DE2722391A1

DE2722391A1 - Verfahren zur bestimmung eines chemischen stoffes durch ermittlung freigesetzter elektromagnetischer strahlung

Info

Publication number: DE2722391A1
Application number: DE19772722391
Authority: DE
Inventors: Marlene A Prof Deluca-Mcelroy
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1976-12-14
Filing date: 1977-05-14
Publication date: 1978-06-15
Also published as: CA1094477A; FR2374643A1; GB1571466A; JPS5374492A; FR2374643B1

Description

Hamburg, den 10. Mai 1977 202477

Anmelder;

The Regents of the University of California 22OO University Avenue

Berkeley, CaI., 94720, Ver.St.A.

Verfahren zur Bestimmung eines chemischen Stoffes durch Ermittlung freigesetzter elektromagnetischer Strahlung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung eines chemischen Stoffes, bei dem dieser Stoff innerhalb eines Reaktionsmediums unter Freisetzung elektromagnetischer Strahlung umgesetzt und die erzeugte Strahlung gemessen wird, und betrifft insbesondere eine diagnostische Untersuchungsmethode zur biochemischen Bestimmung speziell sehr kleiner Mengen von an StoffwechselvorgHngen beteiligten chemischen

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Substanzen, beispielsweise Enzymen und Enzymsubstraten, Antigenen und Antikörpern und dergleichen. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich als analytische Methode, bei der ein zu ermittelnder chemischer Stoff, im allgemeinen ein Biomaterial, entweder über miteinander in Beziehung stehende Zwischenreaktionen oder direkt mit einem eine elektromagnetische Signalstrahlung erzeugenden System reagiert, in dem die Verbindung oder, wenn es sich um Zwischenreaktionen handelt, deren Vorverbindung unter Freisetzung von elektromagnetischer Strahlung in ein Endprodukt umgesetzt wird.

Bei Lebensvorgängen stattfindende Umsetzungsprozesse erfolgen in einer Vielzahl von ineinander überqehenden voneinander abhängigen biochemischen Reaktionen, die miteinander in Beziehung stehen und entweder gleichzeitig stattfinden oder in sorgfältig geregelter Reaktionsfolge ablaufen. Zahlreiche Prozesse dieser Art, bei denen relativ große Mengen an Materialien beteiligt sind, z.B. Stoffwechselvorgänge, können Ihrerseits durch geringe Mengen von Biostoffen, z.B. Enzymen oder Hormonen, gesteuert sein. In anderen Fällen, bei Fehlverhalten und/oder Krankheit des Organismus können extrem geringe Mengen an Riostoffen aus ihrem üblichen Wirkungsbereich in andere Organsysteme freigesetzt werden. Die Entdeckung und quantitative Bestimmung dieser Biostoffe sowohl in ihrem üblichen Wirkungsbereich als auch in unüblichen Bereichen kann eine wichtine Information bezüglich der Funktionsfähigkeit sowohl großer als auch kleiner Organsysteme bringen und kann ein Hinwels für Fehlverhalten eines Systems und/oder Krankheit sein und Aufschluß über das Eindringen von Fremdkörpern, wie beispielsweise Bakterien oder Viren, geben. Als Biostoff wird dabei generell jede beliebige chemische Verbindung verstanden, die sich im lebenden Organismus findet.

In den vergangenen Jahren sind zahlreiche Techniken zur Bestimmung sehr geringer Mengen an Biostoffen entwickelt worden.

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Dazu gehören beispielsweise radioaktive Spurenanalyse, fluometrische Verfahren, F.*irbetechniken, Bioluminescenz, Chemieluminescenz und dergleichen. Diese Arbeitsweisen basieren auf den interessierenden Stoffen eigenen Eigenschaften, die sich dazu eignen, Signale abzugeben, die man mit entsprechenden Instrumenten aufnehmen kann, oder die sich zur Kombination mit oder Anlagerung von Substanzen eignen, die, wenn sie mit den interessierenden Stoffen reagieren, solche Signale abgeben oder zur Abgabe solcher Signale gebracht werden können.

Bei der speziellen analytischen Arbeitsweise, auf die sich das erfindungsgemäße Verfahren bezieht, finden Reaktionen statt, bei denen elektromagnetische Strahlung entsteht. Speziell handelt es sich um solche elektromagnetische Strahlung entwickelnde Systeme, bei denen Licht entsteht, und zwar entweder durch die Reaktion eines biochemischen Stoffes mit einem Protein oder durch die Enzym-angeregte Reaktion des Materials mit einer zweiten chemischen Substanz. Solche Lebensvorgängen entsprechende Systeme, bei denen Proteine, einschließlich Enzymen, beteiligt sind, werden nachfolgend als Bioluminescenz-Reaktionen bezeichnet. Es existiert ausführliche Literatur darüber, siehe beispielsweise Johnson und Mitarb, in "Photophysiology", Band 7, Seiten 275-334 (1972). Die Quellen der Reaktion steil nehmer für solche Reaktionen und die Reinigungsmethoden für die Reaktionskomponenten sind dem Fachmann bekannt. Unter "elektromagnetische Strahlung erzeugend" werden in der vorliegenden Anmeldung solche chemischen Systeme verstanden, aus denen bei Reaktion einer der Komponenten des Systems mit einer anderen, unabhängig davon, ob bei dieser Reaktion ein Katalysator erforderlich ist, elektromagnetische Strahlung freigesetzt und abgegeben wird, wobei wenigstens ein Produkt gewonnen wird, das, bevor das System reagiert hat, als Komponente nicht vorhanden war.

Die bei einem Bioluminescenz-Reaktionssystem erzeugte elektromagnetische Strahlung ist direkt proportional der Menge an der-

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jenigen der für den Eintritt der Reaktion erforderlichen Komponenten, die diese Reaktion limitiert. So entsteht beispielsweise Licht, wenn das Enzym Luciferase in Anwesenheit von Adenosi ntri phosphat (ATP) und Sauerstoff als weitere essentielle Faktoren oxidierend auf das Substrat Leuchtkäfer-Luciferin einwirkt. Die Reaktion läßt sich wie folgt summarisch wiedergeben:

Luci ferase

+ Licht *+ CO

Luciferin + ATP + Q- ^- oxidiertes Luciferin

+ AMP + H,0 + P-P

Darin bedeutet AMP Adenosinmonophosphat und P-P Diphosphat. Bei der Oxidation jedes Luciferin-Moleküls entsteht eine bestimmte Menge Licht, und die Gesamtmenge an erzeugtem Licht ist direkt proportional der Anzahl an oxidierten Molekülen. Dementsprechend kann man aus dem Meßwert für die Lichtausbeute die Anzahl an an der Reaktion beteiligten Luciferin- , ATP- oder Sauerstoff-Molekülen entnehmen, je nach dem, welche dieser drei Komponenten in molarem Überschuß vorhanden ist, oder man kann die Aktivität des Katalysators, Luciferase, bestimmen.

Wenn ATP der am wenigstens reichlich vorhandene Stoff ist, dann hört die Reaktion auf, wenn die Gesamtmenge an ATP verbraucht ist. Wenn andererseits Sauerstoff in der vergleichsweise geringsten Meηie anwesend ist, dann endet die Reaktion, wenn aller Sauerstoff aufgebraucht ist. In gleicher Weise kann man die Aktivität der Luciferase bestimmen, wenn deren Aktivität der begrenzende Faktor bei dem Reaktionsablauf ist. Die am besten genauen und vollständigen Resultate erhält man dann, wenn man sicherstellt, daß alle von der einen unbekannten Komponente, deren Konzentration oder Aktivität bei dem Versuch bestimmt werden soll, verschiedenen Komponenten des Bioluminescenz-Systems in einem molaren Oberschuß vorhanden sind. Ähnliche Überlegungen gelten, wenn man das System mit bakterieller Luciferase für die Analyse eines chemischen Stoffes, zum Beispiel eines Biomaterials, einzusetzen beabsichtigt. Bakterielle Luciferase katalysiert die Oxydation von reduziertem Flavinmononucleotid mit Sauerstoff in Anwesenheit eines langkettigen

