lösung bzw. der lumineszenzfähigen Substanz.

16. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, bei dem die Wirkung einer die Zellstruktur beeinflussen­ den dritten Substanz gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß vor Schritt b) die anhaftende Zellkultur mit der beeinflussenden Substanz in Berührung gebracht wird, und daß anschließend diese Substanz abgewaschen wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei dem die Wirkung einer die Zellstruktur beeinflussenden dritten Substanz gemessen wird, dadurch ge­ kennzeichnet, daß in Schritt a) einer Nährlösung zur Kultivierung der Zellkultur die beein­ flussende Substanz zugemischt ist.

18. Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17, mit einer Küvettenvorrichtung (60) zur Aufnahme einer mit einer lumineszierfähigen Substanz versehenen Probe, wobei in die Küvettenvorrich­ tung (60) eine zweite, die Lumineszenz auslösende Substanz einführbar ist, sowie mit einer Photomulti­ pliervorrichtung (68, 70, 72, 74, 76) zum Erfassen, Zählen und Auswerten der von der Probe ausgestrahlten Strahlung, dadurch gekennzeich­ net, daß zumindest eine von der Außenwelt abschirm­ bare Kulturschalenvorrichtung (10, 30, 40, 50) vorgesehen ist, in der zumindest ein Träger (20) lösbar unter sterilen Bedingungen aufnehmbar ist, und daß der zumindest eine aufgenommene Träger (20) abwechslungsweise mit Nährlösung, Waschlösung, lumineszenzfähiger ersten Substanz behandelbar ist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der zumindest eine Träger (20) die Form eines dünnen Plättchens aus Glas, Kunst­ stoff o. dgl. aufweist, das in waagrechter Position unter eine Fixierleiste (16) einer Schale (20, 30, 40, 50) schiebbar ist, und daß die Schale mehrere untereinan­ der verbundene Trägeraufnahmebereiche (18) aufweist.