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Aldehyds, wobei neben anderen Produkten Licht erzeugt wird. Dieses System benutzt man typischerweise zur Bestimmung von reduziertem Flavinmononucleotid. Das Flavinmononucleotid kann das Produkt einer Reaktion oder einer Reihe von Reaktionen sein, wobei das Flavinmononucleotid gegebenenfalls in einer Menge produziert wird, die einem chemischen Stoff direkt proportional ist, der in der ersten Stufe der Reihe von Reaktionen umgesetzt worden ist. Beispielsweise oxidiert eine Dehydrogenase, wie beispielsweise Flavinmononucleotid-Oxidoreduktase, die reduzierte Form von Nicotinadenindinucleotid, das seinerseits von einer anderen Dehydrogenase zu reduziertem Flavinmononucleotid umgesetzt werden kann. Das Produkt Flavinmononucleotid lHßt sich dann als limitierende Komponente in dem bakteriellen Luciferase-System verwenden. Das so erzeugte Licht ist ein Maß für das ursprünglich reduzierte Nicotinadenindinucleotid. Es läßt sich eine Vielzahl von Reaktionen dieser Art so miteinander kuppeln, daß man schließlich ein Produkt gewinnt, das mittels einer Bioluminescenz-Reaktion bestimmbar ist. Folglich kann jede beliebige chemische Verbindung, die sich so umsetzen läßt, daß man damit eine stöchiometrisch äquivalente Menge an ATP oder reduziertem Flavinmononucleotid erzeugen kann, entweder mit dem Leuchtkäfer-Luciferase-System oder mit einem System von bakterieller Luciferase untersucht werden. Die zuvor beschriebenen Bioluminescenz-Reaktionen hat man schon für qualitative oder quantitative gekoppelte oder direkte Untersuchungen benutzt, vergleiche beispielsweise Hammerstedt "Analytical Biochemistry" 52 : 449-455 (1973); Brolin und Mitarb. "Analytical Biochemistry" 39 :441-453 (1971); und US-PS 3,679,312 von Mansberg. In solchen Fällen, in denen diese Versuche bisher in einem flüssigen Medium durchgeführt wurden, haben sich alle Reaktionskomponenten in Lösung befunden und waren demzufolge homogen untereinander verteilt.

Wenn sehr geringe Mengen einer chemischen Substanz oder eine sehr geringe Aktivität eines Enzyms untersucht werden sollen,

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ist bei den wie zuvor beschriebenen VErfahren die Menge an erzeugter elektromagnetischer Strahlung entsprechend gering. Darüber hinaus liegen, da diese Reaktionen bisher in Lösung durchgeführt worden sind, die Strahlung emittierenden Komponenten in verdünnter Form vor und die Strahlung wird durch ein Volumen hindurch emittiert, so daß die Strahlungsintensität niedriger ist, als wenn man die Reaktlonskomponenten in hohen Konzentrationen einsetzen würde. Dadurch wird die Versuchsgenauiakelt bzw. Versuchsempfindlichkeit negativ beeinflußt. Darüber hinaus gilt, daß, je größer und stärker opak das Volumen der Flüssigkeit ist, desto/ίIt⁶Hie Selbstabsorption der emittierten Strahlung, bevor diese durch die Lösung hindurchgetreten ist und von einem geeigneten Instrument aufgenommen werden kann. Schließlich wird bei den gebräuchlichen Arbeitsweisen die Strahlung als aus einem transnarenten Behälter emittiertes Licht gemessen. Da die Behälterwandungen naturgemäß Unregelmäßigkeiten aufweisen, treten unvorhersehbare Lichtbrechungen auf, und dementsprechend sind bei den Versuchen unterschiedliche Voraussetzungen nicht zu vermeiden.

Ein weiterer Nachteil bei der Ausführung von auf Basis elektromagnetischer Strahlung bsierenden Versuchen in Lösung ist der Verlust an teuren Reaktionskomponenten, wie beispielsweise Enzymen und Coenzymen. Es gibt in der Regel keine einfache Methode, um solche Stoffe aus Lösung zurückzugewinnen. Man muß nach jedem Versuch die Lösung verwerfen und für jeden einzelnen nachfolgenden Versuch neues Reaktionsmaterial einsetzen.

Es ist zwar in der Fachliteratur schon bekannt, zum Konservier ren von wertvollem Enzymmaterial und für dessen mehrmalige Benutzung Enzyme unterschiedlicher Art an unlöslichen Trägern zu verhaften oder miteinander zu fixieren, so daß das Material während des Reaktionsprozesses nicht in die Lösung ausgelaugt wird, sich nicht löst und icht verlorengeht, vergleiche beispielsweise US-PS 3,925,157 von Hamsher; US-PS 3,930,950 von

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Royer; US-PS 3,959,079 von Mareschi und Mitarb.; sowie US-PS 3,542,662 von Hicks und Mitarb.; in denen verschiedene Methoden und Stoffe beschrieben sind, mit denen sich Enzyme an Trägermaterialien anlagern lassen. Eine Abhandlung von H.H. Weetall über den Chemismus der Enzym-Immobilisierung findet sich in "Analytical Chemistry", Band 46, Seiten 6Ο2Λ ff. (1974) , und die Anwendung von immobilisierten Enzymen ist erläutert in "Analytical Chemistry", Band 48, Seiten 544Λ ff. (1976). Bisher ist es jedoch nicht bekannt, daß man bioluminescierende Proteine, wie beispielsweise Luciferasen, so immobilisieren kann, daß sie sich aus einer Untersuchungslösung wiedergewinnen und für weitere Versuche einsetzen lassen. In gleicher Weise ist es bisher nicht bekannt, Flavinmononucleotid-Oxidoreduktase zu immobilisieren.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, wenigstens eine Komponente eines elektromagnetische Strahlung erzeugenden Biolumines cen ζ -Sy st ems an einem festen Träger zu immobilisieren und ein Verfahren zu schaffen, mit dem sich im Verlauf der Chemoluminescenz emittierte elektromagnetische Strahlung konzentrieren und intensivieren läßt und mit dem man Bioluminescenz-Systeme, die während der Reaktion mit geeigneten Substraten in flüssigem Reaktionsmedium sichtbares Licht emittieren, immobilisieren und konzentrieren kann.

Diese Aufgabe wird gelöst mittels eines Verfahrens zur Bestimmung eines chemischen Stoffes, bei dem dieser Stoff in einem Reaktionsmedium homogen unter Erzeugung elektromagnetischer Strahlung umgesetzt und die erzeugte Strahlung gemessen wird, das erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet ist, daß man wenigstens eine Komponente des Systems innerhalb einer bestimmten Region des Reaktionsmediums immobilisiert bzw. fixiert.

Das erfindungsgemfiße Verfahren kann als Methode zur Bestimmung sehr kleiner Mengen von chemischen Stoffen dienen, wobei ein solcher chemischer Stoff oder ein Reaktionsprodukt aus einem

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solchen Stoff mit einem Bioluminescenz-Reakttonssystem gekuppelt wird, in dem wenigstens eine Bioluminescenz-erzeugende Komponente an einem festen Träger konzentriert und !"mobilisiert bzw. fixiert ist.

Vorteilhaft werden die Enzyme bakterielle Luciferase und Flavinmononucleotid-Oxidoreduktase durch covalente Bindung fixiert, wobei dafür gesorgt wird, daß ausreichende Enzymaktivität verbleibt, um die Enzyme bei dem Versuch wirksam einzusetzen.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß man wenigstens eine Komponente eines Chemieluminescenz-Systems so in ein flüssiges Reaktionsmedium einbringen kann, daß man in dem System an dieser Komponente keinerlei Verlust erleidet.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die bisher in undurchsichtigen oder unterschiedlich opaken flüssigen Reaktionsmedien in kauf zu nehmenden Variationen der in solchen Chemieluminescenz- und Bioluminescenz-Systemen erzeugten elektromagnetischen Strahlung und deren Auswirkung auf die Versuchsergebnisse sowie die durch die Ungenau!gkei ten der Behälterwände des Flüssigkeitsbehälters bedingten Versuchsfehler ausgeschaltet werden können.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich chemische Stoffe, einschließlich biologischer Materialien, wie Enzyme, Substrate, Antikörper, Antigene und dergleichen, in sehr geringen Mengen (bis herunter zu picomol-Bereiche) durch den Einsatz von elektromagnetische Strahlung erzeugenden Reaktionen, wie durch Licht-emittierende Enzyme katalysierte Systeme von bakterieller Luciferase und Leuchtkäfer-Luciferase, bestimmen. Die Empfindlichkeit der Untersuchungssysteme läßt sich verstärken dadurch, daß man wenigstens eine Komponente der elektromagnetische Strahlung erzeugenden Reaktion auf einem festen Trägermaterial lokalisiert und konzentriert.

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Die Komoonente wird dadurch inunobi lisiert und unlöslich gemacht. Die lokalisierte, immobilisierte Komponente wird in flüssigem Medium mit geeigneten Reaktionskomponenten in Kontakt gebracht, und in dieser Weise werden elektromagnetische Signale in einem lokalisierten Bereich des Reaktionsmediums, beispielsweise auf dem Trägermaterial, produziert. Die Signale werden dabei intensiviert und lassen sich mit geeigneten Instrumenten auffangen. Man kann das die elektromagnetische Strahlung erzeugende System auch mit anderen Reaktionen kuppeln, bei denen eine für das System erforderliche Komponente erzeugt wird, und dabei kann man auch einen solchen chemischen Stoff ermitteln, der bei einer der Kupplungsreaktionen beteiligt ist.

Sonstige Einzelheiten und weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in der nachfolgenden Beschreibung erläutert und in den Ansprüchen angegeben.

Während man, wie zuvor gesagt, bei den bisher bekannten Analysenverfahren, in denen dadurch auf eine chemische Substanz geprüft wurde, daß diese Substanz mit einem vollständig homogen innerhalb eines Reaktionsmediums verteilten elektromagnetische Strahlung erzeugenden System zur Reaktion gebracht und als Maß für die Verbindung die dabei erzeugte Strahlung gemessen wurde, wird beim erfindungsgemäßen Verfahren wenigstens eine Komponente eines solchen elektromagnetische Strahlung erzeugenden Systems innerhalb einer bestimmten lokalisierten Region des Reaktionsmediums immobilisiert bzw. fixiert. Dabei wird die erzeugte Strahlung an einem bestimmten Abgabeort oder Emmisionsbereich konzentriert und nicht mehr innerhalb der gesamten Umgebung, in der die Reaktion stattfindet, verstreut.

Vorzugsweise wird beim erfindungsgemäßen Verfahren die eine der Komponenten des elektromagnetische Strahlung erzeugenden Systems an einem solchen Träger fixiert bzw. immobilisiert, der in dem Reak ti ons medi um, gewöhnlich eine flüssige Lösung,

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insbesondere eine wässerige Lösuna, unlöslich ist. Man kann eine solche Komnonente jedoch auch so vorbehandeln, daß sie ohne Einsatz eines TriuTermaterials unlöslich wird, beispielsweise kann man sie polymerisieren. Besonders vorteilhaft ist es, diese Komponente so an dem Trägermaterial zu binden, daß sie von der Lösung nur wenig und in unbeachtlich geringer Menge ausgelaugt wird. Dies ist besonders dann bedeutsam und vorteilhaft, wenn man die immobilisierte Komponente in mehreren Versuchen bzw. Untersuchungen einzusetzen wünscht oder einsetzen muß; man sichert damit die Wiederholbarkeit der Versuche, denn wenn die Komponente in Lösung gehen könnte, würde sich die zur Verfügung stehende Aktivität der Komponente in einem Versuch während der Einsatzdauer ständig vermindern, und die so gewonnenen Ergebnisse aus mehreren Versuchen wären entsprechend variiert und ungenau, sofern nicht sher häufig Nullbzw. Standard-Probeuntersuchungen gemacht würden, was unpraktisch ist. Natürlich würde durch einen solchen Aktivitätsverlust auch die Versuchsempfindlichkeit geringer. Es hat sich darüber hinaus erwiesen, daß es vorteilhaft ist, die Komponente mittels covalenter Bindung an dem Trägermaterial zu fixieren.

Beispielsweise kann bei Verwendung eines mit bakterieller Luciferase arbeitenden Systems FMN gemäß der bei Waters und Mitarb, in "Biochem.Rlophys. Research Comm." 57 (4): 1152-1158 (1974) beschriebenen Methode auf einem Träger in den unlöslichen Zustand gebracht werden. Die Anmelderin hat gefunden, daß in dieser Weise unlöslich gemachtes FMN durch auf reduziertes Pyridlnnucleotid wirkende FMN-Oxidoreduktase reduziert werden kann. Das unlöslich gemachte, reduzierte FMN partizipiert seinerseits an dem in üblicher Weise löslichen System mit bakterieller Luciferase. Jedoch wird ebenso wie in dem Fall, daß Luciferase in löslich gemachtem Zustand vorliegt, Licht nur an der Stelle freigesetzt, an der sich das unlöslich gemachte reduzierte FMN befindet. Zusammengefaßt stellt man fest, daß sich die lokalisierte konzentrierte Abgabe von Licht, wie sie dem erfindungsgemäßen Verfahren zugrunde liegt, am

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besten erreichen läßt, wenn man eine oder emhrere Komponenten des die elektromagnetische Strahlung erzeugenden Systems an einem unlöslichen Trägermaterial covalent bindet.

Die Befestigung und Bindung an dem Trägermaterial kann man mittels irgendeiner der dem Fachmann bekannten Methoden vornehmen, wie man sie zum Immobilisieren von Enzymen und ähnlichen Biomaterialien schon benutzt hat. Es ist lediolich erforderlich, daß der Befestigungs- bzw. BindungsVorgang die Funktionsfähigkeit der immobilisierten Komponente nicht beeinträchtigt. Auch ist es vorteilhaft, so viel wie möglich von der Komponente an der Oberfläche des Trägermaterials zu konzentrieren, damit (1) den anderen Reaktionskomponenten der leichte Zugang gewahrt bleibt, und (2) die emittierte Strahlung von dem Trägermaterial nicht verdeckt oder absorbiert wird. Besonders geeignet sind für Strahlung transparente Trägermaterialien, wie beispielsweise Glas, und diese werden beim erfindungsgemäßen Verfahren bevorzuat benutzt.

Besonders handlich ist es, wenn man das Trägermaterial in Form von Stangen, Streifen oder ähnlichen Formkftroern einsetzt, die man in die Reaktionslösung eintauchen, leicht handhaben, reinigen und für spätere Benutzung und Wiederverwendung aufbewahren kann. Wenn man mit Bioluminescenz-Systemen arbeitet, so ist es besonders zweckmäßig, die Enzyme zu immobilisieren, da diese besonders empfindlich sind und ihre mehrfache Wiederverwendung andernfalls fraglich ist, und weil es sich dabei im allgemeinen um die kostspieligste Komponente des Bioluminescenz-Systems handelt. Enzyme lassen sich mittels dem Fachmann bekannter Arbeitstechniken immobilisieren und unlöslich machen. Besonders ausführlich sind Arbeitswelsen dieser Art und auch Trägermaterialien in "Methods in Enzymology", Academic Press, 1974, beschrieben.

Den Trägerstoff kann man aus einer Vielzahl von Materialien auswählen. Die hauptsächlichen Eigenschaften eines Trägers sind (1) die Fähigkeit, eine Komponente des elektromagnetische

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Strahlung erzeugenden Systems entweder über eine physikalische oder über eine chemische Bindung zu immobilisieren oder zu "fixieren", ohne daß (2) dadurch die Aktivität der "fixierten" Komponente leidet. Der Träger sollte auch (3) dazu geeignet und fähig sein, eine relativ große Menge an dieser Komponente auf einer möglichst eng begrenzten Oberfläche oder innerhalb eines möglichst kleinen Volumens zu immobilisieren und zu konzentrieren. Dementsprechend sollte das Trägermaterial eine hohe Oberflächenkonzentration an bindungsfähigen Stellen aufweisen. Es ist weiterhin vorteilhaft, Träger mit porösen oder gewellten Oberflächen einzusetzen.

Es eignen sich dazu eine große Anzahl von Materialien, zu denen beispielsweise synthetische organische Polymeren, wie Acrylharze, Polyacrylamide, Polyacrylsäure^ Methacrylate, Polystyrole, Nylons und dergleichen gehören; Carbohydratpolymere, wie beispielsweise vernetzte Polysaccharide (wie sie unter den Warenzeichen "Sephadex" und "Sepharose" im Handel sind) sowie Agarose und Derivate davon; alle Arten von Zellstoff, einschließlich Celluloseprodukten und deren Derivate; sowie sonstige Materialien, wie beispielsweise Kieselsäuren, unlösliche Proteine, Tone, Harze, Stärken und dergl. Besonders vorteilhaft sind optisch tranparente Materialien, die den Durchtritt der aus den an ihrer Oberfläche "fixierten" immobilisierten Komponenten freiwerdenden elektromagnetischen Strahlung möglichst wenig hemmen. Für die erfindungsgemäßen Zwecke sind als Trägermaterial beispielsweise poröse Gläser, speziell aus Acrylamin oder Acrylaminarten hergestellte Gläser geeignet, wie sie von der Firma Corning Glass, Biological Products Div., auf den Markt gebracht werden. Solche porösen Gläser vermögen mit den Bioluminescenz-Systemen zugehörigen Enzymen unter Bildung von starken, nicht-auslaugbaren covalenten Bindungen zu reagieren; sie sind inert und über lange Benutzungszeiten stabil, und sie sind transparent für die abgegebene Strahlung.

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Die porösen Gläser sind in Form von kleinen losen Kugeln erhältlich. Für die erfindungsgemäßen Zwecke ist es besonders vorteilhaft, die Komponente auf Stagen oder Stäben zu immobilisieren; damit läßt sich die abgegebene Strahlung bestmöglich konzentrieren und lokalisieren. Die Immobilisierung der Komponente in Stabform erleichtert darüber hinaus das Einbringen der immobilisierten Komponente in Standard-Küvetten.

Bei einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Träger ein Bündel aus optisch leitenden Fasern verwendet. Solche Fasern, bekannt als "Faseroptik" sind im Handel erhältlich. Die elektromagnetische Strahlung erzeugende Komponente wird auf einer einen Lichtstrahl aufnehmenden und weiterleitenden Oberfläche der Faser oder des Faserbündeis immobilisiert. Dies ermöglicht es, die Faseroberflache ganz einfach in die Untersuchungsprobe einzutauchen und die erzeugte Strahlung dadurch zu messen, daß man die Strahlung durch die Faser auf ein strahlunganzeigendes Gerät an einer von der Untersuchungsprobe entfernten Stelle leitet. In dieser Weise wird die Strahlungsmessung nicht durch die Opazität des Probenmaterials oder Unregelmäßigkeiten in dem Probenbehälter beeinträchtigt.

Man kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens auch solche chemischen Verbindungen untersuchen, die nicht direkt an der die Strahlung freisetzenden Reaktion beteiligt sind. Dazu bedient man sich einer wie zuvor beschriebenen Kuppelungs-Arbeitsweise, wobei man ein Produkt einer Reaktion als eine der Reaktionskomponenten in einer darauffolgenden Reaktion benutzt. Ein schließliches Endprodukt wird dann als wesentliche und limitierende Reaktionskomponente in einer strahlungabgebenden Reaktion benutzt, und man bestimmt die Menge und Intensität der aus dieser Endreaktion freigesetzten Strahlung. Die Konzentration oder Aktivität der ursprünglichen Verbindung kann dann aus dieser in der Endreaktion emmittierten Strahlung rechnerisch ermittelt werden.

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Wenn die immobilisierte, strahlungerzeugende Komponente sich wieder zu der Form umwandelt, die sie vor der Strahlungsabgabe aufwies, oder wenn sie während der Strahlungsabgebenden Reaktion gar keiner Veränderung unterliegt, wie dies beisnielsweise gewöhnlich bei Coenzymen und Enzymen der Fall ist, kann man sie wiederholt wiederverwenden. Das hat den Vorteil, daß diese kostenaufwendige Komponente erhalten bleibt und für aufeinander folgende Versuche zur Verfügung steht.

Man kann diese Arbeitsweise des Konzentrierens und Lokalinierens bei zahlreichen Arten von elektromaanetische Strahlung erzeugenden Systemen anwenden. Besonders geeignet für diese Arbeitsweise sind Bioluminescenz-Systerne, beispielsweise das Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-ATP-Reaktionssystern oder das Reak ti ons system mit bakterieller Luciferase, das mit Flavincoenzymen arbeitet. Das System mit bakterieller Luciferase hat den besonderen Vorteil, daß es sich sehr einfach mit Oxidoredüktase-Reduktionen koppeln läßt, beispielsweise solchen, bei denen Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP ) und/oder Hi coti nami dadeni ndi nuc leoti d (NAD ) umgesetzt wird. Reaktionen dieser Art sind an einer großen Anzahl Biosystemen beteiligt. Die Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Reaktion ist ebenfalls sehr vorteilhaft, weil man sie sehr einfach mit ATP-Coenzymproduzierenden Systemen kuppeln kann, die häufig an Bio-Energieübertragungssystemen beteiligt sind.

In ähnlicher Weise lassen sich beim erfindungsgemäßen Verfahren Chemieluminescenz-Systerne einsetzen. So kann man beispielsweise Luminol in einer unlöslichen Matrix entweder einschließen oder covalent daran binden und in dieser Form zur Prüfung auf Oxydationsmittel, beispielsweise Wasserstoffperoxid, benutzen. Auch dabei wird das abgestrahlte Licht in der gleichen Reaktion erzeugt, die zur Entdeckung und Anzeige der chemischen Verbindung, auf die geprüft wird, dient, und das Licht wird in hochkonzentrierter Form an einem lokalisierten Ort innerhalb des Reaktionsmediums erzeugt.

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Die dem erfindungsgemHßen Verfahren zugrunde liegenden Prinzipien lassen sich besonders anschaulich anhand des nachfolaenden speziellen Ertni ttlunqssystems erläutern: Eine Anzahl von bakteriellen Substanzen, beispielsweise Photobacterium fischeri, Photobacterlum phosphoreum und Beneckea harveyi, kfinnen bekanntlich sichtbares Licht erzeugen. Es wurde ermittelt, daß diese Lichterzeugung den Ablauf einer speziellen Reaktion erfordert, bei der das bakterielle Enzym, Luciferase, mit einer Co-Faktor, Flavinmononucleotid (gebräuchlicherweise mit FMN abgekürzt), unter Lichterzeugung umgesetzt wird.

Die lichterzeugende Reaktion erfolgt, wenn Luciferase die Oxidation des in reduzierter Form vorliegenden Cofaktors, Flavinmononucleotid, FMNH₂, zu der oxidierten Form, FMN, in Anwesenheit eines langkettlgen Aldehyd-Substrats und Sauerstoff katalysiert. Man kann die Reaktion wie folgt schreiben:

bakterielle

Luci ferase
RCHO + 2FMNH₂ + 2O₃ > 2 FMN + RCOOH + HjOj +

H₂O + Licht,

worin RCHO einen langkettigen Aldehyd mit etwa 8 bis 14 Kohlenstoffatomen bedeutet. Als Substrate besonders geeignete Aldehyde sind beispielsweise Decanal, Tridecanal, Dodecanal und Undecanal.

Das bei der Reaktion freigesetzte Licht ist direkt proportional der Anzahl der der Reaktion unterliegenden Moleküle. Die Messung des freigesetzten Lichts zeigt dementsprechend die in der geringsten molekularen Menge als Substrat oder Cofaktor vorhandenen Verbindung an. Sofern die Luciferase der die Reaktion limitierende Faktor ist, stellt das abgegebene Licht ein Maß für die Enzymaktivität dar.

Die bakterielle Luciferase wird vorteilhaft an porösen Acrylamingals-Kügelchen immobilisiert. Man klebt die Kugeln vorteilhaft zuvor an dünne Glasstäbe an. Es läßt sich jeder beliebige

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Klebstoff verwenden, mit dem die Kuqeln fest an dem Stab anhaften. Für diesen Zweck besonders geeignet sind übliche Epoxy-Kleber. Die Luciferase läßt sich unter Benutzung einer Diazotierungsreaktion, wie sie in der Veröffentlichung "Methods in Enzymology", Academic Press, Mew York, Seiten 59-72 beschrieben ist, an die porösen Glaskugeln kuppeln. Das hoch Siliciumoxid-haltige poröse Glas enthält Nitro-Arylgruppen, die durch die Amid-Kupplung von Nitrobenzoylchlorid daran gebildet worden sind. Die Nttroarylgrunncn werden dann entweder durch Natriumdithionit oder LiAlH zu Aminoarylgruppen reduziert. Die Aminoarylgruppen werden durch die Diazotierung aktiviert, so daß sie zu KuDplungsstellen für die Luciferase werden. Anschließend wird die Luciferase in einer gepufferten wässrigen Lösung (pH 7) 16 Stunden lang in Kontakt mit den mit den Kugeln beaufschlagten Stäben gebracht, so daß das Enzym an dem porösen Glas ankuppeln kann. Danach wird das überschüssige, nicht-angekupnelte Enzym von den Stäben abgewaschen und die Stäbe werden bei verminderter Temperatur (4°C) für spätere Verwendung in Pufferlösung aufbewahrt. Wenn man sie sorgfältig behandelt und nach jeder Benutzung vollständig abspült, lassen sich die mit der immobilisierten Luciferase beaufschlagten Stäbe für eine praktisch unbegrenzte Anzahl von Versuchen stets wiederverwenden, ohne daß die Enzymaktivität nennenswert beeinträchtigt ist.

Man kann die gleiche Immobi Ii sati onstechnik für andere Bioluminescenz-Enzyme und Proteine benutzen.

Bei der Durchführung einer Prüfung wird der Stab mit der immobilisierten Luciferase in eine alle sonstigen für die strahlungserzeugende Reaktion notwendigen Komponenten oder Reaktionsbestandteile, mit Ausnahme der zu prüfenden Substanz, enthaltende Lösung eingetaucht. Die zu prüfende Verbindung wird als das Probenmaterial zugegeben. Da wenigstens eine der essentiellen Komponenten auf dem Träger immobilisiert vorhanden ist, findet die Strahlung-erzeugende Reaktion direkt auf der Ober-

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flache des Trägers statt. Man braucht daher nur noch die Reaktionsmlschung und den darin eingetauchten Stab in das Probenbehältnis eines Photometers einzuschließen, wahrend die strahlungerzeugende Reaktion stattfindet. Alle löslichen Komponenten können zusammengebracht, das Probenbehältnis geschlossen und der Stab eingetaucht werden, und dann erfolgt die Lichtabgabe. Man kann alternativ den Stab auch in eine solche Lösung eintauchen, in der außer einer von mehreren Reaktionskomponenten oder Untersuchungsprobe alle vorhanden sind und dann den Probenbehälter schließen. Bei der Zugabe der noch fehlenden Reaktionskomponente oder ggf. der Versuchsprobe erfolgt die Lichtabgabe. Man kann geeignete elektronische Schaltungen verwenden, um entweder das Strahlungsmaximum oder die gesamte bei der Reaktion emittierte Strahlung zu messen. Die Strahlungsintensität oder die gesamte emittierte Strahlung geben Meßwerte, aus denen sich die Menge an derjenigen für die Strahlungsabgebende Reaktion erforderliche Komponente ausrechnen läßt, die in der geringsten molekularen Menge vorhanden ist, oder man kann die Aktivität daraus bestimmen, wenn Enzyme oder sonstiges katalytisches Material untersucht werden soll.

Man kann die Strahlung, die beim erfindungsgemäßen Verfahren aus einem Testsystem abgegeben wird, beispielweise mittels eines Photometers, zum Beispiel dem Aminco Chem-Glo - Photometer bestimmen. Es handelt sich dabei um ein sehr exaktes und empfindliches Instrument, das sich für die Durchführung des erfinduncrsqemäßen Verfahrens besonders eignet. Dieses Instrument ist mit einer Reaktionskammer ausgerüstet, in der

Küvetten für die Reaktion und Einlasse zum Einspritzen der verschiedenen Komponenten in die Probe, während diese sich in dem Instrument befindet, vorhanden sind. Geeignete im Handel erhältliche Apparaturen können zur Aufzeichnung der von dem Photometer angezeigten, abgegebenen Strahlung eingesetzt werden.

Bei der oben bereits besprochenen Reaktion mit der LeuchtkHfer-Luciferase muß, damit die Licht-emittierende Reaktion ablaufen

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kann, ΛΤΡ vorhanden sein. Für die Ltcht-abqebende Reaktion erfordert Leuchtk.Hfer-Luciferase ΛΤΡ. ΛΤΡ seinerseits ist eine universelle Energiequelle für eine Vielzahl von Bioreaktionen, und seine Anwesenheit oder Abwesenheit in solchen Systemen ist ein besonders gutes Maß für viele Reaktionskomponenten und Produkte bei Bio-Reaktionen.

Typische ATP-produzierende Systeme sind beispielsweise: das Zuckersynthese-System, bei dem aus Phosnhoenolpyruvat in Anwesenheit des Cofaktors AdenosindiphosDhat und des Enzyms Pyruvatkinase Pyruvat und Adenosiηtriphosphat (ΛΤΡ) gewonnen werden. Andere Systeme sind Muskelkontraktionssysteme, worin Kreatinphosphat zu Kreatin umgesetzt wird, während dessen Cofaktor Adenosindiphosphat in Anwesenheit des Enzyms Kreatinphosphokinase zu ΛΤΡ umgewandelt wird. ΛΤΡ-Prüfungen können beispielsweise auch dann zweckmäßig sein, wenn man den Gehalt an Bakterien im Urin, in Abfallprodukten, im Wein, im Bier, in Milch, und ganz generell in Biomassen messen will. Die Messung von ATP in irgend einem Biosystem kann man als Meßwert für ATP-Cofaktoren, Substrate und entsDrechende Enzyme verwenden.

Es wurde bereits zuvor erwähnt, daß ATP ein Coenzym bei der lichtproduzierenden Luci ferin-Luciferase-Reaktion ist. Infolgedessen läßt sich durch das bei einer Lud ferin-Luciferase-Reaktion erzeugte Licht ATP quantitativ bestimmen, wenn das ATP dabei die limitierende Komponente für diese Reaktion ist, im anderen Fall qualitativ. Eine Bestimmung von ATP kann wiederum benutzt werden, um diejenige in der geringsten Menge vorhandene chemische Substanz zu berechnen, aus der ATP entstanden ist.

In ähnlicher Weise läßt sich die Reaktion mit bakterieller Luciferase mit einer Vielzahl von Bio-Reaktionen rückkoppeln. Beispiele dafür sind folgende Konplungsreaktlonen:

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(1) Zu prüfendes Biomaterial + NAD (oder NADP) Enzym

^ NADH (oder NADPH) + Produkt

(2) NADH (oder NADHP) + FMN
NAD: FMN Oxidoreduktase

<«r FMNH» + NAD (oder NADP)

(3) RCHO + FMNH₂ + O₃

immobilisierte
bakterielle Luciferase

FMN + RCOOII + H₂O + H₃O₃ + Licht,

wobei NAD für Nicotinand dadenindinucleotid, NADP für Nicotinamidadentndinucleotidphosphat und NADII bzw. NADPH für die jeweils reduzierten Formen davon stehen. FMN, FMNH_, RCHO und RCOOH haben die zuvor angegebenen Bedeutungen.

Die Reaktion (3) ist bereits zuvor erwähnt worden; sie stellt die lichtabgebende Reaktion mit bakterieller Luciferase dar, die erfindungsgemäß durchgeführt wird und denMeßwert bringt. Bei der Reaktion (2) handelt es sich um eine Oxidati ons-Roaduktions-Reaktion, die von der NADtFMN Oxidoreduktase katalysiert wird, die man in bekannter Art aus Bioluminescenz-Bakterien, wie beispielsweise Beneckea harveyi , erhält. Beispielsweise kann man die Oxidoreduktase von der bakteriellen Luciferase während dieren Reinigung mittels bekannter chromatographischer Methoden abtrennen. Wenn so Luciferase chromatograohisch an DEAE-Sephadex gereinigt wird, eluiert die Reduktase vor der Luciferase und 1-1 ßt sich als separate Fraktion sammeln. Bei der Reaktion (1) handelt es sich um irgend eine der zahlreichen Bioreaktionen, in denen NAD (oder NADP) notwendige Cofaktoren sind. Einige wenige Beispiele für solche NAD oder NADP erfordernden Reaktionen sind:

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Alkohol-Dehydrogenase

Alkohol + NAD (oder NADP) ^ Aldehyd + NADII (oder

NADPH)

2,3-Butandiol + NAD

Glycerin + NAD

Butandiol-Dehydrogenase

Glycerin-Dehydrogenase

Ace toi n + NADII

^ Di hydroxy ace ton + NADH

O-Xylulose-Reduktase

Xylitol + NAD (oder NADP) * D-Xylulose (L-Xylulose)

L-Xylulose- + NADII

Galactitol + NAD L-Gulonat + NADP

Reduktase Galactitol-Dehydrogenase

Glucuronat-Dehydrogenase

Aldose-Reduk tase

Alditol + NADP

D-Tagatose + NADII D-Glucuronat + NADH Aldose + NADPH

Glyoxylat-Reduktase
Glycollat + NAD =»· Glyoxylat + NADH

Lactat-Dehydrogenase
L-Lactat + NAD ^ Pyruvat + NADH

Malat-Dehydrogenase

L-Malat + NAD *- Oxalaacetat + NADH

Glucose-Dehydrogenase ß-o-Glucose + NAD (oder NADP) ■ ^ D-Glucon- S -lacton +

3-^-Hydroxysteroid ^{NADH (oder NADPH)} Dehydrogenase

Androsteron + NAD (oder NADP) ^ Androstan-3,17-dion

+ NADH (oder ΝΛϋΡΗ)

Cortison-Reduktase 20-Di hydrocor ti son + NAD ^ Cortison + NADH

Pyri doxi n-Oehydrogenase Pyridoxin + NADP ■ ^- Pyridoxal + NADPH

Mannitol + NAD

Manni tol-Dehydrogenase

Fructose + NADH

Aldehyd-Dehydrogenase Aldehyd + NAD + H₃O i». Säure + NADH .

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Zahlreiche ähnliche NAD- oder NADP-Cofaktor-Reaktionen sind bekannt; die zuvor angegebenen dienen nur der Illustration.

Es ist klar, daß bei einer großen Anzahl von Pio-Reaktionen NAD oder NADP in reduziertem Zustand anfallen. Wenn solche Reaktionen (1) mit der NADrFMN-Oxidoreduktase- oder NADP:FMN-Oxidoreduktase-Reaktion (2) gekuppelt werden, so ist offensichtlich, daß das FMNH- entsprechend der Menge an NADH (oder NADPH), das aus der Reaktion (1) zur Verfügung steht, produziert wird. Wenn das bei der Reaktion (2) produzierte FMNH-anschließend in die Reaktion (3) , die Reaktion mit der bakteriellen Luciferase, eingebracht wird, ist das dabei produzierte Licht der ursorünglichen Menge an Pyridinnucleotid und infolgedessen dem Dehydrogenase-Enzym oder dessen Substrat, die bestimmt werden sollen, proportional.

Wenn man die Strahlung erzeugende Reaktion wie zuvor ersichtlich mit Vorsubstanz-Reaktionen kuppelt, kann man das erfindungsgentfiße Verfahren mit dem Immobilisierungsvorgang in vielen unterschiedlichen Ausfuhrungsformen einsetzen. Speziell ist es hSufig vorteilhaft, zwei oder mehr essentielle Kompoenten zu immobilisieren und zu konzentrieren, damit man eine Serie von Reaktionen mit einem einzigen Träger durchführen kann. Bei dieser Technik kann man direkt zwei Reaktionen des zuvor angegebenen Typs (2) und (3) miteinander kuppeln.

Bei dieser Arbeitsweise wird die gewünschte FMN-Oxidoreduktase auf demselben Träger wie die Luciferase immobilisiert. Dabei erzeilt man den zusätzlichen Vorteil des erfindungsgemißen Verfahrens, daß die hochoxidationslabile Verbindung FMNH-, die bei der NADH-FMN-Reaktion erzeugt wird, in extrem enger Nachbarschaft neben der Luciferase produziert wird, und so direkt und unmittelbar zur Verfügung steht, um an der Luciferase-Reaktlon teilzunehmen. Es werden so Manipulationsstufen vermindert, Verluste vermieden und unerwünschte Re-Oxidationen des FMNH- durch zu prüfende Komponenten oder Verunreinigungen ausgeschlossen.

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In einem solchen speziellen Fall kann beisnieisweise auch Dehydrogenase an das Trägermaterial gebunden werden.

Pol spiel

10-15 mg kleine Kugeln aus aktiviertem Arylaminglas wurden an 4 cm lange Glasstäbe mit einem Durchmesser von 1,7 mm angeklebt. Die Glasstäbe wurden zuerst in Duro E-Pox.E 5 - Klebstoff eingetaucht und dann in den porösen Glaskugeln gerollt. Die Glasstäbe mit den anhaftenden Kugeln ließ man über Nacht trocknen. Die Luciferase- und Reduktase-Enzyme (aus Beneckon harveyl isoliert) wurden im Verhältnis von 1 mg Luciferase zu 1,5 mg Reduktase vermischt, und davon wurden 0,5 ml wässrige Lösung 16 Stunden lang mit den Stangen und aktivierten Kuqcln in Kontakt gebracht. Die Lösung war mit O,l m Phosnhat auf pH 7,0 gepuffert. Die Stangen wurden danach mit 25 ml kaltem 1 m Natriumchlorid und anschließend mit 100 ml kaltem destilliertem Wasser gewaschen und auf diese Weise die nicht gebundenen Enzyme entfernt. Die Stangen wurden anschließend \\hGT

-4 Nacht mit 1% Rinderserum-Albumin (BSA) in dem 5 χ 10 m

Dithiothreitol (DTT) enthaltenden Phosphatpuffer inkubiert. Die Stangen wurden anschließend in die gleiche Menge an DTT enthaltendem Phosnhatpuffer bei 4°C aufbewahrt.

Die gebundenen Enzyme wurden bestimmt, und in der nachstehenden Tabelle 1 sind typische Versuchsergebnisse der Bestimmung der Bindung der Enzyme an den porösen Glaskugeln und deren scheinbare Aktivitäten zusammengestellt.

In diesem Beispiel ist eine Doppel-Immobilisierung von zwei Enzymen an einem einzigen Träger veranschaulicht.

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Tabelle

Bindung von Luciferase und FMNrReduktase an Glasstangen

Luciferase FMlV-Reduktion crekunoelter mg Protein Relative /Umol Versuch ml

Lichteinh. NADH Oxid. Relative

/ ml per ml per min Lichteinh.

/ ml

(A)	Original Gemisch	7	,0 χ 10⁶	0,293	4	,2 χ	10⁵	2,	56
(B)	Über stehende Lösung	2	χ 10⁶	0,100	2	X	lo⁴	1,	25
(C)	Stangen	2	,5 x 10³	0,020	1	,2 χ	10⁴	1,	31
	Schein bare Aktivität der Stangen in %	0,055	10,3	3			51

(A) Enzymatische Aktivitäten eines Gemisches aus löslicher Luciferase-Reduktase vor dem Kuppeln an die Kugeln, Original-Gemisch. (B) Nach dem Kuppelvorgang wurde das Gemisch erneut geprüft, überstehende Lösung. (C) Es wurde auch die Menge an mit den Stangen verbundener Aktivität geprüft. Der Prozentgohalt an Aktivität,wie er auf den Stangen gefunden wurde, ist bezogen auf die ursprüngliche Gesamt-AktivitSt in dem Oritrinal-Gemisch. Die Luciferase wurde durch Einsprühen von FMNH, untersucht. FMN:Reduktase wurde'ermi ttelt anhand des Verschwindens der Absorption bei 340,um, und das Licht bei der gekunnelten Untersuchung wurde beim Einsprühen von NADH erhalten.

Die Enzyme, und zwar sowohl diejenigen in Lösung als auch die an dem porösen Glas immobilisierten Enzyme wurden wie folgt untersucht: Alle Versuche mit löslichen Enzymen wurden bei 23 C durchgeführt. DIg Luciferase wurde durch Einsprüchen von 0,1 ecm FMNH₂, katalytisch mit H₂ über platiniertem Asbest reduziert, in eine Luciferase, Decanal und 0,1% BSA in 0,1 m Phosphatpuffer von pH 7,0 enthaltende Lösung untersucht. Die

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Endkonzentration der Reaktionskomponenten betrug: 2,3 χ Io m FMNH_ und 0,0005% Decanal und 0,O8.ug Luciferase je ml. Die Lichtintensität wurde mittels eines Aminco Chem-Glo-Photometer gemessen und auf einem Ami neo-Recorder aufgezeichnet. Dip Maximum-Intensitat war, bezogen auf die zugegebene Luciferase, in dem Bereich von 0,08.ug bis 8,ug je ml bei Verwendung dieses Instrumentes linear. Immobilisierte Luciferase wurde unter Verwendung der gleichen Konzentrationen an Substraten untersucht. Die mit den Glaskugeln versehenen Stangen wurden in ein Prüfrohr des Photometers eingesetzt und FMNH₂ wurde eingesprüht.

Lösliche FMN:Reduktase wurde anhand der Geschwindigkeit der; Verschwindens von Absorption bei 340-um in einem Spektrometer des Typs Cary Model 14 untersucht. Durch Zugabe von NADH zu 1 ml 0,015 m Phosphatpuffer von pH 7,0, worin 7 χ in m Kthylandiamintetraessigsäure, 0,4 mg Reduktase und FMN enthalten wa-

-4 ren, initiiert. Die Endkonzentrationen betrugen 2 χ 10 m NADH, 1,3 χ 10~ m FMN. Zur Untersuchung des immobilisierten Enzyms wurde der das Enzym enthaltende Stab in die Küvette getaucht und 1 Minute lang gemischt, dann herausgenommen, und die OD 340 gemessen. Die Untersuchung zeigte für wenigstens 3 Minuten Linearität.

Die gekuppelte Untersuchung wurde durch Ermittlung der auf die Injektion von NAD (P) H in 0,5 ml eines 7,5,ug Reduktase, 5 .ug

—6

Luciferase und 2,3 χ 10 m FMM und 0,0005% Decanal enthaltenden 0,1 m Phosphatpuffer von pH 7,0 folgende! erzielten Maximum-Intensi ta't vorgenommen. Nachdem das immobilisierte Enzym geprüft worden war, wurde die Stange in die FMN und Aldehyd enthaltende Lösung eingetaucht. In diese Lösung wurde NAD(P)H eingesprüht.

Die immobilisierten Enzyme zeigten lineare Abhängigkeit der Maximum-Lichtintensität als Funktion sowohl der NADH-bzw. NADPH-Konzentratlon. Linearität wurde mit NADH in dem Bereich von

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2722391 -κι χ 1θ"¹² mol bis 5 χ 1Ο~⁸ mol und für NADPH in dem Bereich von 1 χ 1O~ mol bis 2 χ 1O~ mol erhalten. Die gebundenen Enzyme waren stabil und wiederverwendbar.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Arbeitsweisen lassen sich anwenden zur Prüfung von Ligand-Rezeptor-Zwischenreaktionen, speziell für die Antigen-Antikörper-Bi ndung.

So ist beispielsweise in der US-PS 3,817,837 von Rubenstein und Mitarb, eine Methode zur Untersuchung von Liganden beschrieben, bei der Enzyme an die Liganden gebunden und eine "Enzym-Bindung-Ligand"-Konfiguration gebildet wird. Die Enzymaktivität des so gebundenen Enzyms kann inhibiert sein, wenn das "Enzym-Verbindung-Ligand"-Gebilde mit einem Rezeptor-Molekül in Kontakt gebracht wird. Die Bindung des Liganden an den Rezeptor inhibiert die Aktivität des an den Liganden gebundenen Enzyms im umgekehrten Verhältnis zu der Menge an nativem Ligand, die von der Versuchsprobe stammt. Die Bestimmung der Enzymaktivität dient so als Maß für die Ligand-Menge in der Versuchsprobe. Es versteht sich, daß das zu bindende Enzym auch eines der Enzyme sein kann, die NAD oder NADP oder ATP als Cofaktor benötigen. In diesem Fall wird das an den Liganden gebundene Enzym mit einem geeigneten Substrat und einem Cofaktor unter Bildung von NADH, NADPH oder ATP umgesetzt. Das so gebildete NADH, NADPH oder ATP kann anschließend in einer damit gekuppelten Licht-bildenden Luciferase-Reaktion in der gleichen Weise, wie zuvor beschrieben, eingesetzt werden, die dann als Untersuchungsmethode für das "Enzym-Bindung-Ligand"-Gebilde dienen kann.

Ähnlich angelegt können Immuno-Versuchsanordnungen, die auf Enzymbestimmungen basieren, gekuppelt werden mit erfindungsgemäßen lichtbildenden Reaktionen mit immobilisierter Komponente. Beispielsweise ist in der US-PS 3,791,932 von Schuurs und Mitarb, ein Verfahren zur Bestimmung von Liganden oder Rezeptoren beschrieben, bei dem die zu prüfende Komponente mit

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ihrem in einer unlöslichen Form vorliegenden Verbindungsmjrtner umgesetzt und danach die feste Phase von der flüssigen Phase getrennt und anschließend die feste ⁿhase mit einer bestimmten Menge eines Kupplungsnroduktes der zu bestimmenden Substanz mit einem Enzym umgesetzt wird. Die Aktivität des zwischen dem unlöslich gemachten und dem überstehenden Material wird dann als Meßwert für das Antigen oder den Antikörper in der UNtersuchungsprobe ermittelt. Bei dem von Rubenstein und Mitarb, beschriebenen Verfahren kann offensichtlich ein geeignet ausgewähltes Enzym mit einem Substrat in der Weise umaesetzt werden, daß ein mittels des erfindungsqem'ißen VErfahrens bestimmbares Produkt qewonnen wird. Das Enzym-Reaktionsprodukt kann dann in der erfindungsaemnßen Verfahrensweise mit dem strahlungerzeugenden immobilisierten Enzym zur Reaktion gebracht und ein bestimmbares Produkt gewonnen und bestimmt werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich Bakterien in flüssigen Proben ermitteln. Man weiß, daß man Bakterien durch die Reaktion von Eisenporphyrinen, beispielsweise in mikrobiellen Zellen enthaltene Peroxidase, Cytochrome, Catalase, mit Luminol (5-Amino-2,3-dihydro-l,4-phthalazindlon) unter Freisetzung von sichtbarem Licht umsetzen kann, vergleiche zum Beispiel Picciolo und Mitarb., Goddard Space Flight Center-Veröffentlichung X-726-76-212 vom September 1976, mit dem Titel" Applications of Luminescent Systems To Infectious Disease Methodology", Seiten 69 ff.

In solchen Systemen entsteht durch die Reaktion von Luminol mit Wasserstoffperoxid in wässriger alkalischer Lösung in Anwesenheit eines oxidierenden Aktivierungsmittels, wie beispielsweise Ferricyanid, Hypochlorit oder eines chelatgebundenen Ubergangsmetalls, wie beispielsweise Eisen oder Kupfer, Chemieluminescenz. Man betrachtet in bakteriellen Untersuchungssystemen die Eisenporphyrine als Aktivatoren für Luminol-Chemiluminescenz.

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Ein solches Chemieluminescenz-System eignet sich für das erfindungsgemäße Verfahren, und bei der erfindungsgemäßen Arbeitsweise läßt sich das Luminol dann auf einem geeigneten Trägermaterial konzentrieren, lokalisieren und immobilisieren. Man kann das Luminol an einem Trägermaterial, wie beispielsweise einem der zuvor beschriebenen Stoffe, absorbiert einsetzen.

Mit dem lokalisierten, immobilisierten Luminol wird bei der Aktivator-katalysierten Reaktion mit Wasserstoffperoxid eine konzentrierte Licht-Emmission abgegeben. Diese Emmission kann in konventioneller Weise untersucht werden unter Verwendung eines wie zuvor beschriebenen Photometers und der gefundene Wert ist dann ein Maß für den Aktivator und dementsprechend für die vorhandene bakterielle Substanz.

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Claims

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_ tSf _

- 4/a -

Patentansprüche

l.J Verfahren zur Bestimmung eines chemischen Stoffes, bei eiern dieser chemische Stoff mit einem in einem neaktionsmedium homogen verteilte elektromagnetische Strahlung erzeugenden System umgesetzt und die erzeugte Strahlung als Maßwert für den Stoff gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens eine Komponente dieses Systems innerhalb eines lokalisierten Bereichs des Reaktionsmediums immobilisiert bzw. fixiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Komponente auf der Oberfläche eines festen Trägers immobilisiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Komponente an einem festen TrHger chemisch bindet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Komponente an einem festen TrHger mittels covalenter Bindung fixiert.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als die zu immobilisierende Komponente ein Enzym benutzt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym eine bakterielle Luciferase benutzt.

7. Verfahren nach Ansnruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym eine LeuchtkMfer-Luciferase benutzt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als die zu immobilisierende Komponente FMN benutzt.

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ORIGINAL INSPECTED

9. Diagnostische Untersuchungsmethode zur Bestimmung eines chemischen Stoffes gem.iß Anspruch 1, bei der der Stoff in einem wässrigen Medium mit anderen in einem elektromagnetische Strahlung erzeugenden System befindlichen Komponenten unter Freisetzen von der Menge des Stoffes proportionaler Strahlung umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Komponente des die elektromagnetische Strahlung erzeugenden Systems innerhalb eines lokalisierten Bereichs des wässrigen Mediums unlöslich gemacht wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente durch Bindung an einen Träger, der für die elektromagnetische Strahlung durchlässig ist, unlöslich gemacht wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als durchlässiger Träger Glas verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als unlöslich zu machende Komponente ein Enzym benutzt und dieses über Diazogruppen an das Glas gebunden wird.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als unlöslich zu machende Komponente ein lichterzeugendes Enzym benutzt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als unlöslich zu machende Komponente Luminol benutzt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym Leuchtkäfer-Luciferase benutzt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dafl als Enzym eine bakterielle Luciferase benutzt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich zu der Luciferase FMN-Oxidoreduktase an den Träger fixiert wird. 809824/0539

- vs -

18. Verfahren zur Untersuchung einer chemischen Verbindung, die an einer elektromagnetische Strahlunq erzeugenden Reaktion teilzunehmen vermaq nach Anspruch 1, dadurch qekennzeichnot, daß man weniqstens eine für die strahlunqerzeuqende Reaktion essentielle Komnonente an einem nicht-reaktiver, festen Tr'iger immobilisiert bzw. fixiert, diese immobilisierte Komnonente mit allen anderen für die Lichterzeugung essentiellen Komnonenten, einschließlich der zu untersuchenden Verbindung in Kontakt brinqt, wobei alle Komnonenten, einschließlich der immobilisierten Komponente in überschuss!qer Menqe, die zuuntersuchende Verbindung in einer die Reaktion limitierenden Menge vorhanden sind, und die an der immohiIiserten Komponente in einer als Funktion von der zu untersuchenden Verbindung anfallenden Menge erzeugte elektromagnetische Strahlung bestimmt und als Maßwert für die zu untersuchende Verbindung ausgev/ertet wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlung durch eine Bioluminescenz-Reaktion freigesetzt wird.

20. Verfahren nach Ansnruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als immobilisierte Komponente ein Bioluminescenz-Fnzym einsetzt.

21. Verfahren nach Ansnruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym eine bakterielle Luciferase einsetzt.

22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym LeuchtkHfer-Luciferase einsetzt.

23. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als zu untersuchende Verbindung ein Material einsetzt, das durch eine Dehydrogenase zu einem reduzierten Pyridinnucleotid oxidierbar ist.

/ D r, "} Q

-Zl-

24. Vorfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlung durch eine Chemlelumlnescenz-neaktlon freigesetzt wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlung mittels einer Lumi no I-Per oxid-Reaktion erzeugt wird.

26. Verfahren zur Untersuchung einer chemischen Verbindung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die chemische Verbindung in einer ersten Verfahrensstufe zu weninst-.pns einem ersten Reaktionsprodukt umsetzt, ein elektromagnetische Strahlung erzeugendes System, für das dieses erste Reaktionsprodukt eine essentielle Komponente darstellt, und in dem wenigstens eine weitere essentielle Komponente für dieses Syπtem an einem festen Träger immobilisiert ist, zusammenstellt, das erste Reaktionsprodukt an dem festen Träger unter Erzeugung einer lokalisierten, konzentrierten Strahlungs-Emmission zur Reaktion bringt, die Strahlung auffingt und als Meßwert für das erste Reaktionsprodukt quantitativ bestimmt und daraus die zur Erzeugung des ersten Reaktionsproduktes erforderliche Menge an der zu untersuchenden chemischen Verbindung berechnet.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man als erstes Reaktionsprodukt ein reduziertes Pyridinnucleotid benutzt.

28. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man als die weitere essentielle Komponente, die an dem festen Träger Immobilisiert ist, ein Enzym benutzt.

29. Verfahren nach »Vnspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man als System eine Bioluminescenz-Reaktion verwendet.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß man als System eine Luciferase-Reaktlon verwendet.

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31. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man in der ersten Reaktion mit einem Enzym katalysiert.

32. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man als System eine Chemieluminescenz-Reaktlon verwendet.

33. Verfahren zur Untersuchung von Enzym-Substraten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man (1) wenigstens ein erstes Enzym einsetzt, (2) dieses erste Enzym mit dem zu untersuchenden Substrat umsetzt und dabei ein erstes Produkt in proportionaler Menge zu dem Substrat bildet, (3) ein zweites Enzym und ein elektromagnetische Strahlung erzeugendes Enzym einsetzt, die beide an einem inerten, festen Träger unlöslich gemacht worden sind, (4) das erste Produkt mit dem zweiten Enzym zu einem zweiten Produkt umsetzt, bei dem es sich um eine essentielle Komponente des elektromagnetische Strahlung erzeugenden Systems handelt und die aus diesem System freiwerdende elektromagnetische Strahlung bestimmt.

34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweites System und die Enzyme durch ccvalente Bindung an dem festen Träger unlöslich gemachte Enzyme verwendet.

35. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß man als festen TrHger eine lichtleitende Faser verwendet.

36. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß man die zweiten Enzyme und das System auf dem Träger eng be nachbart nebeneinander lokalisiert einsetzt.

37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß man als elektromagnetische Strahlung Licht freisetzt.

38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß man das freigesetzte Licht mittels eines Photometers bestimmt.

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39. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß man als festen TrMger ein Arylaminglas benutzt.

40. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß man als erstes Produkt reduziertes Nl coti nami dadeni ndi nucleotl <1 benutzt.

41. Verfahren nach Ansnruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweites Enzym FMN-Oxidoreduktase benutzt.

42. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß man als Strahlungserzeugendes Enzym eine Luciferase benutzt.

43. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß man als erstes Produkt reduziertes Nicotinamldadenindinucleotid, als zweites Enzym Flavinmononucleotid-Oxidoreduktase benutzt und das erste Produkt mit Flavinmononucleotid in Anwesenheit der Oxidoreduktase zwecks Reduktion des Flavlnmononucleottd.¹; umsetzt, als Strahlungserzeugendes Enzym Luciferase verwendet und das reduzierte Flavinmononucleotid mit einem geeigneten Substrat in Anwesenheit der Luciferase zwecks Oxidation des Flavinmononucleotids umsetzt und proportional zu der Menge an reduziertem Flavinmononucleotid Licht erzeugt.

44. Zur Untersuchung einer chemischen Verbindung geeignetes Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt aus einem unlöslichen, elektromagnetische Strahlung erzeugenden System besteht.

45. Produkt nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine unlösliche Komponente eines lichterzeugenden, normalerweise wasserlöslichen Systems handelt.

46. Produkt nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein diagnostisches Produkt in Form wenigstens einer unlöslichen Komponente eines Biolumlnescenz-Systems handelt.

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-ΜΑΤ. Produkt nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein diagnostisches Produkt in Form wenigstens einer unlöslichen Komponente eines Chemieluminescenz-Systems handelt.

48. Produkt nach Ansnruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine unlösliche oder unlöslich zu machende, covalent an einem Substrat gebundene Luciferase handelt.

49. Produkt nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt auch noch FMN-Oxidoreduktase covalent an dem
Substrat gebunden enthält.

50. Produkt nach Ansnruch 45, dadurch gekennzeichnet, daft die KomDonente Luminol ist.

51. Produkt nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daft die unlösliche Komponente ein covalent an einem unlöslichen Träger gebundenes Enzym ist.

52. Produkt nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger Arylamin- oder Alkylamin-Glas vorhanden ist.

53. Produkt nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß das Glas Stangenform hat.

54. Produkt zur Untersuchung einer chemischen Verbindung
nach Anspruch 44, gekennzeichnet durch einen festen Träger, wenigstens eine auf dem festen Träger immobilisierte und zur Reaktion unter Bildung eines Produktes mit der zu untersuchenden Verbindung geeignete erste Komponente sowi*» eine zweite auf dem festen Träger immobilisierte und zur Reaktion mit «lern Produkt unter Erzeugung elektromagnetischer Strahlung geeignete Komponente.

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55. Produkt nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dan die zweite Komponente ein Enzym ist.

56. Produkt nach Ansnruch 55, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Luciferase ist.

57. Produkt nach Ansnruch 54, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Komponente eine Oxidoreduktase ist.

58. Produkt nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dan die erste Komponente eine Kinase ist.

59. Produkt nach Anspruch 44, geeignet zur Kupplung von Bioreaktionen und zur Untersuchung von Biomateriallen, gekennzeichnet durch einen nicht-reaktiven festen TrHger, darauf immobilisiertes Oxidoreduktase-Enzym und darauf ebenfalls immobilisertes Enzym bakterielle Luciferase.

60. Produkt nach Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus an einer Stange festsitzenden Glaskugeln besteht.

61. Produkt nach Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidoreduktase FMN-Oxidoreduktase Ist.

62. Produkt nach Anspruch 44 für diagnostische Zwecke, gekennzeichnet durch eine licht leitende Faser, die auf einer ihrer lichtleltenden Oberflächen Immobilisiert wenigstens eine Komponente eines elektromagnetische Strahlung erzeugenden Systems enthalt.

63. Produkt nach Ansnruch 62, dadurch gekennzeichnet, daß als Komponente ein Enzym vorhanden ist, das covalent an der Oberfläche gebunden ist.

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64. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung eines Liganden oder eines Rezeptors für den Ligand nach dem in den UR-PSs 3,791,932 und 3,017,837 beschriebenen Prinzip, dadurch gekennzeichnet, daß man ein lichterzeugendes Enzym-System benutzt und wenigstens eine Komponente dieses System in unlöslich gemachter Form verwendet.

65. Verfahren nach Anspruch 1 zur Untersuchung von chemischen Verbindungen, die als ein Cofaktor an einer enzymatischen Reaktion mit NAD oder NADP unter Bildung von NADH oder NADPH als eines der Reaktionsprodukte teilzunehmen vermögen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen stangenförmigen Glast r"iger mit daran anhaftenden porösen Glaskugeln einsetzt, an den Glaskugeln eine FMN-Oxidoreduktase und zusätzlich bakterielle Luciferase immobilisiert, den GlastrSger mit der immobilisierten FMN-Oxidoreduktase und der immobilisierten bakteriellen Luciferase mit einer NADH oder NADPH, FMN, einen langkettigon Aldehyd und Sauerstoff enthaltenden wässrigen Lösung in Kontakt bringt und dabei eine Reduktion von FMN zu FMNH- und die Oxidation von NADH oder NADPH zu NAD oder NADP durch die FMN-Oxidoreduktase bewirkt und anschließend durch Reoxidatlon des FMNH₂ zu FMN mittels der bakteriellen Luciferase Licht in einer Menge proportional der Menge an reoxidiertem FMNH₂ erzeugt, das erzeugte Licht quantitativ bestimmt, damit die Menge an durch die Oxidation des NADH oder NADPH erzeugten FMNII₂ mißt und daraus die Menge an für die Produktion des anfänglichen NADH oder NADPH erforderlicher chemischer Verbindung berechnet.

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